本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及化合物7-MDT（7-methyl-2,4-diphenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，7-甲基-2,4-二苯基-5,6,7,8-四氫喹啉,下述簡(jiǎn)稱(chēng)7-MDT）在制備治療卵巢癌的藥物中的應(yīng)用，具體涉及其在誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡方面的研究和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

卵巢惡性腫瘤是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，其中上皮性腫瘤占總數(shù)的70%左右。全球，每年大約有22萬(wàn)女性患有上皮性卵巢癌。由于卵巢深居盆腔，早期癥狀很不明顯，患者難以察覺(jué)，同時(shí)又缺乏有效的篩檢方法，所以大多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期。近幾十年來(lái)，卵巢癌的治療取得了一定的進(jìn)展，如手術(shù)及PVB（順鉑+長(zhǎng)春新堿+博來(lái)霉素）/PEB（順鉑+依托泊苷+博來(lái)霉素）化療方案等，給患者帶來(lái)了新的生機(jī)。盡管患者近期的生存情況和其生活質(zhì)量有了一定的提高，但是化療是一種全身性的治療的方法,多數(shù)化療藥物選擇性抑制作用不強(qiáng),靶向殺死癌細(xì)胞的能力差，故取得療效的同時(shí)也會(huì)損傷機(jī)體的正常細(xì)胞，因而常常出現(xiàn)一定的副作用，采用這兩種化療方案的患者經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)消化系統(tǒng)反應(yīng)和一定的心臟毒性等，這主要是化療藥物的毒性及耐藥性引起的。因此，治療卵巢癌的關(guān)鍵在于尋求一種既可以有效殺死卵巢惡性腫瘤，又可以保證對(duì)身體傷害較小的藥物。

傳統(tǒng)的臨床抗癌藥物在其發(fā)展過(guò)程中遇到了一些困難和問(wèn)題。以鉑類(lèi)抗癌藥物為例，它們?cè)谂R床使用中容易產(chǎn)生毒副作用，如神經(jīng)毒性、肝毒性、腎毒性、耳毒性、骨髓毒性等，這嚴(yán)重制約了鉑類(lèi)藥物的療效和長(zhǎng)期使用，為了降低這些藥物的毒性和提高藥物的適用性，一系列新的藥物就被設(shè)計(jì)和合成出來(lái)，其中比較重要的就是吡啶類(lèi)藥物，該結(jié)構(gòu)經(jīng)研究表明具有良好的廣譜抗癌活性。吡啶類(lèi)衍生物的研究應(yīng)用范圍十分廣泛，主要運(yùn)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、飼料、染料等領(lǐng)域，尤其在醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用十分重要，如結(jié)核病藥異煙肼，中樞興奮藥尼可剎米等。本發(fā)明所涉及的吡啶類(lèi)衍生化合物7-MDT，是2016年在Tetrahedron雜志上已報(bào)道的一種雜環(huán)類(lèi)化合物，為白色固體，其熔點(diǎn)為102-103 ℃，呈弱堿性。其在抗卵巢癌活性方面的生物學(xué)效應(yīng)尚未見(jiàn)到相關(guān)研究報(bào)道。經(jīng)本發(fā)明的試驗(yàn)研究表明，該化合物對(duì)正常人成纖維細(xì)胞無(wú)明顯作用，但可以影響卵巢癌細(xì)胞凋亡，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。因此，本發(fā)明涉及的化合物在抗卵巢癌活性方面具有作用十分明顯，并且在將來(lái)卵巢癌的治療方面具有很大的潛在價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，為更好的治愈或?yàn)橹委熉殉舶┨峁┮环N可行的選擇，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量創(chuàng)造性的勞動(dòng)，篩選出一種化合物7-MDT，在抗卵巢癌活性方面具有很好的抑制作用，進(jìn)而為治療卵巢癌或誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡提供了新的療法或手段。

本發(fā)明首先提供一種吡啶類(lèi)衍生物在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用，其中所述的吡啶類(lèi)衍生物為7-methyl-2,4-diphenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，7-甲基-2,4-二苯基-5,6,7,8-四氫喹啉,簡(jiǎn)稱(chēng)7-MDT，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

。

其中，上面所述的癌癥為卵巢癌；

所述應(yīng)用為抑制癌細(xì)胞增殖或促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡；具體的，所述的應(yīng)用為促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞早期凋亡及晚期凋亡都明顯增加。

