一種可引導組織再生的生物膜及其制備方法
【專利摘要】一種可引導組織再生的生物膜及其制備方法，本發(fā)明是以膠原膜為支架，具有天然的三維空間結(jié)構(gòu)；在膠原膜的一面有氧化鋁或氧化鋯顆粒形成的保護層0.01~0.5μm厚；另一面有羥基磷灰石加固層0.01~0.1mm厚。與現(xiàn)有的單純膠原膜進行拉伸斷裂強度檢測對比，本發(fā)明生物膜的機械強度平均提高約7.5倍；經(jīng)動物修復實驗效果對比，單純的膠原膜在體內(nèi)降解時間為3～4w，本發(fā)明生物膜在體內(nèi)降解時間達到12w，并且未發(fā)生塌陷，生物膜通過加固層能緊密貼合在修復區(qū)域，未發(fā)生移位，在體內(nèi)能夠長時間保證新生組織的空間，具有良好的機械強度，能更大程度地為新骨生長提供良好的環(huán)境，新骨生成的高度與正常骨一致，明顯優(yōu)于對比的修復效果。
【專利說明】一種可引導組織再生的生物膜及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程學生物醫(yī)學材料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種可引導組織再生的生物膜及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]可引導組織 再生的生物膜主要用于修復組織缺損時的組織再生術(shù)，用其作為物理屏障，可以阻止周邊組織長入缺損區(qū)域，同時作為一種保護膜將缺損區(qū)域保護起來，為缺損區(qū)的組織生長預留空間。
[0003]早期的引導組織再生膜為不可吸收材料(以聚乙烯為代表)，這類材料使用時需要二次手術(shù)取出，給患者增加了痛苦。隨后研發(fā)出人工合成的可吸收材料(如聚乳酸、脂肪族聚酯等可降解聚合物)，其降解產(chǎn)物呈酸性，會引起嚴重的炎癥反應，不利于組織愈合，影響修復的最終效果。另外，還有一些天然高分子聚合物(如幾丁糖和殼聚糖制備的再生膜)，其機械性能和抗水性能較差，在體內(nèi)降解較快，不能很好地配合新生組織的生長。為解決這些問題，有采用化學交聯(lián)的方法來提高材料的可降解性，常用的交聯(lián)劑為戊二醛，但是交聯(lián)后試劑的殘存增加了膜材料的毒性。
[0004]目前，人們把重點集中在異種天然生物材料。這類材料來源于哺乳動物的膜組織，經(jīng)去抗原處理制備成片狀膜，主要成分為膠原蛋白，因此也稱膠原膜。膠原膜降解速度較快，在使用過程中隨著降解的進行，其韌性降低，并逐漸向缺損區(qū)域塌陷，無法有效保持缺損空間，影響了缺損區(qū)新生組織的生長及最終修復效果，尤其在缺損較大情況下尤為嚴重。
[0005]美國專利US058372中公開了一種具有雙層結(jié)構(gòu)的膠原膜，采用交聯(lián)方法來延緩膜的降解，并改善膜的機械性能。由于化學交聯(lián)會增加試劑殘留，而物理交聯(lián)(如熱交聯(lián))很難使膠原膜達到理想的機械性能，因此仍無法解決膠原膜降解時間過快，易形成塌陷的問題。中國專利申請201110145229.0中采用丙酮提高膜致密層的致密程度，也未能解決膜的機械性能問題。
[0006]研究發(fā)現(xiàn)，膜與缺損部位是否能夠充分貼合，直接影響最終的成骨效果，貼合越充分，新骨的生成量及成熟度越好。有臨床報道，由于膜表面光滑，使膜固定不充分而發(fā)生膜移位導致感染，最終治療失敗。而且膜材料在使用過程中，不能暴露于外界環(huán)境，否則會導致材料的加速降解，增加膜下新生組織感染的風險。
