用于體內(nèi)組織再生和重建的可注射多孔微載體材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了用于體內(nèi)組織再生和重建的可注射多孔微載體材料及其制備方法。一種聚多肽可注射多孔微載體材料的制備方法，其特征在于在無(wú)致孔劑或添加致孔劑的條件下，通過(guò)乳液法制備聚多肽的多孔可注射微載體。其中聚多肽濃度為0.1-1.0wt%，孔徑為20-60μm，孔隙率為80-90%。本發(fā)明首次提出以合成聚多肽類材料構(gòu)建多孔可注射微載體。聚多肽可注射微載體用于組織工程領(lǐng)域，能為細(xì)胞黏附和增殖提供更好的環(huán)境，能實(shí)現(xiàn)體內(nèi)組織再生和重建。
【專利說(shuō)明】用于體內(nèi)組織再生和重建的可注射多孔微載體材料及其制 備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種可注射多孔微載體材料及其制備方法，特別是一種用于體內(nèi)組織 再生和重建的可注射多孔微載體材料及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 微載體培養(yǎng)技術(shù)首先由Van Wezel于1967年提出，是目前國(guó)際上公認(rèn)進(jìn)行大規(guī)模 細(xì)胞培養(yǎng)最具發(fā)展前途的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。近年來(lái)，微載體在組織工程領(lǐng)域也倍受關(guān)注。微載 體作為可注射型支架用于組織工程具有一系列優(yōu)勢(shì)，包括維持細(xì)胞分化表型，免除外科手 術(shù)過(guò)程，縮小手術(shù)創(chuàng)傷和減輕病人痛苦等。制備微載體的材料有天然材料和合成材料。天 然材料有海藻酸鈉、瓊脂糖、明膠、透明質(zhì)酸、殼聚糖及膠原等。Chen等用乳液法制備了生 物相容性殼聚糖微載體作為生物材料用于組織工程細(xì)胞載體，但是天然材料具有來(lái)源批次 不穩(wěn)定、提取、純化過(guò)程可能受到污染、傳播疾病、機(jī)械性能差、理化性能不可控等缺點(diǎn)，限 制了其在組織工程中的應(yīng)用。常用合成材料有聚乳酸及其共聚物、聚己內(nèi)酯等。Newman等 制備出表面修飾LN同時(shí)裝載RA的聚乳酸微載體，研究了胚胎癌細(xì)胞P19在微載體表面生 長(zhǎng)，但此類材料降解產(chǎn)物通常為酸性，容易導(dǎo)致體內(nèi)局部溫度混亂并引發(fā)炎癥反應(yīng)。
[0003] 鑒于上述問(wèn)題，本發(fā)明采用結(jié)構(gòu)上類似人體蛋白質(zhì)，組成上類似細(xì)胞外基質(zhì)的聚 多肽材料作為制備微載體的新型生物材料。聚多肽材料是氨基酸通過(guò)肽鏈連接而成的聚合 物，其在體內(nèi)能被蛋白分解酶降解成單體氨基酸，降解產(chǎn)物是人體必需物質(zhì)，安全無(wú)毒，且 能被機(jī)體吸收。聚多肽材料由于具有良好的生物活性、生物相容性、生物可降解性、高親水 性、低抗原性或免疫原性等特點(diǎn)，已成為一類具有廣闊應(yīng)用前景的新型生物醫(yī)用材料。目前 關(guān)于這類微載體及其在組織工程領(lǐng)域應(yīng)用的研究未見(jiàn)報(bào)道，本發(fā)明嘗試制備含聚多肽的多 孔可注射微載體，并用于體內(nèi)組織再生，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含聚多肽微載體能顯著提高細(xì)胞黏 附、增殖能力，并能促進(jìn)體內(nèi)組織再生。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于體內(nèi)組織再生和重建的可注射多孔微載體 材料。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該微載體材料的制備方法。
