本發(fā)明涉及了一種輔助維甲酸類藥物治療多種腫瘤的藥物組合物，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命的常見病和多發(fā)病。目前，全世界每年新發(fā)生的癌癥患者大約1000萬，死于癌癥的人數(shù)近600萬，在我國每年新發(fā)病患者大約180萬，死亡130萬，而且發(fā)病率逐年上升。癌癥死亡占我國各類疾病死因的第2位，在城市已占據(jù)首位。癌癥的治療一直是一個世界性的難題，多年來世界各國都在尋找和探索各種有效手段來預(yù)防或治療癌癥。藥物治療是癌癥治療的三大療法之一。傳統(tǒng)化學(xué)藥物治療惡性腫瘤主要以直接或間接殺傷腫瘤細(xì)胞為目的，對正常細(xì)胞也有一定程度的殺傷力、毒副作用明顯，加之腫瘤細(xì)胞耐藥性的存在，大大限制了該類細(xì)胞毒藥物的療效和應(yīng)用。

維甲酸及其類似物(retinoids)是一類維生素A衍生物，包括維甲酸、維胺酸、維胺酯和天然維生素A等，約有4000多種。維甲酸類化合物廣泛應(yīng)用于治療多種疾病，如角化性皮膚病、光老化皮膚病、乳腺癌、皮膚癌、宮頸癌、白血病等。通過研究，發(fā)現(xiàn)該類化合物中的全反式維甲酸和9-順式維甲酸通過參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，具有抗角化、抗增生、促進(jìn)表皮細(xì)胞正常分化的作用，并能通過抑制鳥氨酸脫氫酶的活性干擾腫瘤的發(fā)生，可直接抑制皮脂合成和皮脂腺細(xì)胞的增殖，以減少皮脂分泌。1988年，首先使用全反式維甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)誘導(dǎo)分化治療人急性早幼粒細(xì)胞白血病，獲得顯著療效，五年臨床總結(jié)顯示完全緩解率為86％。目前，全反式維甲酸已被批準(zhǔn)用于急性早幼粒細(xì)胞白血病、口腔白斑等惡性腫瘤的治療，已成為治療白血病的首選藥物之一。常見的維甲酸類化合物結(jié)構(gòu)式：

但是，隨著維甲酸應(yīng)用日益廣泛，ATRA引起的不良反應(yīng)時有發(fā)生，主要不良反應(yīng)有：1皮膚、粘膜損害；2消化系統(tǒng)的不良反應(yīng)如惡心、嘔吐、上腹飽脹等消化道反應(yīng)；3神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)，頭痛、視神經(jīng)乳頭水腫、腦脊液壓力升高；4骨骼、關(guān)節(jié)、肌肉疼痛；5白細(xì)胞計數(shù)增多，國外報道，ATRA治療APL過程中白細(xì)胞增多癥發(fā)生率高達(dá)30％左右；6維甲酸綜合征(RA-RS)，RA-RS是ATRA治療APL的主要危險，主要表現(xiàn)為發(fā)熱及呼吸困難，其它癥狀和體征包括體重增加、肢體遠(yuǎn)端水腫、胸水或心包積液以及發(fā)作性低血壓，胸片見肺間質(zhì)浸潤。此外，ATRA還可引起腕管綜合征、嚴(yán)重的心臟損害、高血脂和高血胺血癥等不良反應(yīng)，大大限制了藥物的應(yīng)用。同時快速發(fā)展的耐藥與高復(fù)發(fā)率仍是影響長期療效的兩大障礙，隨著臨床進(jìn)一步應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其可形成耐藥性并使復(fù)發(fā)患者難以再次獲得緩解。

來源于動物或植物的食用油包含大量的各種脂肪酸，包括不同碳鏈長度和不同飽和度的脂肪酸。他們?yōu)槿祟惢?和動物提供了大量的能量和/或營養(yǎng)來源。其中源于魚類、特別是原產(chǎn)自寒冷海水的野生種群的油中發(fā)現(xiàn)大量n-3多不飽和脂肪酸(n-3PUFA)，它屬于中長鏈脂肪酸中的不飽和脂肪酸。研究表明n-3多不飽和脂肪酸一般對人類健康有益，目前發(fā)現(xiàn)它具有較好的抗心血管疾病和抗脂肪肝作用，并已開發(fā)出降血脂藥物。