[0007]經(jīng)檢索，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于膜與缺損部位充分貼合技術(shù)措施的報道，有報道稱采用多層膜覆蓋進行預防，這意味著手術(shù)費用的增加，對患者造成經(jīng)濟和心理壓力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種可引導組織再生的生物膜及其制備方法，該生物膜具有天然的三維空間結(jié)構(gòu)和良好的機械性能，能夠為新生組織提供充足的空間，在使用過程中不易發(fā)生移位現(xiàn)象，并能誘導骨組織再生。
[0009]本發(fā)明提出的可引導組織再生的生物膜，是以膠原膜為支架，所述的膠原膜源自動物膜組織，具有天然的三維空間結(jié)構(gòu)，能夠為新生組織提供充足的空間；在膠原膜的一面有氧化鋁或氧化鋯顆粒形成的保護層，厚度為0.01-0.5Mffl ;另一面有羥基磷灰石加固層，厚度為0.01-0.1mm。保護層的作用是避免膠原膜直接暴露在外界環(huán)境下而導致加速降解；羥基磷灰石加固層的作用是羥基磷灰石能夠與缺損區(qū)域的骨組織形成化學鍵緊密結(jié)合，使膠原膜固定在骨組織處,不容易發(fā)生移位；同時，保護層和加固層都具有提高膠原膜機械性能的作用。[0010]本發(fā)明可引導組織再生的生物膜的制備方法，其特征在于，將動物膜組織經(jīng)過預處理得到具有天然細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的膠原膜；將氧化鋯或氧化鋁顆粒采用電泳的方法均勻鋪于膠原膜的一個表面，形成保護層；將無水氯化鈣和二水磷酸二氫鈉及乙醇的混合溶液在脈沖電流作用下電解，再與NaOH反應,于膠原膜的另一表面形成羥基磷灰石加固層，最后經(jīng)干燥、包裝、滅菌后得到可引導組織再生的生物膜。具體步驟包括:
步驟一、膜的預處理:將動物膜組織采用純水清洗干凈后，放入生理鹽水或PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)中振蕩清洗，再置入4°C環(huán)境中以0.5°C / min的速度降溫至_80°C，保持12小時，取出后置入PH 7.5^9.0的堿溶液中振蕩解凍，震蕩速率8(Tl00rpm ;清洗后置入75%體積比的酒精溶液中浸泡2小時，再以純水清洗，得到膜材料；
其中，對動物膜組織的凍融處理，使細胞內(nèi)形成冰結(jié)晶，細胞膜破裂，方便細胞碎片溶出，提高后續(xù)脫細胞和脫脂的效果；通過控制冷凍過程的降溫速率，可避免快速冷凍導致細胞內(nèi)冰結(jié)晶對細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞。
[0011]步驟二、膠原膜的制備
脫脂處理:將獲得的膜材料用脫脂棉包裹置于提取容器中，以丙酮為脫脂試劑，加熱并控制溫度在8(T10(TC，冷凝回流抽提2~3小時；將脫脂后的膜材料用純水清洗4-8次；
脫細胞處理:將清洗后的膜材料置入含葡聚糖的PBS緩沖液中(葡聚糖濃度按質(zhì)量比為4~10%)，用塑性袋密封，置入冷等壓靜壓機中，控制溫度為1(T30°C，以20Mpa/min的速度逐步加壓至500MPa，保持5min，再以同樣速度減壓，取出膜材料用PBS緩沖液清洗；再置于含0.1-θ.25Μ的NaOH和IM的NaCl的混合溶液中浸泡lh，轉(zhuǎn)入純水中浸泡lh，如此反復2次；最后用純水沖洗，得到膠原膜；其中，膜組織若為牛源性，需先在IM的NaOH溶液中浸泡Ih去除病毒，再轉(zhuǎn)入含葡聚糖的PBS緩沖液中浸泡；
脫脂采用索氏抽提法，以脫脂試劑對膜材料中的脂溶性物質(zhì)連續(xù)抽提處理，可以在短時間內(nèi)將材料中脂肪控制在1%以下；此外，這種方法節(jié)約了脫脂時間，并可對試劑回收，降低了脫脂成本。
