本發(fā)明涉及HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛藥物用途發(fā)明領(lǐng)域，尤其是涉及白藜蘆醇可用于在制備降低HIV gp120誘導(dǎo)的神經(jīng)病理痛的藥物中的應(yīng)用，其作用機(jī)理涉及抑制背根神經(jīng)節(jié)嘌呤2X(P2X)₇受體介導(dǎo)的痛覺信息傳遞。

背景技術(shù)：

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染常常引起各種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，嚴(yán)重威脅生命。伴隨著疾病的發(fā)展，HIV感染患者常常伴有外周神經(jīng)病變，包括末梢感覺功能障礙，進(jìn)一步可喪失行走功能。研究表明可能是背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)的損傷導(dǎo)致HIV感染并發(fā)周圍神經(jīng)病變。糖蛋白(glucoprotein120,gp120)是暴露在HIV病毒表面的一種結(jié)構(gòu)蛋白。已證實(shí)gp120與HIV感染所致相關(guān)病變有關(guān)，還可引起DRG神經(jīng)細(xì)胞和Schwann細(xì)胞凋亡。HIV外層的gp120識(shí)別并且浸染宿主細(xì)胞，可通過小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放神經(jīng)毒素和炎性因子，損傷神經(jīng)元。gp120直接興奮初級(jí)感覺傳入神經(jīng)元，導(dǎo)致痛覺過敏。短暫置gp120于坐骨神經(jīng)或鞘內(nèi)注射重組gp120導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)械痛和熱痛過敏。

疼痛它是人類共有而個(gè)體差異很大的一種不愉快的感覺，它伴隨著大多數(shù)疾病。根據(jù)疼痛時(shí)程可將疼痛分為急性痛(生理性痛)和慢性痛(病理性痛)，其中慢性痛包括炎癥痛、神經(jīng)病理痛(neuropathic pain,NPP)、癌癥痛。由于慢性痛的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，導(dǎo)致其很難治愈。HIV感染并發(fā)的神經(jīng)病理痛有自發(fā)痛和誘發(fā)痛。HIV并發(fā)外周神經(jīng)病理性損傷常常表現(xiàn)為感覺神經(jīng)病變，30％的艾滋病感染者收其影響。發(fā)病率高、發(fā)病制劑不明確導(dǎo)致HIV感染并發(fā)神經(jīng)病理痛治療極為困難，所以亟待解決。

三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)是重要能量物質(zhì)。Burnstock在上世紀(jì)70年代初提出“嘌呤能神經(jīng)學(xué)說”后，作為神經(jīng)遞質(zhì)的ATP研究工作倍受關(guān)注。嘌呤類物質(zhì)包括三磷酸腺苷(ATP)及代謝產(chǎn)物二磷酸腺苷/一磷酸腺苷(ADP/AMP)和腺苷等均參與信息傳遞。目前普遍認(rèn)為ATP是外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遞質(zhì)。根據(jù)對(duì)腺苷和ATP的選擇性親和力不同將“嘌呤受體”(purinoceptor)區(qū)分為P1和P2受體兩大類型。P2嘌呤受體又分為配體門控離子通道型(P2X)和G-蛋白偶聯(lián)代謝型(P2Y)受體。已有7種P2X受體亞型(分別是P2X₁、P2X₂、P2X₃、P2X₄、P2X₅、P2X₆、P2X₇)，和9種哺乳動(dòng)物的P2Y受體亞型(分別是P2Y₁、P2Y₂、P2Y₄、P2Y₆、P2Y₁₁、P2Y₁₂、P2Y₁₃、P2Y₁₄、P2Y₁₅)被克隆出來。研究表明P2X₇受體涉及神經(jīng)病理性痛。損傷神經(jīng)時(shí)可釋放出大量的細(xì)胞炎性因子，ATP可激活P2X₇受體，與細(xì)胞炎性因子和其它炎癥介質(zhì)共同作用介導(dǎo)神經(jīng)病理痛。

