本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及一種喜樹堿化合物作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑在治療慢性肝臟疾病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肝纖維化是肝臟遭受各種病因引起的慢性損傷后的修復(fù)反應(yīng)，是肝硬化早期的可逆階段；目前唯有通過(guò)肝移植對(duì)肝硬化進(jìn)行治療，因此，對(duì)肝纖維化的防治極其重要；肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是位于肝臟血竇中一類富含維生素A的間充質(zhì)細(xì)胞；在正常肝臟中肝星狀細(xì)胞HSC處于不分裂靜息狀態(tài)；當(dāng)肝臟受損時(shí)，肝星狀細(xì)胞HSC為各類刺激因素激活、轉(zhuǎn)變成旺盛增殖和過(guò)度合成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的肌成纖維母(myofibroblastic,MF)表型細(xì)胞；活化態(tài)肝星狀細(xì)胞HSC的大量擴(kuò)增在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中占有非常重要的地位；因此通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、對(duì)抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)相關(guān)刺激細(xì)胞因子的活性和信號(hào)傳導(dǎo)等途徑抑制肝星狀細(xì)胞HSC的增殖、活化和誘導(dǎo)其凋亡已經(jīng)成為治療肝纖維化的重要手段；目前有人嘗試使用紫杉醇、姜黃素、10-羥基喜樹堿(HCPT)和一氧化氮(NO)類等藥物來(lái)抑制活化態(tài)肝星狀細(xì)胞HSC的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)ECM的沉積；還有采用RNAi技術(shù)沉默I型膠原蛋白基因的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種喜樹堿化合物作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑在的應(yīng)用，所述抑制劑能夠抑制活化態(tài)肝星狀細(xì)胞HSC的糖酵解代謝活動(dòng)、從而有效逆轉(zhuǎn)HSC為靜息態(tài)表型。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種喜樹堿化合物作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑在治療慢性肝臟疾病藥物中的應(yīng)用，該化合物化學(xué)式為C₂₀H₁₆N₂O₄，相對(duì)分子量為348.34，CAS號(hào)：7689-03-4，該化合物為成都蘭貝植化有限公司產(chǎn)品；該化合物是由珙桐科旱蓮屬植物喜樹的根、皮、果實(shí)提取制得的生物堿，由喜樹根或果粉以有機(jī)溶劑提取而得，呈淡黃色針狀結(jié)晶；其結(jié)構(gòu)式如下所示：

該抑制劑由上述化合物溶于二甲基亞砜組成。

進(jìn)一步的，所述抑制劑對(duì)活化態(tài)肝星狀細(xì)胞缺氧因子HIF-1-α有抑制作用。

進(jìn)一步的，所述抑制劑對(duì)活化態(tài)肝星狀細(xì)胞中糖酵解限速酶基因表達(dá)有抑制作用。

進(jìn)一步的，所述抑制劑對(duì)肝星狀細(xì)胞中糖酵解代謝活動(dòng)有抑制作用。

進(jìn)一步的，所述抑制劑對(duì)肝星狀細(xì)胞從活化態(tài)向靜息態(tài)表型逆轉(zhuǎn)有促進(jìn)作用。

所述抑制劑由以下方法制備，將2mg喜樹堿CPT溶于10ml DMSO溶液中充分溶解制備成原始濃度為200μg/ml的細(xì)胞母液；將上述配置好的抑制劑母液用DMSO進(jìn)行梯度稀釋，使抑制劑的最終濃度分別為：0.25μg/ml、0.125μg/ml 0.062μg/ml、0.031μg/ml、0.016μg/ml、0.008μg/ml、0.004μg/ml、0.002μg/ml。