[0012]脫細胞通過液體加壓的方法向膜組織施加壓力,可直接破壞組織細胞的細胞膜，釋放細胞成分，與細胞外基質(zhì)分離；據(jù)報道，在大于220MPa的壓力環(huán)境中，加壓會使水的凝固點上升，此時細胞內(nèi)可生成冰結(jié)晶(http://zhida0.baidu.com/question/118684849.html?qq-pf-to=pcqq.c2c),從而破壞細胞結(jié)構(gòu)，通過壓力、溫度以及中間介質(zhì)濃度的調(diào)整，既達到脫細胞效果，還能保護細胞外基質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)。
[0013]最后用NaOH和NaCl的混合溶液使細胞充分脫水，再置于純水中使細胞溶脹破裂，循環(huán)2次可以徹底洗脫組織中的細胞碎片。
[0014]步驟三、制備保護層:將步驟二得到的膠原膜鋪于鋼板作為電泳陰極，將氧化鋯或氧化鋁顆粒與去離子水按1: 3~15的質(zhì)量比混合，以超聲分散均勻后作為電泳液；進行電泳(直流電壓0.5~10V)，在膠原膜表面形成氧化鋯或氧化鋁保護層；其厚度可通過電壓和電泳液濃度的調(diào)節(jié)實現(xiàn)，電壓和電泳液濃度越高，保護層的厚度越大；
通常，使用膠原膜對傷口進行封閉修復，若出現(xiàn)封閉不嚴或傷口發(fā)炎等導致傷口裂開，使膠原膜暴露于外部環(huán)境，會加速膠原膜的降解；而保護層使膠原膜與外部環(huán)境隔離，避免加速降解，同時降低了新生組織的感染風險；氧化鋯和氧化鋁屬于生物惰性材料，性質(zhì)穩(wěn)定，具有良好的抗壓強度，在一定程度上還提高了膠原膜的機械性能。
[0015]步驟四、制備加固層:將步驟三得到的膠原膜有保護層的一面平鋪于鋼板為負極，碳棒接電源正極，電解液為含有0.004~0.42mol/L的無水氯化鈣和0.003~0.25mol/L的二水磷酸二氫鈉以及體積比為20%的乙醇的混合溶液；接脈沖直流電，電流密度為2mA/cm2,電壓為I~IOOmV,通電I分鐘后再斷電I分鐘，如此反復5~50次，在膠原膜表面形成磷酸鈣涂層；再經(jīng)純水清洗后，置于質(zhì)量體積比為0.4%~4%的NaOH溶液中浸泡3h，在膠原膜上形成羥基磷灰石加固層；用純水清洗后，經(jīng)真空干燥得到可引導組織再生的生物膜；電解液濃度越大、電壓越高、通斷電的周期次數(shù)越多，加固層的厚度就越大。 [0016]本發(fā)明在膠原膜的另一面制備加固層，其目的是:羥基磷灰石具有一定的抗壓強度，可以提高膠原膜的機械性能；其次，羥基磷灰石在體內(nèi)會降解，產(chǎn)生的鈣、磷離子可與周圍骨組織中的鈣、磷離子形成穩(wěn)定的化學鍵，因此，加固層可以使膠原膜與骨組織緊密貼合，不易發(fā)生移位；另外，鈣、磷離子是骨骼和牙齒的主要成分，能被機體吸收、引導骨組織再生。
[0017]本發(fā)明制備的可引導組織再生生物膜，針對現(xiàn)有膠原膜材料機械性能差、易塌陷、易移位以及不能暴露于外界環(huán)境等缺點，通過在膠原膜的表面形成氧化鋯或氧化鋁生物惰性材料的涂層，不僅能夠保護膠原膜免受外部環(huán)境的影響，還很大程度提高膠原膜的機械性能。通過在膠原膜的另一面形成羥基磷灰石加固層，羥基磷灰石中的鈣、磷成分溶解后與骨組織形成化學鍵，可以使膠原膜與骨組織緊密結(jié)合，不易發(fā)生移位；同時，羥基磷灰石可以誘導活骨組織的生長，加速修復進程。
[0018]通過對本發(fā)明制備的可引導組織再生生物膜與現(xiàn)有的單純膠原膜進行拉伸斷裂強度檢測，對比結(jié)果顯示，本發(fā)明生物膜的機械強度平均提高約7.5倍。并將這兩種膜進行兔顱骨缺損、兔尺骨缺損、犬拔牙窩填充、犬骨下袋的動物修復效果進行對比，發(fā)現(xiàn)單純的膠原膜在體內(nèi)降解時間為3~4w，本發(fā)明生物膜在體內(nèi)降解時間達到12w，并且未發(fā)生塌陷，生物膜通過加固層能緊密貼合在修復區(qū)域，未發(fā)生移位，在體內(nèi)能夠長時間保證新生組織的空間；有資料顯示人類骨形成的正常生理周期為17w，可見本發(fā)明生物膜具有良好的機械強度，能更大程度地為新骨生長提供良好的環(huán)境，新骨生成的高度與正常骨一致，明顯優(yōu)于對比的修復效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]附圖1為本發(fā)明可引導組織再生生物膜與現(xiàn)有的單純膠原膜的拉伸斷裂強度檢測結(jié)果對比圖。圖中a為膠原膜的檢測結(jié)果，圖中b為本發(fā)明生物膜的檢測結(jié)果。本發(fā)明生物膜的機械強度比現(xiàn)有的膠原膜提高了 7.5倍。
