本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，涉及一種超飽和甲烷生理鹽水及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

脊髓損傷至今仍然被認(rèn)為是一種無(wú)特殊治療方法的傷病。近20年來(lái)人們對(duì)脊髓損傷的病因及機(jī)制進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究和臨床觀察，認(rèn)識(shí)到原發(fā)性脊髓損傷后的繼發(fā)性損害，如缺血再灌注損傷是造成神經(jīng)損傷的一個(gè)重要因素。

脊髓缺血再灌注損傷是胸腹主動(dòng)脈瘤和脊柱外科手術(shù)后難以預(yù)料的并發(fā)癥，發(fā)生率高達(dá)約13-18％，損傷引起截癱或四肢癱瘓嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。然而，到目前為止仍沒(méi)有有效的防治措施。研究表明，脊髓缺血后再灌注過(guò)程中，產(chǎn)生大量活性氧自由基(ROS)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起蛋白質(zhì)分解，脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA損傷，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。并且，氧化應(yīng)激導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，釋放大量炎癥因子，促進(jìn)血-脊髓屏障的破壞，導(dǎo)致脊髓缺血后脊髓水腫和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。因此，阻斷氧化應(yīng)激，和隨后的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡通路是脊髓神經(jīng)保護(hù)治療的主要思路。

臨床上，脊髓缺血再灌注損傷(Spinal cord ischemia-reperfusion injury,SCIRI)常合并或繼發(fā)在脊柱脊髓外傷病變中，少有單獨(dú)發(fā)生。常用的方法有外科手術(shù)、藥物治療、基因治療、移植治療等，這就增加了治療成本，增加了患者的負(fù)擔(dān)。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種超飽和甲烷生理鹽水的制備方法以及制得的超飽和甲烷生理鹽水，該超飽和甲烷生理鹽水制備簡(jiǎn)單，并且得到的超飽和甲烷生理鹽水中的甲烷含量高。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種所述的超飽和甲烷生理鹽水在制備治療激活核因子E2相關(guān)因子-2(Nrf2)信號(hào)通路藥物中的應(yīng)用，特別是在脊髓缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種超飽和甲烷生理鹽水的制備方法，將無(wú)菌生理鹽水和甲烷氣體按照體積比為3：0.8-1.2輸入內(nèi)層貼覆有聚乙烯膜的鋁箔袋內(nèi)，至所述鋁箔袋內(nèi)的壓力達(dá)到0.18-0.22MPa；

所述鋁箔袋在0.45-0.55MPa的壓力下處理6-8小時(shí)；

然后往所述鋁箔袋內(nèi)輸入甲烷氣體以補(bǔ)充溶解于生理鹽水的部分，使所述鋁箔袋內(nèi)的壓力保持在0.18-0.22MPa。

近年有文獻(xiàn)報(bào)道，甲烷具有器官保護(hù)作用。然而，甲烷氣體在常溫(15-25℃)常壓(1個(gè)大氣壓，即0.1MPa)環(huán)境中,在水中的溶解度較小，僅為0.22mmol/L，難以達(dá)到臨床治療所需的濃度。因此研制一種含甲烷濃度高，攜帶方便，在臨床上容易使用、儲(chǔ)存，并能長(zhǎng)期保持其效價(jià)穩(wěn)定的甲烷溶液十分必要。

本發(fā)明提供的超飽和甲烷生理鹽水的制備方法，特定選用內(nèi)層貼覆有聚乙烯膜的鋁箔袋作為載體，將生理鹽水和甲烷氣體按一定的比例輸入，至鋁箔袋內(nèi)達(dá)到一定的壓力，然后在一定的壓力下處理，再經(jīng)過(guò)額外注射甲烷氣體，以補(bǔ)充溶解于生理鹽水的部分，使得甲烷氣體溶解于生理鹽水中達(dá)到趨于超飽和或飽和的水平。該方法采用高壓溶解技術(shù)，結(jié)合鋁箔袋密封壓力儲(chǔ)藏技術(shù)，將甲烷以超飽和狀態(tài)溶解到生理鹽水中，提高甲烷在常溫、常壓下的溶解度，達(dá)到2.50-2.65mmol/L，是通常狀態(tài)下的11.7倍，并可保持此濃度穩(wěn)定1年以上。

