本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，一類二氫黃酮化合物在預(yù)防或治療肝癌方面的藥物和保健品方面的新用途。
背景技術(shù)：
：肝癌是世界上惡性程度極高，且預(yù)后極差的惡性腫瘤之一，當(dāng)下，肝癌在全球的發(fā)病率都呈上升趨勢(shì)。世界衛(wèi)生組織發(fā)表的《全球癌癥報(bào)告2014》顯示，中國(guó)新增癌癥病例高居世界第一位，其中肝癌的新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。目前，我國(guó)肝癌的發(fā)病率約為25.7/10萬，成為死亡率僅次于胃癌、肺癌的第三大惡性腫瘤。盡管目前肝癌的治療方法有許多種，但治療效果都十分有限，并未顯著延長(zhǎng)病人的生存期。能手術(shù)根治的病人僅占15％，大部分肝癌病人對(duì)化療及放療等治療均不敏感。因此，尋找更為有效的化療藥物單獨(dú)或輔助治療具有一定意義。自噬是目前涉及生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、植物學(xué)和微生物學(xué)等領(lǐng)域的一個(gè)快速發(fā)展的研究熱點(diǎn)。尤其在生物醫(yī)學(xué)界，許多研究人員正在積極探討自噬在各種疾病中的作用，研究疾病中自噬水平調(diào)控的分子機(jī)制，以期利用自噬為臨床疾病治療尋找新的有效靶點(diǎn)。這些疾病包括感染性疾病、心腦血管疾病、癌癥、代謝紊亂性疾病和神經(jīng)退行性疾病等。細(xì)胞自噬是細(xì)胞在饑餓、能量缺乏等代謝應(yīng)激狀態(tài)下的一種分解代謝過程，細(xì)胞內(nèi)的蛋白等大分子、細(xì)胞器和胞質(zhì)通過自噬作用被包裹、消化、降解成核苷、氨基酸和脂肪酸等可被重復(fù)循環(huán)利用的物質(zhì)，用作合成新的大分子和能量來源ATP，從而維持細(xì)胞基本的生命活動(dòng)。自噬參與維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，其在清除細(xì)胞內(nèi)廢物、結(jié)構(gòu)重建以及細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。自噬既是細(xì)胞的一種正常生理活動(dòng)，也可在細(xì)胞遭受各種刺激(缺氧，缺營(yíng)養(yǎng)，化學(xué)物質(zhì)刺激，微生物入侵，細(xì)胞器損傷，異常蛋白堆積等)時(shí)作為應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)生。自噬不僅具有維持細(xì)胞自我調(diào)節(jié)、促進(jìn)細(xì)胞生存的作用，過度活躍的自噬活動(dòng)也可以引起細(xì)胞死亡，即“自噬性細(xì)胞死亡(autophagiccelldeath)”，又稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是一種非半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)依賴性細(xì)胞程序性死亡。Casepase家族屬于半胱氨酸蛋白酶，是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶。Caspase-3是其中較重要的一種酶，是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細(xì)胞凋亡中起著不可代替的作用。Caspase-3最主要的底物是聚合酶PARP，Caspase-3可降解PARP，導(dǎo)致DNA修復(fù)的抑制并啟動(dòng)DNA的降解。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞通過多種逃逸機(jī)制常發(fā)生凋亡缺陷或耐受，因此，誘導(dǎo)非凋亡依賴性，自噬性細(xì)胞死亡成為解決腫瘤耐受的一條新途徑。機(jī)體內(nèi)的活性氧自由基(Reactiveoxygenspecies，ROS)通過其濃度調(diào)節(jié)著機(jī)體細(xì)胞的生死平衡。隨著自由基生物學(xué)研究的發(fā)展，研究者們逐漸認(rèn)識(shí)到ROS可雙向調(diào)控某些腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖，并發(fā)現(xiàn)了自由基與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。細(xì)胞內(nèi)ROS堆積是腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的重要差異之一，鑒于腫瘤細(xì)胞這一特性，利用某些可增加細(xì)胞氧化應(yīng)激的化合物可達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的差異調(diào)節(jié)：一方面ROS水平的進(jìn)一步增加可引起腫瘤細(xì)胞的凋亡或壞死；另一方面，正常細(xì)胞中ROS水平的增加仍在細(xì)胞生理承受范圍內(nèi)，不會(huì)引起細(xì)胞凋亡。此外，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加還是激活自噬的一條重要通路。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基可通過磷酸化AMPK-ULK1信號(hào)軸激活自噬。