仁青常覺(jué)在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及仁青常覺(jué)在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用。所述仁青常覺(jué)為將其配方藥材制備活性成分后制成的濃縮丸或糖衣片或薄膜包衣片或膠囊。所述的活性成分為石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水提取物中的一種或多種。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)應(yīng)用方面的技術(shù)偏見，通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，仁青常覺(jué)的多種提取物體外對(duì)卵巢癌細(xì)胞有較好的抑制作用，其效果與順鉑相當(dāng)或略優(yōu)；仁青常覺(jué)的多種提取物的含藥血清體外對(duì)卵巢癌也均有顯著的抑制作用（P<0.05），其中石油醚提取物、乙酸乙酯提取物及水提取物的效果略優(yōu)于順鉑。
【專利說(shuō)明】仁青常覺(jué)在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及仁青常覺(jué)在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]卵巢癌是女性常見的腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位。但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科腫瘤的首位，對(duì)婦女生命造成嚴(yán)重威脅。卵巢癌的病因尚不清楚，其發(fā)病可能與年齡、生育、血型、精神因素及環(huán)境等有關(guān)。
[0003]仁青常覺(jué)系藏族驗(yàn)方，成方于公元八世紀(jì)，最早是藏王、班禪、達(dá)賴以及達(dá)官貴人專用藥，歷經(jīng)一千多年的應(yīng)用歷史，現(xiàn)如今，仁青常覺(jué)收載于《中國(guó)藥典》(2010版)一部中。仁青常覺(jué)由珍珠、朱砂、檀香、降香、沉香、訶子、牛黃、人工麝香、西紅花等一百余味藥組成，功能為清熱解毒、調(diào)和滋補(bǔ)。用于“隆、赤巴、培根”各病，陳舊性胃腸炎、潰瘍，“木布”病，萎縮性胃炎，各種中毒癥；梅毒，麻風(fēng)，陳舊熱病，炭疽，癤痛，干黃水，化膿等?，F(xiàn)代藥效學(xué)研究結(jié)果表明，本品具有抗炎、抑制潰瘍形成、促進(jìn)潰瘍愈合等作用。急性毒性試驗(yàn)，長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，本品無(wú)明顯毒性。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，本品治療消化系統(tǒng)疾病，如各種急慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎、消化性潰瘍、肝硬化、化療后消化道不良反應(yīng)等方面顯示良好療效，并且有良好的保健作用，是藏醫(yī)保健藥品之一。
[0004]仁青常覺(jué)的功能主治、文獻(xiàn)、專利等方面均未發(fā)現(xiàn)其可用于治療卵巢癌的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供仁青常覺(jué)在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用。
[0006]術(shù)語(yǔ)說(shuō)明:`[0007]仁青常覺(jué)是《中國(guó)藥典》(2010版)一部中記載的藥品名稱，市場(chǎng)可購(gòu)。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0009]仁青常覺(jué)在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用。
[0010]優(yōu)選的，上述仁青常覺(jué)在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用，所述仁青常覺(jué)為將其配方藥材制備活性成分后制成的藥學(xué)制劑。
[0011]上述仁青常覺(jué)活性成分包括石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水提取物中的一種或多種，其中所述的:
[0012]A、石油醚提取物是按如下方法制得的:取仁青常覺(jué)研細(xì)后的細(xì)粉或其配方藥材，以其重量數(shù)6倍體積的石油醚沸騰提取3次，每次I小時(shí)，40°C -50°C減壓回收石油醚，SP得;
[0013]B、乙酸乙酯提取物是按如下方法制得的:取仁青常覺(jué)研細(xì)后的細(xì)粉或其配方藥材，以其重量數(shù)6倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行沸騰提取3次，每次I小時(shí)，50°C _60°C減壓回收乙酸乙酯，即得；
[0014]C、乙醇提取物是按如下方法制得的:取仁青常覺(jué)研細(xì)后的細(xì)粉或其配方藥材，以其重量數(shù)8倍體積的乙醇提取3次，每次1.5小時(shí)，50°C _60°C減壓回收回收乙醇，干燥，即得;
