本發(fā)明屬于醫(yī)用生物材料領(lǐng)域，涉及醫(yī)用鈦合金內(nèi)植物的骨整合效果，具體涉及白藜蘆醇在糖尿病條件下醫(yī)用鈦合金內(nèi)植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病導(dǎo)致鈦合金內(nèi)植物松動(dòng)是亟待解決的醫(yī)學(xué)問(wèn)題：鈦合金是應(yīng)用范圍最廣的骨植入性材料，然而在一些特定疾病人群如糖尿病患者中，鈦合金內(nèi)植物失穩(wěn)率卻顯著升高，嚴(yán)重影響預(yù)后，對(duì)患者造成很大家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)。因此，闡明鈦合金內(nèi)植物失穩(wěn)的發(fā)生機(jī)制并據(jù)此采取有效手段降低鈦內(nèi)植物的失穩(wěn)率是亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。

氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞功能障礙和凋亡是糖尿病致鈦合金松動(dòng)的關(guān)鍵機(jī)制：氧化應(yīng)激(oxidative stress)是機(jī)體內(nèi)高活性物質(zhì)如活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過(guò)多，超出了機(jī)體的清除能力，導(dǎo)致氧化和抗氧化失衡的一種狀態(tài)。生理范圍內(nèi)的ROS在調(diào)節(jié)人體正常的功能如基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起著重要的作用。然而，過(guò)高濃度的ROS可以導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)產(chǎn)生氧化反應(yīng)，損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，引起疾病的發(fā)生。研究表明“材料-骨”界面氧化應(yīng)激嚴(yán)重影響材料的骨整合，糖尿病環(huán)境引起“鈦-骨”界面細(xì)胞內(nèi)源性ROS過(guò)量產(chǎn)生導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能障礙和凋亡增多是糖尿病致鈦合金失穩(wěn)的關(guān)鍵機(jī)制。

糖尿病患者鈦合金內(nèi)植物松動(dòng)率居高不下，當(dāng)前臨床上缺乏有效的治療措施。現(xiàn)有研究未探究可通過(guò)口服等用藥途徑解決此類(lèi)患者痛苦的藥物；個(gè)別基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究通過(guò)鈦合金材料表面羥基磷灰石等材料涂層在一定程度上提高了材料的骨整合效果，但其材料制備工藝復(fù)雜，成本較高，且可控治療手段只在材料本身，材料改良對(duì)不同患者可能出現(xiàn)不同療效，材料植入后如果不能解決骨整合效果不良的問(wèn)題缺乏其他更好的治療手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種白藜蘆醇在糖尿病條件下醫(yī)用鈦合金內(nèi)植物中的應(yīng)用，解決現(xiàn)有技術(shù)中糖尿病通過(guò)細(xì)胞氧化應(yīng)激造成細(xì)胞功能障礙和凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致鈦合金內(nèi)植物骨整合不良和松動(dòng)的技術(shù)問(wèn)題。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

白藜蘆醇在糖尿病條件下醫(yī)用鈦合金內(nèi)植物中的應(yīng)用。

白藜蘆醇在制備促進(jìn)糖尿病條件下醫(yī)用鈦合金內(nèi)植物骨整合的藥物中的應(yīng)用。

白藜蘆醇在制備糖尿病條件下醫(yī)用鈦合金內(nèi)植物的功能化復(fù)合材料中的應(yīng)用。

白藜蘆醇在制備提高糖尿病條件下“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞細(xì)胞活力的藥物中的應(yīng)用。

白藜蘆醇在制備增強(qiáng)糖尿病條件下“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞成骨分化的藥物中的應(yīng)用。

白藜蘆醇在制備提高糖尿病條件下“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞在材料表面粘附狀態(tài)的藥物中的應(yīng)用。

白藜蘆醇在制備抑制糖尿病條件下“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞病理性凋亡的藥物中的應(yīng)用。

白藜蘆醇在制備提高糖尿病條件下“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷能力的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：

