用于牙組織再生的組合物和方法
【專利說明】用于牙組織再生的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2013年6月5日申請的美國臨時申請系列號61/831,595及2013年 3月21日申請的美國臨時申請系列號61/804, 138的權(quán)益，每個申請全文引入本文作參考。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明
[0004] 本發(fā)明是在政府資助下完成的，所述資助為由NationalInstitutesofHealth/ NationalInstituteofDentalandCraniofacialResearch頒發(fā)的基金5RC2DE020767， 及由TheNationalInstitutesofHealth頒發(fā)的基金R01DE15391。政府在本發(fā)明中具有 一定權(quán)利。
[0005] 引入作參考的材料
[0006] 作為本發(fā)明的一部分的序列表包括計算機可讀形式，其含有本發(fā)明的核苷酸和/ 或氨基酸序列。序列表的主題全文引入本文作參考。
[0007] 發(fā)明背景
[0008] 牙齒是生物學可存活的，這主要是由于牙髓。目前，患病的、缺失的或創(chuàng)傷的牙髓 是通過用惰性合成材料覆蓋或置換。最常用的充填材料是杜仲膠，這是橡膠基質(zhì)的熱塑性 聚合物。在除去已經(jīng)患病、缺失或創(chuàng)傷的天然牙髓后，將杜仲膠熔化并注入以充填根管。盡 管牙髓或根管處理已經(jīng)是當代牙科醫(yī)學領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，但是仍具有對于患者的生活質(zhì)量 有不利影響的一些缺點（Salvietal. 2007)。首先，經(jīng)根管治療的牙趨于易碎，且容易斷 裂。其次，在根管治療后通常發(fā)生牙齒變色。其經(jīng)過根管治療而發(fā)生牙齒變色的患者通常 需要額外的高價牙齒美容程序。第三，脫落的牙齒（乳牙）的患病的、缺失的或感染的牙髓 通常缺乏治療選擇，且通常不適于根管治療。牙髓壞死在85-96 %的撕脫牙及70-100 %侵 入牙（intrudedteeth)中發(fā)生。未處理的或不良處理的牙感染可以導致全身性感染（Shay 2002；Brennanetal. 2007)〇
[0009] 理想地，一種改良的用于患病、缺失或創(chuàng)傷牙髓的治療方式使得生物學活組織得 以恢復。組織工程技術(shù)已經(jīng)用于開發(fā)恢復顱面組織和骨的方法和組合物。見例如Alhadlaq andMao, 2003；EdwardsandMason, 2006；Fongetal. , 2005；GoldbergandSmith, 2004 ； HongandMao, 2004；Lovschalletal. , 2001；Maoetal. , 2006；Mathieuetal. , 2006 ； Murrayetal. , 2002；Murrayetal. , 2007；NakashimaandAlamine, 2005；Nakashimaand Reddi, 2003;StosichandMao, 2007;Youngetal. , 2002;美國專利No. 5, 885, 829 ;及美國 專利申請公開20050079470。大多數(shù)技術(shù)包括使用支架材料，其包含哺乳動物細胞如牙髓干 細胞或者間充質(zhì)干細胞，和/或生物活性成分如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)。將細胞接種于支架 材料上的技術(shù)具有難以制備和貯存的缺點，因為活細胞必須在支架上接種、培養(yǎng)和維持。此 外，用于組織再生中的細胞的來源和產(chǎn)量不足。
[0010] 將祖細胞誘導成成牙本質(zhì)細胞（0d)的關(guān)鍵因素尚未知。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 在本發(fā)明的各個方面中，提供了用于再生牙組織的組合物和方法。