雖然維甲酸及其衍生物在預(yù)防在白血病、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤的發(fā)生、抑制腫瘤的生長取得了較好的治療效果，但其對腫瘤的殺傷作用效果欠佳，以及高濃度時有較大的毒副作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要為了增強(qiáng)維甲酸類藥物的抗腫瘤作用，擴(kuò)大其抗腫瘤的范圍(抗瘤譜)，以及/或降低其劑量從而減少用藥時間及/或減少對患者潛在的副作用；而提供一種具有抗腫瘤活性食品輔助治療藥物組合物配方，本發(fā)明還提供該組合物在多種腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的抗腫瘤組合藥物選取維甲酸或其衍生物和n-3多不飽和脂肪酸為主要成分。通過抗腫瘤活性成份之間的協(xié)同作用，達(dá)到更好的治療效果。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種藥物組合物，所述藥物組合物以A和B為主要活性組分；其中A為維甲酸類藥物，B為n-3多不飽和脂肪酸(n-3PUFA)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述維甲酸類藥物包括維甲酸、維胺酸、異維胺酯和天然維生素A、全反式維甲酸、9-順式維甲酸、3-順式維甲酸、阿維甲酯、阿維甲酸、芳香維甲酸、芳香維甲酸乙酯、甲磺基芳香維甲酸、乙酰維甲酸以及其衍生物。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述n-3PUFA為多不飽和脂肪酸，包括α-亞麻酸(α-Linolenicacid，ALA)和/或二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid，EPA，含5個不飽和鍵)和/或二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid，DHA，含6個不飽和鍵)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述n-3多不飽和脂肪酸包括含有n-3PUFA的食品和/或含有n-3PUFA的營養(yǎng)補(bǔ)充劑。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述含有n-3PUFA的食品主要包括魚油。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物組合物中A和B的摩爾比為2:1～1:20。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物組合物中A和B的摩爾比為1:10。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物組合中，A、B單獨(dú)或/和結(jié)合成固態(tài)和/或溶劑化物，即A和B的形態(tài)可以相同，也可以不同，A和B的形態(tài)可以是固體或者溶劑化物。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物組合物是用于抑制和/或預(yù)防和/或治療多種腫瘤的組合物。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述多種腫瘤包括乳腺癌、前列腺癌、白血病、胃癌、肝癌、卵巢癌、直腸癌和/或結(jié)腸癌。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物組合物是用于治療或/和抑制或/和預(yù)防人乳腺癌細(xì)胞的藥物組合物；所述人乳腺癌細(xì)胞包括人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、T47D、SUM185、BT474、BT-483、600MPE、ZR-75、MDA-MB-468/453/231。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物組合物是用于增強(qiáng)和/或提高腫瘤細(xì)胞中p38蛋白質(zhì)活性，降低和/或抑制Erk1/2蛋白質(zhì)活性和/或Akt蛋白質(zhì)活性的藥物組合物。

本發(fā)明還提供了一種評估物質(zhì)對治療乳腺癌、前列腺癌、白血病、胃癌、肝癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌癌癥的輔助效果的方法，將n-3PUFA以不同濃度單獨(dú)和聯(lián)合維甲酸藥物添加到正在培養(yǎng)的人癌細(xì)胞中，在不同時間點(diǎn)檢測Erk1/2信號通路變化情況、Akt信號通路變化情況、p38信號通路變化情況中的至少一種，來評估物質(zhì)對癌細(xì)胞的凋亡和/或增殖的影響，以確定所述物質(zhì)是否能輔助治療癌癥。

當(dāng)檢測結(jié)果為人癌細(xì)胞中Erk1/2和/或Akt活性顯著降低，和/或p38活性顯著增加，則所述物質(zhì)有益于癌治療；若結(jié)果為人癌細(xì)胞中Erk1/2和/或Akt活性顯著增加和/或p38活性顯著降低，則所述物質(zhì)對癌治療無益或有害。

所述有益于癌癥治療，是指聯(lián)合服用n-3多不飽和脂肪酸和維甲酸藥物時，能降低藥物使用劑量或增強(qiáng)藥物作用效果。

所述n-3多不飽和脂肪酸包括α-亞麻酸(α-Linolenicacid,ALA)和/或二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid，EPA，含5個不飽和鍵)和/或二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid，DHA，含6個不飽和鍵)。

