專利名稱：具有梯度結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多層功能膜及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及應(yīng)用于引導(dǎo)骨再生技術(shù)的具有梯度結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多層功能膜及其制備方法。
背景技術(shù)：
組織再生技術(shù)已成為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究前沿。細(xì)胞外基質(zhì)在再生過(guò)程中起到支撐組織穩(wěn)定、保護(hù)細(xì)胞和負(fù)載刺激、激發(fā)細(xì)胞功能的生物因子等作用。由此可見，細(xì)胞外基質(zhì)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建是完成組織再生技術(shù)的前提和關(guān)鍵。不僅如此，細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞的作用位點(diǎn)、作用形式也決定了細(xì)胞的生長(zhǎng)行為和組織的功能。由于骨骼結(jié)構(gòu)和功能相對(duì)簡(jiǎn)單，骨再生技術(shù)已成組織再生技術(shù)的先行者，獲得了極大關(guān)注。引導(dǎo)骨再生技術(shù)(guided bone regeneration,GBR)是將再生膜覆蓋在骨缺損區(qū)域，利用膜的屏障作用阻止結(jié)締組織和上皮細(xì)胞向缺損區(qū)域內(nèi)長(zhǎng)入，同時(shí)在膜下形成一個(gè)空間，允許成骨細(xì)胞優(yōu)先遷移、生長(zhǎng)， 達(dá)到骨再生、修復(fù)的目的的一種方法。通過(guò)引導(dǎo)骨組織再生來(lái)修復(fù)大段骨缺損已被一些研究證明是行之有效的手段。
作為引導(dǎo)骨再生技術(shù)的關(guān)鍵，引導(dǎo)骨再生膜(guided bone regeneration membrane, GBRM)應(yīng)具有(1)良好的生物相容性；( 適當(dāng)?shù)慕到庑阅埽牧媳晃蘸蟊苊舛问中g(shù)，減輕病患痛苦與降低治療費(fèi)用；C3)足夠的力學(xué)強(qiáng)度穩(wěn)定性，維持再生區(qū)域的尺寸穩(wěn)定和保護(hù)新生的再生組織；(4)阻隔和通透性，阻止結(jié)締組織和上皮細(xì)胞的侵入，但應(yīng)允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)入和代謝廢物的排除，維持再生區(qū)域的平衡；( 與生物因子和細(xì)胞有良好的親和性等。均勻結(jié)構(gòu)的單層膜材料無(wú)法滿足上述再生技術(shù)對(duì)膜材料的要求。為此， 人們將目光轉(zhuǎn)向非均勻膜和多層膜。但仍然無(wú)法在GBRM發(fā)生降解的過(guò)程中實(shí)現(xiàn)骨再生并完成骨組織的重建。再生技術(shù)中調(diào)節(jié)材料的降解速率與力學(xué)強(qiáng)度的穩(wěn)定已成為一個(gè)至關(guān)重要的問(wèn)題。
用于構(gòu)建GBRM的膜材料主要有不可降解材料和可生物降解材料。前者如聚四氟乙烯和鈦金屬網(wǎng)等，因需要二次手術(shù)、與周圍組織整合性弱和細(xì)胞親和性差等因素限制了其應(yīng)用；后者如聚羥基丙酸(也稱聚乳酸，PLA)、殼聚糖和膠原等，具有良好的細(xì)胞相容性和生物降解性而受到廣泛地研究和關(guān)注。但是由于成膜方法簡(jiǎn)單等因素造成結(jié)構(gòu)單一、力學(xué)強(qiáng)度不高，而且它們的降解速率較快，膠原經(jīng)過(guò)交聯(lián)處理雖可提高其尺寸穩(wěn)定性和力學(xué)強(qiáng)度，但是有些交聯(lián)劑具有細(xì)胞毒性或與組織的整合性差。還有學(xué)者開發(fā)了天然橡膠和聚酰胺等再生膜，但這些材料在化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)方面與天然骨組織中的膠原相差較大。