白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一類主要存在于葡萄皮、百合科、蓼科、豆科、花生和多種藥用植物中的一種多酚類化合物。白藜蘆醇(Res)化學(xué)名為3,5,4'-三羥基二苯乙烯(3,5,4'-trihydroxystilbene)，是一種植物天然活性成分。白藜蘆醇具有廣泛的藥理作用，可抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗過敏、降血抗氧化、調(diào)節(jié)免疫以及保護(hù)心血管等，是一種重要的植物抗毒素。白藜蘆醇對(duì)多種疾病狀態(tài)下的損害可產(chǎn)生保護(hù)作用，已廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品、化妝品等領(lǐng)域。

本實(shí)驗(yàn)通過HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠模型，觀察白藜蘆醇處理后HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠痛行為的變化，以及與介導(dǎo)神經(jīng)病理痛的P2X₇受體表達(dá)變化的關(guān)系，為白藜蘆醇用于HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛的預(yù)防和治療提供幫助。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供白藜蘆醇的第一個(gè)新用途，即白藜蘆醇在制備防治HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛疾病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供白藜蘆醇的第二個(gè)新用途，即白藜蘆醇在制備HIVgp120并發(fā)神經(jīng)損傷疾病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明證實(shí)白藜蘆醇可降低糖蛋白120神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞P2X₇受體的表達(dá)，降低細(xì)胞炎性因子—腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β的表達(dá)，增加白細(xì)胞介素-10的表達(dá)，降低細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的磷酸化以及膠質(zhì)纖維酸性蛋白與P2X₇受體的共表達(dá)，抑制背根神經(jīng)節(jié)的傷害性信息傳遞，減輕神經(jīng)損傷及炎性物質(zhì)的傷害剌激，減輕糖蛋白120神經(jīng)病理痛大鼠的痛行為，可應(yīng)用于制備人類免疫缺陷病毒糖蛋白120相關(guān)神經(jīng)病理痛、人類免疫缺陷病毒糖蛋白120神經(jīng)損傷相關(guān)疾病的藥物。

附圖說明

圖1為HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠制模過程中的機(jī)械縮足反射閾值變化圖。白藜蘆醇能抑制HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠的機(jī)械痛行為。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。其中^*p<0.05，^**p<0.01表示和對(duì)照組比較，^#p<0.05，^##p<0.01表示與HIV gp120大鼠模型組比較。

圖2為HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠DRG的P2X₇受體real-time PCR檢測(cè)結(jié)果圖。白藜蘆醇可降低HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠DRG上調(diào)的P2X₇mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。其中^**p<0.01表示和對(duì)照組比較，^##p<0.01表示與HIV gp120大鼠模型組比較。

圖3為HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠DRG的P2X₇受體蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果圖。白藜蘆醇處理后可降低HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠DRG上調(diào)的P2X₇受體蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。圖3(a)為蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖3(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中^**p<0.01表示和對(duì)照組比較，^##p<0.01表示與HIV gp120大鼠模型組比較。

圖4為HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠DRG的P2X₇受體與衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果圖。大鼠手術(shù)側(cè)背根神經(jīng)節(jié)P2X₇受體和GFAP存在共表達(dá)。白藜蘆醇處理后可降低HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠DRG上調(diào)的P2X₇受體與GFAP共表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。標(biāo)尺為100μm。

圖5為HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠DRG的TNF-α受體蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果圖。白藜蘆醇處理后可降低HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠DRG上調(diào)的TNF-α受體水平。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。圖5(a)為蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖5(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中^**p<0.01表示和對(duì)照組比較，^##p<0.01表示與HIV gp120大鼠模型組比較。

圖6為HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠DRG的IL-1β蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果圖。白藜蘆醇處理后可降低HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠DRG上調(diào)的IL-1β表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。圖6(a)為蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖6(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中^**p<0.01表示和對(duì)照組比較，^##p<0.01表示與HIV gp120大鼠模型組比較。

圖7為HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠DRG的IL-10蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果圖。白藜蘆醇處理后可升高HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠DRG下調(diào)的IL-10表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。圖7(a)為蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖7(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中^**p<0.01表示和對(duì)照組比較，^##p<0.01表示與HIV gp120大鼠模型組比較。

圖8為HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠DRG的ERK1/2蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果圖。白藜蘆醇處理后可降低HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠DRG上調(diào)的ERK1/2磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。圖8(a)為蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖8(b)(c)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中^**p<0.01表示和對(duì)照組比較，^##p<0.01表示與HIV gp120大鼠模型組比較。

