本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及五羥基黃酮類化合物在制備具有3C蛋白酶活性抑制作用的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

3C蛋白酶是催化小RNA病毒前體蛋白中非結(jié)構(gòu)蛋白裂解的關(guān)鍵蛋白酶，具有高度的酶切特異性，在病毒的生命周期中起著舉足輕重的作用，抑制其催化功能可有效抑制病毒前體蛋白的切割，阻斷病毒復(fù)制，是小RNA病毒藥物治療研究的靶點之一。3C蛋白酶的識別位點為Leu Glu Val Leu Phe Gln↓GlyPro，而切割位點在Gln—G1y之間，稱為Q-G位點。3C蛋白酶具有典型的半胱氨酸蛋白酶特征?；騁ly-X-Cys-Gly，通過氫鍵網(wǎng)絡(luò)將具有催化活性的氨基酸Cys、His、Asp或Glu連接形成活性催化基團；同時該催化基團按照Cys-His-Glu/Asp次序依次發(fā)揮催化酶解功能。

3C蛋白酶基因還具有高度的保守性，因此3C蛋白酶可以作為一個理想的藥物作用靶點。以3C蛋白酶為靶點設(shè)計合成的化合物AG7088及其類似物，是鼻病毒3C蛋白酶的有效抑制劑，也是目前為止最有前景的抗小RNA病毒的化合物。

天然黃酮類化合物存在于高等植物及以植物為原料的食品中，是一類在植物界廣泛分布的多酚化合物，具有眾多生物活性和很高的藥用價值。五羥基黃酮類化合物或衍生物槲皮素(Quecertin)是眾多黃酮類化合物中活性最高的化合物之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種具有如下結(jié)構(gòu)式的五羥基黃酮類化合物或衍生物作為唯一藥效原料在制備具有3C蛋白酶活性抑制作用的藥物中的應(yīng)用，

式中R₁可以為氧代基、C_1-6烷基氨基、苯基，以及含有N、S或O的雜原子5或6元雜環(huán)基，所述的苯基和雜環(huán)基可以各自任意被羥基、氨基和其它烷基取代；R₂選自氫、羥基、氨基、巰基、硝基、C_1-6烷基氨基。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的式(I)的化合物中R₁為羥基、氧代基、羥基取代的含有氧雜環(huán)基；R₂選擇氫、羥基、氨基。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的式(I)的化合物為槲皮素(Quecertin)、槲皮苷(Quercitrin)和蘆丁(Rutin)。

本發(fā)明的另一目的是提供式I所示的五羥基黃酮類化合物或衍生物在制備通過抑制3C蛋白酶活性來治療EV71病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過五羥基黃酮類化合物或衍生物在體外可以有效抑制EV71 3C蛋白酶活性，且實驗證明五羥基黃酮類化合物或衍生物可以有效抑制EV71在RD細(xì)胞中的復(fù)制，因此可以作為預(yù)防和/或治療手足口病的潛在藥物進(jìn)行深入的研究和開發(fā)。

本發(fā)明首次提出五羥基黃酮類化合物或衍生物作為3C蛋白酶抑制劑在制備預(yù)防和/或治療由EV71和CVB3感染引起的手足口病的藥物中的應(yīng)用。

附圖說明

圖1不同濃度的Quercetin對RD細(xì)胞的毒性；

圖2不同濃度的Quercetin抗EV71的活性；

圖3不同濃度的Quercetin抑制EV71 3C蛋白酶活性；

具體實施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

下列實施例主要以Quercetin為例，所用到的主要材料和試劑如下：

槲皮素(Quecertin)購自Calbiochem公司，3C蛋白酶熒光底物Dabcyl-RTATVQGPSLDFE-Edans由上海凱靖生物科技有限公司合成，EV71毒株EV71/wuhan/3018/2010由本實驗室保存。人橫紋肌瘤細(xì)胞(RD)、大腸桿菌DH5α、BL21均由本實驗室保藏。載體pET-28a由華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉德立教授贈送。150i二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo Scientific，ELX800酶標(biāo)儀購自BioTek，96孔板購自Roche，二甲基亞砜(DMSO)購自BD，DMEM(Dulbecco modified Eagle mediuM)購自Gibco，其它常規(guī)使用的無機鹽和有機溶劑都購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

【實施例1】Quercetin抗EV71活性研究

實驗方案：將培養(yǎng)好的RD細(xì)胞接入96孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到80％-90％時，抗病毒組加入7X10⁵EV71感染細(xì)胞，1.5h后棄掉病毒液，與藥毒組同時加入用2％FBS的DMEM配制的Quercetin，濃度分別為0μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM(由于Quercetin溶解性限制，最高藥物毒性和抗病毒活性均只做到200μM)，作用48h后顯微鏡目測細(xì)胞的存活狀況。使用MTT法測細(xì)胞存活率，移除96孔板培養(yǎng)液，每孔使用100μl PBS洗滌細(xì)胞2次；每孔加入30μl 5mg/ml的MTT，置于37℃培養(yǎng)箱孵育2-4h；移除MTT盡可能干凈，加入40μl DMSO溶解混勻；在酶標(biāo)儀490nm處讀取吸光值。