本發(fā)明還提供一種治療癌癥的藥物，所述藥物中的有效成分為吡啶類(lèi)衍生物為7-methyl-2,4-diphenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，7-甲基-2,4-二苯基-5,6,7,8-四氫喹啉,簡(jiǎn)稱(chēng)7-MDT。

其中所述的藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體或輔料，所述載體和/或輔料為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉，在此不做贅述。

所述的藥物為抑制癌細(xì)胞增殖或促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的藥物；具體的，所述的藥物為促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞早期凋亡及晚期凋亡都明顯增加的藥物。

本發(fā)明通過(guò)一系列的篩選方法對(duì)已公開(kāi)的通過(guò)合成得到的一類(lèi)新的化合物進(jìn)行篩選，研究其在抗癌活性方面的相關(guān)作用。具體為對(duì)一系列吡啶類(lèi)衍生化合物通過(guò)體外噻唑藍(lán)比色法（MTT）實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行初步篩選，篩選出明顯對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有抑制增殖作用的化合物，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為卵巢癌A2780細(xì)胞，本發(fā)明通過(guò)篩選得到化合物7-MDT。

化合物7-MDT對(duì)卵巢癌細(xì)胞的特異性增殖抑制是進(jìn)一步通過(guò)體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得出的，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780及人正常成纖維細(xì)胞IMR90，實(shí)驗(yàn)為MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率，細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測(cè)，測(cè)定該化合物對(duì)卵巢癌細(xì)胞和人正常成纖維細(xì)胞之間的細(xì)胞毒性差異，以及對(duì)卵巢癌細(xì)胞的周期、凋亡的影響，從而得知該化合物的抗癌活性非常顯著。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)一系列的化合物進(jìn)行篩選，篩選出化合物7-MDT，該化合物可有效抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，并通過(guò)進(jìn)一步的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗卵巢癌生物活性進(jìn)行評(píng)估。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)該化合物對(duì)正常人纖維細(xì)胞的增殖影響不大，但對(duì)卵巢癌A2780和SKOV3細(xì)胞的增殖抑制十分明顯，其IC₅₀值分別為80.6 μM和92.4 μM ( IBM spss statistics 19 )；細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明，該化合物對(duì)其沒(méi)有太大的改變；細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，該化合物在低濃度下可誘導(dǎo)細(xì)胞晚期凋亡，在高濃度下可以誘導(dǎo)細(xì)胞的早期及晚期凋亡。

本發(fā)明的有益效果：通過(guò)化合物7-MDT對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780和SKOV3及正常細(xì)胞IMR90生長(zhǎng)情況和毒性研究，發(fā)現(xiàn)該化合物在對(duì)卵巢癌細(xì)胞有明顯增殖抑制的時(shí)候，對(duì)正常細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯的抑制效應(yīng)。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)是相比傳統(tǒng)化療藥物，7-MDT化合物能夠明顯抑制卵巢癌細(xì)胞增殖（主要由于細(xì)胞凋亡引起的），然而對(duì)正常細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯影響，對(duì)于傳統(tǒng)廣譜抗癌藥物而言，極大降低了對(duì)正常細(xì)胞組織的毒副作用。因此本發(fā)明為卵巢癌藥物治療提供新的藥物選擇，同時(shí)為藥物的設(shè)計(jì)研發(fā)提供了理論支持，在對(duì)卵巢癌的研究和治療方面具有極大的潛質(zhì)，為將來(lái)的研究提供指導(dǎo)。

附圖說(shuō)明

圖1：不同化合物對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞的影響。

圖2：7-MDT作用于卵巢癌A2780細(xì)胞后，三次平行實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)所得的生長(zhǎng)抑制曲線。其中，橫坐標(biāo)為化合物作用濃度，單位為μM，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率。

圖3：7-MDT作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞后，三次平行實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)所得的生長(zhǎng)抑制曲線。其中，橫坐標(biāo)為化合物作用濃度，單位為μM，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率。

圖4：7-MDT作用于正常人成纖維IMR90細(xì)胞后，三次平行實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)所得的生長(zhǎng)抑制曲線。其中，橫坐標(biāo)為化合物作用濃度，單位為μM，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率。

圖5：分別用0 μM、40 μM、85 μM的7-MDT劑量處理卵巢癌A2780細(xì)胞48h后PI染色的流式細(xì)胞檢測(cè)圖（上圖）和平行3次實(shí)驗(yàn)后的細(xì)胞周期統(tǒng)計(jì)結(jié)果（下圖）。