圖9為白藜蘆醇對(duì)HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染的P2X₇受體ATP激活電流影響結(jié)果圖。白藜蘆醇可以抑制HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染的P2X₇受體ATP激活電流。實(shí)驗(yàn)分組：ATP對(duì)照組；ATP+白藜蘆醇處理組。圖9(a)分ATP、ATP+白藜蘆醇處理激活電流實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖9(b)為白藜蘆醇抑制濃度效應(yīng)曲線，其中^*p<0.05表示和單獨(dú)用ATP比較。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例并對(duì)照附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1。

用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于HIV gp120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛治療的口服或注射的白藜蘆醇制劑。

實(shí)施例2。

用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于涉及HIV gp120并發(fā)神經(jīng)損傷相關(guān)疾病治療的口服或注射的白藜蘆醇制劑。

實(shí)施例3。

用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于涉及HIV gp120并發(fā)感覺神經(jīng)炎性相關(guān)疾病治療的口服或注射的白藜蘆醇制劑。

總之，白藜蘆醇以口服、注射、含片或其它局部或全身用藥劑型藥物進(jìn)行上述疾病防治。

為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面以白藜蘆醇對(duì)P2X₇受體介導(dǎo)的相關(guān)疾病治療作用研究的實(shí)驗(yàn)和結(jié)果來證明白藜蘆醇的用途。

一、材料和方法。

1.動(dòng)物和分組。

南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供30只200g Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠。適應(yīng)一周后隨機(jī)分為3組，每組10只：假手術(shù)對(duì)照組；HIV gp120模型組；HIV gp120模型+白藜蘆醇處理組，分別標(biāo)記，自由飲食飲水。建立應(yīng)用gp120于坐骨神經(jīng)的神經(jīng)病理痛模型：(1)用10％水合氯醛麻醉大鼠；(2)備皮，消毒，切開左側(cè)腿彎凹陷皮膚，使坐骨神經(jīng)暴露，注意不要損傷到神經(jīng)；(3)將2×6mm的氧化纖維素膜浸泡于250μl濃度為0.1％的大鼠血清白蛋白(Rat Serum Albumin，RSA)生理鹽水溶液中，其中含有200ng gp120，對(duì)于假手術(shù)對(duì)照組，則在濃度為0.1％的RSA生理鹽水溶液中浸泡；(4)將浸泡過的纖維素膜寬松的纏繞坐骨神經(jīng)三根分叉部，約有3-4mm的神經(jīng)被纏繞，注意不要壓迫神經(jīng)；(5)縫合肌肉和皮膚切口，用碘伏消毒傷口。

從手術(shù)后第1天到手術(shù)后兩周，每天向HIV gp120+白藜蘆醇組腹腔注射白藜蘆醇(30mg/kg)。同時(shí)，對(duì)照組和HIV gp120模型組在注射相同體積生理鹽水。保持每次給藥時(shí)間一致。兩周后處死大鼠取標(biāo)本(L4-L6段背根神經(jīng)節(jié))。

2.藥物與試劑。

白藜蘆醇(南京澤朗公司)，兔源性P2X₇、TNF-α、IL-1β、IL-10抗體(Abcam公司)，兔源性ERK1/2、p-ERK1/2抗體(CST公司)，小鼠源性GFAP抗體(Millipore公司)。

3.主要儀器。

消毒紗布、手巾、棉簽等，碘酒及75％酒精，手術(shù)器械包：剪刀、眼科小彎鑷、血管鉗、絲線、有齒鑷等。

4.大鼠行為學(xué)測(cè)定。

分別于第0，1，4，7，10，12，14天測(cè)量各組大鼠機(jī)械縮足反射閾值(MWT)，每次測(cè)量的時(shí)間及其他條件保持一致。

機(jī)械痛敏閾值變化的檢測(cè)方法：

機(jī)械縮足反射閾值的檢測(cè)：采用的裝置為BME-404電子機(jī)械刺激器(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所,天津,中國)。該設(shè)備的主要參數(shù)如下：尖端直徑測(cè)試針0.6mm，壓力測(cè)量范圍0.1-50g和壓力測(cè)量分辨率0.05g。大鼠放入規(guī)格為25cm×15cm×25cm以小孔鐵絲網(wǎng)為底的無色透明亞克力盒中，靜置30分鐘以上使之達(dá)到穩(wěn)定的靜息狀態(tài)，此裝置稍高于操作平臺(tái)，以便看清大鼠足底，方便操作。手術(shù)側(cè)(左側(cè))后肢足底表面垂直接觸測(cè)試針，直到大鼠抬起左下肢，壓力值被電腦軟件自動(dòng)記錄。每只大鼠測(cè)量5次(間隔時(shí)間≥5分鐘)，所測(cè)的平均值即為機(jī)械痛敏閾值。