[0015]D、水提取物是按如下方法制得的:取仁青常覺(jué)研細(xì)后的細(xì)粉或其配方藥材，以其重量數(shù)8倍體積的水煎煮2次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，濾液蒸干，即得。
[0016]上述藥學(xué)制劑為濃縮丸、糖衣片、薄膜包衣片或膠囊。
[0017]本發(fā)明中體積與重量的對(duì)應(yīng)關(guān)系為ml/g或1/kg。
[0018]本發(fā)明所述的回收乙醇和濃縮工藝參數(shù)為-0.07~-0.09Mpa，產(chǎn)品減壓干燥的工藝參數(shù)為70°C，_0.08~-0.09Mpa，其它未特別說(shuō)明的均為藥學(xué)生產(chǎn)上慣用的參數(shù)或方法。
[0019]有益效果
[0020]在仁青常覺(jué)的應(yīng)用治療領(lǐng)域，人們熟知其清熱解毒、調(diào)和滋補(bǔ)的作用，熟知其用于“隆、赤巴、培根”各病，陳舊性胃腸炎、潰瘍，“木布”病，萎縮性胃炎，各種中毒癥；梅毒，麻風(fēng)，陳舊熱病，炭疽，癤痛，干黃水，化膿等的治療。
[0021]本發(fā)明克服了上述應(yīng)用方面的技術(shù)偏見，通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，仁青常覺(jué)乙酸乙酯提取物、仁青常覺(jué)石油醚提取物體外對(duì)卵巢癌細(xì)胞有較好的抑制作用，其效果與順鉬相當(dāng)或略優(yōu)；而仁青常覺(jué)的4種提取物的含藥血清體外對(duì)卵巢癌也均有顯著的抑制作用(P〈0.05 )，其中石油醚提取物、乙酸乙酯提取物及水提取物的效果略優(yōu)于順鉬。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明但不限于本發(fā)明。
[0023]實(shí)驗(yàn)例1、仁青常覺(jué)各提取物的制備
[0024]一、樣品
`[0025]仁青常覺(jué)，青海金訶藏藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào):20100707
[0026]二、方法和步驟
[0027]1、石油醚提取物:取仁青常覺(jué)研細(xì)后的細(xì)粉50g，以其重量數(shù)6倍體積的石油醚(60°C~90°C)沸騰提取3次，每次I小時(shí)。40°C _50°C減壓回收石油醚，得石油醚提取物
2.71g。
[0028]2、乙酸乙酯提取物:取仁青常覺(jué)研細(xì)后的細(xì)粉50g，以其重量數(shù)6倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行沸騰提取3次，每次I小時(shí)。50°C -60°C減壓回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物
7.66g。
[0029]3、乙醇提取物:取仁青常覺(jué)研細(xì)后的細(xì)粉50g，以其重量數(shù)8倍體積的乙醇提取3次，每次1.5小時(shí)，50°C _60°C減壓回收回收乙醇，干燥。得乙醇提取物4.68g。
[0030]4、水提取物:取仁青常覺(jué)研細(xì)后的細(xì)粉50g，以其重量數(shù)8倍體積的水煎煮2次。每次2小時(shí)，濾過(guò)，濾液蒸干。得水提取物4.76g。
[0031]實(shí)驗(yàn)例2、仁青常覺(jué)對(duì)卵巢癌的抑制作用
[0032]一、實(shí)驗(yàn)原理
[0033]活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，甲瓚結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比(死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原)。還原生成的甲瓚結(jié)晶可在含50%的N，N- 二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉(pH4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。[0034]二、藥物及試劑
[0035]1、動(dòng)物
[0036]SPF級(jí)健康昆明種小鼠90只，體重30±2g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司新實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK魯20130001。
[0037]2、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
[0038]卵巢癌(skov3)細(xì)胞，由山東省立醫(yī)院提供。
[0039]3、實(shí)驗(yàn)藥物
[0040]實(shí)驗(yàn)藥物:實(shí)驗(yàn)例I制備的仁青常覺(jué)各提取物，各加生理鹽水配制成500ml的混懸液。
[0041]陽(yáng)性對(duì)照藥物:順鉬，批號(hào):1010041DC。
[0042]試劑:1640細(xì)胞培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司);胎牛血清(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司)；胰酶細(xì)胞消化液(碧云天)，青霉素鏈霉素混合液雙抗，注射用順鉬(齊魯制藥 有限公司，批號(hào):1010041DC)。
