一種羥基磷灰石增強角蛋白復合骨材的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明提供了一種羥基磷灰石增強角蛋白復合骨材的制備方法，屬于生物復合材料與生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]由于自然資源的過度開發(fā)與使用，人類越來越關注如何利用可再生的天然資源制備出各種新型生物材料。我國紡織和畜牧業(yè)每年產(chǎn)生大量的廢棄動物毛發(fā)纖維，對環(huán)境造成極大污染。而毛發(fā)纖維中含有大量角蛋白，角蛋白因其具有良好的生物相容性，能支持多種細胞粘附和分化，適用于重建組織工程材料，近年來，以角蛋白為基材的各種生物膜及支架材料也應運而生。
[0003]羥基磷灰石是人類骨骼和牙齒的主要無機成分，是一種具有良好生物相容性和生物活性的材料，在植入人體后能在短時間內(nèi)與人體硬組織緊密結(jié)合，從而促進骨細胞的增值分化，并提供骨誘導因子。因而由羥基磷灰石組成的復合材料也在迅速發(fā)展，有望成為一種新型的骨修復材料。
[0004]雖然角蛋白和羥基磷灰石都具有良好的生物相容性，但是由于純角蛋白的硬度低且純羥基磷灰石材料韌性不足，兩者相復合制備的復合多孔支架材料呈現(xiàn)脆性，從而限制了它們在骨修復材料領域中的應用。天然骨主要是由羥基磷灰石和膠原蛋白復合而成，具有一定的力學強度、韌性及微孔結(jié)構(gòu)。因此，想要開發(fā)羥磷灰石增強角蛋白復合骨材，首要解決的問題是提高該復合材料的力學性能。
[0005]中國專利(102908664 A)，該發(fā)明將水溶液中共沉淀得到的磷灰石與角蛋白復合物沖洗、過濾，最后通過凍干的方式制備成磷灰石/角蛋白復合支架，可用于骨組織的再生，并隨著骨組織的生成最終降解。
[0006]外國學者Akira Tachibana在2005年的報道中提出，將通過還原法從羊毛中提取到的角蛋白溶液用冷凍干燥的方法制備出角蛋白支架，然后把角蛋白支架放入含有羥基磷灰石微粒的PBS溶液中，I小時后取出并清洗、凍干得到羥基磷灰石/角蛋白復合支架(生物材料，2005 (3) 297-302)。研宄結(jié)果表明溶液中70%的羥基磷灰石都嵌入在角蛋白支架上，制備出的復合支架也能較好的誘導成骨細胞的生成和分化。
[0007]以上專利和文獻報道均從不同方面對角蛋白復合支架進行了報道，并充分證明了羥基磷灰石與角蛋白復合制成具有生物相容性多孔支架材料的可行性，試驗中得到的復合支架具有較好的孔隙率和生物相容性，但所得的支架抗壓強度低無法滿足作為骨支架的要求，從而限制了該材料的廣泛運用。因此本發(fā)明從提高羥基磷灰石/角蛋白復合材料力學性能的角度出發(fā)，對該復合材料進行增強處理，從而提高羥基磷灰石/角蛋白復合支架作為骨替代材料的使用性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種羥基磷灰石增強角蛋白復合骨材的制備方法，該方法制備羥基磷灰石增強角蛋白復合骨材的抗壓強度為200-800KPa，能夠滿足非承重骨骼短期修復使用過程中的力學性能要求。
[0009]本發(fā)明采取如下技術方案:
[0010]①將天然角蛋白纖維開松、除雜后剪斷成5-10mm的纖維段，然后用石油醚和去離子水清洗去除油脂等雜質(zhì)，自然風干；
[0011]②將上述毛纖維以固液比為10-16g/250ml浸入到PH為9的還原劑和變性劑混合溶液中，在50°C _80°C條件下攪拌4-8h，攪拌速度為100-300r/min ；
[0012]③將上述攪拌后的混合溶液用100目篩網(wǎng)過濾除去未反應的毛纖維，而后將過濾得到的溶液在室溫條件下透析36h，得到角蛋白溶液；
[0013]④將上述角蛋白溶液進行離心除雜，離心速度為3000rmp/min-8000rmp/min，離心時間10min-30min，而后濃縮得到濃度為50mg/ml-150mg/ml的純角蛋白溶液；
[0014]⑤將羥基磷灰石按質(zhì)量百分比濃度為1% -15%加入上述純角蛋白溶液中，經(jīng)超聲分散使兩者均勻混合，而后將混合溶液注入模具進行快速冷凍，再經(jīng)冷凍干燥的方式得到羥基磷灰石/角蛋白復合多孔材料。
[0015]⑥將上述羥基磷灰石/角蛋白復合多孔材料浸入pH = 7.4的PBS溶液中，并保持水浴溫度為37°C，待1-7天后取出支架清洗，再經(jīng)冷凍干燥，得到羥基磷灰石增強角蛋白復合骨材。
[0016]所述的天然角蛋白纖維為廢棄人發(fā)、羊毛、豬毛、兔毛、牛毛或駝毛。