其中，無(wú)菌生理鹽水和甲烷氣體按照體積比為3：0.8-1.2輸入內(nèi)層貼覆有聚乙烯膜的鋁箔袋內(nèi)的步驟中，無(wú)菌生理鹽水和甲烷氣體的體積比可以為3：0.8、3：1、3：1.2等等。

為了便于操作，且使得甲烷氣體與生理鹽水更好的達(dá)到超飽和狀態(tài)，進(jìn)一步地，所述無(wú)菌生理鹽水與所述甲烷氣體的體積比為3：1。

進(jìn)一步地，所述鋁箔袋在使用前先進(jìn)行滅菌，所述滅菌采用γ射線照射進(jìn)行。輻照滅菌是利用電離輻射產(chǎn)生的電磁波殺死大多數(shù)物質(zhì)上的微生物的一種有效方法。γ射線照射滅菌是最常用的輻照滅菌技術(shù)，一般采用鈷60作為放射源產(chǎn)生γ射線，來(lái)起到消毒、滅菌作用。

優(yōu)選地，所述鋁箔袋放置在高壓倉(cāng)內(nèi)進(jìn)行壓力處理，操作便捷。

為了使甲烷氣體更充分的溶入生理鹽水中，優(yōu)選地，所述鋁箔袋在0.5MPa的壓力下處理7-8小時(shí)。

進(jìn)一步地，所述甲烷氣體的純度為99.9％以上。

本發(fā)明提供的超飽和甲烷生理鹽水的制備方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、制備方法簡(jiǎn)單。根據(jù)甲烷在常溫環(huán)境下，其在水中的溶解度與壓力呈正比的原理，通過(guò)增加外界壓力，來(lái)增加甲烷在水中溶解的量，以達(dá)到臨床所需的治療濃度。

2、制得的超飽和甲烷生理鹽水效價(jià)持久。本技術(shù)采用內(nèi)層貼覆一層聚乙烯膜的鋁箔袋作為儲(chǔ)液容器，即維持了醫(yī)用藥液的常規(guī)儲(chǔ)存條件(醫(yī)用輸液袋一般以聚乙烯膜做材料)，又克服了甲烷等小分子氣體容易透過(guò)常規(guī)醫(yī)用輸液袋產(chǎn)生效價(jià)衰減的弊端(外層的鋁箔層不容易被小分子氣體通過(guò))。另外，鋁箔袋由于是金屬質(zhì)地，較常規(guī)醫(yī)用聚乙烯袋能夠承受較大的張力，使袋內(nèi)維持較高的壓力(0.2MPa)，從而維持甲烷在生理鹽水中的超飽和溶解的穩(wěn)定。

3、本技術(shù)只需常溫下儲(chǔ)存，克服了以往技術(shù)得出的甲烷注射液需在0-5℃環(huán)境下保存的苛刻條件。

本發(fā)明上述方法制得的超飽和甲烷生理鹽水中甲烷的濃度為2.50-2.65mmol/L。

核因子Nrf2信號(hào)通路是目前發(fā)現(xiàn)的抵御外源性刺激和毒物的抗氧化應(yīng)答反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，超飽和甲烷生理鹽水具有激活核因子Nrf2信號(hào)通路的作用，使得生物體對(duì)抗氧化產(chǎn)生應(yīng)答。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了超飽和甲烷生理鹽水在作為制備治療激活Nrf2信號(hào)通路藥物中的應(yīng)用。

具體地，所述的超飽和甲烷生理鹽水在制備治療脊髓缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用。

脊髓缺血再灌注損傷的治療方法，包括給予受試者有效量的超飽和甲烷生理鹽水。

進(jìn)一步地，按生物體的重量計(jì)，所述超飽和甲烷生理鹽水注射的劑量為15-25ml/kg。

優(yōu)選地，所述超飽和甲烷生理鹽水注射的劑量為20ml/kg。

本發(fā)明提供的超飽和甲烷生理鹽水用于治療脊髓缺血再灌注損傷。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明提供的超飽和甲烷生理鹽水的制備方法，采用高壓溶解技術(shù)，結(jié)合鋁箔袋密封壓力儲(chǔ)藏技術(shù)，將甲烷以超飽和狀態(tài)溶解到生理鹽水中，提高甲烷在常溫、常壓下的溶解度，達(dá)到2.50-2.65mmol/L，是通常狀態(tài)下的11.7倍，并可保持此濃度穩(wěn)定1年以上。

