一種引導(dǎo)組織再生膜的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種引導(dǎo)組織再生膜的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 引導(dǎo)組織再生（GTR)的概念在1982年由Nyman等首次提出，隨后便引起了廣大 學(xué)者的關(guān)注，被應(yīng)用于多種軟硬組織的修復(fù)與再生研宄中，如骨缺損、皮膚創(chuàng)傷和肌腱斷裂 等。引導(dǎo)組織再生技術(shù)的基本原理是通過(guò)膜的物理屏障功能，將缺損部位與周圍組織相隔 離并支持一定的組織生存空間，阻止結(jié)締組織、上皮細(xì)胞進(jìn)入缺損區(qū)，從而使得組織修復(fù)再 生能力得到最大程度的發(fā)揮。
[0003] 牙種植中常用膜可根據(jù)其能否在體內(nèi)被吸收、降解分為不可吸收性膜與可吸收性 膜。具有生物可降解性的可吸收性膜是目前GTR技術(shù)研宄較多的一類材料，此種材料的使 用中必須掌握好組織再生與材料降解吸收之間的關(guān)系。理想的可吸收性膜，能選擇性地引 導(dǎo)組織再生，當(dāng)這一過(guò)程完成時(shí)，膜性材料將被完全降解吸收。因此，可吸收性GTRM應(yīng)具 備以下幾個(gè)條件：①能選擇性的引導(dǎo)細(xì)胞再生；②具有良好的生物組織相容性及細(xì)胞親和 性；③具有良好的機(jī)械屏障作用，分隔不同細(xì)胞；④在被修復(fù)的組織面與膜之間能保持一 定空間（膜應(yīng)具有一定的厚度和機(jī)械強(qiáng)度，防止塌陷）；⑤膜的降解速率有可預(yù)測(cè)性，降解 時(shí)間與組織再生進(jìn)程要協(xié)調(diào)；⑥膜降解過(guò)程不妨礙傷口的愈合，降解產(chǎn)物在有機(jī)體內(nèi)無(wú)不 良反應(yīng)；⑦無(wú)免疫原性；⑧具有一定的柔韌性和臨床可操作性。不可吸收性膜為非生物降 解性材料，包括鈦膜、聚四氟乙烯膜（e-PTFE)、微孔濾膜、纖維素膜，臨床上廣泛應(yīng)用的是前 二種引導(dǎo)膜材料，其中，鈦膜由于表面光滑不利組織的附著，應(yīng)用時(shí)既要有足夠大小保證有 效的細(xì)胞屏障作用，又要讓黏骨膜瓣與深部的缺損區(qū)有足夠的接觸面才能避免創(chuàng)口裂開， 且其使用后存在傷口裂開和膜暴露等常見并發(fā)癥；聚四氟乙烯膜是引導(dǎo)組織再生技術(shù)最早 采用的一種生物膜，它不可降解，不會(huì)引起組織發(fā)生炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 與臨床研宄證實(shí)e-PTFE膜具有柔韌性、良好的生物相容性和容易操作等優(yōu)點(diǎn)，能夠保證理 想的成骨效果，但因其不可吸收，e-PTFE生物膜在臨床應(yīng)用中存在較多的并發(fā)癥，如黏膜裂 開、膜暴露、感染等。這些并發(fā)癥的出現(xiàn)常導(dǎo)致成骨失敗，因此不可吸收膜在臨床上使用得 越來(lái)越少，有被可吸收生物膜取代的趨勢(shì)。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的天然膜材料在凍干福照后，天然的膠原蛋白會(huì)被大幅破壞，最終 導(dǎo)致撕裂力下降，降解速度加快，不能起到很好的屏障作用，無(wú)法分隔不同類型的細(xì)胞長(zhǎng) 入，并且現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的天然膜材料添加大量脫脂、脫細(xì)胞試劑，對(duì)膜的破壞相對(duì)較大，往 往導(dǎo)致膜的部分性能的大幅降低。現(xiàn)有技術(shù)中也有用交聯(lián)劑交聯(lián)天然膜材料來(lái)提高產(chǎn)品撕 裂力和耐降解性能，但由于交聯(lián)后的產(chǎn)品降解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不適用于在牙種植治療方面的應(yīng) 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種引導(dǎo)組織再生膜的制備方法。
[0006] 本發(fā)明提供的引導(dǎo)組織再生膜的制備方法包括如下步驟：
[0007] (1)使用表面活性劑溶液浸泡處理離體動(dòng)物的皮膚，得到表面活性劑處理后的皮 膚；
[0008] (2)使用堿溶液浸泡處理步驟（1)中所述表面活性劑處理后的皮膚，得到堿溶液 處理后的真皮組織；
[0009] (3)使用過(guò)氧化物溶液浸泡處理步驟（2)中所述堿溶液處理后的真皮組織，得到 過(guò)氧化物處理后的真皮組織；
[0010] (4)使用輻照保護(hù)試劑溶液浸泡處理步驟（3)中所述過(guò)氧化物處理后的真皮組 織，得到輻照保護(hù)試劑溶液處理后的真皮組織；
[0011] (5)使用緩沖液浸泡處理步驟（4)中所述輻照保護(hù)試劑溶液處理后的真皮組織， 得到緩沖液處理后的真皮組織；
[0012] (6)將步驟（5)中所述緩沖液處理后的產(chǎn)物依次進(jìn)行冷凍干燥和輻照滅菌，得到 所述引導(dǎo)組織再生膜。
[0013] 上述方法中，所述步驟（4)中，所述輻照保護(hù)試劑為類黃酮類輻照保護(hù)劑；所述類 黃酮類輻照保護(hù)劑可為黃芩素、芹菜素、山奈酚、楊梅素、槲皮素或甘草素。
[0014] 上述方法中，所述類黃酮類輻照保護(hù)劑為黃芩素。