本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒分析喜樹堿CPT抑制劑的細(xì)胞毒性；取和不同濃度的CPT溶液共孵育48小時(shí)的大鼠活化態(tài)肝星狀細(xì)胞株HSC-T6、人乳腺癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞制備總蛋白；然后以蛋白質(zhì)印跡法Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中α-SMA、PKM2、HIF-1-α蛋白含量；取和CPT共孵育48小時(shí)的大鼠活化態(tài)肝星狀細(xì)胞株HSC-T6和原代活化態(tài)HSC細(xì)胞，制備細(xì)胞總RNA，以QRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中Pkm、α-Sma、Collagen1a1基因的RNA表達(dá)水平；以DMSO和10-羥基喜樹堿HCPT作為藥物處理對(duì)照組。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：低劑量的喜樹堿可以通過(guò)削弱活化態(tài)肝星狀細(xì)胞中缺氧因子HIF-1-α的蛋白水平而抑制其對(duì)下游一系列糖酵解相關(guān)基因(如Pkm)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，進(jìn)而減退細(xì)胞的糖酵解代謝活動(dòng)，最終抑制細(xì)胞中典型肌成纖維母細(xì)胞MF表型標(biāo)記分子基因(如α-Sma)的表達(dá)；喜樹堿的這一抑制作用表現(xiàn)出對(duì)活化態(tài)肝星狀細(xì)胞細(xì)胞的選擇性；而已報(bào)道的抗肝纖維化藥物10-羥基喜樹堿雖然對(duì)活化態(tài)肝星狀細(xì)胞有相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性，但在不高于半抑制濃度(IC50藥物濃度)時(shí)并不抑制細(xì)胞中缺氧因子HIF-1-α活性和糖酵解限速酶PKM2及MF表型代表標(biāo)記分子ɑ-SMA的蛋白水平。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明涉及的抑制劑特異性好，針對(duì)性強(qiáng)，能夠通過(guò)抑制活化態(tài)肝形狀細(xì)胞HSC的糖酵解代謝活動(dòng)有效逆轉(zhuǎn)HSC為靜息態(tài)表型；

(2)本發(fā)明涉及的抑制劑作為治療肝纖維化的藥物能夠在引起更低的炎癥反應(yīng)及毒副作用的情況下達(dá)到治療效果；

(3)本發(fā)明結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，制備方便。

附圖說(shuō)明

圖1為CPT和HCPT對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞生存率的影響。

圖2為CPT半抑制濃度和1/2半抑制濃度對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞處理48小時(shí)后蛋白水平變化。

圖3為CPT半抑制濃度和1/2半抑制濃度對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞處理48小時(shí)后基因水平變化。

圖4為CPT半抑制濃度和1/2半抑制濃度對(duì)大鼠原代肝星狀細(xì)胞HSC細(xì)胞處理48小時(shí)后基因水平變化。

圖5為HCPT半抑制濃度和1/2半抑制濃度對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞處理48小時(shí)后蛋白水平變化。

圖6為CPT和HCPT半抑制濃度和1/2半抑制濃度對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞處理48小時(shí)后蛋白水平變化。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。

本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)中用到的藥品與試劑如下：

α-SMA單克隆抗體為Abcam公司產(chǎn)品；PKM2單克隆抗體為Cell signaling technology公司產(chǎn)品；HIF-1-α單克隆抗體為Affinity公司產(chǎn)品；β-actin為Genescript公司產(chǎn)品；CCK8(WST)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒為北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司產(chǎn)品；喜樹堿CPT、10-羥基喜樹堿HCPT為成都蘭貝植化有限公司產(chǎn)品。

實(shí)施例中，所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以t檢驗(yàn)分析組間差異，計(jì)量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

實(shí)施例1

喜樹堿抑制劑細(xì)胞毒性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6以0.25％胰酶消化，配置成單細(xì)胞懸液；再以5×10³/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板置于37℃，5％二氧化碳(CO₂)的孵化箱進(jìn)行培養(yǎng)；一天后采用含有10％血清及1％雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基將200μg/ml喜樹堿溶液稀釋至0.25μg/ml、0.125μg/ml 0.062μg/ml、0.031μg/ml、0.016μg/ml、0.008μg/ml、0.004μg/ml、0.002μg/ml終濃度；羥基喜樹堿溶液稀釋至：0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.063μg/ml、0.01μg/ml、0.016μg/ml、0.008μg/ml、0.004μg/ml；吸棄孔板內(nèi)舊培養(yǎng)基，每孔分別換上100μL以上濃度的喜樹堿和羥基喜樹堿培養(yǎng)基溶液，孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h；以CCK-8法檢測(cè)孔內(nèi)存活的大鼠活化態(tài)肝星狀細(xì)胞株HSC-T6相對(duì)細(xì)胞數(shù)量并計(jì)算細(xì)胞的存活率；以未加空白膠束的細(xì)胞組為陰性對(duì)照，以無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基為空白對(duì)照；細(xì)胞的存活率計(jì)算公式如下：