[0020]附圖2為本發(fā)明可引導組織再生生物膜與現(xiàn)有的單純膠原膜用于兔顱骨缺損修復的組織學結(jié)果對比照片。圖a為膠原膜的修復效果照片，可以看出缺損區(qū)域出現(xiàn)凹陷，以及凹陷處完全降解的膠原膜，說明單純的膠原膜降解過快，不能支撐缺損區(qū)域上方，而向缺損區(qū)域塌陷，影響了新生骨生成；圖b為本發(fā)明生物膜的修復效果照片，其缺損區(qū)域充滿了新生骨纖維組織，無凹陷現(xiàn)象，說明本發(fā)明生物膜可以穩(wěn)定地支撐缺損區(qū)域的上方，對缺損區(qū)起到保護作用，保證新骨的快速生長。
[0021]附圖3為本發(fā)明可引導組織再生生物膜與現(xiàn)有的單純膠原膜用于兔尺骨缺損修復的X線片觀察結(jié)果對比照片。圖a為膠原膜修復的效果照片，可以看出缺損區(qū)域與周圍正常骨相比有明顯凹陷，進一步證明單純的膠原膜降解過快，不能支撐缺損區(qū)域上方，而向缺損區(qū)域塌陷，影響了新生骨的生成；圖b為本發(fā)明生物膜修復的效果照片，其缺損區(qū)域與周圍正常骨的高度基本一致，證明生物膜可以穩(wěn)定地支撐缺損區(qū)域上方，為新骨的生成提供充足空間，新骨的高度與正常骨基本一致。
[0022]附圖4為本發(fā)明可引導組織再生生物膜與現(xiàn)有的單純膠原膜用于犬拔牙窩填充的X線片觀察結(jié)果對比照片。圖a為膠原膜的修復效果，可以看出拔牙區(qū)域有明顯的凹陷；圖b為本發(fā)明生物膜的修復效果，其新生骨的高度已基本達到正常骨的水平。說明單純的膠原膜降解過快導致的塌陷，對新骨生長是重要的影響因素。
[0023]附圖5為本發(fā)明可引導組織再生生物膜與現(xiàn)有的單純膠原膜用于犬骨下袋修復的組織學結(jié)果對比照片。圖a為膠原膜的修復效果，可以看出，缺損區(qū)域出現(xiàn)了空白區(qū)，其上方有大量的結(jié)締組織侵入，說明單純膠原膜的降解過快導致塌陷，影響了新骨生成，還會失去阻礙作用，導致結(jié)締組織侵入，形成長的結(jié)合上皮；圖b為本發(fā)明生物膜的修復效果，可以看出，新生骨已填滿缺損區(qū)，修復效果良好，證明本發(fā)明生物膜可以保證新骨的快速生長，與正常骨基本一致。
【具體實施方式】
[0024]以下結(jié)合實例對本發(fā)明技術(shù)方案及效果作進一步說明。實例中所采用的動物膜組織購于屠宰場，在去除膜組織附帶的脂肪等雜質(zhì)后，采用PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)或生理鹽水清洗除去血潰，再用純水清洗。
[0025]實例中采用的冷等壓靜壓機由太原市中平科技有限公司制造，工作室尺寸230X300mm，最高工作壓力600MPa，保壓時間壓力降(300s內(nèi))不超過5% ;電泳槽為北京六一儀器廠生產(chǎn)，型號為DYCZ-21 ;電解槽為河南普樂教育科技公司生產(chǎn)，型號為26023。
[0026]實施例1、
以牛心包膜為原料，按以下步驟制備引導組織再生生物膜。
[0027]步驟一、膜的預處理:將牛心包膜用純水清洗后，放入生理鹽水中振蕩清洗，再置入4°C環(huán)境中以0.50C / min的速度降溫至_80°C，保持12h，取出后置入pH8的碳酸鈉溶液中振蕩解凍，震蕩速率為90rpm ;清洗后置入75%體積比的酒精溶液中浸泡2h，再以純水清洗，得到膜材料；
步驟二、膠原膜的制備