(Ⅰ)白藜蘆醇具有抗氧化等多種有益機(jī)體的藥理作用：白藜蘆醇是天然的多酚類(lèi)化合物，主要來(lái)源于花生、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，具有抗氧化、預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化、心血管保護(hù)、抗腫瘤等多種有益機(jī)體的藥理作用，其最初作為紅酒發(fā)揮保健作用的關(guān)鍵成分而被發(fā)現(xiàn)，已被作為保健藥物用于食品添加劑等用途。

(Ⅱ)醫(yī)用材料植入人體后，“材料-骨”界面的組織修復(fù)主要是骨組織的新生及其與材料的整合，此過(guò)程中最關(guān)鍵的因素就是成骨細(xì)胞，其功能活性決定了材料骨整合的效果。本發(fā)明通過(guò)建立醫(yī)用鈦合金表面成骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，證明了白藜蘆醇對(duì)糖尿病環(huán)境中“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞功能狀態(tài)的改善作用：提高了糖尿病中“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞的細(xì)胞活力；增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的成骨分化效能；改善了成骨細(xì)胞在材料表面粘附狀態(tài)；增強(qiáng)了成骨細(xì)胞抗糖尿病環(huán)境造成的氧化應(yīng)激損傷的能力；減少了成骨細(xì)胞的病理性凋亡。這些直接證明了白藜蘆醇在“鈦-骨”界面局部組織中有效的治療作用。

(Ⅲ)通過(guò)建立骨內(nèi)植入鈦合金材料的動(dòng)物模型，對(duì)動(dòng)物通過(guò)灌胃的方式口服用藥，進(jìn)一步證明了白藜蘆醇提升糖尿病條件下鈦合金內(nèi)植物骨整合效果的功效。

(Ⅳ)白藜蘆醇既可作為口服等全身用藥的藥物，又可作為鈦合金材料功能化改良的復(fù)合材料成為鈦合金表面藥物涂層或復(fù)合材料成分，緩釋進(jìn)入材料周?chē)木植拷M織，從而發(fā)揮治療作用，提升糖尿病條件下鈦合金內(nèi)植物的骨整合效果，減輕患者痛苦。

(Ⅴ)當(dāng)前通過(guò)化學(xué)合成獲得白藜蘆醇的途徑已十分成熟，不受植物來(lái)源的限制，能保證充足的藥物供應(yīng)，生產(chǎn)成本較低。

附圖說(shuō)明

圖1為白藜蘆醇對(duì)糖尿病血清培養(yǎng)條件下鈦合金表面成骨細(xì)胞細(xì)胞活力的影響。

圖2為白藜蘆醇增強(qiáng)糖尿病環(huán)境中鈦合金表面成骨細(xì)胞的成骨分化的效果。

圖3-1為白藜蘆醇對(duì)糖尿病環(huán)境中成骨細(xì)胞在鈦合金表面粘附狀態(tài)的影響。

圖3-2為白藜蘆醇影響糖尿病條件下鈦合金表面成骨細(xì)胞的細(xì)胞面積的數(shù)據(jù)分析。

圖3-3為白藜蘆醇影響糖尿病條件下鈦合金表面成骨細(xì)胞的細(xì)胞密度的數(shù)據(jù)分析。

圖4為白藜蘆醇降低糖尿病環(huán)境中鈦合金表面成骨細(xì)胞的凋亡比例。

圖5-1為白藜蘆醇對(duì)糖尿病環(huán)境中鈦合金表面成骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平的影響。

圖5-2為白藜蘆醇影響糖尿病條件下鈦合金表面成骨細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶表達(dá)水平的蛋白印記檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。

圖6-1為白藜蘆醇影響糖尿病動(dòng)物體內(nèi)植入的鈦合金材料骨整合效果的顯微CT分析的圖像結(jié)果。

圖6-2為白藜蘆醇影響糖尿病動(dòng)物體內(nèi)植入的鈦合金材料周?chē)律切纬汕闆r的量化分析結(jié)果。

圖6-3為白藜蘆醇影響糖尿病動(dòng)物體內(nèi)植入的鈦合金材料骨結(jié)合情況的生物力學(xué)拔出試驗(yàn)結(jié)果。

圖7-1到7-3分別為白藜蘆醇對(duì)糖尿病條件下沒(méi)有鈦合金的環(huán)境中成骨細(xì)胞的細(xì)胞活力、成骨分化和細(xì)胞凋亡比例的影響。

