一種用于牙周組織的生物支架材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于牙周組織的生物支架材料及其制備方法，屬于生物組織工程支架【技術(shù)領(lǐng)域】。該生物支架材料由殼層溶液和芯層溶液通過同軸靜電紡絲制成，殼層溶液和芯層溶液是將各含有一種基因質(zhì)粒的載體復(fù)合物納米微球分別溶解于可降解的有機高分子溶劑中混勻后制得。本發(fā)明方法利用同軸靜電紡絲法制備具有芯殼結(jié)構(gòu)的生物支架材料，工藝簡單，易于操作、成本低，可用于組織工程介導(dǎo)的非病毒基因治療。
【專利說明】一種用于牙周組織的生物支架材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物組織工程支架【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于牙周組織的生物支架材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牙周病是指發(fā)生在牙支持組織(牙周組織)的疾病，包括僅累及牙齦組織的牙齦病和波及深層牙周組織(牙周膜、牙槽骨、牙骨質(zhì))的牙周炎兩大類。牙周疾病是常見的口腔疾病，是引起成年人牙齒喪失的主要原因之一，也是危害人類牙齒和全身健康的主要口腔疾病。現(xiàn)有治療方式只是維持在基礎(chǔ)治療。隨著組織工程技術(shù)的快速發(fā)展，牙周組織工程技術(shù)為牙周病治療和牙周缺損修復(fù)帶來了新的希望，目前已成為牙周組織重建研究的熱點。
[0003]組織工程技術(shù)的關(guān)鍵在于組織工程支架。如何提高孔隙率，給細胞提供三維生長空間、誘導(dǎo)細胞分化生長和血管的長入是困擾組織工程支架的難題。同軸靜電紡絲是一種利用高壓靜電場制備芯-殼型超細纖維支架的新興技術(shù)，其產(chǎn)品具有納米級的纖維細度、超高的比表面積和相互連通的多孔隙三維結(jié)構(gòu)，能夠最大程度的仿生細胞外基質(zhì)的纖維網(wǎng)絡(luò)。芯-殼型內(nèi)外雙層的復(fù)合結(jié)構(gòu)不僅有助于分層承載不同的質(zhì)粒DNA載體，實現(xiàn)目的基因的緩慢可調(diào)釋放，避免突釋效應(yīng)，更有利于將質(zhì)粒DNA載體與支架材料處理過程中的毒性有機溶劑隔離開來，從而更好的發(fā)揮其生物活性。
[0004]已有研究報道，人骨保護素基因(hOPG)有阻斷/延緩骨質(zhì)吸收的作用，人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因(hBMP-2) 有促進骨質(zhì)重建的功能?，F(xiàn)已有技術(shù)報道將其中的一種基因包裹在組織工程支架中，穩(wěn)定釋放，促進成骨細胞分化。然而，骨組織再生重建是多基因多因素共同作用的結(jié)果，單獨一種基因表達的生長因子尚不能很好的完成骨再生這一過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種用于牙周組織的生物支架材料及其制備方法，該生物支架材料能夠促進骨再生，有效治療牙周病，該方法工藝簡單，易于操作。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0007]—種用于牙周組織的生物支架材料，該生物支架材料由殼層溶液和芯層溶液通過同軸靜電紡絲制成，殼層溶液和芯層溶液是將各含有一種基因質(zhì)粒的載體復(fù)合物納米微球分別溶解于可降解的有機高分子溶劑中混勻后制得；其中，殼層溶液與芯層溶液的質(zhì)量比為(I~10):1，可降解的有機高分子溶劑的質(zhì)量濃度為10%~15% ；
[0008]所述基因質(zhì)粒載體復(fù)合納米微球是將基因質(zhì)粒PBS溶液加入基因載體溶液中混勻、靜置制得，基因質(zhì)粒PBS溶液與基因載體溶液的體積比為1: (2~10);基因質(zhì)粒PBS溶液中，基因質(zhì)粒的濃度為0.1~5mg/mL。
[0009]殼層溶液中含有人骨保護素基因質(zhì)粒，芯層溶液中含有人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因質(zhì)粒；基因載體溶液為質(zhì)量濃度為20%~50%的G5-PAMAM-D水溶液。[0010]所述殼層溶液采用的可降解的有機高分子溶劑為聚乳酸、聚己內(nèi)酯或聚乳酸-羥基乙酸溶于有機溶劑中制成，其中，有機溶劑為二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按體積比8:2配成的混合溶液；
[0011]所述芯層溶液采用的可降解的有機高分子溶劑為聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙二醇或聚乳酸-羥基乙酸溶于水中制成。