(2)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的超飽和甲烷生理鹽水具有激活Nrf2信號(hào)通路的功效。

(3)本發(fā)明還提供了將超飽和甲烷生理鹽水應(yīng)用于治療脊髓缺血再灌注損傷，具有很好的功效。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中制得的超飽和甲烷生理鹽水隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)甲烷濃度的變化曲線圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中不同組別的大鼠后肢運(yùn)動(dòng)-感覺(jué)障礙指數(shù)曲線圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中不同組別的大鼠腰段脊髓前角正常神經(jīng)元數(shù)量柱形圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中不同組別的大鼠血漿、脊髓組織中的甲烷濃度曲線圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中不同組別的大鼠實(shí)驗(yàn)流程及指標(biāo)測(cè)定的示意圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中不同組別的大鼠后肢神經(jīng)功能和組織形態(tài)學(xué)的結(jié)果圖。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例3中不同組別的大鼠血-脊髓屏障通透性、脊髓含水量和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的結(jié)果圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例3中不同組別的大鼠腰段脊髓甲烷濃度的結(jié)果圖；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例3中不同組別的大鼠核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2蛋白表達(dá)情況示意圖；

圖10為本發(fā)明實(shí)施例3中不同組別的大鼠各種抗氧化酶及氧化損傷標(biāo)志物變化圖；

圖11為本發(fā)明實(shí)施例3中不同組別的大鼠中Nrf2蛋白在神經(jīng)元表達(dá)情況圖；

圖12為本發(fā)明實(shí)施例3中不同組別的大鼠中小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)及Nrf2蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)情況圖；

圖13為本發(fā)明實(shí)施例3中不同組別的大鼠中星型膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)及Nrf2蛋白在星型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)情況圖；

圖14為本發(fā)明實(shí)施例3中不同組別的大鼠中脊髓神經(jīng)元調(diào)亡情況圖；

圖15為本發(fā)明實(shí)施例3中不同組別的大鼠神經(jīng)元線粒體調(diào)亡途徑的標(biāo)志物變化圖；

圖16為本發(fā)明實(shí)施例3中不同組別的大鼠促炎因子、趨化因子、黏附分子和MMP-9表達(dá)情況圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

制備超飽和甲烷生理鹽水：

選用內(nèi)層貼覆有一層無(wú)毒聚乙烯膜的鋁箔袋作為儲(chǔ)液袋和輸液袋，其由500ml容積的袋體與輸液接口組成(由江蘇省蘇州市星辰新材料有限公司制備)，輸液接口被橡膠密封圈封住；使用前采用γ射線照射滅菌；

將無(wú)菌生理鹽水、甲烷氣體(純度99.9％)以3:1的體積比通過(guò)輸液接口注入鋁箔袋內(nèi)，注滿直至鋁箔袋內(nèi)壓力達(dá)到0.2MPa(從輸液接口處，通過(guò)在輸液接口橡膠密封圈上插入一端連有壓力表的6號(hào)輸液針頭測(cè)得)；

將充滿甲烷的鋁箔袋置入高壓艙，使高壓艙內(nèi)壓力升至0.5MPa，并維持此壓力達(dá)8小時(shí)，將甲烷氣體溶解于生理鹽水中達(dá)到超飽和水平；

從高壓艙中取出鋁箔袋，然后從輸液接口輸入少量甲烷氣體，以補(bǔ)充溶解于生理鹽水的部分，使袋內(nèi)壓力保持0.2MPa，然后置于常溫下保存。

采用氣相色譜法測(cè)定制備的超飽和甲烷生理鹽水中含有甲烷的濃度，得出新鮮制備1天的生理鹽水中的甲烷平均濃度為2.63mmol/L；制備1月后，生理鹽水中的甲烷平均濃度為2.61mmol/L，制備1年后，生理鹽水中的甲烷平均濃度仍保持在2.54mmol/L，具體如圖1所示。