隨著自噬研究的日漸深入，天然產(chǎn)物成為發(fā)現(xiàn)自噬活性化合物的主要來源，而天然產(chǎn)物中，又以黃酮類化合物的研究最為火熱。姜黃素、槲皮素、芹菜素，山奈黃酮，染料木黃酮等均有大量報(bào)道研究其自噬活性?？鄥?SophoraeflavescentisRadix)，為豆科植物苦參(SophoraflavescensAit.)的干燥根，苦參具有清熱燥濕，殺蟲，利尿的功效，中醫(yī)臨床常配伍用于治療熱痢、便血、黃疸尿閉、赤白帶下、濕疹、濕瘡等病癥?，F(xiàn)代藥理研究表明苦參具有抗腫瘤、抗病毒、抗肝損傷、抗肝纖維化、中樞抑制等多種藥理活性?？鄥⒅械闹饕瘜W(xué)成分為生物堿、黃酮、皂苷等。苦參黃酮是苦參中一類重要的化學(xué)成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗心率失常等作用，能增強(qiáng)心肌收縮力、擴(kuò)張血管平滑肌等活性。發(fā)明人從苦參中分離得到一類結(jié)構(gòu)新穎的二氫黃酮化合物結(jié)構(gòu)如ZH33，ZH36所示，在自然界中尚屬首次發(fā)現(xiàn)，以及若干結(jié)構(gòu)與之類似的二氫黃酮化合物結(jié)構(gòu)如ZH27，ZH29，ZH37，ZH44，ZH47，ZH49及ZH50所示，這類化合物均具有一定的自噬活性。目前，國(guó)內(nèi)尚未有報(bào)道此類苦參中二氫黃酮化合物激活自噬，增加肝癌細(xì)胞ROS水平，也未有此類二氫黃酮化合物在治療或預(yù)防肝癌方面的專利申請(qǐng)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一類二氫黃酮化合物、含有其的藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療肝癌產(chǎn)品中的應(yīng)用，并進(jìn)一步提供該類化合物的制備方法。為解決本發(fā)明的技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明第一方面提供了一類來源于苦參的二氫黃酮化合物在制備預(yù)防和/或治療肝癌產(chǎn)品中的應(yīng)用，該類化合物結(jié)構(gòu)如下：本發(fā)明第二方面提供含有第一方面所述的二氫黃酮化合物的藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療肝癌產(chǎn)品中的應(yīng)用，該藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。可通過將本發(fā)明化合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成適于人或動(dòng)物使用的任何劑型。本發(fā)明化合物在其藥物組合物中的含量通常為0.1-95重量％。本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮膚、陰道、直腸等。給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括o/w型、w/o型和復(fù)乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉)霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑等。本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也制成是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將本發(fā)明化合物制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤(rùn)劑可以是水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤(rùn)滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成膠囊劑，可以將有效成分本發(fā)明化合物與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物先與稀釋劑、黏合劑、崩解劑制成顆?；蛭⑼?，再置于硬膠囊或軟膠囊中。用于制備本發(fā)明化合物片劑的各稀釋劑、黏合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備本發(fā)明化合物的膠囊劑。為將本發(fā)明化合物制成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物作溶劑并加入適量本領(lǐng)域常用的增溶劑、助溶劑、pH調(diào)劑劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-β-環(huán)糊精等；pH調(diào)劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化鈉等；滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量依照所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的個(gè)體情況，給藥途徑和劑型等可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍為0.001-150mg/Kg體重，優(yōu)選為0.1-100mg/Kg體重，更優(yōu)選為1-60mg/Kg體重，最優(yōu)選為2-30mg/Kg體重。