絲素蛋白具有高力學(xué)強(qiáng)度、良好的生物相容性、抗原反應(yīng)低、來(lái)源豐富、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。通過(guò)控制結(jié)晶形態(tài)、微結(jié)構(gòu)甚至制備工藝等措施都可以調(diào)節(jié)絲素蛋白的降解速率，使其在超過(guò)1年的時(shí)間內(nèi)不喪失力學(xué)強(qiáng)度(與實(shí)現(xiàn)完全骨再生修復(fù)需要ι年左右的時(shí)間相匹配)，2年內(nèi)被完全吸收，也保證了 GBR的尺寸和形狀穩(wěn)定， 有利于組織再生。由此可見，絲素蛋白是非常適合用作引導(dǎo)骨再生膜材料。此外，絲素蛋白具有良好的磷灰石沉積能力。在引導(dǎo)骨再生膜中加入磷酸鈣不僅提供骨礦化時(shí)需要的磷和鈣元素，還可能會(huì)誘導(dǎo)成骨，增加與成骨細(xì)胞的親和性。邵正中等人(一種全絲素蛋白復(fù)合材料及其制備方法，中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?0071017182 采用定向排列的脫膠蠶繭絲以作為增強(qiáng)層，再用高濃度絲素蛋白水溶液進(jìn)行澆鑄成膜的方法，獲得了一種高性能的全絲素蛋白復(fù)合材料，但仍然是單層致密膜。
因此，引導(dǎo)骨再生膜若滿足引導(dǎo)骨再生技術(shù)的要求，必須在力學(xué)強(qiáng)度、降解速率和再生速率之間達(dá)到一個(gè)理想的平衡，并為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供一個(gè)適當(dāng)?shù)募?xì)胞外微環(huán)境。采用具有不同微結(jié)構(gòu)和功能的多層結(jié)構(gòu)的薄膜可以滿足上述要求，實(shí)現(xiàn)引導(dǎo)骨再生。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服上述存在的不足而提出了一種具有梯度結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多層功能膜及其制備方法，該方法制備工藝條件簡(jiǎn)單，所制備的多層功能膜具有良好的力學(xué)性能，并為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供一個(gè)適當(dāng)?shù)募?xì)胞外微環(huán)境。
本發(fā)明的技術(shù)方案為一種具有梯度結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多層功能膜，其特征在于該多層功能膜由阻隔層、中間層和多孔層組成；其中，阻隔層為含有納米孔的絲素薄膜，中間層為表面涂有磷酸鈣的絲素蛋白紡織物，多孔層為可降解多孔絲素蛋白支架。
所述的磷酸鈣為磷灰石、磷酸八鈣、磷酸氫鈣或無(wú)定形磷酸鈣中的一種或它們的組合。
本發(fā)明還提供了上述具有梯度結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多層功能膜的制備方法，其具體步驟如下
A)采用交替浸漬法在絲素紡織物表面涂覆磷酸鈣涂層將絲素紡織物浸入濃度為0. Olmol .L—1 1. OOmol -L"1的鈣源溶液中浸泡0. 5h 池后取出，用蒸餾水浸洗后，再將其浸入濃度為0. Olmol · L—1 Imol · L—1的磷源溶液中浸泡0. 5h 池后取出；如此重復(fù)交替浸漬5 60次，清洗干燥后形成磷酸鈣-絲素蛋白紡織物復(fù)合膜即中間層，其中控制鈣源和磷源溶液的溫度均為5°C 60°C ；