附圖中數(shù)據(jù)都是平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；*代表和正常組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，#代表和糖尿病組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)解釋說(shuō)明。

具體實(shí)施方式

研究表明，糖尿病條件引起“鈦-骨”界面細(xì)胞內(nèi)源性ROS過(guò)量產(chǎn)生導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能障礙和凋亡是糖尿病致鈦合金失穩(wěn)的關(guān)鍵機(jī)制。

白藜蘆醇具有抗氧化等多種有益機(jī)體的藥理作用：白藜蘆醇是天然的多酚類(lèi)化合物，主要來(lái)源于花生、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，具有抗氧化、預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化、心血管保護(hù)、抗腫瘤等多種有益機(jī)體的藥理作用，其最初作為紅酒發(fā)揮保健作用的關(guān)鍵成分而被發(fā)現(xiàn)，已被作為保健藥物用于食品添加劑等用途。

本發(fā)明的目的在于提供白藜蘆醇改善糖尿病患者中鈦合金內(nèi)植物骨整合效果的應(yīng)用，白藜蘆醇可作為新藥或醫(yī)用材料功能化改良的復(fù)合材料提升糖尿病條件下鈦合金內(nèi)植物的骨整合效果。有效成分含有白藜蘆醇的藥物可采用片劑、膠囊劑、散劑、丸劑、顆粒劑、注射劑或乳劑，用于全身性用藥。上述制劑中可含有輔助物質(zhì)、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑和其它常用的添加劑，如乳糖、檸檬酸、酒石酸、硬脂酸鎂、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、明膠、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、可可脂、乙二醇、抗壞血酸、甘露醇等。

也可將白藜蘆醇作為鈦合金的表面藥物涂層或復(fù)合材料進(jìn)行醫(yī)用鈦合金內(nèi)植物的生物性能改良，在組織局部發(fā)揮治療作用，提升糖尿病條件下鈦合金內(nèi)植物的骨整合效果。

以下給出本發(fā)明的具體實(shí)施例，需要說(shuō)明的是本發(fā)明并不局限于以下具體實(shí)施例，凡在本申請(qǐng)技術(shù)方案基礎(chǔ)上做的等同變換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

需要說(shuō)明的是：本發(fā)明中所述的“糖尿病條件”在實(shí)施例1～5中指用從糖尿病動(dòng)物體內(nèi)提取的糖尿病血清用于細(xì)胞培養(yǎng)，在實(shí)施例6中指在糖尿病動(dòng)物體內(nèi)。糖尿病血清提取過(guò)程：將四氧嘧啶(STZ)40mg/kg尾靜脈注射于體重約250～300g的SD雄性大鼠，每天1次，連續(xù)5天。最后一次注射后14天，測(cè)空腹血糖，空腹血糖>300mg/dl為糖尿病動(dòng)物。采集糖尿病動(dòng)物的血液，血液通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的血清分離方法分離出糖尿病血清，血清過(guò)濾除菌備用。

本發(fā)明中所述的“糖尿病條件”跟一般意義上的“高糖條件”完全不同：前者指糖尿病動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞生存的環(huán)境，主要是糖尿病血清；糖尿病是機(jī)制復(fù)雜的代謝性疾病，糖尿病患者的血清中存在多種成分的異常，比如血糖增高、胰島素等多種內(nèi)分泌激素含量異常、多種血脂成分含量異常(存在不同程度的對(duì)細(xì)胞有害的脂類(lèi)代謝產(chǎn)物)，很多對(duì)細(xì)胞代謝具有重要保護(hù)作用的激素水平下降；在本發(fā)明的體外實(shí)驗(yàn)中我們用直接從糖尿病動(dòng)物體內(nèi)提取的血清來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，能直接模擬糖尿病體內(nèi)環(huán)境中細(xì)胞的生存環(huán)境；而“高糖條件”指在用正常血清進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的液體中直接加入高劑量的葡萄糖，這和糖尿病血清內(nèi)環(huán)境完全是兩個(gè)概念。在這兩種不同條件下得到的研究結(jié)果不能等同。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例給出白藜蘆醇在制備提高糖尿病條件下“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞細(xì)胞活力的藥物中的應(yīng)用，即給出白藜蘆醇對(duì)糖尿病環(huán)境中鈦合金表面成骨細(xì)胞的細(xì)胞活力的改善作用。