[0013] 本發(fā)明一方面提供了用于再生牙組織的組合物。在一些實施方案中，組合物包含 基質(zhì)或支架（例如包含水凝膠的基質(zhì)或支架）和治療有效量的Wnt3a多肽和骨形態(tài)發(fā)生蛋 白7(BMP-7)。在一些實施方案中，組合物包含治療有效量的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)、堿 性成纖維細胞生長因子（bFGF)或者神經(jīng)生長因子（NGF)。在一些實施方案中，組合物不包 含活細胞。在一些實施方案中，基質(zhì)或支架包含Wnt3a和BMP-7,及任選存在的VEGF、bFGF 或NGF。所述組合物的其它特征在下文使用方法中論述。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解這種特征可 同樣用于組合物自身。
[0014] 本發(fā)明另一方面提供了用于再生牙組織的方法。在一些實施方案中，所述方法包 括提供上述組合物，及將組合物插入哺乳動物牙齒的天然或人工的洞或腔室中。在一些實 施方案中，所述組合物促進祖細胞的成牙本質(zhì)細胞分化，促進祖細胞迀移至牙組織中，促進 血管發(fā)生性、牙發(fā)生性、纖維發(fā)生性或者神經(jīng)發(fā)生性發(fā)育，以再生牙組織。在一些實施方案 中，所述組合物再生血管化牙髓組織或者再生新牙本質(zhì)（neodentin)。
[0015] 在一些實施方案中，所述支架進一步包括選自如下的化合物：血小板衍生生長因 子（PDGF)、內(nèi)皮細胞生長因子（ECGF)、轉(zhuǎn)化生長因子1 (TGF-P1)、表皮生長因子（EGF)、 肝細胞生長因子（HGF)、基質(zhì)細胞衍生的因子-l(SDFl)、除了BMP-7之外的骨形態(tài)發(fā)生 蛋白（BMP)、TGF-P、生長和分化因子（GDF)、胰島素樣生長因子-l(IGFl)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋 白、牙本質(zhì)涎蛋白、骨涎蛋白、牙釉蛋白、整聯(lián)蛋白、血管生成素（angiogenin)、血管形成 素-l(angi〇p〇ietin-l)、del-1、卵泡抑素、粒細胞集落刺激因子（G-CSF)、肝細胞生長因 子/散射因子（HGF/SF)、白細胞介素-8 (IL-8)、瘦素、中期因子、胎盤生長因子、血小板衍 生內(nèi)皮細胞生長因子（PD-ECGF)、血小板衍生生長因子-BB(H)GF-BB)、多營養(yǎng)因子（PTN)、 顆粒蛋白前體、增殖蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-a(TGF-a)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-P)、腫瘤壞 死因子-a(TNF-a)、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP)、血管形成素1 (angl)、ang2、delta-樣配體 4(DLL4)、結(jié)締組織生長因子（CTGF)、腦衍生神經(jīng)因子（BDNF)、NT-4和NT-3。在一些實施方 案中，支架進一步包含抗生素或鎮(zhèn)痛藥。
[0016] 在一些實施方案中，將Wnt3a多肽、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF注射于、混合于、包囊 于、束縛于（tetheredto)或者吸附于基質(zhì)或支架中。
[0017] 在一些實施方案中，支架具有人切牙、人尖牙、人雙尖牙（bicuspid)或人磨牙或 者其中天然或人工的洞或腔室的形狀。
[0018] 在一些實施方案中，基質(zhì)或支架包括天然聚合物，選自膠原蛋白、明膠、多糖、殼聚 糖、羥磷灰石（HA)及聚羥基脂肪酸酯。在一些實施方案中，基質(zhì)或支架包括合成的聚合物， 選自聚（a-羥基酸）的脂肪族聚酯及聚乙二醇。在一些實施方案中，基質(zhì)或支架包括羥磷 灰石。在一些實施方案中，基質(zhì)或支架包括藻酸鹽水凝膠。在一些實施方案中，基質(zhì)或支架 是生物可降解的。