所述維甲酸類藥物包括全反式維甲酸，9-順式維甲酸，13-順式維甲酸，以及其衍生物。

所涉及的人癌細(xì)胞包括人乳腺癌、人前列腺癌、人白血病、人胃癌、人肝癌、人卵巢癌、人結(jié)腸癌、人直腸癌癌細(xì)胞。所述細(xì)胞生長可以通過CCK8方法檢測，細(xì)胞凋亡可以通過TUNEL、細(xì)胞核熒光染色DAPI方法確定。細(xì)胞數(shù)目變化可以通過顯微鏡血球計數(shù)板方法進(jìn)行直接計數(shù)，細(xì)胞形態(tài)可染色顯微觀察。

所述Erk1/2信號通路、Akt信號通路、p38信號通路變化情況是指Erk1/2、Akt和p38蛋白活性變化情況。所述Erk1/2、Akt和p38蛋白質(zhì)活性是指Erk1/2、Akt和p38蛋白質(zhì)磷酸激酶活性，通過免疫雜交或Western方法來檢測。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將單獨(dú)n-3多不飽和脂肪酸(主要包括ALA、EPA和DHA)濃度(80μM)，單獨(dú)維甲酸藥物(主要包括全反式維甲酸、9-順式維甲酸、13-順式維甲酸)濃度(8μM)，以及維甲酸藥物(4μM)聯(lián)合n-3多不飽和脂肪酸(40μM)，分別加入正在培養(yǎng)的人癌細(xì)胞中，在一定的時間點(diǎn)(如6h、12、24h、48h、72h等)通過檢測細(xì)胞數(shù)目、形態(tài)、DNA片段和核破裂和濃縮等來評估食品和/或營養(yǎng)補(bǔ)充劑對癌細(xì)胞的凋亡和/或增殖作用，從而評估所述補(bǔ)充劑是否能輔助該維甲酸藥物發(fā)揮協(xié)同作用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將單獨(dú)n-3多不飽和脂肪酸(主要包括ALA、EPA和DHA)濃度(80μM)，單獨(dú)維甲酸藥物(主要包括全反式維甲酸、9-順式維甲酸、13-順式維甲酸)濃度(8μM)，以及維甲酸藥物(4μM)聯(lián)合n-3多不飽和脂肪酸(40μM)，分別加入正在培養(yǎng)的人癌細(xì)胞中，在一定的時間點(diǎn)(如6h、12、24h、48h、72h等)通過蛋白質(zhì)印跡法檢測ERK1/2活性變化等來評估食品和/或營養(yǎng)補(bǔ)充劑對癌細(xì)胞的凋亡和/或增值作用，以評估所述補(bǔ)充劑對Erk1/2信號的作用效果。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將單獨(dú)n-3多不飽和脂肪酸(主要包括ALA、EPA和DHA)濃度(80μM)，單獨(dú)維甲酸藥物(主要包括全反式維甲酸、9-順式維甲酸、13-順式維甲酸)濃度(8μM)，以及維甲酸藥物(4μM)聯(lián)合n-3多不飽和脂肪酸(40μM)，分別加入正在培養(yǎng)的人癌細(xì)胞中，在一定的時間點(diǎn)(如6h、12、24h、48h、72h等)通過蛋白質(zhì)印跡法檢測AKT活性變化等來評估食品和/或營養(yǎng)補(bǔ)充劑對癌細(xì)胞的凋亡和/或增值作用，以評估所述補(bǔ)充劑對AKT信號的作用效果。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將單獨(dú)n-3多不飽和脂肪酸(主要包括ALA、EPA和DHA)濃度(80μM)，單獨(dú)維甲酸藥物(主要包括全反式維甲酸、9-順式維甲酸、13-順式維甲酸)濃度(8μM)，以及維甲酸藥物(4μM)聯(lián)合n-3多不飽和脂肪酸(40μM)，分別加入正在培養(yǎng)的人癌細(xì)胞中，在一定的時間點(diǎn)(如6h、12、24h、48h、72h等)通過蛋白質(zhì)印跡法檢測p38活性變化等來評估食品和/或營養(yǎng)補(bǔ)充劑對癌細(xì)胞的凋亡和/或增值作用，以評估所述補(bǔ)充劑對p38信號的作用效果。