5、實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)。

(1)提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA：所有器械均經(jīng)DEPC處理。在第14天取材，分別取各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)，用DEPC處理過的PBS沖洗，置于RNA Store液中﹣20℃保存，提取RNA時(shí)將神經(jīng)節(jié)取出移至加有1ml Trizol勻漿器中，研磨后轉(zhuǎn)移到1.5ml的無核酶離心管中，加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s，靜置3min,，低溫離心12000g×15min,收集上層無色液相，加入與液相等體積的異丙醇，混勻，常溫靜置25min，沉淀RNA，之后4℃離心12000g×10min，棄上清，在管底可見少許白色沉淀為RNA，加入1ml無核酶水配置的75％乙醇，充分洗滌RNA。4℃離心5000g×3min后，吸棄上清液，倒置2分鐘，略干燥(切勿過分干燥，否則RNA不溶于水)，加20μl無RNase水溶解沉淀。采用50μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：無核酶水11.75μl，5×buffer 10μl，dNTP 3μl，Olig DT 2μl，MMLV 2μl，Rnasin 1.25μl，RNA樣本20μl，共50μl，離心，恒溫37℃水浴1小時(shí)。

(2)設(shè)計(jì)引物：參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)P2X₇受體引物序列。本發(fā)明選用β-actin作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，引物序列分別為：

(3)實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系(共20μl)：

(4)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)條件：

(5)分析數(shù)據(jù)。用β-actin作為內(nèi)參對(duì)P2X₇受體表達(dá)進(jìn)行標(biāo)化處理。

6、蛋白印跡。

(1)蛋白提?。簩RG置于加有200μl組織裂解液(含蛋白酶抑制劑)的1ml勻漿器中，于冰上研磨充分。冰上靜止30min，將勻漿樣品轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中，4℃，14000g離心15min，取上清，按比例加入6×loading buffer，混勻后煮沸5min，使蛋白變性，-20℃保存，備用。

(2)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。

制備SDS-PAGE凝膠，所用試劑如下表：

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳構(gòu)成(ml)

(3)上樣及電泳：每孔上樣量為25μl(蛋白含量約為20μg)，樣本兩邊加3μl蛋白Marker。濃縮膠恒壓60V，分離膠90V，待溴酚藍(lán)遷移至膠的下緣時(shí)停止電泳。

(4)轉(zhuǎn)膜：根據(jù)蛋白Marker的指示和目的蛋白的分子量準(zhǔn)備合適大小的PVDF膜和2張4層的濾紙，PVDF膜用甲醇激活后，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中(濾紙置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中)浸泡以備用。電泳完畢后轉(zhuǎn)膜，300mA轉(zhuǎn)膜2個(gè)小時(shí)。

(5)免疫反應(yīng)。

A)封閉：將膜置于含5％脫脂牛奶的TBST封閉液中，水平搖床室溫作用2h。

B)一抗結(jié)合：將膜放入用5％脫脂牛奶配制的一抗(兔來源的P2X₇、TNF-α、IL-1β、IL-10、ERK1/2、p-ERK1/2稀釋比例1:1000，小鼠抗β-actin單抗稀釋比例1:800)中，4℃過夜，或室溫平搖3h，TBST洗膜3次。

C)二抗結(jié)合：將膜用IgG-HRP二抗反應(yīng)液(P2X₇、TNF-α、IL-1β、IL-10、ERK1/2、p-ERK1/2二抗為山羊抗兔，按1:2000溶于封閉液，β-actin為山羊抗小鼠，按1：2000溶于封閉液)孵育，室溫平搖1.5h后，TBST洗膜10min×3次。