[0006] 本發(fā)明提出的聚多肽可注射多孔微載體材料的制備方法，是在無(wú)致孔劑或添 加致孔劑的條件下，通過(guò)乳液法制備聚多肽的多孔可注射微載體。其中聚多肽濃度為 0· 1-1. Owt%，孔徑為 20-60 μ m，孔隙率為 80-90%。
[0007] 本發(fā)明中聚多肽為人工合成聚氨基酸酯類物質(zhì)。
[0008] 本發(fā)明中提出的聚多肽可注射多孔微載體材料的制備方法，具體步驟如下： 1.將聚乙烯醇（PVA)溶于去離子水配制成濃度為0.1-1 wt%的溶液，90-95 °C下攪拌 至PVA完全溶解后，自然冷卻至室溫，4°預(yù)冷； 2. 將聚多肽溶于二氯甲烷中配制濃度為0.1-1 wt%的溶液，室溫下攪拌至聚多肽完全 溶解，得無(wú)色透明溶液； 3. 將步驟1所得100 mL預(yù)冷PVA溶液置于冰水浴中，攪拌下將步驟2所得20 mL聚多 肽聚合物溶液快速加入到PVA溶液中，機(jī)械攪拌下至二氯甲烷完全揮發(fā)，過(guò)濾，去離子水洗 滌除去PVA后，即得到多孔微載體。
[0009] 本發(fā)明通過(guò)上述的制備方法得到用于體內(nèi)組織再生和重建的可注射微載體，該微 載體材料包括聚氨基酸甲酯、聚氨基酸乙酯和聚氨基酸芐酯材料；所述聚多肽材料通過(guò)冷 乳液法制備多孔復(fù)合微載體；所述多孔復(fù)合微載體可作為細(xì)胞微載體用于體內(nèi)組織再生和 重建。
[0010] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：首次提出以合成聚多肽類材料構(gòu)建多孔可注射微載體。 微載體具有多孔結(jié)構(gòu)，能負(fù)載大量細(xì)胞，具有良好的細(xì)胞相容性和組織相容性。將聚多肽可 注射微載體用于組織工程領(lǐng)域，能為細(xì)胞黏附和增殖提供更好的環(huán)境，能實(shí)現(xiàn)體內(nèi)組織再 生和重建。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為聚多肽可注射多孔微載體的掃描電子顯微鏡照片。如圖所示微載體具 有良好球形結(jié)構(gòu)和疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔洞連續(xù)貫通，孔徑與孔隙率的范圍也在20-60 μ m和 80-90%。
[0012] 圖2為聚多肽可注射多孔微載體上生長(zhǎng)的熒光共聚焦圖。綠色熒光點(diǎn)表明軟骨細(xì) 胞在微載體上生產(chǎn)情況。左圖為細(xì)胞生長(zhǎng)1 d的熒光共聚焦圖，細(xì)胞最先黏附在微載體表 面；右圖為細(xì)胞生長(zhǎng)7 d的熒光共聚焦圖，如圖所示細(xì)胞充滿微載體表面和內(nèi)部。隨著接種 培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，綠色熒光點(diǎn)數(shù)目增多，表明軟骨細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增殖。
[0013] 圖3為聚多肽可注射多孔微載體用于軟骨再生的數(shù)碼相片。由圖可知，經(jīng)裸鼠皮 下注射并體內(nèi)培養(yǎng)8周后，形成了具有半透明白色、光滑表面及彈性類軟骨組織，組織表面 沒(méi)有發(fā)現(xiàn)大塊帶血管組織及不正常組織。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的用于體內(nèi)組織再生和重 建的可注射多孔微載體材料及其制備方法進(jìn)行說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍不受以下實(shí)施例的 限制。
[0015] 實(shí)施例1 : 1.將聚乙烯醇（PVA)溶于去離子水配制成濃度為1 wt%的溶液，90-95 °C下攪拌至PVA 完全溶解后，自然冷卻至室溫，4°C預(yù)冷。