[0043]4、實(shí)驗(yàn)儀器
[0044]立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50FBS，上海申安)；雙人單面凈化工作臺(tái)(SW-CJ-1C，蘇州凈化)；二氧化碳培養(yǎng)箱；臺(tái)式離心機(jī)；酶標(biāo)儀(MK3，賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(101，上海鵬順科學(xué)儀器有限公司)；倒置顯微鏡(XDS-1B，重慶光學(xué)儀器廠);水浴恒溫振蕩器(SHZ-82，金壇市醫(yī)療儀器廠);移液器；培養(yǎng)瓶；96孔板。
[0045]三、實(shí)驗(yàn)方法
[0046]1、仁青常覺(jué)體外對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用實(shí)驗(yàn)
[0047](I)細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)
[0048]從超低溫冰箱中取凍存的卵巢癌(skov3)細(xì)胞，迅速投入預(yù)先加熱到37°C的滅菌水中，待凍存液溶化后，2000r/min離心三分鐘，收集細(xì)胞。然后以含10%胎牛血清的1640新鮮培養(yǎng)基在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0049](2)接種
[0050]待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，以0.25%的胰酶細(xì)胞消化液(含0.0296EDTA)進(jìn)行消化，以I X IO4個(gè)細(xì)胞每孔接種于96孔板中，預(yù)留三個(gè)調(diào)零孔，調(diào)零孔只加不含血清的1640培養(yǎng)基，不加細(xì)胞。
[0051](3)加藥
[0052]待96孔板中的細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，棄掉培養(yǎng)基，調(diào)零組、空白對(duì)照組加100 μ L不含血清的1640培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組加10 μ g/ml順鉬100 μ I。其他給藥組每孔分別加入含梯度稀釋濃度的篩選藥物的1640培養(yǎng)基100 μ 1，加藥一排。然后細(xì)胞在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，所加藥物濃度為折算后的仁青常覺(jué)原藥濃度。
[0053](4)測(cè)定
[0054]MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率:在每孔加入5mg/mlMTT溶液20 μ I于培養(yǎng)箱內(nèi)避光反應(yīng)4h。然后加入100 μ L DMSO用酶標(biāo)儀于492nm測(cè)定OD值，計(jì)算抑制率:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組吸光度平均值一實(shí)驗(yàn)組吸光度平均值)/對(duì)照組吸光度平均值X 100%。
[0055]2、仁青常覺(jué)含藥血清體外對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用實(shí)驗(yàn)
[0056](I)細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)[0057]從超低溫冰箱中取凍存的卵巢癌(skov3)細(xì)胞，迅速投入預(yù)先加熱到37°C的滅菌水中，待凍存液溶化后，2000r/min離心三分鐘，收集細(xì)胞。然后以含10%胎牛血清的1640新鮮培養(yǎng)基在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0058](2)含藥血清的制備
[0059]昆明種小鼠90只，隨機(jī)分為6組，空白對(duì)照組、順鉬組、仁青常覺(jué)石油醚提取物組、仁青常覺(jué)乙酸乙酯提取物組、仁青常覺(jué)乙醇提取物組、仁青常覺(jué)水提取物組，每組15只。仁青常覺(jué)各提取物組的給藥濃度相當(dāng)于IOmg仁青常覺(jué)原藥/ml，順鉬組給藥濃度為10 μ g/ml。各組小鼠連續(xù)灌胃3天，每天每只0.5ml，相當(dāng)于人體最大建議劑量的100倍。其中空白對(duì)照組給予生理鹽水。最后一天灌胃后I小時(shí)，10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3000轉(zhuǎn)/min離心，取上層血清，-80°C保存。同組血清混合，0.22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌于備用。
[0060](3) MTT法測(cè)定含藥血清對(duì)不同腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制狀況
[0061]將C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的卵巢癌(skov3)細(xì)胞，以0.25%的胰酶細(xì)胞消化液(含