脫脂處理:將獲得的膜材料用脫脂棉包裹置于提取容器中，以丙酮為脫脂試劑，加熱并控制溫度在85°C ;冷凝回流抽提2h ;取出脫脂后的膜材料，用純水清洗4次；
脫細胞處理:將清洗后的膜材料先在IM的NaOH溶液中浸泡lh，再置入含葡聚糖的PBS緩沖液中(葡聚糖濃度按質(zhì)量比為10%)，用塑性袋密封，置入冷等壓靜壓機中，控制溫度在10°c,以20Mpa/min的速度逐步加壓至500MPa，保持5min，再以同樣速度減壓，取出膜材料用PBS緩沖液清洗；然后置于含0.25M的NaOH和IM的NaCl的混合溶液中浸泡lh，轉(zhuǎn)入純水中浸泡lh，如此反復2次；最后用純水清洗，得到膠原膜；
步驟三、制備保護層:將得到的膠原膜鋪于鋼板作為電泳陰極，將氧化鋯顆粒與去離子水按1: 15的質(zhì)量比混合，以超聲分散均勻后作為電泳液；進行電泳(直流電電壓1.0V)，電泳液中氧化鋯顆粒逐漸向陰極移動，均勻平鋪于膠原膜的表面，形成氧化鋯保護層(厚度0.05Mm)；
步驟四、制備加固層:將步驟三得到的膠原膜有保護層的一面平鋪于鋼板為負極，膠原膜朝上，碳棒接電源正極，電解液為含有0.008mol/L的無水氯化鈣和0.005mol/L的二水磷酸二氫鈉以及體積比20%的乙醇的混合溶液；接脈沖直流電，電流密度2mA/cm2，電壓2mV，通斷電各I分鐘為一周期，反復50次，在膠原膜表面形成磷酸鈣(化學式CaHPO4.2H20)涂層，再經(jīng)純水清洗后，置于質(zhì)量體積比為0.8%的NaOH溶液中浸泡lh，在膠原膜上形成羥基磷灰石(化學式Caltl(PO4)6(OH)2)加固層(厚度0.015_)，用純水清洗后，經(jīng)真空干燥得到可引導組織再生的生物膜。
[0028]本實例制得的生物膜厚度為0.12mm,拉伸斷裂強度為190~210MPa，與單純的膠原膜材料相比，機械性能提高約7.5倍(參見附圖1)。該材料適用于各種原因引起的小范圍骨組織缺損，在修復過程中可以穩(wěn)定地覆蓋在缺損區(qū)上方，不會發(fā)生移位現(xiàn)象。
[0029]實施例2、
以豬腹膜為原料，按以下步驟制備引導組織再生生物膜。
[0030]步驟一、膜的預處理:將豬腹膜用純水清洗干凈后，放入生理鹽水中振蕩清洗；再置入4°C環(huán)境中以0.50C / min的速度降溫至_80°C，保持12h，取出后置入pH8.5的氫氧化鈉溶液中振蕩解凍，震蕩速率為80rpm ;清洗后置入75%體積比的酒精溶液中浸泡2h，再以純水清洗，得到膜材料；
步驟二、膠原膜的制備
脫脂處理:將獲得的膜材料用脫脂棉包裹置于提取容器中，以丙酮為脫脂試劑，加熱并控制溫度在90°C ;冷凝回流抽提3h ;取出脫脂后的膜材料，用純水清洗8次；
脫細胞處理:將清洗后的膜材料置入含葡聚糖的PBS緩沖液中(葡聚糖濃度按質(zhì)量比為6%)，用塑性袋密封，置入冷等壓靜壓機中，控制溫度在20°C，以20Mpa/min的速度逐步加壓至500MPa，保持5min，再以同樣速度減壓，取出膜材料用PBS緩沖液清洗；然后置于含
0.15M的NaOH和IM的NaCl的混合溶液中浸泡lh，轉(zhuǎn)入純水中浸泡lh，如此反復2次；最后用純水清洗，得到膠原膜；
步驟三、制備保護層:將得到的膠原膜鋪于鋼板為電泳陰極，將氧化鋯顆粒與去離子水按1: 10的質(zhì)量比混合，以超聲分散均勻后作為電泳液；進行電泳(直流電電壓5.0V)，電泳液中氧化鋯顆粒逐漸向陰極移動，均勻平鋪于膠原膜的表面，形成氧化鋯保護層(厚度
0.25Mm)；
步驟四、制備加固層:將步驟三得到的膠原膜有保護層的一面平鋪于鋼板為負極，膠原膜朝上，碳棒接電源正極，電解液為含有0.021mol/L的無水氯化鈣和0.013mol/L的二水磷酸二氫鈉以及體積比為20%的乙醇的混合溶液；接脈沖直流電，電流密度為2mA/cm2，電壓為5mV，通斷電各I分鐘為一周期，反復40次，在膠原膜表面形成磷酸鈣涂層，再經(jīng)純水清洗后，置于質(zhì)量體積比為2%的NaOH溶液中浸泡lh，在膠原膜上形成羥基磷灰石加固層(厚度0.05_)，用純水清洗后，經(jīng)真空干燥得到可引導組織再生的生物膜。