D)免疫復(fù)合物的檢測(cè)：膜加ECL發(fā)光劑反應(yīng)3min后，用保鮮膜包裹，置于X線暗盒，暗室中剪大小合適X線膠片，曝光10s～10min，顯影、定影，

(6)半定量分析：膠片掃描后，通過Image圖像分析軟件分析目的條帶在的光密度值，以各組β-actin條帶的光密度值標(biāo)化其相應(yīng)組P2X₇、TNF-α、IL-1β、IL-10、ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表達(dá)量。

7、免疫熒光雙標(biāo)。

從大鼠分離的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌后用4％多聚甲醛(PFA)固定24小時(shí)，20％蔗糖4℃過夜脫水。用冰凍切片機(jī)將神經(jīng)節(jié)切位厚度為10μm的切片。用PBS洗滌后三次，將切片在37℃下用10％正常山羊血清預(yù)孵育40分鐘，然后孵育兔源性抗體P2X₇(1:500)和雞抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)(1：500，Abcam)在PBS中稀釋過夜4℃。在PBS中漂洗三次后，孵育切片用山羊抗雞FITC和山羊抗兔TRITC熒光二抗(1:200)37℃孵育40分鐘。在PBS中洗滌三次后，切片用甘油固定并用熒光顯微鏡檢測(cè)。對(duì)于陰性對(duì)照組，正常山羊血清和PBS代替一抗。

8、HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

HEK 293細(xì)胞用含有10％FBS、1％青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。根據(jù)Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑說明書對(duì)人源性的pcDNA3.0-EGFP-P2X₇質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。當(dāng)HEK293細(xì)胞長滿70-80％時(shí)，轉(zhuǎn)染前2小時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為Opti-MEM無血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染步驟如下：(a)將4μg質(zhì)粒DNA稀釋到終體積為250μl Opti-MEM中；(b)10μl Lipofectimine2000加入終體積為250μl的Opti-MEM中；(c)將含有Lipofectamine的溶液與含質(zhì)粒的溶液混合，并在室溫下孵育20分鐘。隨后，向每個(gè)孔中加入cDNA/Lipofectamine混合溶液。細(xì)胞在37℃，5％CO₂下孵育6小時(shí)。孵育后，細(xì)胞培養(yǎng)基換成含有10％FBS的DMEM并孵育24-48小時(shí)。GFP熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。全細(xì)胞膜片鉗記錄轉(zhuǎn)染后1-2天進(jìn)行。

9、電生理電流記錄。

應(yīng)用全細(xì)胞膜片鈕技術(shù)記錄全細(xì)胞電流。所用微電極用兩步拉制法制成，微電極充灌電極液后電阻在2-10MΩ之間。電流信號(hào)經(jīng)Axopatch 200B膜片甜放大器、Digidata 1440A及Clampex10.3采集和分析。調(diào)節(jié)微操縱器使微電極尖端接近細(xì)胞表面，并對(duì)微電極內(nèi)施加一負(fù)壓，形成高阻封接(1-10GΩ)，置鉗制電壓于-60mV，吸破細(xì)胞膜。移動(dòng)微操縱器上的加藥裝置排管，不同藥物的傳送依賴于重力流的作用，每管直徑(I.D)為0.2mm，管口距記錄細(xì)胞100μm左右，然后分別加入需要的藥物。表達(dá)綠色熒光的單個(gè)HEK293細(xì)胞表明其表達(dá)P2X₇受體。電極內(nèi)液成分為(mM)：K gluconate 145，EGTA 0.75，HEPES 10，CaCl₂ 0.1，MgATP 2，Na₃GTP 0.3。用KOH調(diào)節(jié)pH到7.2。細(xì)胞外液成分為(mM)：NaCl 126，KCl 2.5，glucose 10，MgCl₂ 1.2，CaCl₂ 2.4，NaHCO₃ 18。用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.4。

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間差異性采用方差分析，組間比較采用LSD法，p<0.05表示有顯著性差異，p<0.01為極顯著差異。

二、結(jié)果。

(一)行為學(xué)結(jié)果。

各組大鼠造模中均未見肢體運(yùn)動(dòng)障礙和自殘現(xiàn)象。造模前測(cè)定各組間機(jī)械縮足反射閾值的基礎(chǔ)值差異無顯著性(p>0.05)。