上述劑量可以一個(gè)劑量單位或分成幾個(gè)劑量單位給藥，這取決于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。本發(fā)明的化合物或組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用。當(dāng)本發(fā)明的化合物與其它治療藥物存在協(xié)同作用時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整它的劑量。本發(fā)明第一方面和第二方面所述的產(chǎn)品包括但不限定于藥品、保健品。本發(fā)明第三方面是提供第一方面和第二方面所述的二氫黃酮化合物的制備方法，包括以下步驟：苦參藥材95％乙醇回流提取，濃縮后浸膏通過有機(jī)溶劑萃取、凝膠柱層析、反相硅膠柱層析及制備型HPLC分離純化，得到上述化合物，經(jīng)各種譜學(xué)手段分析鑒定其結(jié)構(gòu)，為一類黃酮B環(huán)2,4位取代的化合物。有益技術(shù)效果：1，本發(fā)明提供一類二氫黃酮化合物在預(yù)防或治療肝癌方面的新用途。2，實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明所述的化合物在藥理上具有以下兩方面顯著活性：一，該類化合物可明顯激活細(xì)胞自噬，是一類自噬激動(dòng)劑；二，該類化合物可明顯抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡；三，該類化合物可明顯增加肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平，成為其誘導(dǎo)自噬激活的分子機(jī)制。3，該類化合物的制備方法成熟，簡(jiǎn)單易得。附圖說明圖1為用流式細(xì)胞技術(shù)證明ZH33，ZH36具有自噬激動(dòng)作用。圖2為對(duì)ZH33，ZH36激活自噬水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖3為用自噬抑制劑氯喹翻轉(zhuǎn)ZH33，ZH36的自噬激動(dòng)作用，從而證明ZH33，ZH36為自噬流激動(dòng)劑。圖4為用活性氧自由基探針證明ZH33，ZH36可增加肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平。圖5為對(duì)ZH33，ZH36增加肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖6為用細(xì)胞增殖活力測(cè)定方法證明ZH33，ZH36可抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng),對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的IC50分別為21.35uM及51.78uM。圖7為用細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法證明ZH33可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生不依賴凋亡途徑的自噬性細(xì)胞死亡，且這種細(xì)胞死亡具有劑量依賴性。圖8為對(duì)ZH33誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖9為用免疫印記方法證明ZH33可激活自噬信號(hào)通路，增加自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。圖10為用免疫印記方法證明ZH33可激活氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路，增加氧化應(yīng)激蛋白的表達(dá)圖11為用免疫印記方法證明ZH33不影響凋亡相關(guān)信號(hào)通路。具體實(shí)施方式下面的實(shí)施例及藥理活性實(shí)驗(yàn)用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。下述實(shí)施例中，部分物質(zhì)的全稱或相應(yīng)的中文名稱如下：DHE：二氫乙啶BSA：牛血清白蛋白DMEM：一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基SDS：十二烷基硫酸鈉PVDF：聚偏氟乙烯PBST：PhosphateBufferedSalinewithTween-20,pH7.5,10x，去污緩沖液ECL：電化學(xué)發(fā)光PMSF：苯甲基磺酰氟ROS：ReactiveOxygenSpecies，活性氧自由基AnnexinV：膜聯(lián)蛋白PI：PropidiumIodide，碘化丙啶下述實(shí)施例中所述室溫如本領(lǐng)域常規(guī)所述，一般指15～25℃。實(shí)施例1.二氫黃酮化合物的制備方法39kg苦參干燥根，粉碎后用大提取罐提取，95％乙醇回流提取2次，每次2小時(shí)，過濾后收集上清，藥渣再用70％的乙醇提取1次，時(shí)間2小時(shí)，與95％乙醇提取液合并，減壓回收乙醇得到粗浸膏8.4kg?？鄥⒔嗨稚⒑蠓謩e用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，乙酸乙酯部位回收溶劑，得浸膏1.5kg。