本發(fā)明還提供一種藥物輔助劑，所述輔助劑是n-3多不飽和脂肪酸或者含有n-3多不飽和脂肪酸的物質(zhì)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物輔助劑是維甲酸類藥物的輔助劑。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述含有n-3多不飽和脂肪酸的物質(zhì)是含有n-3PUFA的食品和/或是含有n-3PUFA的營養(yǎng)補(bǔ)充劑。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物輔助劑是用于抑制和/或預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物的輔助劑。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述腫瘤包括乳腺癌、前列腺癌、白血病、胃癌、肝癌、卵巢癌、直腸癌和/或結(jié)腸癌。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物輔助劑是用于增強(qiáng)和/或提高腫瘤細(xì)胞中p38蛋白質(zhì)活性的藥物的輔助劑。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物輔助劑是用于降低和/或抑制Erk1/2蛋白質(zhì)活性的藥物的輔助劑。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物輔助劑是用于降低和/或抑制Akt蛋白質(zhì)活性的藥物的輔助劑。

本發(fā)明的有益效果：

(1)為減少維甲酸類藥物的毒副作用及增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明通過n-3PUFA輔助維甲酸類共同治療人乳腺癌、人前列腺癌、人白血病、人胃癌、人肝癌、人卵巢癌、人結(jié)腸癌、人直腸癌等癌癥，這種組合配方能獲得令人滿意的治療效果。本發(fā)明聯(lián)合治療腫瘤的效果，對治療或預(yù)防具有指導(dǎo)作用。

(2)本發(fā)明的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以乳腺癌細(xì)胞為例，可以證明本藥物和n-3多不飽和脂肪酸組合物有好的協(xié)同效果：將n-3PUFA以不同濃度單獨(dú)和聯(lián)合維甲酸藥物添加到正在培養(yǎng)的人癌細(xì)胞中，在不同時間點(diǎn)檢測細(xì)胞生長情況，篩選出明顯抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞死亡的單獨(dú)n-3PUFA和維甲酸藥物的濃度；再將二者該濃度各減半作為協(xié)同作用濃度，可以明顯得出協(xié)同時比單獨(dú)添加n-3PUFA和維甲酸藥物有更好的抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞死亡的作用。證明了本發(fā)明將和n-3多不飽和脂肪酸與維甲酸類藥物間發(fā)揮了協(xié)同作用。

附圖說明

圖1不同濃度脂肪酸對細(xì)胞生長的影響；

圖2不同濃度脂肪酸對細(xì)胞增殖的影響；

圖3不同濃度維甲酸對細(xì)胞生長的影響；

圖4不同濃度維甲酸對細(xì)胞增殖的影響；

圖5脂肪酸與維甲酸對細(xì)胞生長的影響；

圖6脂肪酸與維甲酸對細(xì)胞增殖的影響；

圖7脂肪酸與維甲酸對細(xì)胞凋亡的影響；

圖8脂肪酸與維甲酸對細(xì)胞凋亡蛋白水平的檢驗(yàn)；

圖9脂肪酸與維甲酸處理細(xì)胞后ERK、Akt、p38的活性變化。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：n-3多不飽和脂肪酸對癌細(xì)胞的生長作用效果

EPA和DHA對癌細(xì)胞生長、增殖的抑制，已被很多研究證實(shí)，然而對于ALA對癌細(xì)胞的作用，并無明確定論，本發(fā)明從生長和增殖兩方面，通過兩種實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證。

1.取對數(shù)生長期癌細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中(2×10⁵個/孔細(xì)胞)，5％CO₂，37℃孵育，待細(xì)胞貼壁后分別加入濃度梯度(10μM、20μM、40μM、80μM)的EPA、DHA和ALA，孵育24小時候顯微鏡下觀察，并拍攝照片。

2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：CCK-8實(shí)驗(yàn)，具體方法如下：

(1)收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，用96孔板每孔加入100ul，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。

(2)5％CO₂，37℃孵育，細(xì)胞貼壁后加入濃度梯度的藥物，每孔1ul，設(shè)5個復(fù)孔。

(3)孵育24小時后，每孔加入10微升CCK-8溶液。設(shè)置加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照。

(4)在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1小時。在450nm測定吸光度，并使用650nm作為參考波長進(jìn)行雙波長測定。