實(shí)驗(yàn)方法：將醫(yī)用鈦合金切割加工成鈦片，表面打磨拋光，清洗消毒后備用。利用分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠顱骨的成骨細(xì)胞，并將其按1×10⁴個(gè)/毫升的細(xì)胞密度接種在鈦合金表面，建立體外“鈦-骨”界面模型。

分為5組：

1)正常血清組(正常組)；

2)糖尿病血清組(糖尿病組)；

3)糖尿病+白藜蘆醇10μM；

4)糖尿病+白藜蘆醇50μM；

5)糖尿病+白藜蘆醇250μM。

各組細(xì)胞接種量相同，培養(yǎng)的第3和第7天，用MTT法檢測(cè)鈦表面成骨細(xì)胞的細(xì)胞活力，評(píng)價(jià)不同劑量白藜蘆醇在“鈦-骨”界面對(duì)糖尿病環(huán)境中成骨細(xì)胞細(xì)胞活力的提升作用。

結(jié)果：如圖1所示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組成骨細(xì)胞細(xì)胞活力明顯受抑制，而糖尿病血清中加入白藜蘆醇后，成骨細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力都有明顯提高，且該改善作用與白藜蘆醇的劑量在低于250μM的范圍內(nèi)正相關(guān)。

結(jié)果分析：上述結(jié)果表明，白藜蘆醇對(duì)糖尿病環(huán)境中“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞的細(xì)胞活力有明顯改善作用。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例給出白藜蘆醇在制備增強(qiáng)糖尿病條件下“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞成骨分化的藥物中的應(yīng)用，即給出白藜蘆醇對(duì)糖尿病環(huán)境中鈦合金表面成骨細(xì)胞的成骨分化的增強(qiáng)作用。

實(shí)驗(yàn)方法：將成骨細(xì)胞按1×10⁴個(gè)/毫升的細(xì)胞密度接種在鈦合金表面進(jìn)行培養(yǎng)，分為5組：

1)正常組；

2)糖尿病組；

3)糖尿病+白藜蘆醇10μM；

4)糖尿病+白藜蘆醇50μM；

5)糖尿病+白藜蘆醇250μM。

在培養(yǎng)7天后利用ALP酶活力檢測(cè)試劑盒(Sigma公司)檢測(cè)鈦表面成骨細(xì)胞分化程度(ALP活性反應(yīng)成骨分化)，按照試劑盒的專(zhuān)業(yè)說(shuō)明書(shū)操作。

結(jié)果：如圖2所示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組成骨細(xì)胞ALP活性明顯下降。糖尿病環(huán)境中加入白藜蘆醇后，成骨細(xì)胞的ALP活性(成骨分化程度)明顯提高，且該改善作用與白藜蘆醇的劑量正相關(guān)。

結(jié)果分析：上述結(jié)果表明，白藜蘆醇對(duì)糖尿病環(huán)境造成的“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞成骨分化的抑制有明顯改善作用。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例給出白藜蘆醇在制備提高糖尿病條件下“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞在材料表面粘附狀態(tài)的藥物中的應(yīng)用，即給出白藜蘆醇對(duì)糖尿病環(huán)境中成骨細(xì)胞在鈦合金表面粘附狀態(tài)和細(xì)胞增殖的改善作用。

實(shí)驗(yàn)方法：將成骨細(xì)胞接種在鈦合金表面進(jìn)行培養(yǎng)，分為5組：

1)正常組；

2)糖尿病組；

3)糖尿病+白藜蘆醇10μM；

4)糖尿病+白藜蘆醇50μM；

5)糖尿病+白藜蘆醇250μM。

在培養(yǎng)3天后對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞骨架和細(xì)胞核的熒光染色，后用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。每組采集三個(gè)鈦片上的圖片(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)，每個(gè)鈦片上隨機(jī)選取的6個(gè)視野進(jìn)行拍照，對(duì)各組的細(xì)胞密度和細(xì)胞面積兩項(xiàng)指標(biāo)利用Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)比組間差異，評(píng)價(jià)白藜蘆醇對(duì)糖尿病環(huán)境中成骨細(xì)胞在鈦合金表面粘附狀態(tài)和細(xì)胞增殖的影響。