[0012]所述同軸靜電紡絲是將殼層纖維溶液和芯層纖維溶液通過以同心方式排列的不同內(nèi)徑的針頭進行靜電紡絲，其中，芯層針頭內(nèi)徑為0.06~1mm，殼層針頭內(nèi)徑為0.2~2mm ο
[0013]一種用于牙周組織的生物支架材料的制備方法，包括以下步驟:
[0014]I)制備基因質(zhì)粒載體復(fù)合納米微球
[0015]將含有人骨保護素基因質(zhì)粒的PBS溶液和人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因的PBS溶液分別加入基因載體溶液中，充分混勻后靜置，得到人骨保護素基因質(zhì)粒載體復(fù)合納米微球和人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因質(zhì)粒載體復(fù)合納米微球；
[0016]其中，含有人骨保護素基因質(zhì)粒的PBS溶液和人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因的PBS溶液與基因載體溶液的體積比均為1: (2~10);
[0017]人骨保護素基因質(zhì)粒的PBS溶液和人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因的PBS溶液中，基因質(zhì)粒的用量為0.1~5mg/mL ；
[0018]2)配制殼層 纖維溶液和芯層纖維溶液
[0019]將人骨保護素基因質(zhì)粒載體復(fù)合納米微球和人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因質(zhì)粒載體復(fù)合納米微球分別溶于質(zhì)量濃度為10%~15%的可降解的有機高分子溶劑中，制得殼層溶液和芯層溶液；
[0020]3)同軸靜電紡絲
[0021]將殼層溶液和芯層溶液以同心排列的不同內(nèi)徑的針頭進行靜電紡絲，得到用于牙周組織的生物支架材料。
[0022]6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于牙周組織的生物支架材料的制備方法，其特征在于，所述人骨保護素基因質(zhì)粒為pDsRed2-Nl-h0PG，所述人骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2基因為pIRES2-EGFP-hBMP2 ;所述基因載體溶液為質(zhì)量濃度為20%~50%的G5-PAMAM-D水溶液。
[0023]所述殼層溶液采用的可降解的有機高分子溶劑為聚乳酸、聚己內(nèi)酯或聚乳酸-羥基乙酸溶于有機溶劑中制成，其中，有機溶劑為二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按體積比8:2配成的混合溶液；
[0024]所述芯層溶液采用的可降解的有機高分子溶劑為聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙二醇或聚乳酸-羥基乙酸溶于水中制成。
[0025]步驟3)所述的以不同內(nèi)徑的針頭進行靜電紡絲時采用的芯層針頭內(nèi)徑為0.06~Imm,殼層針頭內(nèi)徑為0.2~2mm。
[0026]所述靜電紡絲的條件為:芯層纖維溶液流速為0.1~lmL/h，殼層纖維溶液流速為
0.5~15mL/h,針頭與接收板距離為10~30cm,電壓為6~30kv。
[0027]還包括對得到的牙周組織的生物支架材料進行干燥的步驟，具體為:在溫度為15~25°C下，真空干燥20~30h。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:[0029]本發(fā)明的用于牙周組織的生物支架材料中攜帶兩種用于哺乳動物轉(zhuǎn)染的基因質(zhì)粒，該兩種基因質(zhì)粒能夠隨著材料的降解而釋放出來，并轉(zhuǎn)染到細胞中去，表達相關(guān)生長因子，從而能夠有效促進細胞分化、生長。本發(fā)明的雙基因生物支架材料具有纖維結(jié)構(gòu)，表面光滑，直徑均一，無缺陷結(jié)構(gòu)，機械性能優(yōu)良，且降解可持續(xù)50天以上，釋放的質(zhì)粒能夠高效率轉(zhuǎn)染入細胞，其中殼層降解速度快，芯層緩慢，兩層攜帶的質(zhì)粒能夠有序轉(zhuǎn)染表達相應(yīng)生長因子。