[0031]本實例制得的生物膜厚度為0.15mm。其足夠厚的保護層增加了材料在暴露時的穩(wěn)定性，非常適于在口腔中應用。該材料用于犬拔牙窩填充修復實驗，牙齦縫合時采取不完全封閉方式，將小部分膜材料暴露于口腔中，一月后取材觀察，發(fā)現(xiàn)該材料組的新生骨高度仍然可以達到與正常骨一致的效果，而單純的膠原膜材料組在手術(shù)區(qū)可以觀察到明顯的局部骨量生長不足(參見附圖2)。
[0032]實施例3、
以豬心包膜為原料，按以下步驟制備引導組織再生生物膜。
[0033]步驟一、膜的預處理:將豬心包膜用純水清洗干凈后，放入生理鹽水中振蕩清洗，再置入4°C環(huán)境中以0.50C / min的速度降溫至_80°C，保持12h，取出后置入pH8.5的碳酸鉀溶液中振蕩解凍，震蕩速率為85rpm ;清洗后置入75%體積比的酒精溶液中浸泡2h，再以純水清洗，得到膜材料；
步驟二、膠原膜的制備
脫脂處理:將獲得的膜材料用脫脂棉包裹并置于提取容器中，以丙酮為脫脂試劑，加熱并控制溫度在90°C ;冷凝回流抽提2.5h ;取出脫脂后的膜材料，用純水清洗8次；
脫細胞處理:將清洗后的膜材料置入含葡聚糖的PBS緩沖液中(葡聚糖濃度按質(zhì)量比為5%)，用塑性袋密封，置入冷等壓靜壓機中，控制溫度在30°C，以20Mpa/min的速度逐步加壓至500MPa，保持 5min，再以同樣速度減壓，取出膜材料用PBS緩沖液清洗；然后置于含0.2M的NaOH和IM的NaCl的混合溶液中浸泡lh，轉(zhuǎn)入純水中浸泡lh，如此反復2次；最后用純水沖洗，得到膠原膜；
步驟三、制備保護層:將得到的膠原膜鋪于鋼板作為電泳陰極，將氧化鋁顆粒與去離子水按1: 15的質(zhì)量比混合，以超聲分散均勻后作為電泳液；進行電泳(直流電電壓8.0V)，電泳液中氧化鋁顆粒逐漸向陰極移動，均勻平鋪于膠原膜的表面，形成氧化鋁保護層(厚度0.3Mm)；
步驟四、制備加固層:將步驟三得到的膠原膜有保護層的一面平鋪于鋼板為負極，膠原膜朝上，碳棒接電源正極，電解液為含有0.136mol/L的無水氯化鈣和0.081mol/L的二水磷酸二氫鈉以及體積比為20%的乙醇的混合溶液；接脈沖電流，電流密度為2mA/cm2，電壓為30mV,通斷電各I分鐘為一周期，反復8次，在膠原膜的表面形成磷酸鈣涂層，再經(jīng)純水清洗后，置于質(zhì)量體積比為2%的NaOH溶液中浸泡2h，在膠原膜上形成羥基磷灰石加固層(厚度0.03_)，用純水清洗后，經(jīng)真空干燥得到可引導組織再生的生物膜。
[0034]本實例制得的生物膜厚度為0.15mm，適用于淺層骨組織缺損修復，保護層與加固層增加了材料的穩(wěn)定性和可塑性，能使材料穩(wěn)定地支撐在缺損區(qū)。將該材料用于兔尺骨缺損修復，一月后的新生骨高度與正常骨一致，并與周圍骨組織整合良好，而單純的膠原膜材料組修復區(qū)出現(xiàn)空白，此為材料塌陷所致(參見附圖3 )。
[0035]實施例4、
以牛腹膜為原料，按以下步驟制備引導組織再生生物膜。
[0036]步驟一、膜的預處理:將牛腹膜用純水清洗后，放入PBS緩沖液中振蕩清洗；再置入4°C環(huán)境中以0.50C / min的速度降溫至_80°C，保持12h，取出后置入pH8的碳酸氫鉀溶液中振蕩解凍，震蕩速率為IOOrpm ;清洗后置入75%體積比的酒精溶液中浸泡2h，再以純水清洗，得到膜材料；
步驟二、膠原膜的制備
脫脂處理:將獲得的膜材料用脫脂棉包裹置于提取容器中，以丙酮為脫脂試劑，加熱并控制溫度在95°C ;冷凝回流抽提2h ;取出脫脂后的膜材料，用純水清洗5次；