實(shí)施例2

大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型于再灌注開(kāi)始即刻分別腹腔注射實(shí)施例1中制得的超飽和甲烷生理鹽水，按大鼠的重量計(jì)，注射量分別為5ml/kg、10ml/kg和20ml/kg，分別為Methane-5組、Methane-10組、Methane-20組，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，即IR組；

分別測(cè)定再灌注72小時(shí)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)-感覺(jué)障礙指數(shù)(神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分)、腰段脊髓前角正常神經(jīng)元數(shù)量，以及血漿和腰段脊髓組織甲烷濃度。大鼠后肢運(yùn)動(dòng)-感覺(jué)障礙指數(shù)結(jié)果如圖2所示，腰段脊髓前角正常神經(jīng)元數(shù)量結(jié)果如圖3所示，血漿和腰段脊髓組織甲烷濃度結(jié)果如圖4所示。圖3中，A代表IR組，B代表Methane-5組，C代表Methane-10組，D代表Methane-20組，箭頭指示正常神經(jīng)元；E為4組正常神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計(jì)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與缺血再灌注組(IR組)比較，腹腔注射20ml/kgMS(Methane-20組)可顯著提高血漿、脊髓組織中的甲烷濃度，改善運(yùn)動(dòng)-感覺(jué)障礙，保存脊髓前角正常神經(jīng)元；而注射量為5ml/kg則對(duì)改善運(yùn)動(dòng)-感覺(jué)障礙影響不大；注射量為10ml/kg時(shí)運(yùn)動(dòng)-感覺(jué)障礙稍有改善。

從上述試驗(yàn)得到，超飽和甲烷生理鹽水注射量為20ml/kg能夠?qū)崿F(xiàn)很好的治療效果。

另外，還采用15ml/kg和25ml/kg的超飽和甲烷生理鹽水注射劑量，15ml/kg的注射劑量效果比20ml/kg的注射劑量效果稍差，而25ml/kg的超飽和甲烷生理鹽水注射劑量效果與20ml/kg的注射劑量效果相當(dāng)，但是，由于大鼠腹腔大小的限制，更多劑量造成注射的難度。因此，優(yōu)選采用20ml/kg的超飽和甲烷生理鹽水注射劑量。

實(shí)施例3

將大鼠隨機(jī)分為五組，分別為sham組、IR組、methane組、Si-Methane組和Con-Methane組，每組38只。具體每組的信息如下：

Sham組：假手術(shù)組，除未實(shí)施脊髓缺血再灌注損傷，其他同IR組。

IR組：采用阻斷胸主動(dòng)脈合并體循環(huán)低血壓9分鐘后恢復(fù)灌注和血壓的方法制備大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型。

Methane組：采用阻斷胸主動(dòng)脈合并體循環(huán)低血壓9分鐘后恢復(fù)灌注和血壓的方法制備大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型；于恢復(fù)灌注即刻腹腔注射超飽和甲烷生理鹽水(MS)20ml/kg。

Si-Methane組：大鼠鞘內(nèi)注射Nrf2小干擾RNA(Nrf2 siRNA)300μg/kg，每隔24小時(shí)注射一次，連續(xù)3次。最后一次鞘內(nèi)注射24小時(shí)后，實(shí)施手術(shù)，采用阻斷胸主動(dòng)脈合并體循環(huán)低血壓9分鐘后恢復(fù)灌注和血壓的方法制備大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，于恢復(fù)灌注即刻腹腔注射超飽和甲烷生理鹽水(MS)20ml/kg。

Con-Methane組：大鼠鞘內(nèi)注射陰性對(duì)照小干擾RNA(control siRNA)300μg/kg，每隔24小時(shí)注射一次，連續(xù)3次。最后一次鞘內(nèi)注射24小時(shí)后，實(shí)施手術(shù)，采用阻斷胸主動(dòng)脈合并體循環(huán)低血壓9分鐘后恢復(fù)灌注和血壓的方法制備大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，于恢復(fù)灌注即刻腹腔注射超飽和甲烷生理鹽水(MS)20ml/kg。

具體各組的區(qū)別如圖5所示。

1、MS可以改善IR損傷大鼠后肢神經(jīng)功能和組織形態(tài)學(xué)