圖6：分別用0 μM、40 μM、85 μM的7-MDT劑量處理卵巢癌A2780細(xì)胞48h后經(jīng)PI/Annexin V染色的流式細(xì)胞檢測(cè)圖（上圖）和平行3次實(shí)驗(yàn)后的細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果（下圖）。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所涉及的具體化合物為吡啶類(lèi)衍生化合物7-MDT，通過(guò)下面的實(shí)施例做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，下述非限制性實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，所使用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，所用材料、試劑等均可從化學(xué)試劑公司購(gòu)買(mǎi)。

本發(fā)明所涉及的具體化合物7-MDT的制備方法請(qǐng)參見(jiàn)Chunyin Zhu*, Benwei Bi, Ya Ding, Te Zhang, Qiu-Yun Chen. Iodine-catalyzed aerobic oxidative formal [4+2] annulation for the construction of polyfunctionalized pyridines. Tetrahedron.2016, 72(5), 779.本發(fā)明涉及的化合物均由該論文作者提供。

實(shí)施例1. 細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代

卵巢癌A2780和SKOV3細(xì)胞 (購(gòu)于American type culture collection)體外分別培養(yǎng)于含10% 胎牛血清及青霉素（100U/mL）-鏈霉素（100μg/mL）的DMEM(購(gòu)于Life Technologies公司，美國(guó))培養(yǎng)基和含10% 胎牛血清及青霉素（100U/mL）-鏈霉素（100μg/mL）的RMPI-1640培養(yǎng)基(購(gòu)于Life Technologies公司，美國(guó))中；人成纖維IMR90細(xì)胞(購(gòu)于American type culture collection) 培養(yǎng)于含10% 胎牛血清及青霉素-鏈霉素的專(zhuān)用DMEM培養(yǎng)基中。每天定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿時(shí)及時(shí)傳代（一般在貼壁細(xì)胞表面積占80% 及以上時(shí)傳代）。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)和傳代效果良好時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

上面所述專(zhuān)用DMEM培養(yǎng)基500 mL =1 mL維生素( 100 ×，購(gòu)于Life Technologies，美國(guó) ) + 5 mL丙酮酸酯(100 nM ，購(gòu)于Life Technologies，美國(guó)) + 2mL氨基酸( 50 ×，購(gòu)于Life Technologies，美國(guó) ) + 1 mL非必需氨基酸(100 ×，購(gòu)于Life Technologies，美國(guó) )+491 mL DMEM培養(yǎng)基。

實(shí)施例2. MTT檢測(cè)不同化合物對(duì)細(xì)胞存活率的影響

第一步：在底面直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)卵巢癌A2780細(xì)胞，傳代良好后，棄原培養(yǎng)液，用2 mLPBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，取溶液200 g離心5 min，棄上清，加含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5 mL到EP管，用槍吸取10 μL于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)或稀釋相應(yīng)倍數(shù)后計(jì)數(shù)。每孔種2×10⁴個(gè)細(xì)胞，一共11組孔，每組3個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞種到24孔板中，每孔吹打混勻。放入CO₂恒溫培養(yǎng)箱（Thermo scientific，37 ℃）靜止培養(yǎng)24 h，使其貼壁。

第二步：加濃度約為100 μM不同化合物DMSO溶液。將不同化合物按一定量溶解于無(wú)菌干凈的DMSO溶液中，保持每孔所加的化合物溶液的體積保持不變，對(duì)照加等體積的DMSO溶液。放入CO₂恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）靜止培養(yǎng)48 h。