圖1是不同濃度的脂肪酸作用細(xì)胞后，細(xì)胞微觀形態(tài)的變化比較。圖2是對應(yīng)不同濃度的脂肪酸作用后，細(xì)胞增殖情況的變化。由圖1的結(jié)果可以看出，EPA、DHA和ALA對細(xì)胞均有不同程度的損傷，細(xì)胞數(shù)目大量減少，在脂肪酸濃度達(dá)到40μM時，細(xì)胞數(shù)量有一定較少，而當(dāng)脂肪酸濃度增至80μM時，細(xì)胞數(shù)量只有起始量的約1/2。在三種脂肪酸中，EPA作用效果最明顯。圖2反應(yīng)了不同濃度脂肪酸處理后，細(xì)胞的增殖水平的變化。由結(jié)果可看出，三種脂肪酸對細(xì)胞的增殖均產(chǎn)生的強(qiáng)烈的抑制作用，其中EPA效果最為明顯，此結(jié)果與上述結(jié)果相符。

實(shí)施例2：維甲酸對癌細(xì)胞的生長作用效果

維甲酸作為臨床試驗(yàn)研究癌藥物，對于癌細(xì)胞的凋亡作用，已被明確證實(shí)，本發(fā)明從細(xì)胞生長和增殖兩方面，通過兩種實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證。

1.取對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中(2×10⁵個/孔細(xì)胞)，5％CO₂，37℃孵育，待細(xì)胞貼壁后加入濃度梯度(0μM、2μM、4μM、8μM)的維甲酸，孵育24小時候顯微鏡下觀察，并拍攝照片。

2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)方法：與上述一致。

圖3是不同濃度的維甲酸作用細(xì)胞后，細(xì)胞微觀形態(tài)的變化比較。由圖3的結(jié)果可以看出，維甲酸對癌細(xì)胞有一定增殖抑制，當(dāng)藥物濃度達(dá)到8μM時，增殖抑制較為明顯，細(xì)胞數(shù)目減少。圖4反應(yīng)了不同濃度維甲酸處理后，細(xì)胞增殖水平的變化。由結(jié)果可看出，維甲酸對細(xì)胞的增殖均產(chǎn)生的強(qiáng)烈的抑制作用，其中濃度達(dá)到8μM有顯著性，此結(jié)果與上述結(jié)果相符。

實(shí)施例3：脂肪酸聯(lián)合維甲酸對癌的生長作用效果

如實(shí)施例1和2，脂肪酸和維甲酸單獨(dú)對癌細(xì)胞抑制增殖作用都已經(jīng)明確被證實(shí)，維甲酸的毒副作用以及耐藥性在臨床上已經(jīng)成為影響其發(fā)揮抗腫瘤作用的重要因素。因此，本發(fā)明提出一個新的觀點(diǎn)，將二者聯(lián)合是否能發(fā)揮協(xié)同的作用，從而降低脂肪酸與維甲酸的有效治療濃度。本發(fā)明從細(xì)胞生長和增殖兩方面，通過兩種實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證。

1.取對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中(2×10⁵個/孔細(xì)胞)，5％CO₂，37℃孵育，待細(xì)胞貼壁后加入單獨(dú)脂肪酸(EPA、DHA、ALA)濃度(80μM)，單獨(dú)維甲酸藥物濃度(8μM)，以及維甲酸藥物(4μM)聯(lián)合脂肪酸(40μM)，孵育24小時候顯微鏡下觀察，并拍攝照片。

2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)方法：與上述一致。

圖5是脂肪酸和維甲酸單獨(dú)以及聯(lián)合作用細(xì)胞后，細(xì)胞微觀形態(tài)的變化比較。由圖3的結(jié)果可以看出，脂肪酸(80μM)和維甲酸(8μM)單獨(dú)對癌細(xì)胞數(shù)目有一定減少，減半濃度脂肪酸(40μM)和維甲酸聯(lián)合細(xì)胞數(shù)目減少更多(4μM)。圖6反應(yīng)了脂肪酸和維甲酸單獨(dú)以及聯(lián)合作用細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖水平的變化。由結(jié)果可看出，減半濃度脂肪酸和維甲酸聯(lián)合對細(xì)胞的增殖抑制作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)脂肪酸和維甲酸的作用，此結(jié)果與上述結(jié)果相符。