實驗結(jié)果：圖1表明在200μM范圍內(nèi)Quercetin對RD細(xì)胞有微弱毒性，細(xì)胞存活率均在80％以上，不具備濃度依賴性，CC50大于200μM。圖2表明Quercetin能顯著抑制EV71在RD細(xì)胞中的增殖，提高細(xì)胞存活率，并且具有濃度依賴性，EC50為15μM。治療指數(shù)SI(CC50/EC50)大于13.3。

【實施例2】Quercetin體外抑制EV71 3C蛋白酶活性

本發(fā)明利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，先合成一段熒光多肽Dabcyl-RTATVQGPSLDFE-Edans作為3C蛋白酶底物，其中QG是3C蛋白酶切割位點。在100μl反應(yīng)體系中，50mM Tris-HCl、200mM NaCl、2mM DTT、1μM3C蛋白酶、一定梯度濃度的化合物Quercetin，本發(fā)明使用濃度梯度為200μM、100μM、50μM、10μM、5μM、1μM，室溫孵育4-6h后，加入50μM的熒光底物混勻后立即在多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光檢測。理論上若化合物能抑制3C蛋白酶的活性，那么加入化合物后在反應(yīng)的初始階段熒光產(chǎn)生的速率會降低，反應(yīng)初始階段作為一級反應(yīng)處其起熒光強度在一定時間范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，根據(jù)不同濃度的化合物處理后熒光產(chǎn)生的速率即斜率可以計算抑制率，再根據(jù)不同濃度化合物的抑制率可求得該化合物的IC50。

本發(fā)明實施例2所用方法可分為以下步驟：

1、引物設(shè)計

通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢EV71/wuhan/3018/2010毒株3C蛋白酶基因序列，使用Primer 5軟件設(shè)計N端帶有his標(biāo)簽的3C蛋白酶引物，序列如下：F 5，-CGCCCATGGGGCCCAGCTTAGACTTCG-3，；R 5，-CCCAAGCTTT TATTG CTCGCTGGC AAAATAAC-3，，酶切位點為Nco I和Hind III。引物由華大基因公司合成。

2、重組質(zhì)粒構(gòu)建

EV71感染RD細(xì)胞48h后，提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，收獲cDNA作為PCR模板。對目的片段進(jìn)行PCR擴增，根據(jù)引物TM值以及目的片段的長度確定PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，共30個循環(huán)，72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物和載體pET-28a分別經(jīng)Nco I與Hind III37℃酶切4h后，T4連接酶4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，涂布于含卡納青霉素的LB平板，挑取陽性克隆富集培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后經(jīng)PCR和酶切鑒定，送往華大基因公司測序。

3、3C蛋白酶原核表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pET28a-3C轉(zhuǎn)化BL21，涂布于含卡納青霉素的LB平板，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基37℃，220rpm震蕩培養(yǎng)，待菌液OD600達(dá)到0.8時，加入終濃度0.5mM的IPTG于18℃誘導(dǎo)過夜。收集菌體，加入0.3倍體積的裂解液超聲裂解30min，功率30％，工作5s間隔5s。菌體裂解液13000rmp，4℃離心20min，收集上清即為粗酶液。

裝好Ni-NTA柱，加入2ml新鮮樹脂，讓柱中酒精在重力作用下自然流干，然后加入3倍柱體積的裂解緩沖液平衡柱子。柱平衡后注入粗酶液，控制流速為1mL/min左右，收集流出液，上樣結(jié)束后加入含一定濃度咪唑的沖洗緩沖液沖洗雜蛋白，最后加入1倍柱體積的洗脫液將目的蛋白從柱子上洗脫下來，收集每次過濾的濾液。考馬斯亮藍(lán)法測純化后蛋白濃度并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

4、Quercetin對3C蛋白酶抑制作用

反應(yīng)體系：50mM Tris-HCl、200mM NaCl、2mM DTT、1μM 3C蛋白酶、一定梯度的3C化合物室溫孵育4-6h后，加入50μM熒光多肽底物，按以上反應(yīng)體系配制反應(yīng)液于酶標(biāo)板，震蕩混勻后立即在多功能酶標(biāo)儀上檢測，檢測條件為：激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為500nm，反應(yīng)溫度37℃，每隔30s讀取一個數(shù)值，總時間為20min。以DMSO作為陰性對照，Rutin作為陽性對照，將得到的數(shù)據(jù)做成熒光強度與時間的散點圖并求出斜率，抑制率＝(陰性對照組斜率-化合物組斜率)/陰性對照組斜率*100％。通過SPSS軟件求出化合物半數(shù)抑制濃度。

實驗結(jié)果：圖3表明在體外Quercetin能抑制EV71 3C蛋白酶活性，半數(shù)抑制濃度達(dá)18μM。

綜上所述，以Quercetin為代表的五羥基黃酮類化合物具有較好的抗EV71活性和抑制3C蛋白酶的活性，為以3C蛋白酶為靶點的抗EV71藥物設(shè)計和研發(fā)提供指導(dǎo)。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北工業(yè)大學(xué)

<120> 五羥基黃酮類化合物在制備具有3C蛋白酶活性抑制作用的藥物中的應(yīng)用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 3C蛋白酶上游引物

<400> 1

cgcccatggg gcccagctta gacttcg 27

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 3C蛋白酶下游引物

<400> 2

cccaagcttt tattgctcgc tggcaaaata ac 32