機(jī)械痛敏(MWT)測(cè)定結(jié)果。

Gp120大鼠神經(jīng)病理痛模型的機(jī)械縮足反射潛伏期測(cè)定結(jié)果顯示，在術(shù)后4天到14天，模型組與對(duì)照組相比，手術(shù)側(cè)機(jī)械痛反應(yīng)閾值明顯降低(p<0.05)，其中術(shù)后7天到14天降低更明顯(p<0.01)。模型+白藜蘆醇處理組與模型組相比，手術(shù)側(cè)機(jī)械痛反應(yīng)閾值明顯升高(p<0.05)，其中術(shù)后12天到14天升高更明顯。(見圖1)。

(二)實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)。

P2X₇受體表達(dá)。

P2X₇的Real-time PCR結(jié)果表明：gp120模型組DRG中P2X₇受體mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(p<0.01)，gp120模型+白藜蘆醇處理組明顯低于模型組(p<0.01)。(見圖2)。

(三)蛋白印跡。

1、P2X₇蛋白印跡結(jié)果。

P2X₇蛋白印跡結(jié)果表明：gp120模型組DRG中P2X₇受體表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加(p<0.01)；gp120模型組+白藜蘆醇處理組P2X₇受體蛋白的表達(dá)低于模型組(p<0.01)(見圖3)。

2、TNF-α蛋白印跡結(jié)果。

TNF-α蛋白印跡結(jié)果表明：gp120模型組DRG中TNF-α受體表達(dá)水平高于對(duì)照組(p<0.01)；gp120模型組+白藜蘆醇處理組TNF-α受體蛋白的表達(dá)低于模型組(p<0.01)(見圖5)。

3、IL-1β蛋白印跡結(jié)果。

IL-1β蛋白印跡結(jié)果表明：gp120模型組DRG中IL-1β表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加(p<0.01)；gp120模型組+白藜蘆醇處理組IL-1β蛋白的表達(dá)低于模型組(p<0.01)(見圖6)。

4、IL-10蛋白印跡結(jié)果。

IL-10蛋白印跡結(jié)果表明：gp120模型組DRG中IL-10表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(p<0.01)；gp120模型組+白藜蘆醇處理組IL-10蛋白的表達(dá)高于模型組(p<0.01)(見圖7)。

5、ERK1/2蛋白印跡結(jié)果。

ERK1/2蛋白印跡結(jié)果表明：gp120模型組DRG中ERK1/2磷酸化水平較對(duì)照組明顯增加(p<0.01)；gp120模型組+白藜蘆醇處理組ERK1/2磷酸化水平低于模型組(p<0.01)(見圖8)。

(四)免疫熒光雙標(biāo)。

免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明：gp120模型組DRG中P2X₇受體與GFAP的共表達(dá)水平與對(duì)照組比較明顯著升高。P2X₇受體與GFAP的共表達(dá)水平在gp120模型組+白藜蘆醇處理組明顯低于模型組。標(biāo)尺100μm(見圖4)。

(四)全細(xì)胞膜片鉗。

全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果表明：白藜蘆醇可濃度依賴性抑制HEK293細(xì)胞P2X₇受體ATP激活電流(見圖9)。

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可降低HIV gp120模型組DRG中P2X₇的表達(dá)水平，同時(shí)觀察到白藜蘆醇升高HIV gp120模型組大鼠的機(jī)械痛閾值，表明白藜蘆醇可緩解HIV gp120模型組神經(jīng)病理大鼠的痛行為。白藜蘆醇處理后下調(diào)HIV gp120模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X₇受體表達(dá)的同時(shí)，還降低細(xì)胞炎性因子—腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL-1β)的含量，增加抗細(xì)胞炎性因子—白細(xì)胞介素(IL-10)的含量，降低ERK1/2磷酸化水平。因此，白藜蘆醇可能是通過減少TNF-α、IL-1β的釋放，增加IL-10的釋放，降低ERK1/2磷酸化水平，降低HIV gp120神經(jīng)病理大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X₇受體的表達(dá)，抑制背根神經(jīng)節(jié)P2X₇受體介導(dǎo)的傷害性信息傳遞，減輕HIV gp120神經(jīng)病理痛大鼠的痛行為。