實(shí)施例4：脂肪酸聯(lián)合維甲酸對癌的凋亡作用效果

脂肪酸和維甲酸分別或聯(lián)合作用于細(xì)胞時，細(xì)胞生長增殖被抑制，兩者聯(lián)合對細(xì)胞凋亡的效果也進(jìn)一步被驗(yàn)證。本發(fā)明通過凋亡相關(guān)的三種實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證。

1.DPAI染色法

a)溶液配制如下：

(1)0.01mol/L(pH7.0)：取0.1mol/LNaH₂PO₄·H₂O 34ml、0.1mol/LNa₂HPO₄66ml、NaCl 0.9g，溶于900m1雙蒸水；

(2)DAPI儲存液：將0.5mgDAPI溶于5.0ml中，分裝，低溫長期保存；

(3)DAPI工作液：用稀釋DAPI儲存液，終濃度為0.1ug/ml。

b)具體染色方法如下：

(1)取對數(shù)生長期癌細(xì)胞接種，5％CO₂，37℃孵育，待細(xì)胞貼壁后加入濃度梯度藥物單獨(dú)脂肪酸(EPA、DHA、ALA)濃度(80μM)，單獨(dú)維甲酸藥物濃度(8μM)，以及維甲酸藥物(4μM)聯(lián)合脂肪酸(40μM)，孵育24小時后吸去培養(yǎng)基，PBS洗一次。

(2)用4％的多聚甲醛室溫固定15分鐘，PBS漂洗3次，每次兩分鐘；

(3)DAPI染色液室溫孵育30分鐘，并用錫箔紙包裹，PBS漂洗3次，每次兩分鐘；

(4)熒光顯微鏡下觀察，用UV波段激發(fā)照相。

圖7反應(yīng)了脂肪酸和維甲酸單獨(dú)以及聯(lián)合作用細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡DAPI染色情況。由結(jié)果可看出，減半濃度脂肪酸和維甲酸聯(lián)合作用后，細(xì)胞核DAPI染色熒光強(qiáng)度明顯高于單獨(dú)脂肪酸和維甲酸，得出聯(lián)合作用對細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用優(yōu)于單獨(dú)脂肪酸和維甲酸的作用。

2.Western Blot檢測PARP蛋白水平

a)脂肪酸溶液配制：

(1)10％(w/v)十二烷基硫酸鈉SDS溶液：0.1gSDS，1mlH2O去離子水配制，室溫保存。

(2)分離膠緩沖液：1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris用80ml水溶解，用HCL調(diào)節(jié)pH到8.8，加水稀釋到100ml終體積。

(3)濃縮膠緩沖液：0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于80ml水中，用約HCL調(diào)至pH6.8，加水稀釋到100ml終體積。

(4)SDS-PAGE加樣緩沖液：pH6.80.5mol/LTris緩沖液8ml，甘油6.4ml，10％SDS 12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05％溴酚藍(lán)1.6ml，H2O 32ml混勻備用。

(5)Tris-甘氨酸電泳緩沖液：30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，臨用前稀釋10倍。

(6)轉(zhuǎn)膜緩沖液：稱取14.4g甘氨酸、6.04gTris，并加入200ml甲醇，加水至總量1L。

(7)Tris緩沖鹽溶液(TBS)：20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。

b)具體步驟如下：

將癌細(xì)胞用PBS清洗3次，加入裂解液，直接煮沸5分鐘，冰上冷卻后，12000rpm離心2min，取上清，-20保存?zhèn)溆谩?/p>

(一)SDS-PAGE凝膠電泳

(1)清洗后的玻璃板對齊后放入夾中卡緊，然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。

(2)配10％分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，隨即用乙醇液封，膠充分凝固就可倒去膠上層乙醇并用吸水紙吸干。

(3)配5％的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，豎直向上輕輕將其拔出。

(5)將其放入電泳槽中，加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。蛋白質(zhì)樣品測完蛋白含量后，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×，在沸水中煮3min混勻后上樣，總蛋白量35μg。

(6)恒壓80V電泳跑膠，當(dāng)樣品進(jìn)入下層膠后恒壓120V電泳直至溴酚藍(lán)達(dá)到凝膠底部為止，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

(二)轉(zhuǎn)膜：

(1)切膠：將玻璃板撬掉，除去小玻璃板后，將濃縮膠刮去，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要按照蛋白的分子量，以Marker為對照進(jìn)行切膠。