于再灌注12、24、48、72小時(shí)對(duì)各組大鼠進(jìn)行后肢神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(運(yùn)動(dòng)-感覺(jué)障礙指數(shù),圖6A)；于再灌注72小時(shí)對(duì)各組大鼠脊髓腰段進(jìn)行Nissl染色，觀察形態(tài)學(xué)變化(圖6B)，測(cè)定脊髓前角、中間部和后角的正常神經(jīng)元數(shù)量(圖6C)。

各組大鼠都能存活至再灌注后72小時(shí)，以保證各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)。如圖6A所示，9分鐘脊髓缺血可引起大鼠明顯的神經(jīng)行為學(xué)障礙；與Sham組比較，IR組于再灌注12、24、48、72小時(shí)平均運(yùn)動(dòng)-感覺(jué)障礙指數(shù)明顯增加(p<0.01)；與IR組比較，Methane組各時(shí)間點(diǎn)平均運(yùn)動(dòng)-感覺(jué)障礙指數(shù)明顯下降(p<0.01)；與Methane組和Con-Methane組比較，Si-Methane組各時(shí)間點(diǎn)平均運(yùn)動(dòng)-感覺(jué)障礙指數(shù)明顯增加(p<0.05)；與Methane組比較，Con-Methane組各時(shí)間點(diǎn)平均運(yùn)動(dòng)-感覺(jué)障礙指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)

9分鐘脊髓缺血可引起大鼠脊髓灰質(zhì)各個(gè)區(qū)域神經(jīng)元死亡。如圖6B、C所示：與Sham組比較，IR組脊髓前角、中間部、后角正常神經(jīng)元數(shù)量顯著下降(p<0.001)；與IR組比較，Methane組脊髓各區(qū)域正常神經(jīng)元數(shù)量明顯增加(p<0.01)；與Methane組和Con-Methane組比較，Si-Methane組脊髓各區(qū)域正常神經(jīng)元數(shù)量明顯下降(p<0.05)；與Methane組比較，Con-Methane組脊髓各區(qū)域正常神經(jīng)元數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。

2、MS減輕IR損傷大鼠血-脊髓屏障通透性、脊髓含水量和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)

于再灌注72小時(shí)測(cè)定各組大鼠腰段脊髓伊文思藍(lán)熒光強(qiáng)度(圖7A,B)和含量(圖7C)(兩者皆反映血-脊髓屏障通透性)、脊髓含水量(圖7D)和髓過(guò)氧化物酶活性(圖7E,反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度)。

從圖7可知，與Sham組比較，IR組腰段脊髓伊文思藍(lán)含量和熒光強(qiáng)度、含水量、髓過(guò)氧化物酶活性顯著增加(p<0.01)；與IR組比較，Methane組脊髓伊文思藍(lán)含量和熒光強(qiáng)度、含水量、髓過(guò)氧化物酶活性顯著降低(p<0.01或p<0.05)；與Methane組和Con-Methane組比較，Si-Methane組脊髓伊文思藍(lán)含量和熒光強(qiáng)度、含水量、髓過(guò)氧化物酶活性顯著升高(p<0.05)；與Methane組比較，Con-Methane組脊髓伊文思藍(lán)含量和熒光強(qiáng)度、含水量、髓過(guò)氧化物酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。

3、氣象色譜法測(cè)定各組大鼠腰段脊髓甲烷濃度

圖8A是氣象色譜圖，反映Methane組腹腔注射20ml/kg MS后10分鐘(a1)、12小時(shí)(a2)、24小時(shí)(a3)、48小時(shí)(a4)、72小時(shí)(a5)脊髓組織甲烷濃度。圖8B為各組大鼠各時(shí)點(diǎn)腰段脊髓甲烷濃度的比較。

從圖8可以看出，與Sham組和IR組比較，Methane組、Si-Methane組、Con-Methane組腹腔注射MS后10min脊髓甲烷濃度顯著升高(p<0.001)，并于給藥后12、24、48、72小時(shí)保持較高的甲烷濃度(p<0.01)。Methane組、Si-Methane組、Con-Methane組三組間在各時(shí)間點(diǎn)脊髓甲烷濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。IR組，缺血雖能導(dǎo)致脊髓中甲烷濃度輕微增加，但其濃度與Sham組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。