[0016] 2.將聚氨基酸甲酯溶于二氯甲烷中配制濃度為1 wt%的溶液，室溫下攪拌至聚氨 基酸甲酯完全溶解，得無(wú)色透明溶液；將步驟1所得l〇〇mL預(yù)冷PVA溶液置于冰水浴中，攪 拌下將20mL聚氨基酸甲酯溶液快速加入到PVA溶液中，機(jī)械攪拌下至二氯甲烷完全揮發(fā)， 過(guò)濾，去離子水洗滌除去PVA后，即得到多孔微載體。
[0017] 實(shí)施例2: 1.將聚乙烯醇（PVA)溶于去離子水配制成濃度為1 wt%的溶液，90-95 °C下攪拌至PVA 完全溶解后，自然冷卻至室溫，4°C預(yù)冷。
[0018] 2.將聚氨基酸甲酯溶于二氯甲烷中配制濃度為0.5 wt%的溶液，室溫下攪拌至聚 氨基酸甲酯完全溶解，得無(wú)色透明溶液；將步驟1所得l〇〇mL預(yù)冷PVA溶液置于冰水浴中， 攪拌下將20mL聚氨基酸甲酯溶液快速加入到PVA溶液中，機(jī)械攪拌下至二氯甲烷完全揮 發(fā)，過(guò)濾，去離子水洗滌除去PVA后，即得到多孔微載體。
[0019] 實(shí)施例3: 1.將聚乙烯醇（PVA)溶于去離子水配制成濃度為1 wt%的溶液，90-95 °C下攪拌至PVA 完全溶解后，自然冷卻至室溫，4°C預(yù)冷。
[0020] 2.將聚氨基酸甲酯溶于二氯甲烷中配制濃度為0.1 wt%的溶液，室溫下攪拌至聚 氨基酸甲酯完全溶解，得無(wú)色透明溶液；將步驟1所得l〇〇mL預(yù)冷PVA溶液置于冰水浴中， 攪拌下將20mL聚氨基酸甲酯溶液快速加入到PVA溶液中，機(jī)械攪拌下至二氯甲烷完全揮 發(fā)，過(guò)濾，去離子水洗滌除去PVA后，即得到多孔微載體。
[0021] 實(shí)施例4: 1.將聚乙烯醇（PVA)溶于去離子水配制成濃度為1 wt%的溶液，90-95 °C下攪拌至PVA 完全溶解后，自然冷卻至室溫，4°C預(yù)冷。
[0022] 2.將聚氨基酸乙酯溶于二氯甲烷中配制濃度為1 wt%的溶液，室溫下攪拌至聚氨 基酸乙酯完全溶解，得無(wú)色透明溶液；將步驟1所得100mL預(yù)冷PVA溶液置于冰水浴中，攪 拌下將20mL聚氨基酸乙酯溶液快速加入到PVA溶液中，機(jī)械攪拌下至二氯甲烷完全揮發(fā)， 過(guò)濾，去離子水洗滌除去PVA后，即得到多孔微載體。
[0023] 實(shí)施例5 : 1.將聚乙烯醇（PVA)溶于去離子水配制成濃度為1 wt%的溶液，90-95 °C下攪拌至PVA 完全溶解后，自然冷卻至室溫，4°C預(yù)冷。
[0024] 2.將聚氨基酸乙酯溶于二氯甲烷中配制濃度為0.5 wt%的溶液，室溫下攪拌至聚 氨基酸乙酯完全溶解，得無(wú)色透明溶液；將步驟1所得100mL預(yù)冷PVA溶液置于冰水浴中， 攪拌下將20mL聚氨基酸乙酯溶液快速加入到PVA溶液中，機(jī)械攪拌下至二氯甲烷完全揮 發(fā)，過(guò)濾，去離子水洗滌除去PVA后，即得到多孔微載體。
[0025] 實(shí)施例6 : 1.將聚乙烯醇（PVA)溶于去離子水配制成濃度為1 wt%的溶液，90-95 °C下攪拌至PVA 完全溶解后，自然冷卻至室溫，4°C預(yù)冷。
[0026] 2.將聚氨基酸乙酯溶于二氯甲烷中配制濃度為0.1 wt%的溶液，室溫下攪拌至 聚氨基酸乙酯完全溶解，得無(wú)色透明溶液；將步驟1所得100 mL預(yù)冷PVA溶液置于冰水浴 中，攪拌下將20mL聚氨基酸乙酯溶液快速加入到PVA溶液中，機(jī)械攪拌下至二氯甲烷完全 揮發(fā)，過(guò)濾，去離子水洗滌除去PVA后，即得到多孔微載體。
[0027] 實(shí)施例7 : 1.將聚乙烯醇（PVA)溶于去離子水配制成濃度為1 wt%的溶液，90-95 °C下攪拌至PVA 完全溶解后，自然冷卻至室溫，4°C預(yù)冷。
[0028] 2.將聚氨基酸芐酯溶于二氯甲烷中配制濃度為1 wt%的溶液，室溫下攪拌至聚氨 基酸芐酯完全溶解，得無(wú)色透明溶液；將步驟1所得l〇〇mL預(yù)冷PVA溶液置于冰水浴中，攪 拌下將20mL聚氨基酸芐酯溶液快速加入到PVA溶液中，機(jī)械攪拌下至二氯甲烷完全揮發(fā)， 過(guò)濾，去離子水洗滌除去PVA后，即得到多孔微載體。
[0029] 實(shí)施例8 : 1.將聚乙烯醇（PVA)溶于去離子水配制成濃度為1 wt%的溶液，90-95 °C下攪拌至PVA 完全溶解后，自然冷卻至室溫，4°C預(yù)冷。
