本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種用靈發(fā)素誘導(dǎo)煙草葉片再生植株的方法。
背景技術(shù)：
煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是植物生物技術(shù)研究重要的模式植物。所以，其植株再生技術(shù)的建立和批量生產(chǎn)“再生植株”(試管苗)對(duì)品種性狀改良，良種快繁推廣，特別是對(duì)定向獲得性的確切驗(yàn)證，都具有重要的理論意義和實(shí)踐意義。通過(guò)組織培養(yǎng)建立獲得煙草再生植株技術(shù)體系的報(bào)導(dǎo)已有不少，其共同的突出缺點(diǎn)是程序繁雜，一般都分3個(gè)階段：1、由不同的原始外植體(花粉、子房、子葉、胚軸、莖段、葉片、原生質(zhì)體，等)誘導(dǎo)出愈傷組織；2、由愈傷組織誘導(dǎo)出不定芽(即無(wú)根苗)；3、由無(wú)根苗誘導(dǎo)出不定根，才能得到根苗齊全的完整再生植株。每一個(gè)階段，都需要分別配制組成分(多為2-4種)及其相對(duì)比例皆不相同的培養(yǎng)基(誘導(dǎo)芽以細(xì)胞分裂素cytokinin為主，誘導(dǎo)根則以生長(zhǎng)素auxin為主)，有時(shí)在同一個(gè)階段還要連續(xù)繼代培養(yǎng)數(shù)代，才能達(dá)到目標(biāo)進(jìn)入下一個(gè)階段。而且在不同階段，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境條件的要求也不盡相同。因此，建立快速、簡(jiǎn)單、高效的煙草再生植株技術(shù)體系備受關(guān)注。
在各種不同的外植體中，以葉片最容易獲得。李勝彬等人研究發(fā)表了關(guān)于煙草葉片直接再生植株及抗生素耐受性研究，其以5cm2葉切片為外植體，用MS固體培養(yǎng)基，添加復(fù)合誘導(dǎo)劑6-BA(N6-芐基腺嘌呤)0.1-0.5mg/L和IAA(吲哚乙酸)0.5mg/L，培養(yǎng)20d，每個(gè)切片收獲再生植株5-10個(gè)，平均7.5個(gè)/切片。比以往技術(shù)有顯著進(jìn)步。但是，仍存在以下兩個(gè)問(wèn)題：①誘導(dǎo)劑仍需要2個(gè)成分復(fù)配；②實(shí)際收獲再生植株數(shù)量不多，每個(gè)切片平均每天僅獲得0.375個(gè)再生植株。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種用靈發(fā)素誘導(dǎo)煙草葉片再生植株的方法，其能夠簡(jiǎn)化了培養(yǎng)基的配制，具有操作簡(jiǎn)單誘導(dǎo)再生植株速度快、產(chǎn)量高、質(zhì)量好的優(yōu)點(diǎn)。
為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種用靈發(fā)素誘導(dǎo)煙草葉片再生植株的方法，取煙草葉片外植體，接種至添加有靈發(fā)素的MS固體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH至5.8-6.0，培養(yǎng)30天，獲得煙草再生植株。
優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導(dǎo)煙草葉片再生植株的方法，靈發(fā)素的濃度為3.0-5.0mg/L。
優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導(dǎo)煙草葉片再生植株的方法，靈發(fā)素的濃度為4.5mg/L。
優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導(dǎo)煙草葉片再生植株的方法，添加有靈發(fā)素的MS固體培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理。
優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導(dǎo)煙草葉片再生植株的方法，所述煙草葉片外植體的獲取方法為：煙草種子獲得煙草無(wú)菌植株，長(zhǎng)至5、6片葉時(shí)，取其自上而下的第3片葉，切除葉柄以上2mm、葉尖以下2mm的葉片部分，沿主脈兩側(cè)分切成方形切片，作煙草葉片外植體。
優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導(dǎo)煙草葉片再生植株的方法，沿主脈兩側(cè)分切成5mm×5mm的切片作煙草葉片外植體。