B)將可溶性聚合物-絲素蛋白混合溶液澆鑄在磷酸鈣-絲素蛋白紡織物復(fù)合膜表面上，在5°C 60°C干燥成膜后，再放入真空干燥箱干燥24h 72h，然后再放入醇中浸泡處理后，最后溶解去除可溶性聚合物即可獲得含有中間層和阻隔層的雙層膜；
C)在雙層膜的中間層上澆鑄絲素蛋白溶液，用冷凍干燥后在阻隔層-中間層雙層膜上構(gòu)建多孔膜；再將膜置于京尼平(Genipin)交聯(lián)反應(yīng)，洗滌干燥后得具有梯度結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多層功能膜。
優(yōu)選步驟A)所述的鈣源溶液為乙酸鈣、硝酸鈣或氯化鈣溶液；所述的磷源溶液為磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸銨、磷酸氫銨或磷酸二氫銨溶液。
優(yōu)選步驟B)中所述的可溶性聚合物-絲素蛋白混合溶液中可溶性聚合物占絲素蛋白質(zhì)量的百分含量為 30%，絲素蛋白溶液的濃度為10g/L 100g/L;所述的醇是甲醇或乙醇；膜放入醇中浸泡處理溫度在10°C 60°C，處理時(shí)間為0. 5h 池；溶解去除可溶性聚合物的溶液優(yōu)選為5°C 90°C的水；優(yōu)選所述的可溶性聚合物為聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、聚乙烯醇(PVA)或聚乙二醇(PEG)。
優(yōu)選步驟C)中絲素蛋白溶液的濃度為10g/L 100g/L;再將膜置于京尼平(Genipin)交聯(lián)反應(yīng)時(shí)為了提高各層間的結(jié)合強(qiáng)度，京尼平交聯(lián)反應(yīng)是將多層膜浸泡在 10°C 80°C下的京尼平溶液中處理池 48h ；其中京尼平溶液的濃度為lg/L 50g/L。
本發(fā)明所述的具有梯度結(jié)構(gòu)的多層膜?？梢岳肦GD或BMP功能分子對(duì)多層膜中的多孔層進(jìn)行生物功能修飾，改善多孔層的生物性能。
有益效果
與現(xiàn)有的引導(dǎo)骨再生膜相比，本發(fā)明制得的多層膜含有三層①阻隔層含有納米孔，主要是起到阻隔和通透的作用；②中間層為力學(xué)強(qiáng)度層，提供骨再生過(guò)程需要的力學(xué)強(qiáng)度和膜材料在降解過(guò)程中的尺寸穩(wěn)定；③多孔層為生物功能層，作為細(xì)胞外基質(zhì)提供細(xì)胞外微環(huán)境，引導(dǎo)甚至誘導(dǎo)骨細(xì)胞和/或干細(xì)胞在多孔支架內(nèi)的粘附、增殖和分化。多層功能膜在再生過(guò)程中的降解速率和力學(xué)強(qiáng)度下降速率與骨再生的速率相匹配；在多孔層構(gòu)筑微納結(jié)構(gòu)和引入BMP、RGD等生物分子實(shí)現(xiàn)高生物學(xué)響應(yīng)的多孔微環(huán)境，提高骨再生過(guò)程中的骨引導(dǎo)和骨誘導(dǎo)能力，加速骨再生速率。


圖1為具有的梯度結(jié)構(gòu)多層功能膜的結(jié)構(gòu)示意圖其中，1-多孔層，2-中間層和 3-阻隔層；
圖2為化學(xué)沉積法在絲素蛋白紡織物表面沉積取向磷酸鈣的SEM照片；
圖3為絲素蛋白紡織物/絲素蛋白多孔支架復(fù)合膜的橫斷面SEM照片。
具體實(shí)施方式
以下利用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但不能認(rèn)為限制發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
取0. 05g的絲素蛋白紡織物，浸入濃度為0. 167mol · L—1、溫度為37°C的鈣源溶液中浸泡0. 5h后取出，用蒸餾水浸洗2遍，再將其浸入濃度為0. IOOmol · L—1的磷源溶液中0.證。如此重復(fù)交替浸漬6次后用蒸餾水和乙醇分別清洗3遍后，室溫干燥即獲得磷酸鈣-絲素蛋白紡織物復(fù)合膜(中間層)。從圖2所示的中間層的SEM照片，可以看出絲素蛋白上沉積了磷酸鈣。