[0019] 在一些實施方案中，支架包括直徑為（i) 50-500ym;或者（ii)大約200ym的微 通道。在一些實施方案中，Wnt3a和BMP-7及任選存在的VEGF、bFGF或NGF被包埋入支架 微通道中的凝膠中。在一些實施方案中，Wnt3a和BMP-7及任選存在的VEGF、bFGF或NGF 包囊于微球中。
[0020] 在一些實施方案中，所述方法進一步包括使用計算機輔助設(shè)計（CAD)制作牙齒或 牙洞模型，及用生物繪圖儀（bioplotter)合成支架。
[0021] 在一些實施方案中，Wnt3a多肽包含SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3 或 3￡〇10勵:4所示氨基酸序列。在一些實施方案中，1拉3&多肽包括與36〇10勵 ：1、3￡〇10N0:2、SEQIDN0:3或SEQIDN0:4具有至少大約95%序列相同性并具有Wnt3a活性的氨 基酸序列。
[0022] 在一些實施方案中，Wnt3a以大約lng至大約1，OOOmgWnt3a/ml溶液的濃度存在， 其中所述溶液被導入基質(zhì)或支架中。在一些實施方案中，BMP-7以大約lng至大約l，000mg BMP-7/ml溶液的濃度存在，其中所述溶液被導入基質(zhì)或支架中。在一些實施方案中，Wnt3a 以大約l〇ng/ml溶液的濃度存在，BMP-7以大約200ng/ml溶液的濃度存在，其中所述溶液 被導入基質(zhì)或支架中。在一些實施方案中，VEGF以大約lng至大約l，000mgVEGF/ml溶液 的濃度存在。在一些實施方案中，bFGF以大約lng至大約1，OOOmgbFGF/ml溶液的濃度存 在。在一些實施方案中，NGF以大約lng至大約1，OOOmgNGF/ml溶液的濃度存在。在一些 實施方案中，上述溶液被導入基質(zhì)或支架中。
[0023] 在一些實施方案中，所述方法進一步包括暴露牙髓腔或根管中創(chuàng)傷或患病的牙髓 組織；及用所述組合物覆蓋或充填至少一部分牙髓腔或根管，其中在覆蓋或充填后新生的 血管化牙髓樣組織在牙髓腔或根管中形成。
[0024] 在一些實施方案中，所述方法進一步包括從牙齒中除去創(chuàng)傷或患病的牙髓組織， 以產(chǎn)生基本上沒有創(chuàng)傷或患病組織的牙髓腔或根管。在一些實施方案中，所述方法進一步 包括從牙齒中除去基本上所有的牙髓組織。在一些實施方案中，所述方法進一步包括用惰 性材料充填至少一部分牙髓腔。
[0025] 本發(fā)明的其它目的和調(diào)整在后文將部分顯見和點明。
[0026] 附圖描述
[0027] 本領(lǐng)域技術(shù)人員理解下文所述附圖只是舉例說明本發(fā)明。附圖不以任何方式限制 本發(fā)明教導的范圍。
[0028] 圖1是經(jīng)過臨床相同根管處理的成人牙齒照片。經(jīng)牙髓處理的根管和牙髓腔用無 生物活性成分（a圖），或者僅具有堿性成纖維細胞生物活性成分（bFGF) (b圖），或者既具 有bFGF也具有血管內(nèi)皮生物活性成分（VEGF) (c圖）的膠原蛋白海綿充填。將牙齒在皮下 植入免疫缺陷的小鼠維持2周，以評估在牙髓處理的根管和牙髓腔內(nèi)是否發(fā)生血管化。與 無生物活性成分處理（僅膠原蛋白海綿）（a)相反，僅bFGF(b)及VEGF和bFGF組合（c)處 理均示出在插入根管中的膠原蛋白海綿中的血管化。
[0029] 圖2示出如圖1所示處理的成人牙齒切片的顯微照片。A圖示出植入無生物活性 成分的膠原蛋白海綿的人恒切牙的根管。在免疫缺陷的小鼠中體內(nèi)植入后，不存在任何宿 主組織從牙根尖孔的向內(nèi)生長。B圖示出具有VEGF-加載的膠原蛋白海綿的人恒切牙的根 管，示出存在血管化（箭頭所指）和宿主組織向內(nèi)生長。浸潤的宿主組織附著于牙本質(zhì)。C 圖示出具有bFGF-加載的膠原蛋白海綿的人恒切牙的根管，示出存在血管化（箭頭所指） 和宿主組織向內(nèi)生長。浸潤的宿主組織附著于牙本質(zhì)。D圖示出具有VEGF+bFGF-加載的膠 原蛋白海綿的人恒切牙的根管，示出存在血管化（箭頭所指）和宿主組織向內(nèi)生長。浸潤 的宿主組織附著于牙本質(zhì)。