脫細胞處理:將清洗后的膜材料在IM的NaOH水溶液中浸泡lh，然后置入含葡聚糖的PBS緩沖液中(葡聚糖濃度按質(zhì)量比為4%)，用塑性袋密封，置入冷等壓靜壓機中，控制溫度在15°C，以20Mpa/min的速度逐步加壓至500MPa，保持5min，再以同樣速度減壓，取出膜材料用PBS緩沖液清洗；然后置于含0.15M的NaOH和IM的NaCl的混合溶液中浸泡lh，轉(zhuǎn)入純水中浸泡lh，如此反復2次；最后用純水沖洗，得到膠原膜；
步驟三、制備保護層:將得到的膠原膜鋪于鋼板為電泳陰極，將氧化鋁顆粒與去離子水按1: 8的質(zhì)量比混合，以超聲分散均勻后作為電泳液；進行電泳(直流電電壓3.0V)，電泳液中氧化鋁顆粒逐漸向陰極移動，均勻平鋪于膠原膜的表面，形成氧化鋁保護層(厚度
0.25Mm)；
步驟四、制備加固層:將步驟三得到的膠原膜有保護層的一面平鋪于鋼板為負極，膠原膜朝上，碳棒接電源正極，電解液為含有0.21mol/L的無水氯化鈣和0.125mol/L的二水磷酸二氫鈉以及體積比為20%的乙醇的混合溶液；接脈沖直流電，電流密度2mA/cm2，電壓50mV，通斷電各I分鐘為一周期，反復11次，在膠原膜表面形成磷酸鈣涂層，再經(jīng)純水清洗后，置于質(zhì)量體積比為3%的NaOH溶液中浸泡2.5h，在膠原膜上形成羥基磷灰石加固層(厚度0.08_)，用純水清洗后，經(jīng)真空干燥得到可引導組織再生的生物膜。
[0037]本實例制得的生物膜厚度0.2mm，適用于大范圍骨組織缺損的修復，其加固層與骨組織表面之間形成充足的化學鍵，可以緊貼于缺損區(qū)上方，保證新骨的生長空間。將該材料用于兔顱骨缺損修復，一月后取材經(jīng)組織學觀察，其材料仍具有完整結(jié)構(gòu)，新生骨高度與正常骨一致，而單純的膠原膜材料由于固定不充分導致塌陷，骨量生長不足(參見附圖4)。
[0038]實施例5、
以豬小腸粘膜下層為原料，按以下步驟制備引導組織再生生物膜。
[0039]步驟一、膜的預處理:將豬小腸粘膜下層用純水清洗后，放入PBS緩沖液中振蕩清洗；再置入4°C環(huán)境中以0.50C / min的速度降溫至_80°C，保持12h，取出后置入pH8.5的磷酸鈉溶液中振蕩解凍，震蕩速率為85rpm ;清洗后置入75%體積比的酒精溶液中浸泡2h，再以純水清洗，得到膜材料；
步驟二、膠原膜的制備
脫脂處理:將獲得的膜材料用脫脂棉包裹置于提取容器中，以丙酮為脫脂試劑，加熱并控制溫度在90°C ;冷凝回流抽提3h ;取出脫脂后的膜材料，用純水清洗8次；
脫細胞處理:將清洗后的膜材料置入含葡聚糖的PBS緩沖液中(葡聚糖濃度按質(zhì)量比為5%)，用塑性袋密封，置入冷等壓靜壓機中，控制溫度在30°C，以20Mpa/min的速度逐步加壓至500MPa， 保持5min，再以同樣速度減壓，取出膜材料用PBS緩沖液清洗；然后置于含
0.1M的NaOH和IM的NaCl的混合溶液中浸泡lh，轉(zhuǎn)入純水中浸泡lh，如此反復2次；最后用純水沖洗，得到膠原膜；
步驟三、制備保護層:將得到的膠原膜鋪于鋼板作為電泳陰極，將氧化鋁顆粒與去離子水按1: 3的質(zhì)量比混合，以超聲分散均勻后作為電泳液；進行電泳(直流電電壓10V)，電泳液中氧化鋁顆粒逐漸向陰極移動，均勻平鋪于膠原膜的表面，形成氧化鋁保護層(厚度0.5Mm)；
步驟四、制備加固層:將步驟三得到的膠原膜有保護層的一面平鋪于鋼板為負極，膠原膜朝上，碳棒接電源正極，電解液為含有0.42mol/L的無水氯化鈣和0.25mol/L的二水磷酸二氫鈉以及體積比為20%的乙醇的混合溶液；接脈沖直流電，電流密度為2mA/cm2，電壓為IOOmV,通斷電各I分鐘為一周期，反復7次，在膠原膜表面形成磷酸鈣涂層，再經(jīng)純水清洗后，置于質(zhì)量體積比為4%的NaOH溶液中浸泡3h，在膠原膜上形成羥基磷灰石加固層(厚度0.1_)，用純水清洗后，經(jīng)真空干燥得到可引導組織再生的生物膜。
[0040]本實例制得的生物膜厚度為0.15mm，適用于深層骨組織缺損修復，加固層降解產(chǎn)生的鈣、磷離子分布在缺損區(qū)域，為新生骨組織的再生起到引導作用，能加快骨組織缺損的修復過程。將該材料 用于犬骨下袋修復實驗，一月后取材發(fā)現(xiàn)，新生骨與正常骨基本一致，而單純的膠原膜材料在骨缺損區(qū)有大量結(jié)締組織的侵入，影響新骨的生長(參見附圖5)。