將0. 3gPVP加入到20ml濃度為50g/L的絲素蛋白溶液中形成PVP-絲素蛋白混合溶液(其中PVP與絲素蛋白的質(zhì)量百分比為30% )，將該混合溶液澆鑄在中間層表面上在 10°C干燥成膜后，再放入真空干燥箱干燥24h得到含有中間層和阻隔層的雙層膜。雙層膜用40°C甲醇處理30min后放入大量去離子水中在50°C下溶去PVP后形成由中間層和阻隔層組成的雙層膜。從圖3所示的多孔層層的SEM照片，可以看出多孔層含有大量的連續(xù)孔。
將雙層膜鋪平整，倒入濃度為50g/L的絲素蛋白溶液，冷凍干燥后，得到由阻隔層、中間層和多孔層組成的多層膜。
將上述多層膜置于濃度為5g/L的京尼平水溶液中，于37°C下交聯(lián)反應(yīng)24h后，洗滌干燥后即得多層膜(結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示)。
實(shí)施例2
取0. IOg的絲素蛋白紡織物，浸入濃度為0. IOOmol · L_\溫度為50°C的鈣源溶液中浸泡后，取出，用蒸餾水浸洗3遍，再將其浸入濃度為0. 150mol化入溫度為50°C的磷源溶液中2h。如此重復(fù)交替浸漬15次后用蒸餾水和乙醇分別清洗3遍后，室溫干燥即獲得磷酸鈣-絲素蛋白紡織物復(fù)合膜(中間層)。
將0.5g PEG加入到20ml濃度為100g/L的絲素蛋白溶液中形成PEG-絲素蛋白混合溶液(PEG與絲素蛋白的質(zhì)量百分比為25% )，將該混合溶液澆鑄在中間層表面上在 50°C干燥成膜后，再放入真空干燥箱干燥4 得到含有中間層和阻隔層的雙層膜。雙層膜用60°C乙醇處理Ih后放入大量去離子水中在80°C下溶去PEG后形成由中間層和阻隔層組成的雙層膜。
將雙層膜鋪平整，倒入濃度為100g/L的絲素蛋白溶液，冷凍干燥后，得到由阻隔層、中間層和多孔層組成的多層膜。
將上述多層膜置于濃度為10g/L的京尼平水溶液中，于60°C下交聯(lián)反應(yīng)4 后，洗滌干燥后即得多層膜。
實(shí)施例3
取0. 50g的絲素蛋白紡織物，浸入濃度為0. 800mol · L—1、溫度為20°C的鈣源溶液中浸泡池后，取出，用蒸餾水浸洗3遍，再將其浸入濃度為0. 600mol化入溫度為20°C的磷源溶液中2h。如此重復(fù)交替浸漬50次后用蒸餾水和乙醇分別清洗3遍后，室溫干燥即獲得磷酸鈣-絲素蛋白紡織物復(fù)合膜(中間層)。
將0. 16g PVA加入到20ml濃度為80g/L的絲素蛋白溶液中形成PVA-絲素蛋白混合溶液(PEG與絲素蛋白的質(zhì)量百分比為10% )，將該混合溶液澆鑄在中間層表面上在 40°C干燥成膜后，再放入真空干燥箱干燥64h得到含有中間層和阻隔層的雙層膜。雙層膜用10°C乙醇處理池后放入大量去離子水中在10°C下溶去PVA后形成由中間層和阻隔層組成的雙層膜。
將雙層膜鋪平整，倒入濃度為20g/L的絲素蛋白溶液，冷凍干燥后，得到由阻隔層、中間層和多孔層組成的多層膜。
將上述多層膜置于濃度為30g/L的京尼平水溶液中，于70°C下交聯(lián)反應(yīng)Mi后，洗滌干燥后即得多層膜。
權(quán)利要求
1.一種具有梯度結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多層功能膜，其特征在于該多層功能膜由阻隔層 (1)、中間層⑵和多孔層(3)組成；其中，阻隔層⑴為含有納米孔的絲素薄膜，中間層(2) 為表面涂有磷酸鈣的絲素蛋白紡織物，多孔層( 為可降解多孔絲素蛋白支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有梯度結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多層功能膜，其特征在于所述的磷酸鈣為磷灰石、磷酸八鈣、磷酸氫鈣或無(wú)定形磷酸鈣中的一種或它們的組合。