[0030] 圖3示出在1 %BSA溶液中TGF3從PLGA微球中的釋放動力學圖。通過ELISA 檢測，TGFf3 3以緩釋方式在直至36和42天分別從以50:50或75:25的共聚合物比率的 PLGA微球釋放。這兩個共聚合物比率均觀測到初始的爆發(fā)樣釋放，盡管50:50PLA/PGA比率 比75:25PLA/PGA比率產(chǎn)生更快速的釋放速率。
[0031] 圖4是掃描電子顯微圖，示出PLGA微球的制造和降解。A圖示出由聚-d-1-乳 酸-共-乙醇酸（PLGA)以50:50PLA/PGA比率制造的包囊有TGFI3 3的微球的代表性SEM 圖像。B圖示出包囊有TGFP3的PLGA微球在PBS溶液中的預期降解的代表性SEM圖像。
[0032] 圖5是示出BMP-7從PLGA微球中的累積平均釋放的圖表。
[0033] 圖6是示出NGF從PLGA微球中的累積平均釋放的圖表。
[0034] 圖7是描述collal(2. 3kb)_EGFP小鼠中報道基因表達及成牙本質(zhì)細胞和成骨細 胞的微陣列分析的一系列圖像、散點圖和陣列圖。圖7A是轉(zhuǎn)基因示意圖，其含有驅(qū)動EGFP 表達的2. 3kbcollal啟動子。圖7B是分離自轉(zhuǎn)基因小鼠的頌骨的圖像，其中GFP信號可 以在骨與牙齒中均檢測到。圖7C示出經(jīng)解剖的Collal小鼠的顱蓋骨，以及在縫合處和骨 中觀測到轉(zhuǎn)基因表達。圖7D示出頌骨和磨牙的切片。圖7E示出在牙槽骨、牙周膜和成牙 本質(zhì)細胞中觀察到GFP信號。圖7F和圖7G示出GFP陽性小鼠的切牙，GFP陽性細胞沿著 牙本質(zhì)表面排成一行，GFP信號位于成牙本質(zhì)細胞中。圖7H示出GFP陽性成牙本質(zhì)細胞形 成牙本質(zhì)小管。圖71示出GFP陽性成牙本質(zhì)細胞從Collal-EGFP小鼠牙髓中迀移出。圖 7J示出來自皮下接種于膠原蛋白凝膠（0.lml)中的牙髓的10, 000個GFP陽性細胞（基于 GFP分選）。在圖7J左側(cè)角插入的X-線圖像示出3周后礦化組織形成。圖7K示出礦化 組織是GFP陽性的。圖7L是示出輸送的GFP陽性成牙本質(zhì)細胞形成與紊亂的牙本質(zhì)相似 的礦化結(jié)構(gòu)的組織切片。圖7M是示出DSP陽性的牙本質(zhì)樣組織的圖像（綠色，GFP;紅色， 03卩；紫色，04?1)。圖7~示出來自接種于腎小囊（0.11111)中的牙髓的10,000個6??陽性 細胞（基于GFP分選）。在圖7N的左側(cè)角插入的X-線圖像示出3周后礦化組織形成。圖 70示出礦化組織的H&E染色。圖7P示出細胞形成DSPP陽性礦化組織。圖7Q和圖7R示 出在Collal-EGFP小鼠中顱蓋骨的骨細胞和成骨細胞是GFP陽性的。圖7S示出分離自顱 蓋骨并在〇頂中培養(yǎng)的細胞，其中GFP細胞在一周內(nèi)形成結(jié)節(jié)。圖7T和圖7U示出分離自 牙（成牙本質(zhì)細胞）和顱蓋骨（成骨細胞）的GFP陽性細胞的mRNA的Agilent全基因組 微陣列分析。所有點的信號強度的散射圖。圖7U示出一個陣列試驗數(shù)據(jù)的實例（n= 4)。 每個特征的信號強度以圓點表示。
[0035] 圖8是示出通過免疫組織化學和原位雜交檢測的差異表達的基因的一系列圖像。 進行免疫組織化學以檢測選擇的基因的蛋白質(zhì)水平。圖2A、圖8B、圖8C、圖8E示出在切牙、 磨牙和顱蓋骨的成牙本質(zhì)細胞中高度表達的選擇的基因的表達。圖8F和圖8G示出在成骨 細胞中高度表達的選擇的基因的表達（比例尺=20ym) (De:牙本質(zhì)；P:牙髓）。圖8H、圖 81和圖8J示出通過原位雜交檢測的生長因子的表達，因為Wnts和BMP7是分泌的生長因 子，其可以擴散至周圍組織（比例尺：A-G，50ym;H、I、J，250ym)。
[0036] 圖9是示出通過RT-PCR證實微陣列的一系列條形圖。圖9A示出在成牙本質(zhì)細胞 中高度表達的選擇的基因。圖9B示出在成骨細胞中高度表達的選擇的基因。選擇的基因 的表達通過實時PCR證實，使用分離自GFP陽性成牙本質(zhì)細胞和成骨細胞的RNA進行（n= 3)。選擇的基因是生長因子或分泌因子及轉(zhuǎn)錄因子。