細(xì)胞存活率％＝(OD_sample－OD_blank/OD_control－OD_blank)×100％

在公式中，OD_sample為樣品組吸光度值，OD_blank為空白對(duì)照吸光度值，OD_control為陰性對(duì)照吸光度值；根據(jù)細(xì)胞存活情形計(jì)算CPT的IC₅₀。

實(shí)驗(yàn)如圖1所示，與不含藥物的陰性對(duì)照組相比，CPT和HCPT均對(duì)大鼠活化態(tài)肝星狀細(xì)胞株HSC-T6細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著抑制作用，隨著藥物濃度的升高細(xì)胞生存率下降；根據(jù)SPSS軟件擬合得到CPT和HCPT的IC₅₀值分別為0.025μg/ml和0.04μg/ml；CPT較HCPT對(duì)大鼠活化態(tài)肝星狀細(xì)胞株HSC-T6細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。

實(shí)施例2

HSC中缺氧因子HIF-1-ɑ蛋白/糖酵解酶基因/肌成纖維母細(xì)胞MF表型分子標(biāo)記基因的表達(dá)

大鼠活化態(tài)肝星狀細(xì)胞株HSC-T6和體外培養(yǎng)14天的原代HSC，CPT或者HCPT共孵育48小時(shí)備用；根據(jù)CPT和HCPT細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果擬合得到藥物濃度與細(xì)胞生存率曲線；計(jì)算半抑制濃度IC₅₀值，并設(shè)置IC₅₀濃度為高劑量、1/2IC₅₀為低劑量進(jìn)行RNA分析；

將含有10％血清及1％雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基將200μg/ml濃度溶液稀釋至CPT IC50濃度(高劑量：0.025μg/ml)和1/2CPT IC50濃度并與孔板內(nèi)大鼠活化態(tài)肝星狀細(xì)胞株HSC-T6細(xì)胞共孵育48h。

采用RT-QPCR實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)方法如下：

以Trizol試劑(總RNA抽提試劑)裂解細(xì)胞、提取總RNA并定量；隨后對(duì)RNA樣品進(jìn)行脫氧核糖核酸酶I(DNase I酶)消化以去除DNA污染，采用隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)第一鏈；最后取稀釋的cDNA樣品模板和各基因特異擴(kuò)增引物，采用SYBR green綠色熒光試劑盒分別進(jìn)行QPCR反應(yīng)；以S9基因?yàn)閮?nèi)對(duì)照，采用ΔCt計(jì)算方法對(duì)各基因mRNA進(jìn)行定量。

如圖2所示，較無(wú)CPT處理組，CPT處理組細(xì)胞中缺氧因子HIF-1-ɑ的蛋白水平隨濃度增加而下降；與之相應(yīng)的是糖酵解限速酶PKM2和MF表型典型標(biāo)記分子ɑ-SMA的蛋白水平也呈現(xiàn)相似的下降趨勢(shì)；MF表型代表標(biāo)記分子ɑ-Sma基因和I型膠原蛋白分子基因的mRNA水平也隨著CPT處理而顯著下降(圖3)，表明HSC-T6的MF表型被抑制；進(jìn)一步采用兩種同樣濃度的CPT分別處理體外激活的原代HSC細(xì)胞48小時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中Pkm、α-Sma和Collagen 1a1基因的mRNA水平也均隨著CPT處理而下降，且表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制效果(圖4)，說(shuō)明原代活化態(tài)肝星狀細(xì)胞MF表型被CPT抑制。