[0030]本發(fā)明方法利用同軸靜電紡絲法制備具有芯殼纖維結(jié)構(gòu)的生物支架材料，提高了電紡纖維的包封率，可以長時間保持基因質(zhì)粒的生物活性，能夠長期穩(wěn)定的釋放基因質(zhì)粒。各基因質(zhì)粒能夠進入細胞并順利復(fù)制、表達，分泌生長因子，促進骨再生，從而達到治療牙周病的目的。本發(fā)明工藝簡單，易于操作、成本低，可用于組織工程介導(dǎo)的非病毒基因治療。與細胞外基質(zhì)(ECM)相適應(yīng)，可滿足傷口敷料、藥物緩釋載體、GTR膜以及組織工程支架的要求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為本發(fā)明的靜電紡絲裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0032]圖2為本發(fā)明實施例1制得的生物支架材料的掃描電鏡照片；
[0033]圖3為本發(fā)明實施例1制得的生物支架材料的降解曲線。
[0034]其中，A為芯層 溶液注射泵；B為殼層溶液注射泵；C同軸噴頭；D為芯層溶液入口 ；E為殼層溶液入口 ；F為正高壓級；G為接收板；H為負高壓級。
【具體實施方式】
[0035]下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0036]一種用于牙周組織的生物支架材料(應(yīng)用于組織工程的雙基因活化基質(zhì))的制備方法，包括以下步驟:
[0037]1、將兩種基因質(zhì)粒分別溶于基因載體G5-PAMAM-D溶液中，得到的混合物靜置30min形成兩種G5-PAMAM-D基因質(zhì)粒載體復(fù)合物納米微球；
[0038]2、將兩種基因質(zhì)粒載體復(fù)合物納米微球分別溶于質(zhì)量濃度為10%~15%的可降解的有機高分子溶劑中，制成殼層溶液和芯層溶液；
[0039]3、將殼層溶液和芯層溶液用同心方式排列的不同內(nèi)徑的針頭進行同軸靜電紡絲，芯層內(nèi)徑0.06-lmm,殼層內(nèi)徑0.2_2mm。芯層溶液流速0.1-lml/h,殼層溶液流速0.5_15ml/h ;針頭與接收板距離為10-30cm,電壓為6-30kv。
[0040]其中，靜電紡絲所用裝置參見圖1所示的結(jié)構(gòu)，A為芯層溶液注射泵；B為殼層溶液注射泵；(:同軸噴頭山為芯層溶液入口出為殼層溶液入口 ；F為正高壓級而為接收板；H為負高壓級。
[0041]實施例1
[0042]一種用于牙周組織的生物支架材料的制備方法，包括以下步驟:
[0043]I)制備質(zhì)粒載體復(fù)合納米微球:
[0044]在溫和渦旋攪拌條件下，向pIRES2-EGFP-hBMP2、pDsRed2-Nl-h0PG 質(zhì)粒的 100 μ LPBS溶液中快速加入ImL質(zhì)量濃度為30%的G5-PAMAM-D水溶液，混勻后，靜置30min，得到pIRES2-EGFP-hBMP2-G5-PAMAM-D 復(fù)合納米微球和 pDsRed2-Nl-hOPG-G5-PAMAM_D 復(fù)合納米微球；
[0045]2)配制殼層溶液和芯層溶液:
[0046]配制殼層溶液:將聚己內(nèi)酯(PCL，分子量8萬，粘度系數(shù)0.8dl/g)溶于二氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺混合溶劑中(v/v = 8:2)，配制成質(zhì)量濃度為10%溶液；將步驟I)中制備好的pIRES2-EGFP-hBMP2-G5-PAMAM-D復(fù)合納米微球加入質(zhì)量濃度為10%的PCL溶液中，混勾，制成殼層溶液；
[0047]配制芯層溶液:將聚乙二醇(PEG，分子量4000)溶于去離子水，配制成質(zhì)量濃度為10% (w/w)的溶液，將步驟I)中制備好的pDsRed2-Nl-h0PG-G5-PAMAM-D復(fù)合納米微球加入到質(zhì)量濃度為10%的PEG水溶液中，充分混勻，制成芯層溶液；
[0048]3)同軸靜電紡絲:
[0049]選用17/25G同軸針頭，芯層針頭內(nèi)徑為0.06mm，殼層針頭內(nèi)徑為0.2mm以殼層流速2mL/h，芯層流速0.5mL/h,電壓15KV，距離15cm為條件進行靜電紡絲，制得用于牙周組織的生物支架材料樣品，將制備好的樣品室溫下在真空干燥機中干燥24h。
[0050]實施例2
[0051]一種用于牙周組織的生物支架材料的制備方法，包括以下步驟:
[0052]I)制備質(zhì)粒載 體復(fù)合納米微球:
[0053]在溫和渦旋攪拌條件下，向pIRES2-EGFP-hBMP2、pDsRed2-Nl-h0PG 質(zhì)粒的 100 μ LPBS溶液中分別快速加入500 μ L濃度為20%的G5-PAMAM-D水溶液，混勻后，靜置30min，得到 pIRES2-EGFP-hBMP2-G5-PAMAM-D 復(fù)合納米微球和 pDsRed2-Nl-h0PG-G5-PAMAM_D 復(fù)合納米微球；
[0054]2)配制殼層溶液和芯層溶液:
[0055]配制殼層溶液:將聚己內(nèi)酯溶于二氯甲烷/N，N_二甲基甲酰胺混合溶劑中(v/v = 8:2)配制成質(zhì)量濃度為15 % (w/w)溶液；將步驟I)中制備好的PI RES2-EGFP-hBMP2-G5-PAMAM-D復(fù)合納米微球加入到質(zhì)量濃度為15 %的聚己內(nèi)酯溶液中，混勾，制成殼層溶液；
[0056]配制芯層溶液:將聚乙二醇(PEG，分子量4000)溶于去離子水，配制成質(zhì)量濃度為12%的水溶液，將步驟I)中制備好的pDsRed2-Nl-h0PG-G5-PAMAM-D復(fù)合納米微球加入到濃度為12 %的PEG水溶液中，充分混勻，制成芯層溶液；
[0057]3)靜電紡絲:
[0058]選用17/25G同軸針頭，芯層針頭內(nèi)徑為0.4mm，殼層針頭內(nèi)徑為1.5mm以殼層流速
0.5mL/h,芯層流速0.lmL/h,電壓6KV，針頭與接收板距離1cm為條件進行靜電紡絲，制得用于牙周組織的生物支架材料樣品，將制備好的樣品在20°C下，在真空干燥機中干燥20h。
[0059]實施例3
[0060]一種用于牙周組織的生物支架材料的制備方法，包括以下步驟:
[0061]I)制備質(zhì)粒載體復(fù)合納米微球:
[0062]在溫和渦旋攪拌條件下，將pIRES2-EGFP_hBMP2、pDsRed2-Nl_h0PG質(zhì)粒的100 μ L PBS溶液中快速加入200 μ LlO % G5-PAMAM-D溶液，混勻后，靜置30min，得到pIRES2-EGFP-hBMP2-G5-PAMAM-D 復(fù)合納米微球和 pDsRed2-Nl-hOPG-G5-PAMAM_D 復(fù)合納米微球；
[0063]2)配制殼層溶液和芯層溶液:
[0064]配制殼層溶液:將聚乳酸溶于二氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺混合溶劑中(v/v = 8:
2)配制成質(zhì)量濃度為15%的溶液；將步驟I)中制備好的pIRES2-EGFP-hBMP2-G5-PAMAM-D復(fù)合納米微球加入到濃度為15%的聚乳酸溶液中，混勻，制成殼層溶液；
[0065]配制芯層溶液:將聚乳酸-羥基乙酸溶于去離子水，配制成濃度為15% (w/w)溶液，將步驟I)中制備好的pDsRed2-Nl-h0PG-G5-PAMAM-D復(fù)合納米微球加入到濃度為15%的聚乳酸-羥基乙酸水溶液中，充分混勻，制成芯層溶液；
[0066]3)靜電紡絲:
[0067]選用17/25G同軸針頭，芯層針頭內(nèi)徑為1mm，殼層針頭內(nèi)徑為2mm以殼層流速15mL/h，芯層流速lmL/h，電壓30KV，針頭與接收板距離30cm為條件進行靜電紡絲，制得用于牙周組織的生物支架材料樣品，將制備好的樣品在15°C下，在真空干燥機中干燥30h。
[0068]下面對本發(fā)明制得的生物支架材料進行效果驗證試驗:
[0069]將實施例1制得的生物支架材料進行掃描電鏡，照片參見圖2，從圖中可以看出，該生物支架材料纖維表面光滑，直徑均一，無缺陷結(jié)構(gòu)。
[0070]對該生物材料的機械性能進行測試，結(jié)果如下表1所示:
[0071]表1本發(fā)明制得的生物支架材料機械性能測試結(jié)果
[0072]
【權(quán)利要求】
1.一種用于牙周組織的生物支架材料，其特征在于，該生物支架材料由殼層溶液和芯層溶液通過同軸靜電紡絲制成，殼層溶液和芯層溶液是將各含有一種基因質(zhì)粒的載體復(fù)合物納米微球分別溶解于可降解的有機高分子溶劑中混勻后制得；其中，殼層溶液與芯層溶液的質(zhì)量比為(I~10):1，可降解的有機高分子溶劑的質(zhì)量濃度為10%~15% ； 所述基因質(zhì)粒載體復(fù)合納米微球是將基因質(zhì)粒PBS溶液加入基因載體溶液中混勻、靜置制得，基因質(zhì)粒PBS溶液與基因載體溶液的體積比為1: (2~10);基因質(zhì)粒PBS溶液中，基因質(zhì)粒的濃度為0.1~5mg/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于牙周組織的生物支架材料，其特征在于，殼層溶液中含有人骨保護素基因質(zhì)粒，芯層溶液中含有人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因質(zhì)粒；基因載體溶液為質(zhì)量濃度為20%~50%的G5-PAMAM-D水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于牙周組織的生物支架材料，其特征在于，所述殼層溶液采用的可降解的有機高分子溶劑為聚乳酸、聚己內(nèi)酯或聚乳酸-羥基乙酸溶于有機溶劑中制成，其中，有機溶劑為二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按體積比8:2配成的混合溶液； 所述芯層溶液采用的可降解的有機高分子溶劑為聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙二醇或聚乳酸-羥基乙酸溶于水中制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于牙周組織的生物支架材料，其特征在于，所述同軸靜電紡絲是將殼層纖維溶液和芯層纖維溶液通過以同心方式排列的不同內(nèi)徑的針頭進行靜電紡絲，其中，芯層針頭內(nèi)徑為0.06~1mm，殼層針頭內(nèi)徑為0.2~2mm。
