一種引導(dǎo)牙周組織再生術(shù)生物膜及其制備方法和應(yīng)用
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物膜制備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種引導(dǎo)牙周組織再生術(shù)生物膜及其制備方法和應(yīng)用。
【【背景技術(shù)】】
[0002]牙周炎是人類牙齒丟失的首要病因。牙周組織再生是牙周病治療的最終目的，但傳統(tǒng)的牙周潔治和刮治等基礎(chǔ)治療，只能消除病因，不能修復(fù)已經(jīng)喪失的牙周組織。引導(dǎo)組織再生術(shù)牙周治療中的常用方法，是在牙周手術(shù)中利用膜性材料作為屏障，阻擋牙齦上皮在愈合過程中沿根面生長，阻擋牙齦結(jié)締組織與根面接觸，并提供一定的空間，引導(dǎo)具有形成新附著能力的牙周膜細(xì)胞優(yōu)先占領(lǐng)根面，從而在已暴露于牙周袋內(nèi)的根面上形成新的牙骨質(zhì)，并有牙周膜纖維埋入，形成牙周組織的再生，即形成新附著性愈合。
[0003]用于引導(dǎo)組織再生術(shù)的膜性材料可分為兩類:不可吸收性膜和可吸收性膜。B1-Gide膠原膜為一種可吸收生物膜，不需要二次手術(shù)取出，它能有效阻擋牙齦結(jié)締組織長入牙周膜，有利于牙周膜細(xì)胞形成新的附著。但是，對于一些重度牙周炎患者，B1-Gide膜引導(dǎo)組織再生的程度往往不甚理想，一部分原因是重度牙周炎患者其牙周膜及牙槽骨等牙周組織喪失過多，很難引導(dǎo)其恢復(fù)到正常水平，另一部分原因是局部的厭氧環(huán)境使得生物膜易于被細(xì)菌污染，從而造成手術(shù)失敗。
[0004]牙周膜干細(xì)胞是從牙周膜組織中分離出的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，該細(xì)胞可分化成牙周的三種組織:牙槽骨、牙周膜和牙骨質(zhì)，被認(rèn)為是牙周組織工程的首選種子細(xì)胞。將牙周膜干細(xì)胞接種到B1-Gide膜用于牙周引導(dǎo)組織再生術(shù)，可提高引導(dǎo)組織再生術(shù)后牙周組織再生的程度。因此，功能性的接種牙周膜干細(xì)胞的B1-Gide復(fù)合生物膜具有非常可觀的臨床應(yīng)用前景。
[0005]然而，在該復(fù)合生物膜植入早期，其內(nèi)部缺乏新生的血管，膜內(nèi)部的細(xì)胞將難以通過滲透作用獲得營養(yǎng)和氧分的支持。如何能夠保證膜內(nèi)的牙周膜干細(xì)胞能夠保持良好的活性和功能狀態(tài)，并改善局部的厭氧環(huán)境，提高牙周組織再生術(shù)的成功率，成為了目前一個急需要解決的問題。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種引導(dǎo)牙周組織再生術(shù)生物膜及其制備方法和應(yīng)用，該生物膜可提高牙周組織再生的效率，解決了現(xiàn)有生物膜引導(dǎo)牙周組織再生時出現(xiàn)的早期氧供不足問題。
[0007]本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案包括以下步驟:
[0008]一種引導(dǎo)牙周組織再生術(shù)生物膜的制備方法，包括以下步驟:
[0009]分別培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞及制備無菌富氧的全氟三乙胺乳液，將二者混合制成每毫升全氟三乙胺乳液中104_108個干細(xì)胞的細(xì)胞-全氟三乙胺乳液，將制得的細(xì)胞-全氟三乙胺乳液接種于生物膜片上培養(yǎng)，終止培養(yǎng)后，即得到引導(dǎo)牙周組織再生術(shù)生物膜。
[0010]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞的步驟具體為:
[0011]1.1)人牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng):取因正畸或阻生而拔除的牙體牙周均健康的新鮮牙齒，在超凈工作臺內(nèi)冠根單向刮取根中1/3牙周膜組織，修剪成為l_Xl_Xlmm的組織±夬，用lmg/mL的I型膠原酶置于37°C消化30min，將組織塊均勻接種于6孔板內(nèi)，蓋無菌蓋玻片，滴加含10% FBS和青鏈霉素的α -MEM培養(yǎng)基，置于37°C、5% C02飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)10-15天，每2天換液，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時，胰酶消化傳代；
[0012]1.2)分離和純化人牙周膜干細(xì)胞:用有限稀釋法克隆培養(yǎng)分離的人牙周膜干細(xì)胞:取步驟1.1得到的細(xì)胞用α -MEM制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為ΙΟ/mL以下，接種于96孔板，每孔0.lmL，放入37°C、5% C02飽和濕度條件的培養(yǎng)箱，12h后待細(xì)胞貼壁后鏡下觀察標(biāo)記含單個細(xì)胞的孔，補(bǔ)加0.2mL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3天換液；當(dāng)細(xì)胞形成克隆并長至孔底40%時，胰酶消化，擴(kuò)大培養(yǎng)，即得人牙周膜干細(xì)胞。
[0013]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，還包括步驟1.3)人牙周膜干細(xì)胞的鑒定:將經(jīng)步驟1.2)培養(yǎng)出的人牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行克隆形成實驗、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)分析及多向誘導(dǎo)分化實驗；要求細(xì)胞的克隆形成率高于12%，免疫化學(xué)染色STR0-1和CD146陽性率高于30%，流式細(xì)胞術(shù)分析STR0-1和⑶146陽性率高于85%，多向分化實驗可誘導(dǎo)細(xì)胞成骨和成脂。