4、MS治療誘導(dǎo)脊髓IR損傷后Nrf2蛋白表達(dá)增加及其核轉(zhuǎn)位

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，MS治療減輕脊髓IR損傷，與MS誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2蛋白表達(dá)增加及促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位有關(guān)，并呈時(shí)間依賴性。

圖9A-D顯示，與Sham組比較，IR組于再灌注12、24、48、72小時(shí)Nrf2蛋白在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)量及細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)的比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；與IR組比較，Methane組各時(shí)間點(diǎn)脊髓Nrf2蛋白在細(xì)胞核(p<0.05vs.IR for 12,24h,p<0.01vs.IR for 48,72h)、細(xì)胞質(zhì)(p<0.05vs.IR for 12,24,48h,p<0.01vs.IR for 72h)中的表達(dá)量及細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核的比例(p<0.05vs.IR for 12,24h,p<0.01vs.IR for 48,72h)逐漸增加；與Methane組和Con-Methane組比較，Si-Methane組各時(shí)間點(diǎn)Nrf2蛋白在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)量及細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)的比例明顯降低(p<0.05)；與Methane組比較，Con-Methane組Nrf2蛋白在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)量及細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)的比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。

圖9E-F顯示，與Sham組比較，IR組于再灌注12、24、48、72小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)Nrf2 mRNA表達(dá)量、DNA結(jié)合活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；與IR組比較，Methane組各時(shí)間點(diǎn)脊髓Nrf2 mRNA表達(dá)量(p<0.05vs.IR for 12,24h,p<0.01vs.IR for 48,72h)及其DNA結(jié)合活性(p<0.05vs.IR for 12,24h,p<0.01vs.IR for 48,72h)逐漸增加；與Methane組和Con-Methane組比較，Si-Methane組各時(shí)間點(diǎn)Nrf2 mRNA表達(dá)量、DNA結(jié)合活性下降(p<0.05)；與Methane組比較，Con-Methane組Nrf2 mRNA表達(dá)量、DNA結(jié)合活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。

5、MS治療活化脊髓IR損傷后Nrf2調(diào)控的抗氧化保護(hù)機(jī)制

在以上研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步探討Nrf2調(diào)控的抗氧化機(jī)制是否參與了MS的脊髓保護(hù)作用，減輕氧化損傷。

圖10A-D顯示，與Sham組比較，IR組于再灌注12、24、48、72小時(shí)血紅素氧化酶-1蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性逐漸下降(p<0.05vs.IR for 12,24h,p<0.01vs.IR for 48,72h)。與IR組比較，Methane組于再灌注12、24、48、72小時(shí)血紅素氧化酶-1蛋白和超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性逐漸增加(p<0.05vs.IR for 12,24h,p<0.01vs.IR for 48,72h)。與Methane組和Con-Methane組比較，Si-Methane組各時(shí)間點(diǎn)HO-1蛋白和超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性明顯降低(p<0.05)。與Methane組比較，Con-Methane組各時(shí)間點(diǎn)血紅素氧化酶-1蛋白和超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。

圖10E-G顯示，與Sham組比較，IR組于再灌注12、24、48、72小時(shí)脊髓丙二醛、8-羥脫氧鳥(niǎo)苷、3-硝基酪氨酸含量顯著升高(p<0.05vs.IR for 12h,p<0.01vs.IR for 24,48,72h)。與IR組比較，Methane組各時(shí)間點(diǎn)丙二醛、8-羥脫氧鳥(niǎo)苷、3-硝基酪氨酸含量逐漸降低(p<0.05vs.IR for 12,24h,p<0.01vs.IR for 48,72h)。與Methane組和Con-Methane組比較，Si-Methane組各時(shí)間點(diǎn)丙二醛、8-羥脫氧鳥(niǎo)苷、3-硝基酪氨酸含量顯著增加(p<0.05)。與Methane組比較，Con-Methane組丙二醛、8-羥脫氧鳥(niǎo)苷、3-硝基酪氨酸含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。

6、MS治療誘導(dǎo)Nrf2蛋白脊髓IR損傷后在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)