5.一種用于牙周組織的生物支架材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)制備基因質(zhì)粒載體復(fù)合納米微球 將含有人骨保護素基因質(zhì)粒的PBS溶液和人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因的PBS溶液分別加入基因載體溶液中，充分混勻后靜置，得到人骨保護素基因質(zhì)粒載體復(fù)合納米微球和人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因質(zhì)粒載體復(fù)合納米微球； 其中，含有人骨保護素基因質(zhì)粒的PBS溶液和人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因的PBS溶液與基因載體溶液的體積比均為1: (2~10); 人骨保護素基因質(zhì)粒的PBS溶液和人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因的PBS溶液中，基因質(zhì)粒的用量為0.1~5mg/mL ； 2)配制殼層纖維溶液和芯層纖維溶液 將人骨保護素基因質(zhì)粒載體復(fù)合納米微球和人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因質(zhì)粒載體復(fù)合納米微球分別溶于質(zhì)量濃度為10%~15%的可降解的有機高分子溶劑中，制得殼層溶液和芯層溶液； 3)同軸靜電紡絲 將殼層溶液和芯層溶液以同心排列的不同內(nèi)徑的針頭進行靜電紡絲，得到用于牙周組織的生物支架材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于牙周組織的生物支架材料的制備方法，其特征在于，所述人骨保護素基因質(zhì)粒為pDsRed2-Nl-hOPG，所述人骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2基因為pIRES2-EGFP-hBMP2 ;所述基因載體溶液為質(zhì)量濃度為20%~50%的G5-PAMAM-D水溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于牙周組織的生物支架材料的制備方法，其特征在于，所述殼層溶液采用的可降解的有機高分子溶劑為聚乳酸、聚己內(nèi)酯或聚乳酸-羥基乙酸溶于有機溶劑中制成，其中，有機溶劑為二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺按體積比8:2配成的混合溶液； 所述芯層溶液采用的可降解的有機高分子溶劑為聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙二醇或聚乳酸-羥基乙酸溶于水中制成。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于牙周組織的生物支架材料的制備方法，其特征在于，步驟3)所述的以不同內(nèi)徑的針頭進行靜電紡絲時采用的芯層針頭內(nèi)徑為0.06~1mm，殼層針頭內(nèi)徑為0.2~2mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于牙周組織的生物支架材料的制備方法，其特征在于，所述靜電紡絲的條件為:芯層纖維溶液流速為0.1~lmL/h，殼層纖維溶液流速為.0.5~15mL/h,針頭與接收板距離為10~30cm,電壓為6~30kv。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于牙周組織的生物支架材料的制備方法，其特征在于，還包括對得到的牙周組織的生物支架材料進行干燥的步驟，具體為:在溫度為15~.25 °C下，真空干燥20~30h。
【文檔編號】D01D5/34GK104027848SQ201410289608
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】賈駿, 徐宏宇, 賈列妮, 郭秋云, 董瑜 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)