[0014]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的制備無菌富氧的全氟三乙胺乳液的步驟具體為:
[0015]2.1)稱取蛋黃卵磷脂加入到Tyrode鹽緩沖液內(nèi)，配制成質(zhì)量體積百分比濃度為15%?16.6%的蛋黃卵磷脂與Tyrode鹽緩沖液的混合溶液，于280W?320W功率下，超聲乳化1?3次，每次超聲10?20秒，每兩次超聲乳化之間間隔1分鐘，制備得基礎(chǔ)乳液；
[0016]2.2)另取全氟三乙胺原液，將經(jīng)步驟2.1)制備出的基礎(chǔ)乳液與全氟三乙胺原液按20:1-1:20的體積比混合，于280W?320W功率下，超聲乳化8?12次，每次超聲10?20秒，每兩次超聲乳化之間間隔1分鐘，制備出可溶于水的全氟三乙胺乳液；
[0017]2.3)、將經(jīng)步驟2.2)制備的全氟三乙胺乳液放入高壓氧艙內(nèi)8min?12min，使全氟三乙胺乳液充分溶解氧氣，使其達(dá)到飽和狀態(tài)；
[0018]2.4)、采用濾膜孔徑不大于0.65 μ m的濾器對經(jīng)步驟2.3)處理后的全氟三丁胺乳液進(jìn)行過濾除菌處理，得到無菌富氧的全氟三丁胺乳液。
[0019]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的制備細(xì)胞-全氟三乙胺乳液的步驟具體為:將培養(yǎng)狀態(tài)良好的牙周膜干細(xì)胞，加入到制備的全氟三乙胺乳液中，制成每毫升104_108個細(xì)胞的全氟三乙胺乳液，即細(xì)胞-全氟三乙胺乳液。
[0020]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的生物膜片上培養(yǎng)步驟具體為:將剪成1.5cmX 1.5cm生物膜片置于24孔板上，取細(xì)胞-全氟三乙胺乳液接種于生物膜片上，培養(yǎng)8-48h后終止培養(yǎng)。
[0021]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的生物膜片為B1-Gide膠原膜。
[0022]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的全氟三乙胺原液質(zhì)量濃度大于98%。
[0023]上述的方法制得的引導(dǎo)牙周組織再生術(shù)生物膜。
[0024]一種引導(dǎo)牙周組織再生術(shù)生物膜在牙周病損部位引導(dǎo)牙周組織再生中的應(yīng)用。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0026]本發(fā)明一種引導(dǎo)牙周組織再生術(shù)生物膜的制備方法，選擇生物膜、全氟三丁胺(Perfluorotributylamine, PFTBA)水凝膠及牙周膜干細(xì)胞，其中將PFTBA作為增氧劑，為植入B1-Gide膠原膜內(nèi)的牙周膜干細(xì)胞提供早期的氧供，提高了牙周膜干細(xì)胞的存活率，保持了牙周膜干細(xì)胞的活性和功能，從而最大限度的發(fā)揮引導(dǎo)牙周組織再生的能力，促進(jìn)了牙周組織的再生和恢復(fù)。本發(fā)明的引導(dǎo)牙周組織再生生物膜制備方法通過改善膜內(nèi)的乏氧環(huán)境，在提高牙周膜干細(xì)胞植入后早期的存活效率的同時，抑制局部厭氧菌的滋生，極大的降低了引導(dǎo)組織再生術(shù)的失敗率，提高了成功率，具有很好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。
[0027]本發(fā)明一種引導(dǎo)牙周組織再生術(shù)生物膜，采用牙周膜干細(xì)胞的復(fù)合可提高牙周組織再生的效率，采用全氟三乙胺解決了現(xiàn)有生物膜引導(dǎo)牙周組織再生時出現(xiàn)的早期氧供不足問題。
[0028]應(yīng)用本發(fā)明的引導(dǎo)牙周組織再生生物膜在進(jìn)行引導(dǎo)牙周組織再生術(shù)的過程中，牙周膜干細(xì)胞可分化為牙周組織，提高了本生物膜促進(jìn)牙周組織再生的效率。
【【附圖說明】】
[0029]圖1是本發(fā)明的制備方法原理圖。
[0030]圖2是本發(fā)明的再生膜可顯著促進(jìn)牙周組織愈合驗證對比圖。
【【具體實施方式】】
[0031]如圖1所示，本發(fā)明的全氟三乙胺乳液與牙周膜干細(xì)胞復(fù)合的引導(dǎo)牙周組織再生術(shù)生物膜制備方法，具體按照以下步驟實施:
[0032]步驟1、人牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)與純化:
[0033]1.1人牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng):取12-45歲之間因正畸或阻生而拔除的牙體牙周均健康的新鮮牙齒，立即在超凈工作臺內(nèi)冠根單向刮取根中1/3牙周膜組織，修剪成為1mmX 1mmX 1mm大小的組織塊，用I型膠原酶(lmg/mL)置于37°C消化30min，將組織塊均勾接種于6孔板內(nèi)，蓋無菌蓋玻片，滴加含10% FBS和青鏈霉素的α -MEM培養(yǎng)基，置于37°C、5% C02飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)10-15天，每2天換液。待細(xì)胞達(dá)到80%融合時，胰酶消化傳代。
[0034]1.2分離和純化人牙周膜干細(xì)胞:用有限稀釋法克隆培養(yǎng)分離的人牙周膜干細(xì)胞:取上述細(xì)胞用α -MEM制成單細(xì)胞