[0017]所述的還原劑為巰基乙醇(又稱為β -巰基乙醇)、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鉀、亞硫酸氫鉀或偏重亞硫酸鈉，還原劑的質(zhì)量百分比濃度為4% -7%。
[0018]所述的蛋白質(zhì)變性劑為尿素、硫脲或溴化鋰，蛋白質(zhì)變性劑的質(zhì)量百分比濃度為15-25%。
[0019]所述的超聲分散具體為:將羥基磷灰石與純角蛋白溶液的混合物放入玻璃儀器中，以50-100W的功率和20-40Ηζ的頻率超聲振蕩10_30min。
[0020]本發(fā)明所用的羥基磷灰石和廢棄角蛋白天然纖維來源廣泛、成本低廉，所制備的羥基磷灰石增強角蛋白復合骨材安全無毒，具有良好的生物相容性，有利于細胞的快速生長和分化。
[0021]本發(fā)明中采用的羥基磷灰石/角蛋白復合多孔材料增強處理顯著改善了羥基磷灰石增/蛋白復合多孔材料的力學性能，并完善羥基磷灰石/角蛋白復合多孔材料的孔隙結(jié)構(gòu)，操作方法簡單，成本低，所得羥基磷灰石增強角蛋白復合骨材的抗壓強度可達200-800KPa，能夠滿足非承重骨骼短期修復使用過程中的力學性能要求，促進了羥基磷灰石/角蛋白復合生物支架材料作為骨替代材料的應用。
【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明方法得到的羥基磷灰石/角蛋白復合多孔材料的截面電鏡圖片，其中角蛋白濃度為110mg/ml，羥基磷灰石含量為5%。
[0023]圖2為羥基磷灰石增強角蛋白復合骨材的截面電鏡圖片，其中角蛋白濃度為110mg/ml，羥基磷灰石含量為5%，PBS溶液中增強處理時間為I天。
[0024]圖3為不同角蛋白濃度的羥基磷灰石增強角蛋白復合骨材的抗壓強度，其中角蛋白濃度依次為70mg/ml、90mg/ml、110mg/ml、130mg/ml，輕基磷灰石含量為5%，PBS溶液中增強處理時間為I天。
[0025]圖4為不同羥基磷灰石含量的角蛋白濃度羥基磷灰石增強角蛋白復合骨材的抗壓強度，其中角蛋白濃度為110mg/ml，羥基磷灰石含量為依次為1%、3%、5%、7%，PBS溶液中增強處理時間為I天。
[0026]圖5為不同增強處理時間條件下角蛋白濃度羥基磷灰石增強角蛋白復合骨材的抗壓強度，其中角蛋白濃度為110mg/ml，羥基磷灰石含量為5%，PBS溶液中增強處理時間依次為1、3、5、7天。
【具體實施方式】
[0027]下面通過實施例來具體說明本發(fā)明。
[0028]實施例1
[0029]將人發(fā)纖維開松、除雜后切斷成5-10mm長的纖維段，然后清洗晾干，以固液比為14g/250ml浸入到含有還原劑和蛋白質(zhì)變性劑的溶液中，其中還原劑為巰基乙醇，質(zhì)量百分比濃度為5% ;蛋白質(zhì)變性劑為尿素，質(zhì)量百分比濃度為25%，混合溶液PH為9，在60°C條件下對混合物攪拌8h，攪拌器轉(zhuǎn)速200r/min?；旌衔锝?jīng)100目篩網(wǎng)過濾去除未反應纖維，然后在室溫下將過慮得到的溶液進行透析，而后離心處理去除沉淀物質(zhì)，離心速度5000rpm/min，離心時間15min。對離心得到的上清液進行濃縮處理，得到質(zhì)量濃度為110mg/ml的純角蛋白溶液。
[0030]向110mg/ml的純角蛋白溶液中加入5%的羥基磷灰石，以功率50W和頻率20kHz超聲波振蕩處理15min，使羥基磷灰石在角蛋白溶液中均勻分散，將混合溶液注入模具后快速冷凍，而后經(jīng)冷凍干燥制得羥基磷灰石/角蛋白復合多孔材料。將得到的羥基磷灰石/角蛋白復合多孔材料放入PBS溶液中，水浴溫度為37°C下增強處理3天，而后取出，再次冷凍干燥得到羥基磷灰石增強角蛋白復合骨材。
[0031]實施例2
[0032]將羊毛纖維開松、除雜后切斷成5-10mm長的纖維段，然后清洗晾干，以固液比為10g/250ml浸入到含有還原劑和蛋白質(zhì)變性劑的溶液中，其中還原劑為偏重亞硫酸鈉，質(zhì)量百分比濃度為7% ;蛋白質(zhì)變性劑為硫脲，質(zhì)量百分比濃度為20%，混合溶液PH為9，在80°C條件下對混合物攪拌4h，攪拌器轉(zhuǎn)速100r/min?；旌衔锝?jīng)100目篩網(wǎng)過濾去除未反應纖維，然后在室溫下將過濾得到的溶液進行透析，而后離心處理去除溶液中沉淀物質(zhì)，離心速度7000rpm/min，離心時間lOmin。對離心得到的上清液進行濃縮處理，得到質(zhì)量濃度為90mg/ml的純角蛋白溶液。
[0033]向90mg/ml的純角蛋白溶液中加入7%的羥基磷灰石，以功率80W和頻率20kHz超聲波振蕩處理lOmin，使羥基磷灰石在角蛋白溶液中均勻分散，將混合溶液注入模具后快速冷凍，而后經(jīng)冷凍干燥制得