圖11A、12C、13C顯示再灌注72小時(shí)Nrf2蛋白分別與神經(jīng)元(NeuN)、小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba-1)、星型膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)免疫熒光雙標(biāo)染色。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Sham組大鼠腰段脊髓灰質(zhì)只見(jiàn)少量Nrf2蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度，并且其大多數(shù)分布于神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)。IR組脊髓灰質(zhì)Nrf2蛋白的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞分布與Sham組比較無(wú)差異(p＞0.05)。Methane組脊髓灰質(zhì)前角、中間部、后角都可見(jiàn)大量Nrf2蛋白免疫熒光(p＜0.01vs.IR)，并且大部分分布在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞的胞核。Si-Methane組脊髓灰質(zhì)前角、中間部、后角的Nrf2蛋白免疫熒光強(qiáng)度較Methane組、Con-Methane組顯著減少(p<0.05)，且大部分分布在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿。Con-Methane組脊髓灰質(zhì)區(qū)域的Nrf2熒光強(qiáng)度、分布與Methane組相似(p＞0.05)。圖11B、12D、13D為5組脊髓灰質(zhì)中與神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)的Nrf2蛋白熒光強(qiáng)度的比較。

7、MS治療減輕脊髓IR損傷后神經(jīng)元調(diào)亡

圖14顯示再灌注72小時(shí)各組腰段脊髓進(jìn)行末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)，反映脊髓神經(jīng)元調(diào)亡情況。

Sham組脊髓只見(jiàn)極少TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞；IR組脊髓前角、中間部、后角可見(jiàn)大量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(p＜0.001vs.Sham)。與IR組比較，Methane組脊髓前角、中間部、后角TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少(p＜0.01)。Si-Methane組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較Methane組、Con-Methane組明顯增加(p＜0.05)。與Methane組比較，Con-Methane組TUNEL細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。

圖15顯示再灌注72小時(shí)MS對(duì)神經(jīng)元線粒體調(diào)亡途徑的標(biāo)志物細(xì)胞色素c及活化型半胱天冬酶-9、活化型半胱天冬酶-3的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：IR組脊髓細(xì)胞色素c及活化型半胱天冬酶-9、活化型半胱天冬酶-3蛋白表達(dá)量及活化型半胱天冬酶-3陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯升高(p＜0.001vs.Sham)。與IR組比較，Methane組脊髓細(xì)胞色素c及活化型半胱天冬酶-9、活化型半胱天冬酶-3蛋白表達(dá)量及活化型半胱天冬酶-3陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少(p＜0.01)。與Methane組和Con-Methane組比較，Si-Methane組細(xì)胞色素c及活化型半胱天冬酶-9、活化型半胱天冬酶-3蛋白表達(dá)量及活化型半胱天冬酶-3陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加(p＜0.05)。與Methane組比較，Con-Methane組細(xì)胞色素c及活化型半胱天冬酶-9、活化型半胱天冬酶-3蛋白表達(dá)量及活化型半胱天冬酶-3陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。

8、MS治療抑制脊髓IR損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞活化

圖12A顯示，再灌注72小時(shí)腰段脊髓切片小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1免疫熒光染色，提示MS抑制脊髓IR損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞活化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Sham組可見(jiàn)脊髓灰質(zhì)零星分布著少量小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞)，呈靜息狀態(tài)：典型的小細(xì)胞體，有數(shù)個(gè)細(xì)小分枝。IR組脊髓灰質(zhì)前角、中間部、后角小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多(p＜0.001vs.Sham)，呈活化狀態(tài)：細(xì)胞體變肥大，分枝變短、變粗。與IR組比較，Methane組脊髓灰質(zhì)前角、中間部、后角小膠質(zhì)細(xì)胞明顯減少(p＜0.01)，活化狀態(tài)降低。與Methane組、Con-Methane組比較，Si-Methane組脊髓灰質(zhì)前角、中間部、后角小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多(p＜0.05)。與Methane組比較，Con-Methane組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、活化狀態(tài)相似(p＞0.05)。