結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，糖尿病血清中培養(yǎng)的成骨細(xì)胞細(xì)胞骨架排列紊亂，細(xì)胞邊緣大多卷曲，與鈦合金的粘附不佳(附圖3-1)，細(xì)胞密度(附圖3-2)和面積(附圖3-3)都明顯下降。糖尿病環(huán)境中加入白藜蘆醇后，成骨細(xì)胞細(xì)胞骨架排列、鈦表面粘附、細(xì)胞密度和面積都明顯改善，且對(duì)細(xì)胞密度和面積的改善作用與白藜蘆醇的計(jì)量正相關(guān)。

結(jié)果分析：上述結(jié)果表明，糖尿病內(nèi)環(huán)境造成“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞在鈦合金表面粘附不佳，因而細(xì)胞密度和細(xì)胞伸展的面積下降；而白藜蘆醇能有效改善糖尿病條件下成骨細(xì)胞在鈦合金表面的粘附，細(xì)胞增殖得到恢復(fù)。

實(shí)施例4：

本實(shí)施例給出白藜蘆醇在制備抑制糖尿病條件下“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞病理性凋亡的藥物中的應(yīng)用，即給出白藜蘆醇減少糖尿病環(huán)境中鈦合金表面成骨細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)方法：將成骨細(xì)胞接種在鈦合金表面進(jìn)行培養(yǎng)，分組與實(shí)施例3相同。

培養(yǎng)第7天，用胰酶將細(xì)胞從材料上消化下來(lái)形成細(xì)胞懸液，利用Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)雙標(biāo)法進(jìn)行細(xì)胞染色并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，評(píng)價(jià)白藜蘆醇對(duì)糖尿病條件下成骨細(xì)胞凋亡的影響。

結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，糖尿病組成骨細(xì)胞凋亡比例升高了約6倍(附圖4)，而糖尿病環(huán)境中白藜蘆醇的存在明顯降低了成骨細(xì)胞凋亡的比例，增強(qiáng)了細(xì)胞的存活能力。這種抗凋亡作用與白藜蘆醇的計(jì)量在低于250μM的范圍內(nèi)正相關(guān)。

結(jié)果分析：上述結(jié)果表明，白藜蘆醇能明顯提高糖尿病條件下“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞的生存能力，降低其凋亡率。

實(shí)施例5：

本實(shí)施例給出白藜蘆醇在制備提高糖尿病條件下“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷能力的藥物中的應(yīng)用，即給出白藜蘆醇對(duì)糖尿病環(huán)境中鈦表面成骨細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的能力的改善作用。

實(shí)驗(yàn)方法：將成骨細(xì)胞接種在鈦合金表面進(jìn)行培養(yǎng)，分組與實(shí)施例3相同。

培養(yǎng)第7天，用DCFH-DA染色(Sigma)結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇含量，評(píng)估細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。用Western bolt蛋白印記檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶的表達(dá)水平，評(píng)估細(xì)胞的抗氧化損傷能力，組間比較。

結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，糖尿病組成骨細(xì)胞內(nèi)活性氧簇含量明顯增加(附圖5-1)，過(guò)氧化氫酶表達(dá)則明顯下降(附圖5-2)，說(shuō)明糖尿病環(huán)境造成“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。而加入白藜蘆醇后，過(guò)氧化氫酶表達(dá)上升，細(xì)胞內(nèi)活性氧簇水平顯著下調(diào)，說(shuō)明白藜蘆醇明顯增強(qiáng)了糖尿病環(huán)境中成骨細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，改善了細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