所述不同化合物分別為：

A：5-（4-甲氧基苯基）-1-（2-氧代-1,2-二苯基乙基）-1H-吡唑-3-羧酸甲酯；

B：（E）-1-（2-氧代-1,2-二苯基乙基）-5-苯乙烯基-1H-吡唑-3-羧酸甲酯；

C：1-異丙基乙酯-5-苯乙烯基-1-氫吡唑-3-羧酸甲酯；

D：N-溴丁二酰亞胺；

E：（E）-1-（2-氧代-1,2-二苯基乙基）-5-苯乙烯基-1H-吡唑-3-羧酸甲酯；

F：5-氨基-3-（2-溴苯基）-1-甲基-1-氫-吡唑-4-甲腈；

G：5-氨基-1-甲基-3-（4-硝基苯基）-1-氫-吡唑-4-甲腈；

H：5-甲基-6-乙基-4-苯基-鄰吡啶甲酸甲酯；

I：2,4,6-三苯吡啶；

和7-MDT。各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下表1中所示。

所選化合物主要為吡唑和吡啶類(lèi)化合物，在醫(yī)藥領(lǐng)域研究均較為廣泛，并

且所選化合物多未進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證。

表1 .各化合物的化合結(jié)構(gòu)式

第三步：將培養(yǎng)48 h后的加不同化合物的細(xì)胞取出，吸去培養(yǎng)基，分別加入100 μL含10 % MTT的DMEM 培養(yǎng)基（MTT濃度為5 mg/mL），放入CO₂恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）反應(yīng)1.5~2 h，待細(xì)胞染成藍(lán)紫色后吸去培養(yǎng)基，加入0.5 mL的DMSO并輕輕震蕩使結(jié)晶溶解。選擇550 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

不同化合物對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞作用后的吸光度值見(jiàn)表2所示。

表2. 不同化合物對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞作用后的吸光度值

三次平行實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：如圖1所示，在作用濃度約為100 μM時(shí)，不同的化合物對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞的增殖抑制不同，其中化合物7-MDT對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制作用最明顯。

實(shí)施例3. MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率

第一步：在底面直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)卵巢癌A2780和SKOV3細(xì)胞及人成纖維IMR90細(xì)胞，傳代良好后，棄原培養(yǎng)液，用2 mL PBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的DMEM(或RMPI-1640，IMR90專(zhuān)用DMEM)培養(yǎng)基吹打混勻，取溶液200 g離心5 min，棄上清，加含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的DMEM(或RMPI-1640，IMR90專(zhuān)用DMEM)培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5 mL到EP管，用槍吸取10 μL于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)或稀釋相應(yīng)倍數(shù)后計(jì)數(shù)。每孔種3500個(gè)細(xì)胞(IMR90細(xì)胞每孔2000個(gè))，一共7組孔，每組3個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞種到96孔板中,每孔吹打混勻。并設(shè)空白對(duì)照孔，加等體積細(xì)胞培養(yǎng)液。放入CO₂恒溫培養(yǎng)箱（Thermo scientific，37 ℃）靜止培養(yǎng)24 h，使其貼壁。

第二步：加不同濃度的7-MDT化合物DMSO溶液。將化合物按不同比例稀釋于無(wú)菌干凈的DMSO溶液中，保持每孔所加的化合物稀釋液的體積保持不變，所加濃度分別為5 μM、10 μM、20 μM、40 μM、80 μM、120 μM，對(duì)照加等體積DMSO溶液。放入CO₂恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）靜止培養(yǎng)48 h。

第三步：將培養(yǎng)48 h后的加不同細(xì)胞取出，吸去培養(yǎng)基，分別加入10 μLMTT（5 mg/mL），放入CO₂恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）反應(yīng)1.5~2 h，待細(xì)胞染成藍(lán)紫色后吸去培養(yǎng)基，加入0.1 mL的DMSO并輕輕震蕩使結(jié)晶溶解。選擇550 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=（（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照OD值））×100%，用SPSS軟件計(jì)算求出IC₅₀值 ( 細(xì)胞數(shù)量減少一半時(shí)所需化合物濃度 )。

7-MDT作用于卵巢癌A2780、SKOV3細(xì)胞及人正常纖維IMR90細(xì)胞后的MTT結(jié)果吸光度值分別如表3、4、5所示。

表3. 7-MDT作用于卵巢癌A2780后的MTT結(jié)果吸光度值

表4. 7-MDT作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞后的MTT結(jié)果吸光度值

表5. 7-MDT作用于人正常纖維IMR90細(xì)胞后的MTT結(jié)果吸光度值

三次平行實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)所得的生長(zhǎng)抑制曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：化合物7-MDT可以有效抑制卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖，但是對(duì)正常人成纖維細(xì)胞無(wú)明顯影響。如圖2所示，化合物7-MDT對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制呈濃度依賴(lài)關(guān)系，IC₅₀為80.6 μM。如圖3所示，該化合物對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制也同樣呈濃度依賴(lài)關(guān)系，IC₅₀為92.4 μM。如圖4所示，該化合物對(duì)人正常纖維IMR90細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。