[0037] 圖10是示出Wnt3a選擇性誘導成牙本質(zhì)細胞迀移的一系列條形圖和圖像。圖10A 是條形圖，示出用于研究響應Wnt3a、BMP-7的細胞迀移的使用PDL細胞進行的Boyden室測 定的結(jié)果。將l〇〇k個PDL細胞接種在孔中，并將迀移誘因加入室中。12小時后，將迀移的 細胞經(jīng)胰蛋白酶消化并計數(shù)。然后將細胞鋪板及增殖以進一步研究（n= 4*p〈0. 05)。圖 10B是在成骨誘導培養(yǎng)基中分化的迀移的細胞的圖像，3周后用硝酸銀染色（vonKossa)。 圖10C和圖10D是示出通過PCR檢測的標記基因表達的條形圖（n= 3*p〈0. 05)。
[0038] 圖11是示出通過標準牙髓切除術(shù)除去的迷你豬牙髓的一對圖像。在牙髓腔做入 口。在根除牙髓組織后，清潔髓腔。根管用手銼成形，直徑為〇. 1-2. 5_，并用鹽水洗滌。用 無菌紙尖干燥根管。
[0039] 圖12是示出Wnt3a或BMP-7再生牙髓和牙本質(zhì)的一系列圖像和條形圖。圖12A、 圖12B、圖12C和圖12D示出與生長因子（對照物、BMP-7或Wnt3a)組合的可注射的膠原 蛋白凝膠注射進根管中。開放尋開髓室入口（accesscavity)用基材和復合樹脂密封。圖 12E和圖12F是圖12D部分的放大圖。圖12H、圖121、圖12J和圖12K示出在6-8周后收獲 及用組織學和微型-CT檢驗的切牙。圖12L和圖12M示出新形成的牙本質(zhì)體積和密度的數(shù) 量（p〈0. 05,n= 4)。
[0040] 圖13是示出牙髓減壓充填膜的一系列圖，其中：1是膜；2是復合材料的邊緣粘 附；3是備填牙洞；4是可吸附生物材料；5是微孔膜和牙洞的連接；及6是牙髓組織。圖13A 示出充填膜的頂視圖，其示出膜的中心部分和復合材料的周圍部分。圖13B示出充填膜的 截面圖，其示出復合材料中攜帶的膜。圖13C示出以透視法示出的牙腔密封裝置的截面圖。 牙腔中炎癥的滲出物可以由藻酸鹽立即吸收，隨后從膜中滲出，而口腔中的細菌被該膜阻 止。圖13D示出密封裝置與牙的截面圖。
[0041] 圖14是藻酸鹽水凝膠形成的反應示意圖。
[0042] 圖15是物理交聯(lián)的藻酸鹽水凝膠的泡脹率（％ )條形圖。
[0043] 圖16是麻醉的迷你豬的口腔照片，其中放置橡皮障以隔離切牙。通過用高速牙鉆 機械性開口以觸及牙髓腔。
[0044] 圖17是迷你豬切牙的組織橫切面圖，示出在將具有BMP-7 (200ng/ml)的水凝膠注 射進根管和牙髓腔之后4周形成的再生的牙髓（r.p.)、再生的血管（b.v.)、再生的牙本質(zhì) (r.d.)和天然的牙本質(zhì)（n.d.)。
[0045] 圖18是迷你豬切牙的組織橫切面圖，示出在將具有Wnt蛋白質(zhì)（10ng/ml)的水凝 膠注射進根管和牙髓腔之后4周形成的再生的牙髓（r.p.)、再生的血管（b.v.)、再生的牙 本質(zhì)（r.d.)和天然的牙本質(zhì)（n.d.)。
[0046] 圖19是迷你豬切牙的組織橫切面圖，示出在將具有BMP-7 (200ng/ml)和Wnt蛋白 質(zhì)（10ng/ml)的水凝膠注射進根管和牙髓腔之后4周形成的再生的牙髓（r.p.)、再生的血 管（b.v.)、再生的牙本質(zhì)（r.d.)和天然的牙本質(zhì)（n.d.)。
[0047] 發(fā)明詳述
[0048] 本發(fā)明至少部分基于發(fā)現(xiàn)患病的、創(chuàng)傷的或缺失的牙髓可以用包含基質(zhì)或支架及 一或多種生物活性成分的組合物置換，所述組合物促進血管發(fā)生性、牙發(fā)生性、纖維發(fā)生性 或者神經(jīng)發(fā)生性發(fā)育。這種組合物可以促進髓腔中血管發(fā)生性、牙發(fā)生性、纖維發(fā)生性或者 神經(jīng)發(fā)生性發(fā)育，保持牙齒活力。
[0049] 本發(fā)明提供了組合物，其包含用于一或多種生物活性劑，以再生牙髓或牙本質(zhì)。各 種組合物可包含生物活性劑如Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF、NGF或者其組合。
[0050] 本發(fā)明還提供了一些生物相容的材料以在可復性牙髓炎階段保持牙髓的活力。如 本文所示，一些可再吸收或不可再吸收的生物材料，包括多孔膜和水凝膠，不僅允許血液、 組織液或水擴散，而且也可以阻止口腔中病原