結(jié)果分析：以上結(jié)果表明，在糖尿病條件下，白藜蘆醇能有效增強(qiáng)“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞的抗氧化能力，減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，由此能解釋實(shí)施例1～4中白藜蘆醇對(duì)糖尿病條件下成骨細(xì)胞的活力、分化、粘附和凋亡的改善作用。

實(shí)施例6：

本實(shí)施例給出白藜蘆醇在制備促進(jìn)糖尿病條件下醫(yī)用鈦合金內(nèi)植物骨整合的藥物中的應(yīng)用，即給出白藜蘆醇提高糖尿病動(dòng)物體內(nèi)植入的鈦合金材料的骨整合效果。

實(shí)驗(yàn)方法：將四氧嘧啶(STZ)40mg/kg尾靜脈注射于體重約200g的SD雄性大鼠，每天1次，連續(xù)5天。最后一次注射后7天，測(cè)空腹血糖，空腹血糖>300mg/dl為糖尿病成模動(dòng)物，用于后續(xù)試驗(yàn)。在外科手術(shù)條件下，SD大鼠雙側(cè)股骨遠(yuǎn)端沿股骨長(zhǎng)軸方向向髓內(nèi)植入直徑1.5mm、長(zhǎng)10mm的圓柱形鈦合金內(nèi)植物，建立鈦內(nèi)植物體內(nèi)植入模型。將白藜蘆醇溶解于生理鹽水中準(zhǔn)備給動(dòng)物用藥。動(dòng)物隨機(jī)分為4組，每組12只：

1)正常對(duì)照組；

2)糖尿病組：2天一次，生理鹽水2ml灌胃(陰性對(duì)照)；

3)糖尿病+白藜蘆醇5mg/kg：2天一次，白藜蘆醇5mg/kg(藥量/體重比)灌胃；

4)糖尿病+白藜蘆醇15mg/kg：2天一次，白藜蘆醇15mg/kg灌胃。

材料植入后6周取材，取植入了材料的股骨，每只老鼠左側(cè)股骨用于顯微CT掃描(GE公司)檢測(cè)，右側(cè)股骨用于材料骨結(jié)合生物力學(xué)檢測(cè)。利用顯微CT掃描數(shù)據(jù)計(jì)算“鈦-骨”界面骨植入物結(jié)合分?jǐn)?shù)(Bone-implant contact)，利用生物力學(xué)拔出試驗(yàn)測(cè)得材料拔出的最大力(Maximal push-out force)，綜合評(píng)價(jià)各組鈦合金材料的骨整合效果。

結(jié)果：與正常動(dòng)物相比，糖尿病動(dòng)物體內(nèi)的鈦合金材料骨結(jié)合不佳(附圖6-1)，骨植入物結(jié)合分?jǐn)?shù)明顯下降(附圖6-2)，生物力學(xué)檢測(cè)中最大拔出力明顯降低(附圖6-3)，說(shuō)明材料骨結(jié)合效果不佳。糖尿病動(dòng)物白藜蘆醇給藥后骨植入物結(jié)合分?jǐn)?shù)明顯升高，最大拔出力顯著提高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。且高計(jì)量(15mg/kg)的改善作用比低劑量(5mg/kg)更明顯。

結(jié)果分析：上述結(jié)果說(shuō)明，白藜蘆醇能有效提高糖尿病條件下體內(nèi)鈦合金植入物的骨整合效果，增強(qiáng)鈦內(nèi)植物的穩(wěn)定性。

實(shí)施例7：

本實(shí)施例給出白藜蘆醇在制備糖尿病條件下醫(yī)用鈦合金內(nèi)植物的功能化復(fù)合材料中的應(yīng)用，即給出白藜蘆醇作為醫(yī)用鈦合金材料的復(fù)合藥物涂層用于組織局部藥物緩釋?zhuān)瑥亩龠M(jìn)糖尿病患者鈦合金內(nèi)植物骨整合的應(yīng)用。

鈦合金材料植入人體骨組織的過(guò)程造成局部骨組織的損傷，植入完成后材料周?chē)墙M織需要再生修復(fù)，生成新的骨組織并與內(nèi)植物整合，從而保證內(nèi)植物的穩(wěn)定。機(jī)體局部骨組織中多種細(xì)胞參與此骨新生過(guò)程，其中起關(guān)鍵作用即成骨細(xì)胞，它的功能狀態(tài)直接決定“鈦-骨”界面骨再生和鈦合金骨整合的效果。