將乙酸乙酯部位與硅膠1:1拌樣，采用索式提取器依次用5L的石油醚、石油醚：乙酸乙酯(1:1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯：丙酮(1:1)、丙酮、丙酮：甲醇(1:1)、甲醇依次萃取6h，收集乙酸乙酯萃取液，回收溶劑后經(jīng)硅膠柱層析、ODS反相硅膠柱層析、SephadexLH-20凝膠柱層析反復(fù)純化得到上述化合物ZH-33(18mg)、ZH-36(23mg)、ZH-27(23mg)、ZH-37(18mg)、ZH-49(16mg)、ZH-50(56mg)、ZH-29(359mg)、ZH-44(17mg)、ZH-47(206mg)，經(jīng)各種譜學(xué)手段分析鑒定其結(jié)構(gòu)，為一類黃酮B環(huán)2,4位取代的化合物。上述化合物的波譜信息及核磁信號(hào)歸屬如下：ZH-33：UVλmax(MeOH)nm:294,330；HR-ESI-MSm/z441.2278[M+H]+(calcdforC26H32O6,441.2272)；1HNMR(500MHz,dmso-d6)δ:6.00(1H,s,H-6),6.79(1H,d,J＝8Hz,H-6’),6.10(1H,dd,J＝8.0,2.5Hz,H-5’),6.25(1H,d,J＝2.5Hz,H-3’),3.09(2H,t,J＝7Hz,H-α),2.67(2H,t,J＝7Hz,H-β),3.75(3H,s,5-OMe),14.33(1H,s,H-9OH),2.52(2H,m,H-1a),2.46(1H,m,H-2a),2.00(2H,t,J＝7Hz,H-3a),4.96(1H,t,J＝7Hz,H-4a),4.56(2H,m,H-9a),1.49(3H,s,H-6a),1.58(3H,s,H-7a),1.63(3H,s,H-10a)；13CNMR(125MHz,dmso-d6)δ:44.09(C-α),24.9(C-β),204.7(C-4),160.8(C-5),90.4(C-6),164.6(C-7),106.5(C-8),163.2(C-9),103.8(C-10),118.0(C-1’),156.4(C-2’),102.4(C-3’),155.9(C-4’),105.9(C-5’),130.1(C-6’),55.5(5-OMe),26.7(C-1a),46.2(C-2a),30.9(C-3a),123.5(C-4a),130.5(C-5a),17.7(C-6a),25.6(C-7a),147.8(C-8a),110.9(C-9a),18.5(C-10a).ZH-36：UVλmax(MeOH)nm:294,330；HR-ESI-MSm/z468.216[M+H]+(calcdforC26H32O6,468.2148)；1HNMR(500MHz,dmso-d6)δ:6.10(1H,s,H-6),7.24(1H,d,J＝8Hz,H-6’),6.38(1H,dd,J＝2.5,8.0Hz,H-5’),6.42(1H,d,J＝2.5Hz,H-3’),5.22(1H,d,J＝12Hz,H-2),4.41(1H,d,J＝12Hz,H-3),3.72(3H,s,5-OMe),3.68(3H,s,4-’OMe),2.40(2H,m,H-1a),2.34(1H,m,H-2a),1.91(2H,t,J＝7Hz,H-3a),4.82(1H,t,J＝7Hz,H-4a),4.50(2H,m,H-9a),1.43(3H,s,H-6a),1.49(3H,s,H-7a),1.58(3H,s,H-10a)；13CNMR(125MHz,dmso-d6)δ:76.9(C-2),71.7(C-3),191.7(C-4),159.9(C-5),93.1(C-6),163.3(C-7),107.3(C-8),162.3(C-9),102.6(C-10),115.9(C-1’),159.5(C-2’),99.2(C-3’),159.3(C-4’),107.2(C-5’),129.9(C-6’),55.7(5-OMe),55.7(4’-OMe),27.0(C-1a),46.6(C-2a),31.4(C-3a),123.9(C-4a),131.0(C-5a),18.0(C-6a),26.0(C-7a),148.3(C-8a),111.2(C-9a),18.9(C-10a).ZH-27：UVλmax(MeOH)nm:294,330；ESI-MSm/z452(M+)；1HNMR(500MHz,dmso-d6)δ:6.03(1H,s,H-6),7.50(1H,d,J＝8Hz,H-6’),6.44(1H,dd,J＝8.0,2.5Hz,H-5’),6.46(1H,d,J＝2.5Hz,H-3’),7.85(1H,d,J＝16Hz,H-α),7.90(1H,d,J＝16Hz,H-β),3.83(3H,s,5-OMe),3.83(3H,s,4’-OMe),14.86(1H,s,9-OH),2.52(2H,m,H-1a),2.45(1H,m,H-2a),2.00(2H,t,J＝7Hz,H-3a),4.97(1H,t,J＝7Hz,H-4a),4.50(2H,m,H-9a),1.49(3H,s,H-6a),1.58(3H,s,H-7a),1.64(3H,s,H-10a)；13CNMR(125MHz,dmso-d6)δ:123.5(C-α),137.8(C-β),191.6(C-4),161.8(C-5),90.9(C-6),163.7(C-7),108.5(C-8),165.4(C-9),104.2(C-10),114.8(C-1’),160.2(C-2’),99.2(C-3’),160.5(C-4’),106.7(C-5’),130.5(C-6’),55.5(5-OMe),55.5(4’-OMe),26.8(C-1a),46.2(C-2a),30.8(C-3a),123.8(C-4a),130.7(C-5a),17.7(C-6a),25