0.02%EDTA)進(jìn)行消化，以I X IO 4個(gè)細(xì)胞每孔接種于96孔板中，預(yù)留三個(gè)調(diào)零孔，調(diào)零孔只加不含血清的1640培養(yǎng)基，不加細(xì)胞。待96孔板中的細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，棄掉培養(yǎng)基，調(diào)零組、空白對(duì)照組加100 μ L不含血清的1640培養(yǎng)基，每孔分別加入含含藥血清的1640培養(yǎng)基100 μ 1，每個(gè)濃度的藥物加6孔。然后細(xì)胞在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。加入5mg/mlMTT溶液20 μ I于培養(yǎng)箱內(nèi)避光反應(yīng)4h。然后加入100 μ L DMSO用酶標(biāo)儀于492nm測(cè)定OD值，計(jì)算抑制率:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組吸光度平均值一實(shí)驗(yàn)組吸光度平均值)/對(duì)照組吸光度平均值X 100%。
[0062]四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0063]所有數(shù)據(jù)均以(X土`SD)顯示,采用GraphPad Prism5軟件分析處理數(shù)據(jù),利用t檢驗(yàn)觀察各組與空白組之間是否存在顯著性差異，P〈0.05為差異顯著。
[0064]1、仁青常覺(jué)體外對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用實(shí)驗(yàn)
[0065]對(duì)各種藥物進(jìn)行IC50計(jì)算，IC50值低于250 μ g/ml的藥物進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證后的所有數(shù)據(jù)以X±SD表示，t檢驗(yàn)比較組間差異的顯著性，P〈0.05為差異顯著。
[0066]IC5tl值低于250 μ g/ml的藥物為:仁青常覺(jué)石油醚提取物，IC5tl值為92.29。其他藥物IC5tl值偏大或者對(duì)癌細(xì)胞沒(méi)有抑制作用，不再做驗(yàn)證試驗(yàn)。其中，仁青常覺(jué)乙醇提取物、仁青常覺(jué)乙酸乙酯提取物的量效關(guān)系不明顯，選擇對(duì)癌細(xì)胞抑制作用較好的濃度做驗(yàn)證試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1:
[0067]表1不同提取物對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制率(n=6，土SD)
【權(quán)利要求】
1.仁青常覺(jué)在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的仁青常覺(jué)在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用，所述仁青常覺(jué)為將其配方藥材制備活性成分后制成的藥學(xué)制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的仁青常覺(jué)在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用，所述仁青常覺(jué)活性成分包括石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水提取物中的一種或多種，其中所述的: A、石油醚提取物是按如下方法制得的:取仁青常覺(jué)研細(xì)后的細(xì)粉或其配方藥材，以其重量數(shù)6倍體積的石油醚沸騰提取3次，每次I小時(shí)，40°C -50°C減壓回收石油醚，即得； B、乙酸乙酯提取物是按如下方法制得的:取仁青常覺(jué)研細(xì)后的細(xì)粉或其配方藥材，以其重量數(shù)6倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行沸騰提取3次，每次I小時(shí)，50°C -60°C減壓回收乙酸乙酯，即得； C、乙醇提取物是按如下方法制得的:取仁青常覺(jué)研細(xì)后的細(xì)粉或其配方藥材，以其重量數(shù)8倍體積的乙醇提取3次，每次1.5小時(shí)，50°C -60°C減壓回收回收乙醇，干燥，即得； D、水提取物是按如下方法制得的:取仁青常覺(jué)研細(xì)后的細(xì)粉或其配方藥材，以其重量數(shù)8倍體積的水煎煮2次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，濾液蒸干，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的仁青常覺(jué)在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用，所述藥學(xué)制劑為濃縮丸、糖衣片、薄膜包衣片`或膠囊。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103623144SQ201310669502
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】張義智, 單玉剛, 付素心, 彭坤, 馬寧 申請(qǐng)人:山東阿如拉藥物研究開發(fā)有限公司