圖13A顯示，再灌注72小時(shí)腰段脊髓切片星型細(xì)胞標(biāo)志物GFAP免疫熒光染色，提示MS抑制脊髓IR損傷后星型膠質(zhì)細(xì)胞活化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Sham組可見(jiàn)脊髓灰質(zhì)少量星型膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽(yáng)性細(xì)胞)。IR組脊髓灰質(zhì)前角、中間部、后角星型膠質(zhì)細(xì)胞增殖，數(shù)量明顯增多(p＜0.001vs.Sham)。與IR組比較，Methane組脊髓灰質(zhì)前角、中間部、后角星型膠質(zhì)細(xì)胞明顯減少(p＜0.01)。與Methane組、Con-Methane組比較，Si-Methane組脊髓灰質(zhì)前角、中間部、后角星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多(p＜0.05)。與Methane組比較，Con-Methane組星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。

9、MS治療通過(guò)干擾核因子Kappa B(NF-κB)信號(hào)抑制脊髓IR損傷后促炎因子、趨化因子、黏附分子和MMP-9表達(dá)

圖16A-C顯示，再灌注72小時(shí)MS治療抑制NF-κB p65亞單位的磷酸化(p-NF-κB p65)及核轉(zhuǎn)位。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與Sham組比較，IR組脊髓p-NF-κB p65細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)的比例、DNA結(jié)合活性顯著升高(p＜0.001)。與IR組比較，Methane組p-NF-κB p65細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)的比例、DNA結(jié)合活性明顯降低(p＜0.01)。與Methane組比較，Si-Methane組p-NF-κB p65細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)的比例、DNA結(jié)合活性明顯升高(p＜0.05)，提示MS抑制NF-κB p65亞單位的磷酸化及核轉(zhuǎn)位，依賴Nrf2活性增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)的。與Methane組比較，Con-Methane組p-NF-κB p65細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)的比例、DNA結(jié)合活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。

圖16D-K顯示，再灌注72小時(shí)MS對(duì)NF-κB調(diào)控的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、CXC趨化因子配體1(CXCL1)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)的抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與Sham組比較，IR組脊髓TNF-α、IL-1β、CXCL1、ICAM-1的mRNA和含量顯著升高(p＜0.001)。與IR組比較，Methane組TNF-α、IL-1β、CXCL1、ICAM-1的mRNA和含量明顯降低(p＜0.01)。與Methane組比較，Si-Methane組TNF-α、IL-1β、CXCL1、ICAM-1的mRNA和含量明顯升高(p＜0.05)，Con-Methane組TNF-α、IL-1β、CXCL1、ICAM-1的mRNA和含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。

圖16L-N顯示，再灌注72小時(shí)MS對(duì)NF-κB調(diào)控的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的抑制，以及對(duì)緊密連接蛋白(Claudin-5、Occludin、ZO-1)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與Sham組比較，IR組脊髓MMP-9蛋白表達(dá)量顯著升高，Claudin-5、Occludin、ZO-1的蛋白表達(dá)量明顯降低(p＜0.001)。與IR組比較，Methane組脊髓MMP-9蛋白表達(dá)量明顯下降，Claudin-5、Occludin、ZO-1的蛋白表達(dá)量明顯增加(p＜0.01)。與Methane組比較，Si-Methane組MMP-9蛋白量明顯增加，Claudin-5、Occludin、ZO-1的蛋白量明顯下降(p＜0.05)，Con-Methane組MMP-9、Claudin-5、occludin、ZO-1的蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。

另外，本發(fā)明還改變實(shí)施例1的超飽和甲烷生理鹽水的制備方法制備超飽和甲烷生理鹽水：

組1：無(wú)菌生理鹽水的體積與甲烷氣體的體積比是3:0.8，至鋁箔袋內(nèi)的壓力達(dá)到0.18MPa，于0.45MPa的壓力下處理6小時(shí)，得到的超飽和甲烷生理鹽水中的甲烷濃度為2.55mmol/L；常溫保存1年，甲烷濃度為2.50mmol/L以上。

組2：無(wú)菌生理鹽水的體積與甲烷氣體的體積比是3:1.2，至鋁箔袋內(nèi)的壓力達(dá)到0.22MPa，于0.55MPa的壓力下處理8小時(shí)，得到的超飽和甲烷生理鹽水中的甲烷濃度為2.65mmol/L；常溫保存1年，甲烷濃度為2.60mmol/L以上。

盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。