醫(yī)用材料表面復(fù)合涂層用于組織局部的藥物緩釋?zhuān)顾幬锛凶饔糜谀繕?biāo)范圍的組織，被公認(rèn)為有效提升材料生物學(xué)性能的方法。本發(fā)明實(shí)施例1～5采用鈦合金表面培養(yǎng)成骨細(xì)胞的方法，模擬體內(nèi)“鈦-骨”結(jié)合部(“鈦-骨”界面)的生物學(xué)環(huán)境，直觀地檢測(cè)糖尿病血清(代表糖尿病內(nèi)環(huán)境)對(duì)成骨細(xì)胞的不良影響以及白藜蘆醇對(duì)糖尿病環(huán)境中“鈦-骨”界面成骨細(xì)胞的直接改善作用和機(jī)制，證明了白藜蘆醇在組織局部有效的治療效果。由此，可以得出以下科學(xué)推論：相對(duì)口服用藥等全身性用藥方式，鈦合金材料表面復(fù)合白藜蘆醇涂層后植入需要使用鈦合金內(nèi)植物的糖尿病患者的骨組織，能使白藜蘆醇在“鈦-骨”界面局部集中發(fā)揮作用，改善糖尿病內(nèi)環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的負(fù)面影響，提高成骨細(xì)胞參與骨組織新生的功能，從而促進(jìn)鈦合金內(nèi)植物的骨整合，改善糖尿病患者鈦內(nèi)植物的穩(wěn)定性，減輕患者痛苦。

對(duì)比例1：

本實(shí)施給出白藜蘆醇對(duì)糖尿病條件下沒(méi)有鈦合金的環(huán)境中成骨細(xì)胞的影響，說(shuō)明白藜蘆醇對(duì)糖尿病條件下不在鈦合金表面的成骨細(xì)胞無(wú)明顯生長(zhǎng)促進(jìn)作用。

實(shí)驗(yàn)方法：利用分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠顱骨的成骨細(xì)胞，將其按1×10⁴個(gè)/毫升的細(xì)胞密度接種在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔內(nèi)，在沒(méi)有鈦合金的環(huán)境中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分為四組，各組細(xì)胞接種量相同：

1)正常血清組；

2)糖尿病血清組；

3)糖尿病+白藜蘆醇50μM；

4)糖尿病+白藜蘆醇250μM。

分別在培養(yǎng)3天和7天后，用MTT法檢測(cè)鈦表面成骨細(xì)胞的細(xì)胞活力；培養(yǎng)7天后利用ALP酶活力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鈦表面成骨細(xì)胞分化程度，并利用Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)雙標(biāo)法染色法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

結(jié)果：與正常組相比，糖尿病條件在沒(méi)有鈦合金存在的環(huán)境中也導(dǎo)致了成骨細(xì)胞的增殖力降低(附圖7-1)，分化程度減弱(附圖7-2)和凋亡比例增加(附圖7-3)。糖尿病條件下加入兩個(gè)不同劑量的白藜蘆醇后成骨細(xì)胞的上述生物學(xué)性能抑制都未得到有效改善。

結(jié)果分析：鈦合金與骨的接觸面(“鈦-骨”界面)是一種特殊的生物環(huán)境，細(xì)胞在鈦表面的生物學(xué)行為與在沒(méi)有鈦合金的普通人體環(huán)境中不同，這也是當(dāng)前科研領(lǐng)域熱衷于研究“材料-人體組織”界面的特殊生物學(xué)現(xiàn)象和機(jī)制的原因。本實(shí)施例結(jié)果表明，在沒(méi)有鈦合金存在的糖尿病環(huán)境中白藜蘆醇對(duì)糖尿病條件造成的成骨細(xì)胞損傷沒(méi)有明顯改善作用，白藜蘆醇的良好治療作用只在“鈦-骨”界面這個(gè)特殊環(huán)境中發(fā)揮作用。