.6(C-7a),147.9(C-8a),110.8(C-9a),18.5(C-10a).ZH-29：UVλmax(MeOH)nm:294,330；ESI-MSm/z452(M+)；1HNMR(500MHz,dmso-d6)δ:6.11(1H,s,H-6),7.29(1H,d,J＝8Hz,H-6’),6.39(1H,dd,J＝2.5,8.0Hz,H-5’),6.43(1H,d,J＝2.5Hz,H-3’),5.44(1H,dd,J＝2.5,13.5Hz,H-2),2.85(1H,dd,J＝13.5,16Hz,H-3α),2.50(1H,dd,J＝2.5,16Hz,H-3β),3.71(3H,s,5-OMe),3.69(3H,s,4-’OMe),2.60(2H,m,H-1a),2.50(1H,m,H-2a),1.93(2H,t,J＝7Hz,H-3a),4.86(1H,t,J＝7Hz,H-4a),4.50(2H,m,H-9a),1.41(3H,s,H-6a),1.51(3H,s,H-7a),1.57(3H,s,H-10a)；13CNMR(125MHz,dmso-d6)δ:73.1(C-2),44.1(C-3),188.8(C-4),162.4(C-5),92.6(C-6),162.4(C-7),107.0(C-8),159.6(C-9),104.2(C-10),117.5(C-1’),158.8(C-2’),98.9(C-3’),157.3(C-4’),106.9(C-5’),127.4(C-6’),55.7(5-OMe),55.7(4-’OMe),26.9(C-1a),46.3(C-2a),30.8(C-3a),123.4(C-4a),130.6(C-5a),17.6(C-6a),25.5(C-7a),147.9(C-8a),110.8(C-9a),18.5(C-10a).ZH-37：UVλmax(MeOH)nm:294,330；ESI-MSm/z456(M+)；1HNMR(500MHz,dmso-d6)δ:5.93(1H,s,H-6),7.30(1H,d,J＝8Hz,H-6’),6.39(1H,dd,J＝2.5,8.0Hz,H-5’),6.43(1H,d,J＝2.5Hz,H-3’),5.50(1H,dd,J＝2.5,13.5Hz,H-2),3.07(1H,dd,J＝13.5,16Hz,H-3α),2.60(1H,dd,J＝2.5,16Hz,H-3β),12.12(1H,5-OH),3.74(3H,s,4-’OMe),2.42(2H,m,H-1a),2.28(1H,m,H-2a),1.14(2H,m,H-3a),1.26(2H,m,H-4a),4.50(2H,m,H-9a),0.94(3H,s,H-6a),0.94(3H,s,H-7a),1.54(3H,s,H-10a)；13CNMR(125MHz,dmso-d6)δ:73.4(C-2),41.7(C-3),191.0(C-4),160.8(C-5),95.3(C-6),161.2(C-7),107.0(C-8),160.5(C-9),101.3(C-10),117.5(C-1’),158.8(C-2’),98.9(C-3’),157.2(C-4’),106.9(C-5’),127.6(C-6’),55.4(4-’OMe),27.0(C-1a),47.1(C-2a),26.5(C-3a),41.5(C-4a),68.6(C-5a),29.1(C-6a),29.5(C-7a),147.6(C-8a),110.9(C-9a),18.0(C-10a).ZH-44：UVλmax(MeOH)nm:294,330；ESI-MSm/z438(M+)；1HNMR(500MHz,dmso-d6)δ:6.00(1H,s,H-6),7.39(1H,d,J＝8Hz,H-6’),6.30(1H,dd,J＝8.0,2.5Hz,H-5’),6.36(1H,d,J＝2.5Hz,H-3’),7.86(1H,d,J＝16Hz,H-α),7.90(1H,d,J＝16Hz,H-β),3.80(3H,s,5-OMe),14.99(1H,s,9-OH),2.52(2H,m,H-1a),2.46(1H,m,H-2a),2.00(2H,t,J＝7Hz,H-3a),4.96(1H,t,J＝7Hz,H-4a),4.50(2H,m,H-9a),1.49(3H,s,H-6a),1.58(3H,s,H-7a),1.64(3H,s,H-10a)；13CNMR(125MHz,dmso-d6)δ:122.7(C-α),138.5(C-β),191.4(C-4),161.3(C-5),91.1(C-6),162.4(C-7),108.0(C-8),165.4(C-9),104.0(C-10),113.8(C-1’),159.2(C-2’),102.7(C-3’),160.4(C-4’),106.7(C-5’),130.3(C-6’),55.5(5-OMe),26.9(C-1a),46.2(C-2a),30.8(C-3a),123.6(C-4a),130.4(C-5a),17.7(C-6a),25.6(C-7a),148.0(C-8a),110.8(C-9a),18.6(C-10a).ZH-47：UVλmax(MeOH)nm:294,330；ESI-MSm/z454(M+)；1HNMR(500MHz,methanol-d4)δ:6.10(1H,s,H-6),7.27(1H,d,J＝8Hz,H-6’),6.37(1H,dd,J＝2.5,8.0Hz,H-5’),6.35(1H,d,J＝2.5Hz,H-3’),5.34(1H,d,J＝12Hz,H-2),4.58(1H,d,J＝12Hz,H-3),3.82(3H,s,5-OMe),2.52(2H,m,H-1a),2.47(1H,m,H-2a),1.97(2H,t,J＝7Hz,H-3a),4.93(1H,t,J＝7Hz,H-4a),4.50(2