優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導(dǎo)煙草葉片再生植株的方法，煙草葉片外植體的獲取在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
本發(fā)明至少包括以下有益效果：
第一、本發(fā)明針對(duì)雙子葉植物煙草的生物學(xué)特性，通過(guò)添加同時(shí)具有細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素生物活性的靈發(fā)素作唯一的誘導(dǎo)劑，激發(fā)誘導(dǎo)外植體內(nèi)源相關(guān)活性物質(zhì)的代謝方向與強(qiáng)度，形成一個(gè)適合葉片外植體植株再生的實(shí)時(shí)內(nèi)環(huán)境，才能實(shí)現(xiàn)葉片外植體的植株再生；
第二、本發(fā)明經(jīng)過(guò)反復(fù)的試驗(yàn)，確定靈發(fā)素的有效以及最適宜的濃度范圍，既能夠得到好的誘導(dǎo)效果，又不會(huì)在培養(yǎng)期間使培養(yǎng)材料發(fā)生褐化或玻璃化，中途無(wú)需更換新的培養(yǎng)基，同時(shí)避免多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的復(fù)配造成的步驟繁瑣和人力物力的浪費(fèi)；
第三、本發(fā)明用葉片外植體收獲的再生植株，以每天、每1cm2面積計(jì)算其生產(chǎn)效率，可達(dá)到現(xiàn)有技術(shù)(李勝彬等2010年的方法)的1.7倍，而且質(zhì)量更好(見(jiàn)表1)。
本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū)文字能夠據(jù)以實(shí)施。
需要說(shuō)明的是，下述實(shí)施方案中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法，所述試劑和材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
實(shí)施例1：
一種用靈發(fā)素誘導(dǎo)煙草葉片再生植株的方法，包括以下步驟：
步驟一、誘導(dǎo)培養(yǎng)基制備：以MS為基本培養(yǎng)基，以靈發(fā)素作為唯一誘導(dǎo)劑，添加靈發(fā)素3.0mg/L，調(diào)整培養(yǎng)基pH為5.8-6.0，滅菌后備用；
步驟二、外植體準(zhǔn)備：取由煙草種子獲得的無(wú)菌煙草植株，在無(wú)菌條件下，將煙草葉片切成方形切片作為外植體，備用，方形切片可切成大小約為5mm×5mm；
步驟三、接種培養(yǎng)與記錄：將步驟二獲得的煙草葉片外植體在無(wú)菌條件下接入步驟一的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)30天。
實(shí)施例2：
一種用靈發(fā)素誘導(dǎo)煙草葉片再生植株的方法，包括以下步驟：
步驟一、誘導(dǎo)培養(yǎng)基制備：以MS為基本培養(yǎng)基，以靈發(fā)素作為唯一誘導(dǎo)劑，添加靈發(fā)素4.5mg/L，調(diào)整培養(yǎng)基pH為5.8-6.0，滅菌后備用；
步驟二、外植體準(zhǔn)備：按常規(guī)方法用煙草種子獲得無(wú)菌煙草植株，長(zhǎng)至5、6片葉時(shí)，取其自上而下的第3片葉，在無(wú)菌條件下，切除葉柄以上2mm葉片部分和葉尖以下2mm葉片部分，再沿主脈兩側(cè)分切成方形切片，作煙草葉片外植體，方形切片可以切成大小約為5mm×5mm，備用，需要說(shuō)明的是，前述的沿主脈切片是指棄用了葉片左右兩側(cè)的邊緣葉片部分，只要主脈兩側(cè)的葉片部分；
步驟三、接種培養(yǎng)與記錄：將步驟二獲得的煙草葉片外植體在無(wú)菌條件下接入步驟一的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)30天。
實(shí)施例3：
一種用靈發(fā)素誘導(dǎo)煙草葉片再生植株的方法，包括以下步驟：
步驟一、誘導(dǎo)培養(yǎng)基制備：以MS為基本培養(yǎng)基，以靈發(fā)素作為唯一誘導(dǎo)劑，添加靈發(fā)素5.0mg/L，調(diào)整培養(yǎng)基pH為5.8-6.0，滅菌后備用；