[0015] 上述方法中，所述輻照保護(hù)試劑溶液中，所述輻照保護(hù)試劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0? 01-0. 5%〇
[0016] 上述方法中，所述步驟（4)中，所述浸泡處理的溫度為8-20°C ;所述浸泡處理的時(shí) 間為l_18h。
[0017] 上述方法中，
[0018] 所述步驟（1)中，所述表面活性劑為TritonX-100、Tween_8〇或Tween-40 ;
[0019] 所述步驟（2)中，所述堿溶液為堿性化合物水溶液；所述堿性化合物為NaOH或 K0H ;所述堿性化合物具體為NaOH ;
[0020] 所述步驟（3)中，所述過(guò)氧化物溶液為過(guò)氧化物水溶液；所述過(guò)氧化物為1120 2;
[0021] 所述步驟（5)中，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
[0022] 上述方法中，
[0023] 所述表面活性劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1-5% ;
[0024] 所述堿性化合物水溶液中，所述堿性化合物的濃度為0. l_5mol/L ;
[0025] 所述過(guò)氧化物水溶液中，所述H202的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-5 % ;
[0026] 所述緩沖液的pH值為5. 0-8. 0。
[0027] 上述方法中，
[0028] 所述步驟（1)中浸泡處理的溫度為0_25°C ;所述浸泡處理的時(shí)間為20_48h ;
[0029] 所述步驟⑵中浸泡處理的溫度為0_25°C ;所述浸泡處理的時(shí)間為4_18h ;
[0030] 所述步驟（3)中所述浸泡處理的時(shí)間為l_5h ;
[0031] 所述步驟（5)中所述浸泡處理的時(shí)間為5_48h ;
[0032] 所述步驟（6)中輻照的劑量為15_25KGy。
[0033] 上述方法中，所述動(dòng)物為家畜；所述家畜為?；蜇i。
[0034] 上述方法中，所述家畜為牛；所述牛為12個(gè)月以下的牛。
[0035] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述方法制備得到的引導(dǎo)組織再生膜。
[0036] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供上述引導(dǎo)組織再生膜在制備牙種植或輔助骨再生 或引導(dǎo)組織生長(zhǎng)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0037] 本發(fā)明制備的引導(dǎo)組織再生膜采用了低毒性、無(wú)刺激性異味、殘留可控和安全有 效的天然提取物類黃酮類試劑-黃芩素作為穩(wěn)定有效的輻照保護(hù)劑，最大化降低了輻照過(guò) 程對(duì)產(chǎn)品固有蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，從而降低了輻照過(guò)程對(duì)產(chǎn)品撕裂力和降解速度的影響。通 過(guò)實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明引導(dǎo)組織再生膜可用于輔助骨再生和引導(dǎo)組織生長(zhǎng)。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1為本發(fā)明制備的引導(dǎo)組織再生膜的掃描電鏡圖。其中，圖1A為未用輻照保護(hù) 劑處理得到的引導(dǎo)組織再生膜的掃描電鏡圖；圖1B為用輻照保護(hù)劑處理得到的引導(dǎo)組織 再生膜的掃描電鏡圖。
[0039] 圖2為引導(dǎo)組織再生膜的切片圖。
[0040] 圖3為皮下植入引導(dǎo)組織再生膜后的體內(nèi)降解圖。
[0041] 圖4為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)植入材料后骨組織生長(zhǎng)情況的組織切片。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0043] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0044] 下述實(shí)施例中的黃芩素是陜西昊辰生物科技有限公司的產(chǎn)品，分子式：C15H 1(i05。
[0045] 下述實(shí)施例中的磷酸鹽緩沖液的制備方法：稱7. 9g NaCl、0. 2g KC1、0. 24g KH2P04 和1. 8g K2HP04，溶于800ml蒸餾水中，用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至6. 8,最后加蒸餾水定容至 lL〇
[0046] 實(shí)施例1、引導(dǎo)組織再生膜的制備
[0047] 一、實(shí)驗(yàn)組1
[0048] 1、選料：由專人從規(guī)范化管理的屠宰廠中收集新鮮的出生小牛（12個(gè)月以下）的 皮膚，盡量避免接觸污染物，收集后立即冷凍儲(chǔ)存；
[0049] 2、預(yù)處理：將離體的皮膚解凍后對(duì)其充分清洗，并去除不適宜加工的部分，得到預(yù) 處理后的產(chǎn)品；
[0050] 3、表面活性劑處理：使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的TrironX-100水溶液浸泡預(yù)處理后的 產(chǎn)品，并振蕩過(guò)夜（24h