H,m,H-9a),1.49(3H,s,H-6a),1.55(3H,s,H-7a),1.57(3H,s,H-10a)；13CNMR(125MHz,dmso-d6)δ:78.8(C-2),73.3(C-3),194.2(C-4),161.6(C-5),93.2(C-6),165.0(C-7),109.5(C-8),164.2(C-9),103.6(C-10),115.8(C-1’),159.9(C-2’),103.5(C-3’),158.7(C-4’),107.6(C-5’),130.6(C-6’),55.9(5-OMe),27.9(C-1a),48.1(C-2a),32.6(C-3a),124.9(C-4a),132.0(C-5a),17.9(C-6a),25.9(C-7a),149.6(C-8a),111.2(C-9a),19.0(C-10a).ZH-49：UVλmax(MeOH)nm:294,330；ESI-MSm/z442(M+)；1HNMR(500MHz,methanol-d4)δ:7.25(1H,d,J＝8Hz,H-6’),6.30(1H,dd,J＝2.5,8.0Hz,H-5’),6.26(1H,d,J＝2.5Hz,H-3’),5.43(1H,dd,J＝2.5,13.5Hz,H-2),2.86(1H,dd,J＝13.5,16Hz,H-3α),2.64(1H,dd,J＝2.5,16Hz,H-3β),1.40(2H,m,H-1a),1.30(2H,m,H-2a),1.07(3H,s,H-4a),1.07(3H,s,H-5a),2.55(2H,m,H-1b),2.25(2H,m,H-2b),4.50(2H,m,H-4b),1.46(3H,s,H-5b)；13CNMR(125MHz,dmso-d6)δ:74.8(C-2),42.6(C-3),197.8(C-4),162.2(C-5),106.7(C-6),165.9(C-7),107.8(C-8),161.6(C-9),102.3(C-10),117.6(C-1’),155.5(C-2’),102.3(C-3’),158.5(C-4’),106.7(C-5’),127.5(C-6’),27.5(C-1a),41.9(C-2a),70.5(C-3a),27.9(C-4a),28.3(C-5a),26.9(C-1b),47.9(C-2b),148.0(C-3b),110.7(C-4b),17.1(C-5b).ZH-50：UVλmax(MeOH)nm:294,330；ESI-MSm/z442(M+)；1HNMR(500MHz,methanol-d4)δ:7.30(1H,d,J＝8Hz,H-6’),6.35(1H,dd,J＝2.5,8.0Hz,H-5’),6.35(1H,d,J＝2.5Hz,H-3’),5.56(1H,dd,J＝2.5,13.5Hz,H-2),2.96(1H,dd,J＝13.5,16Hz,H-3α),2.73(1H,dd,J＝2.5,16Hz,H-3β),1.33(2H,m,H-1a),1.27(2H,m,H-2a),1.01(3H,s,H-4a),1.01(3H,s,H-5a),2.54(2H,m,H-1b),2.33(2H,m,H-2b),4.55(2H,m,H-4b),1.58(3H,s,H-5b)；13CNMR(125MHz,dmso-d6)δ:74.8(C-2),42.3(C-3),197.9(C-4),162.3(C-5),106.6(C-6),165.8(C-7),107.6(C-8),161.6(C-9),102.3(C-10),117.3(C-1’),155.7(C-2’),102.3(C-3’),158.6(C-4’),106.6(C-5’),127.6(C-6’),27.5(C-1a),41.8(C-2a),70.5(C-3a),27.8(C-4a),28.2(C-5a),26.9(C-1b),47.6(C-2b),148.5(C-3b),110.6(C-4b),17.6(C-5b).藥理實(shí)驗(yàn)：二氫黃酮化合物的藥理活性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)例1利用自噬活性物質(zhì)篩選系統(tǒng)對(duì)二氫黃酮化合物的自噬活性進(jìn)行評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)例中所用細(xì)胞系為穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3熒光蛋白的CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞)細(xì)胞，該細(xì)胞中Ⅱ型GFP-LC3的量可反映自噬水平，因此自噬水平越高細(xì)胞熒光強(qiáng)度越高。具體操作步驟如下：1.穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的CHO細(xì)胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，以0.25％的胰酶消化細(xì)胞，傳代至12孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。2.在12孔板中加入不同刺激：不加任何刺激的孔作為陰性對(duì)照，加入20uM姜黃素的孔作為陽性對(duì)照，加入10uM二氫黃酮化合物作為受試物。繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。3.收取細(xì)胞，用0.1％皂素重懸細(xì)胞，500g離心后用PBS重懸，避光操作。4.流式細(xì)胞儀測(cè)定FL1通道(488nm)熒光強(qiáng)度值，使用流式細(xì)胞分析軟件FCSExpress5分析得出圖1所示結(jié)果。