實(shí)施例3

蛋白表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)采用大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6和人乳腺細(xì)胞株Hela，與CPT或HCPT共孵育48小時(shí)；根據(jù)喜樹堿和羥基喜樹堿細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果擬合得到藥物濃度與細(xì)胞生存率曲線，計(jì)算IC₅₀值，并設(shè)置CPT IC₅₀濃度(高劑量)和1/2IC₅₀濃度(低劑量)進(jìn)行蛋白分析；處理方法為含有10％血清及1％雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基將200μg/ml藥物溶液稀釋至指定劑量并與孔板內(nèi)細(xì)胞共孵育48小時(shí)。

實(shí)驗(yàn)方法如下：

以RIPA裂解液裂解細(xì)胞制備總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測(cè)法測(cè)定蛋白濃度；然后以聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE電泳)對(duì)蛋白進(jìn)行分離、并通過(guò)電轉(zhuǎn)進(jìn)行蛋白印跡至聚偏氟乙烯(PDVF)膜；然后進(jìn)行封閉、一抗和二抗依次孵育，最后以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL顯色法)進(jìn)行顯色、并于Image Lab成像儀中成像。

如圖5所示，無(wú)論是采用IC₅₀還是1/2IC₅₀濃度，10-羥基喜樹堿都未能減少T6細(xì)胞中的缺氧因子HIF-1-ɑ蛋白；細(xì)胞中糖酵解限速酶PKM2和MF表型典型標(biāo)記分子ɑ-SMA的蛋白水平也并未受到影響；如圖6所示，在不高于IC₅₀藥物濃度下，CPT和HCPT也均未能明顯改變Hela細(xì)胞中的HIF-1-α、PKM2和α-SMA的蛋白水平。

低劑量的喜樹堿可以通過(guò)削弱活化態(tài)肝星狀細(xì)胞中缺氧因子HIF-1-α的蛋白水平而抑制其對(duì)下游一系列糖酵解相關(guān)基因(如Pkm)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，進(jìn)而減退細(xì)胞的糖酵解代謝活動(dòng)，最終抑制細(xì)胞中典型肌成纖維母細(xì)胞MF表型標(biāo)記分子基因(如α-Sma)的表達(dá)；喜樹堿的這一抑制作用表現(xiàn)出對(duì)活化態(tài)肝星狀細(xì)胞細(xì)胞的選擇性；除此之外，已經(jīng)報(bào)道的抗肝纖維化藥物10-羥基喜樹堿雖然對(duì)活化態(tài)肝星狀細(xì)胞有相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性，但在不高于半抑制濃度(IC₅₀藥物濃度)時(shí)并不抑制細(xì)胞中缺氧因子HIF-1-α活性和糖酵解限速酶PKM2及MF表型代表標(biāo)記分子ɑ-SMA的蛋白水平；因此，通過(guò)使用喜樹堿可以抑制活化態(tài)肝星狀細(xì)胞細(xì)胞中的HIF-1-α和相應(yīng)的糖代謝活動(dòng)，從而逆轉(zhuǎn)其肌成纖維母細(xì)胞(myofibroblastic,MF)表型、最后達(dá)到治療肝纖維化的目的。

本發(fā)明與抑制肌成纖維母細(xì)胞表型的活化態(tài)肝星狀細(xì)胞(MF-HSC細(xì)胞)的增殖和促進(jìn)其凋亡的治療手段相比，誘導(dǎo)其MF表型向靜息態(tài)逆轉(zhuǎn)能夠在不引起炎癥反應(yīng)及更低毒副作用的情況下達(dá)到治療肝纖維化的目的；研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制活化態(tài)肝星狀細(xì)胞HSC的糖酵解代謝活動(dòng)可以有效逆轉(zhuǎn)HSC為靜息態(tài)表型；選用了我國(guó)特有喜樹堿(CPT)處理活化態(tài)HSC，通過(guò)減少缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1-α蛋白來(lái)削弱細(xì)胞的糖酵解活動(dòng)、進(jìn)而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞活化態(tài)表型。