(2)備膜：裁剪PVDF膜和濾紙，將切好的PVDF置于80％甲醇溶液中激活30s。

(3)裝膜：將轉(zhuǎn)膜用的夾子打開使黑的一面(負(fù)極)保持水平。在上面墊一張海綿墊，加入轉(zhuǎn)膜液浸濕，在墊子上墊上中浸泡好的濾紙，隨后按照凝膠—硝酸纖維素膜—濾紙—海綿墊的順序依次疊放。最后將白色板(正極)蓋好裝入轉(zhuǎn)膜槽中。

(4)轉(zhuǎn)膜：將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。4℃轉(zhuǎn)膜，恒流400mA。

(5)轉(zhuǎn)完后將膜取下，標(biāo)記一角。

(三)免疫反應(yīng)

(1)封閉：將膜用TBST中漂洗3次，每次5min。漂洗后將硝酸纖維素膜放入5％脫脂奶粉中，室溫下?lián)u床1h。

(2)加一抗：將封閉后的硝酸纖維素膜放入含有TBST的洗缸中搖床上漂洗3次，每次5min。放入加有一抗的平皿中4℃過夜孵育。

(3)加二抗：回收一抗，將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中室溫?fù)u床漂洗3次，每次5min，然后將漂洗過的硝酸纖維素膜放入加有二抗的平皿中，避光室溫孵育45min。孵育后將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中洗3次，每次5min。

(四)化學(xué)發(fā)光

(1)將A和B兩種試劑在小離心管里按照發(fā)光試劑盒說明書操作將其混合，加到硝酸纖維素膜上，用化學(xué)發(fā)光成像儀顯色。

和維甲酸單獨(dú)以及聯(lián)合作用細(xì)胞后，提取總蛋白進(jìn)行Western Blot檢測PARP蛋白水平。圖8反映了在不同時間段(12h、24h、48h)，脂肪酸和維甲酸聯(lián)合作用時剪切形式的PARP有明顯的上升，24h只有EPA與維甲酸聯(lián)合有剪切形式的PARP蛋白的出現(xiàn)；而到48h時，三種脂肪酸聯(lián)合維甲酸都出現(xiàn)了明顯的剪切形式PARP，這代表隨著時間的推遲，驗(yàn)證脂肪酸和維甲酸聯(lián)合作用有明顯的細(xì)胞凋亡發(fā)生。

實(shí)施例5:脂肪酸聯(lián)合維甲酸對AKT、ERK1/2、p38信號的作用

Akt又稱PKB或Rac，在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用。胰島素等生長和存活因子都可以激活A(yù)kt信號途徑，Akt的Ser473可以被PDK1磷酸化。

ERKs調(diào)節(jié)著細(xì)胞的增殖、分化和存活，是多種生長因子(EGF、NGF、PDGF等)的下游蛋白，ERK和其信號途徑在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起中介和放大信號的作用，一方面接受大量來自生長因子、絲裂原、環(huán)境刺激等的信號，另一方面通過ERK信號級聯(lián)反應(yīng)作用于核轉(zhuǎn)錄因子如AP-1、NF-кB等，調(diào)控基因表達(dá)。在許多人類的癌癥(如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、白血病、口腔癌、黑色素瘤等)中都可發(fā)現(xiàn)ERK的過度激活。

p38信號通路是MAPK通路的一重要分支，它在炎癥、細(xì)胞應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞周期和生長等多種生理和病理過程中起重要作用。4種已知的p38異構(gòu)體包括p38α、p38β、p38γ和p38δ.多年來已發(fā)現(xiàn)p38MAPK通路可以由應(yīng)激包括高滲、熱休克、放射線和其他應(yīng)激反應(yīng)活化。因此，p38MAPK通路參與了多種刺激引起的信號級聯(lián)反應(yīng)，表明它在引起多種細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用，并且，p38在細(xì)胞凋亡中也顯示調(diào)節(jié)效應(yīng)。

本發(fā)明采用western blotting的方法對AKT、ERK1/2、p38信號通路進(jìn)行驗(yàn)證。

圖9是脂肪酸和維甲酸聯(lián)合作用細(xì)胞后的AKT、ERK1/2、p38信號磷酸化水平的變化。由圖9可看出，脂肪酸處理后，AKT、ERK1/2、p38活性上調(diào)。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。