如圖1所示，橫坐標(biāo)表示FL1通道熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞個(gè)數(shù)，熒光峰越靠右代表熒光強(qiáng)度越高，相應(yīng)的GFP-LC3表達(dá)量越高，自噬激活水平越高。圖1的結(jié)果表明，具有新結(jié)構(gòu)的二氫黃酮化合物ZH33，ZH36可明顯激活自噬，同時(shí)，表1的結(jié)果表明，其余二氫黃酮化合物也可不同程度的激活自噬。樣品編號(hào)相對(duì)自噬活性空白1.00姜黃素陽性對(duì)照1.58±0.15ZH277.28±0.92ZH291.52±0.09ZH372.00±0.08ZH441.42±0.08ZH471.19±0.04ZH491.93±0.17ZH501.70±0.13實(shí)驗(yàn)例2利用自噬抑制劑氯喹證明ZH33，ZH36可激活自噬流在本實(shí)驗(yàn)例及后續(xù)實(shí)驗(yàn)例中，發(fā)明人主要探討具有全新結(jié)構(gòu)的二氫黃酮化合物ZH33及ZH36。具體操作步驟如下：1.穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的CHO細(xì)胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，以0.25％的胰酶消化細(xì)胞，傳代至12孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。2.在12孔板中加入不同刺激：10uMZH33，ZH36單獨(dú)培養(yǎng)孔，同時(shí)設(shè)10uMZH33，ZH36及50uM氯喹共同培養(yǎng)孔，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。3.收取細(xì)胞，用0.1％皂素重懸細(xì)胞，500g離心后用PBS重懸，避光操作。4.流式細(xì)胞儀測(cè)定FL1通道(488nm)熒光強(qiáng)度值，使用流式細(xì)胞分析軟件FCSExpress5分析得出圖3所示結(jié)果。如圖3所示，加入自噬抑制劑氯喹阻斷自噬溶酶體降解后，ZH33，ZH36引起的LC3堆積進(jìn)一步增加，因此可排除ZH33，ZH36抑制自噬溶酶體性降解的可能，說明ZH33，ZH36為自噬流激動(dòng)劑。實(shí)驗(yàn)例3用活性氧自由基探針測(cè)定ZH33，ZH36對(duì)肝癌細(xì)胞ROS水平的影響具體操作步驟如下：1.12孔板培養(yǎng)肝癌細(xì)胞Hepg2，分別加入10uMZH33，ZH36，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。2.收取細(xì)胞，每孔加入200uL1:1000比例稀釋后的DHE探針染料(購(gòu)自維格拉斯生物技術(shù)有限公司)，37℃避光孵育15分鐘。3.3000rpm離心，棄去上清，用PBS洗一遍，離心后用PBS重懸。4.流式細(xì)胞儀分析FL2通道(480-535nm波長(zhǎng))熒光強(qiáng)度值，結(jié)果如圖4所示，ZH33，ZH36均可增加肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平，ZH33更為明顯。圖5給出了ZH33，ZH36增加肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)例4用CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒測(cè)定ZH33,ZH36對(duì)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞增殖活力的影響具體操作步驟如下：1.將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞Hepg2用胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后用DMEM培養(yǎng)基稀釋至2.5×104個(gè)/ml，接種于96孔板中，每孔加入100ul細(xì)胞混懸液，置37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。2.將ZH33，ZH36用DMEM培養(yǎng)基依次稀釋成多個(gè)濃度梯度，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(不加受試物)及空白對(duì)照(不加細(xì)胞及受試物)。取出96孔板，吸出培養(yǎng)基，每孔加入100μl含有不同濃度梯度受試物的培養(yǎng)基，每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。3.取出96孔板，每孔中加入10μlCCK-8溶液，置37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)。酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。