【權(quán)利要求】
1.一種可引導組織再生的生物膜，其特征是以膠原膜為支架，所述的膠原膜源自動物膜組織，具有天然的三維空間結(jié)構(gòu)；在膠原膜的一面有氧化鋁或氧化鋯顆粒形成的保護層，厚度為0.Ο1~Ο.5Mm ;另一面有羥基磷灰石加固層，厚度為0.Ο1~Ο.1mm。
2.制備權(quán)利要求1所述的可引導組織再生生物膜的方法，其特征在于，將動物膜組織經(jīng)過預處理得到具有天然細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的膠原膜；將氧化鋯或氧化鋁顆粒采用電泳的方法均勻鋪于膠原膜的一個表面，形成保護層；將無水氯化鈣和二水磷酸二氫鈉及乙醇的混合溶液在脈沖電流作用下電解，再與NaOH反應，于膠原膜的另一表面形成羥基磷灰石加固層，最后經(jīng)干燥、包裝、滅菌后得到可引導組織再生的生物膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，具體步驟包括: 步驟一、膜的預處理:將動物膜組織采用純水清洗干凈后，放入生理鹽水或PBS緩沖液中振蕩清洗，再置入4°C環(huán)境中以0.5°C / min的速度降溫至-80°C，保持12小時，取出后置入pH 7.5^9.0的堿溶液中振蕩解凍，震蕩速率8(Tl00rpm ;清洗后置入體積濃度為75%的酒精溶液中浸泡2小時，再以純水清洗，得到膜材料； 步驟二、膠原膜的制備 脫脂處理:將獲得的膜材料用脫脂棉包裹置于提取容器中，以丙酮為脫脂試劑，加熱并控制溫度在8(T10(TC，冷凝回流抽提2~3小時；將脫脂后的膜材料用純水清洗4~8次； 脫細胞處理:將清洗后的膜材料置入含葡聚糖的PBS緩沖液中，用塑性袋密封，置入冷等壓靜壓機中，控制溫度為1(T30°C，以20Mpa/min的速度逐步加壓至500MPa，保持5min，再以同樣速度減壓，取出膜材料用PBS緩沖液清洗；再置于含0.1~θ.25Μ的NaOH和IM的NaCl的混合溶液中浸泡lh，轉(zhuǎn)入純水中浸泡lh，如此反復2次；最后用純水沖洗，得到膠原膜； 步驟三、制備保護層:將步驟二得到的膠原膜鋪于鋼板作為電泳陰極，將氧化鋯或氧化鋁顆粒與去離子水按1: 3~15的質(zhì)量比混合，以超聲分散均勻后作為電泳液；進行電泳，在膠原膜表面形成氧化鋯或氧化鋁保護層； 步驟四、制備加固層:將步驟三得到的膠原膜有保護層的一面平鋪于鋼板為負極，碳棒接電源正極，電解液為含有0.004~0.42mol/L的無水氯化鈣和0.003~0.25mol/L的二水磷酸二氫鈉以及體積比為20%的乙醇的混合溶液；接脈沖直流電，電流密度為2mA/cm2，電壓為I~IOOmV,通電I分鐘后再斷電I分鐘，如此反復5~50次，在膠原膜表面形成磷酸鈣涂層；再經(jīng)純水清洗后，置于質(zhì)量體積比為0.4%~4%的NaOH溶液中浸泡3h，在膠原膜上形成羥基磷灰石加固層；用純水清洗后，經(jīng)真空干燥得到可引導組織再生的生物膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟二的脫細胞處理中，所述的葡聚糖的濃度按質(zhì)量比為4~10%。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，若動物膜組織為牛源性，在步驟二的脫細胞處理中，需先在IM的NaOH溶液中浸泡Ih去除病毒，再轉(zhuǎn)入含葡聚糖的PBS緩沖液中浸泡。
【文檔編號】A61L31/12GK103721296SQ201310669263
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】劉芮廷 申請人:陜西瑞盛生物科技有限公司