步驟二、外植體準(zhǔn)備：按常規(guī)方法用煙草種子獲得無(wú)菌煙草植株，長(zhǎng)至5、6片葉時(shí)，取其自上而下的第3片葉，在無(wú)菌條件下，切除葉柄以上2mm葉片部分和葉尖以下2mm葉片部分，再沿主脈兩側(cè)分切成方形切片，作煙草葉片外植體，方形切片可以切成大小約為5mm×5mm，備用，需要說(shuō)明的是，前述的沿主脈切片是指棄用了葉片左右兩側(cè)的邊緣葉片部分，只要主脈兩側(cè)的葉片部分；
步驟三、接種培養(yǎng)與記錄：將步驟二獲得的煙草葉片外植體在無(wú)菌條件下接入步驟一的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)30天。
對(duì)比例1：
為了說(shuō)明本發(fā)明的用靈發(fā)素誘導(dǎo)煙草葉片再生植株的方法的效果，本發(fā)明的發(fā)明人以實(shí)施例3的方法，將誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的靈發(fā)素濃度依次設(shè)定為：3.0mg/L，3.5mg/L，4.0mg/L，4.5mg/L和5.0mg/L，并以參考李勝彬等2010年的技術(shù)配方下得到的培養(yǎng)基(其配方為：MS+IAA0.5mg/L+6-BA0.1mg/L)為對(duì)照組(CK)，培養(yǎng)基均調(diào)pH5.8-6.0，常規(guī)滅菌，在上述6組試驗(yàn)中每組接種10瓶，每瓶接種2個(gè)方形切片的煙草葉片外植體(煙草葉片外植體獲取方法同實(shí)施例3)，按照實(shí)施例3的方法培養(yǎng)30天終止試驗(yàn)；
對(duì)對(duì)比例1的6組試驗(yàn)獲得的煙草葉片再生植株，每組隨機(jī)各取5瓶無(wú)污染者，統(tǒng)計(jì)：植株發(fā)生率＝發(fā)生再生植株切片數(shù)/接種切片數(shù)×100％；株數(shù)/切片、葉片數(shù)/株、根數(shù)/株。記錄3批次平均值。結(jié)果如表1所示。
表1.不同濃度靈發(fā)素誘導(dǎo)煙草葉片再生植株的效果及其與傳統(tǒng)技術(shù)(CK)的對(duì)比
表1中，序號(hào)6(CK)的配方參考李勝彬，等(2010)的研究結(jié)果擬定；葉片以展開(kāi)成扇形者計(jì)數(shù)；根以肉眼可辨其長(zhǎng)度(≥2mm)者計(jì)數(shù)。
由表1中6個(gè)案例對(duì)比得到，用靈發(fā)素單一誘導(dǎo)劑配制的煙草再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其效果全面優(yōu)于由IAA(吲哚乙酸)和6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)復(fù)配成的傳統(tǒng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基：①在有效濃度之內(nèi)，再生植株發(fā)生率(％)普遍高于CK組；②每個(gè)外植體切片(0.25cm2)日均獲得株數(shù)平均是CK組的1.7倍[解釋?zhuān)?0.23+0.28+0.30+0.34+0.34)/5/0.18＝1.66≈1.7]，最佳濃度4.5mg/L則達(dá)CK組的1.9倍(解釋?zhuān)?.34/0.18＝1.89≈1.9)。若將切片面積換算成1.00cm2，則每1.00cm2葉片外植體每天平均收獲再生植株可達(dá)1.19個(gè)[解釋?zhuān)?0.23+0.28+0.30+0.34+0.34)×4/5＝1.19]，是李勝彬，等(2010年)方法0.75個(gè)的1.6倍；③單株葉片數(shù)和根數(shù)都超過(guò)CK組，而且達(dá)到生產(chǎn)用苗的標(biāo)準(zhǔn)。所以，本發(fā)明所建立的技術(shù)方法是一種簡(jiǎn)單、高效、優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)煙草再生植株的方法，具有實(shí)用價(jià)值。
這里說(shuō)明的設(shè)備數(shù)量和處理規(guī)模是用來(lái)簡(jiǎn)化本發(fā)明的說(shuō)明的。對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用、修改和變化對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開(kāi)如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書(shū)和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的實(shí)施例。