計(jì)算公式：細(xì)胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率％(IR)＝100％-細(xì)胞存活率As：實(shí)驗(yàn)孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、受試物質(zhì))Ac：對(duì)照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒有受試物質(zhì))Ab：空白孔(不含細(xì)胞和受試物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8)統(tǒng)計(jì)得回歸方程曲線，求半數(shù)致死率％(IC50)＝IR為50％的藥物濃度。如圖6所示，ZH33，ZH36均對(duì)肝癌細(xì)胞Hepg2的生長(zhǎng)具有抑制作用，但以ZH33更為顯著，ZH33，ZH36抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50值分別為21.35及51.78uM。實(shí)驗(yàn)例5用凋亡試劑盒測(cè)定ZH33誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞凋亡的能力由于ZH33在激活肝癌細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞ROS及抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)方面活性均明顯高于ZH36，鑒于ZH33和ZH36在結(jié)構(gòu)上的相似性，在本實(shí)驗(yàn)例及后續(xù)實(shí)驗(yàn)例中，發(fā)明人主要探討ZH33發(fā)揮以上活性的分子機(jī)制。具體操作步驟如下：1.在12孔板中分別培養(yǎng)肝癌細(xì)胞Hepg2。2.待細(xì)胞在孔板中貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度的ZH33，同時(shí)設(shè)不加藥空白對(duì)照組。3.加藥處理24小時(shí)后，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，用500ulPBS重懸細(xì)胞。4.加入5uLAnnexinV-FITC混勻后，加入5uLPropidiumIodide(PI)，混勻，室溫避光反應(yīng)15分鐘。5.3000rpm離心收集細(xì)胞，棄去上清，用1mLPBS重懸細(xì)胞。6.流式細(xì)胞儀測(cè)定，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)Ex＝488nm；發(fā)射波長(zhǎng)Em＝530nm。AnnexinV-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測(cè)；PI紅色熒光通過PI通道(FL2)檢測(cè)。7.用流式細(xì)胞分析軟件FCSExpress5分析結(jié)果，如圖7，圖8所示，ZH33可劑量依賴性誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡，死亡類型非細(xì)胞凋亡，而是細(xì)胞壞死，結(jié)合ZH33激活自噬的顯著作用，說明ZH33可誘導(dǎo)非凋亡依賴性的，自噬性細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)例6利用免疫印記方法證明ZH33對(duì)自噬、ROS及凋亡相關(guān)信號(hào)通路的影響具體操作步驟如下：1.肝癌細(xì)胞Hepg2于6孔板中培養(yǎng)24h后，加入不同刺激，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。2.收取細(xì)胞，每孔細(xì)胞加入150ul細(xì)胞裂解緩沖液(購(gòu)自北京普利萊基因有限公司，C1053)，冰上裂解30分鐘。3.12000rpm離心30分鐘，小心吸取上清，調(diào)整每孔蛋白至統(tǒng)一濃度，按體積比4：1加入5xloadingbuffer(購(gòu)自北京普利萊基因有限公司，即5xSDS-PAGE非還原性蛋白上樣緩沖液B1030)。4.上樣至SDS電泳凝膠，電泳后，取膠，使用電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5.使用10％BSA封閉，按抗體說明書比例分別加入稀釋特異性一抗抗體(購(gòu)自美國(guó)CST公司)，4℃孵育12h。6.使用PBST在搖床中室溫洗滌6x8min，按說明書比例稀釋辣根酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2h。7.使用PBST在搖床中室溫洗滌6x8min。8.使用ECL發(fā)光液曝光，使用ECL4000(購(gòu)自北京普利萊基因有限公司，SuperECLPlus超敏發(fā)光液P1010)成像。以GAPDH(購(gòu)自上海康成生物公司)作為內(nèi)參，GAPDH斑塊灰度一致表明細(xì)胞總蛋白數(shù)目一致。結(jié)果如圖9，10，11所示。圖9顯示ZH33可激活自噬通路相關(guān)蛋白：ULK1,p-AMPK,PI3KC3,Beclin1,P62及LC3表達(dá)量均有明顯增加。圖10顯示ZH33可激活ROS氧化應(yīng)激信號(hào)通路標(biāo)志蛋白CHOP及p-Elf2a。圖11顯示ZH33對(duì)凋亡信號(hào)通路標(biāo)志蛋白PARP及cleaved-caspase3無影響，說明ZH33發(fā)揮其抗腫瘤作用不依賴于凋亡信號(hào)通路，主要通過自噬信號(hào)通路及ROS信號(hào)通路。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3