3.一種制備如權(quán)利要求1所述的具有梯度結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多層功能膜的方法，其具體步驟如下A)采用交替浸漬法在絲素紡織物表面涂覆磷酸鈣涂層將絲素紡織物浸入濃度為 0. Olmol · L—1 1. OOmol · L—1的鈣源溶液中浸泡0. 5h 池后取出，用蒸餾水浸洗后，再將其浸入濃度為0. Olmol · L—1 Imol · L—1的磷源溶液中浸泡0. 5h 池后取出；如此重復(fù)交替浸漬5 60次，清洗干燥后形成磷酸鈣-絲素蛋白紡織物復(fù)合膜即中間層，其中控制鈣源和磷源溶液的溫度均為5°C 60°C ；B)將可溶性聚合物-絲素蛋白混合溶液澆鑄在磷酸鈣-絲素蛋白紡織物復(fù)合膜表面上，在5°C 60°C干燥成膜后，再放入真空干燥箱干燥24h 72h，然后再放入醇中浸泡處理后，最后溶解去除可溶性聚合物即可獲得含有中間層和阻隔層的雙層膜；C)在雙層膜的中間層上澆鑄絲素蛋白溶液，用冷凍干燥后在阻隔層-中間層雙層膜上構(gòu)建多孔膜；再將膜置于京尼平溶液中交聯(lián)反應(yīng)，洗滌干燥后得具有梯度結(jié)構(gòu)的絲素蛋白多層功能膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟A)所述的鈣源溶液為乙酸鈣、硝酸鈣或氯化鈣溶液；所述的磷源溶液為磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、 磷酸二氫鉀、磷酸銨、磷酸氫銨或磷酸二氫銨溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟B)中所述的可溶性聚合物-絲素蛋白混合溶液中可溶性聚合物占絲素蛋白質(zhì)量的百分含量為 30%，絲素蛋白溶液的濃度為10g/L 100g/L ；所述的可溶性聚合物為聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或聚乙二醇；所述的醇是甲醇或乙醇；溶解去除可溶性聚合物的溶液為5°C 90°C的水。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟C)中絲素蛋白溶液的濃度為10g/L 100g/L ；京尼平交聯(lián)反應(yīng)是將多層膜浸泡在10°C 80°C下的京尼平溶液中處理池 48h ； 其中京尼平溶液的濃度為lg/L 50g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種梯度結(jié)構(gòu)的絲素多層功能膜及其制備方法；利用具有納米孔的絲素蛋白膜作為阻隔層，控制絲素蛋白的結(jié)晶形態(tài)和孔結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)其對(duì)結(jié)締組織的阻隔作用和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換；利用高強(qiáng)度的絲素蛋白紡織物/磷酸鈣復(fù)合材料作為中間層提供引導(dǎo)骨再生膜的力學(xué)強(qiáng)度和尺寸穩(wěn)定性；利用絲素蛋白構(gòu)筑多孔層，調(diào)節(jié)多孔層的降解行為、細(xì)胞親和性、提供細(xì)胞外基質(zhì)和骨再生的生長(zhǎng)空間。采用交聯(lián)處理增加不同層之間的整合性。該多層功能膜具有良好的骨再生能力，且其降解速率和力學(xué)強(qiáng)度與骨再生速率相匹配。
文檔編號(hào)A61L31/14GK102512712SQ20111043555
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者李延報(bào), 江蕓, 程新, 許仲梓, 陸春華 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)