[0030] 2.將聚氨基酸芐酯溶于二氯甲烷中配制濃度為0.5 wt%的溶液，室溫下攪拌至聚 氨基酸芐酯完全溶解，得無(wú)色透明溶液；將步驟1所得l〇〇mL預(yù)冷PVA溶液置于冰水浴中， 攪拌下將20mL聚氨基酸芐酯溶液快速加入到PVA溶液中，機(jī)械攪拌下至二氯甲烷完全揮 發(fā)，過(guò)濾，去離子水洗滌除去PVA后，即得到多孔微載體。
[0031] 實(shí)施例9: 1.將聚乙烯醇（PVA)溶于去離子水配制成濃度為1 wt%的溶液，90-95 °C下攪拌至PVA 完全溶解后，自然冷卻至室溫，4°C預(yù)冷。
[0032] 2.將聚氨基酸芐酯溶于二氯甲烷中配制濃度為0. 1 wt%的溶液，室溫下攪拌至聚 氨基酸芐酯完全溶解，得無(wú)色透明溶液；將步驟1所得l〇〇mL預(yù)冷PVA溶液置于冰水浴中， 攪拌下將20mL聚氨基酸芐酯溶液快速加入到PVA溶液中，機(jī)械攪拌下至二氯甲烷完全揮 發(fā)，過(guò)濾，去離子水洗滌除去PVA后，即得到多孔微載體。
[0033] 實(shí)施例10 :100 mL培養(yǎng)皿中，5 X 106個(gè)軟骨細(xì)胞與1 mL微球密度進(jìn)行混合，并加 入含10 mL DMEM的20% FBS。然后，在培養(yǎng)箱中以75 rpm轉(zhuǎn)速振搖培養(yǎng)皿6 h，再加入20 mL培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至37 °C、5% C02、100%飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)長(zhǎng)期培養(yǎng)，以后隔日更換培養(yǎng)液。
[0034] 實(shí)施例11:將多孔微載體與軟骨細(xì)胞懸液混合，并注射到7 d齡裸鼠皮下。每只 裸鼠背部?jī)蛇呌?3號(hào)針頭注射2次，每次分別含有2 X106個(gè)細(xì)胞（0.5 mL)與1 mg微載 體的細(xì)胞微載體復(fù)合物，共注射18只小鼠，八周后，將裸鼠皮下新生成的軟骨組織分別用 甲苯胺藍(lán)染色，免疫組織化學(xué)染色用于生化分析。
[0035] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種聚多肽可注射多孔微載體材料的制備方法，其特征在于在無(wú)致孔劑或添 加致孔劑的條件下，通過(guò)乳液法制備聚多肽的多孔可注射微載體；其中聚多肽濃度為 0· 1-1. Owt%，孔徑為 20-60 μ m，孔隙率為 80-90%。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1述的聚多肽可注射多孔微載體材料，其特征在于所述的聚多肽為 人工合成聚氨基酸酯類物質(zhì)，如聚谷氨酸甲酯、乙酯、芐酯等；聚賴氨酸甲酯、乙酯、芐酯等； 聚精氨酸甲酯、乙酯、芐酯等及其它類聚氨基酸酯類。
3. 根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1述的聚多肽聚合物制備多孔微載體的制備方法，其特征在于具 體步驟如下： (1) .將聚乙烯醇（PVA)溶于去離子水配制成濃度為0.1-1. 0 wt%的溶液，90-95 °C下 攪拌至PVA完全溶解后，自然冷卻至室溫，4 °C預(yù)冷； (2) .將聚多肽溶于二氯甲烷中配制濃度為0.1-1. 0 wt%的溶液，室溫下攪拌至聚多肽 完全溶解，得無(wú)色透明溶液； (3) .將步驟1所得100 mL預(yù)冷PVA溶液置于冰水浴中，攪拌下將步驟2所得20mL聚 多肽聚合物溶液快速加入到PVA溶液中，機(jī)械攪拌下至二氯甲烷完全揮發(fā)，過(guò)濾，去離子水 洗滌除去PVA后，即得到多孔微載體。
【文檔編號(hào)】A61L27/44GK104147645SQ201410210634
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月19日
【發(fā)明者】尹靜波, 方建軍, 張坤璽, 鄒佩云, 崔磊 申請(qǐng)人:上海大學(xué)