實(shí)施例4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

第一步：底面直徑6 cm培養(yǎng)皿的卵巢癌A2780細(xì)胞培養(yǎng)和傳代良好后，棄原培養(yǎng)液，用2 mL PBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10% 胎牛血清及青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻，200 g離心5 min，棄上清，加含10% 胎牛血清及青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5 mL到EP管，用槍吸取10 μL于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)或稀釋相應(yīng)倍數(shù)后計(jì)數(shù)。取底面直徑6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，每碟種1×10⁵個(gè)細(xì)胞，每組3碟。放入 CO₂恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）靜止培養(yǎng)24 h，使其貼壁。

第二步：分別取0 μM、40 μM、85 μM化合物7-MDT劑量加入實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中，對(duì)照組加入等體積的DMSO和培養(yǎng)基。放入CO₂恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）靜止培養(yǎng)48 h。

第三步：將培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞取出，吸去培養(yǎng)基，分別取0.5 mL的PBS清洗，吸去PBS，加0.5 mL胰酶消化，加0.5 mL相應(yīng)培養(yǎng)基終止消化，延孔壁吹洗，轉(zhuǎn)至EP管，重復(fù)用0.5 mL培養(yǎng)基洗一次，減少細(xì)胞殘余。轉(zhuǎn)至4 ℃冰盒，并在4 ℃冷凍離心機(jī)中300 g離心5 min，吸去上清，刮勻。每管加300 μL4 ℃預(yù)冷的PBS，混勻，4 ℃冷凍離心機(jī)中300 g離心5 min，吸去上清，刮勻。每管滴加0.5 mL -20 ℃預(yù)冷的70% 的乙醇，混勻，放入4 ℃冰箱保存至少24 h。

第四步：從4 ℃取出待處理的細(xì)胞，4 ℃冷凍離心機(jī)中500 g離心5 min，棄上清，刮勻。每管加300 μL4 ℃預(yù)冷的PBS,混勻，4℃冷凍離心機(jī)中500 g離心5 min。棄上清，刮勻，每管加500 μL PI染色液（485 μL PBS+10 μL 1 mg/mL的PI+5 μL1 mg/mL的RNASE），吹打4-5次混勻，轉(zhuǎn)至周期檢測(cè)管，避光中37℃水浴鍋中孵育1 h。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：如圖5所示，化合物7-MDT對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞的周期沒(méi)有影響。

實(shí)施例5.流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡檢測(cè)

第一步：底面直徑6 cm培養(yǎng)皿的卵巢癌A2780細(xì)胞培養(yǎng)和傳代良好后，棄原培養(yǎng)液，用2 mL PBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10% 胎牛血清及青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻，200 g離心5 min，棄上清，加含10% 胎牛血清及青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5 mL到EP管，用槍吸取10 μL于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)或稀釋相應(yīng)倍數(shù)后計(jì)數(shù)。取底面直徑6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，每碟種1×10⁵個(gè)細(xì)胞,每組3碟。放入 CO₂恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）靜止培養(yǎng)24 h，使其貼壁。

第二步：分別取0 μM、40 μM、85 μM的化合物7-MDT劑量加入實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中。放入CO₂恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）靜止培養(yǎng)48 h。

第三步：將A2780細(xì)胞從6 cm碟消化離心，收集所有的上清液。轉(zhuǎn)至4℃冰盒，并在4 ℃冷凍離心機(jī)中300 g離心5 min，吸去上清，刮勻。將上清離心后的細(xì)胞和相應(yīng)消化下來(lái)的細(xì)胞全部合并，用0.5 mL預(yù)冷PBS洗滌，4℃冷凍離心機(jī)中300 g離心5 min，吸去上清，刮勻。每管加500 μL4℃預(yù)冷的PBS，混勻，重復(fù)上述操作。加入100 μL1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μLAnnexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，輕輕搖勻(細(xì)胞凋亡試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司)。避光，室溫反應(yīng)10 min，加入400 μL1×Binding Buffer，混勻，1 h內(nèi)送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，如圖6所示，化合物7-MDT對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用。在40 μM的化合物濃度下，主要誘導(dǎo)卵巢癌A2780細(xì)胞的晚期凋亡，在85 μM的化合物濃度下，誘導(dǎo)卵巢癌A2780細(xì)胞的早期及晚期凋亡。從而可以得出結(jié)論，該化合物是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制癌細(xì)胞增殖的。