本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及黃酮類化合物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
手足口病是由病毒引起的兒童傳染病，為我國(guó)法定丙類傳染病。該病主要感染0-6歲的嬰幼兒，以2-3歲兒童感染最為常見(jiàn)，手足口病發(fā)病初期在患兒四肢末端以及口腔等出引起皰疹或潰瘍，患兒多在1-2周內(nèi)痊愈。然而，少數(shù)病例病情進(jìn)展迅速，可在發(fā)病1-5天左右出現(xiàn)腦膜炎、無(wú)菌性腦炎、腦干腦炎、腦脊髓炎、肺水腫以及循環(huán)障礙等，極少數(shù)病例病情危重，可致死亡，存活病例可留有后遺癥。
根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，能夠引起手足口病癥狀的病毒大約有20多種，其中以腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)和柯薩奇病毒A組16型(coxsachievirus A16，CoxA16)最為常見(jiàn)，由這兩種病毒感染引起的病例數(shù)約占總病例數(shù)80％以上。其他能夠引起手足口病的病毒主要包括：柯薩奇病毒A組4、5、7、9和10型(CoxA4、CoxA5、CoxA7、CoxA9和CoxA10)，柯薩奇病毒B組2和5型(CoxB2和CoxB5)以及埃可病毒(ECHO)等。
目前，盡管針對(duì)EV71病毒的疫苗已經(jīng)獲批上市，但仍沒(méi)有直接靶向病毒的藥物，臨床主要采取對(duì)癥治療的策略；而廣譜抗病毒藥物利巴韋林在應(yīng)用于嬰幼兒時(shí)有致畸和抑制生長(zhǎng)發(fā)育的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本發(fā)明提供的化合物能夠在這一方面彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
模型是化合物活性及作用機(jī)理的載體，手足口病毒感染可誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡，包括人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞(RD)、神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞(SK-N-MC)、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SK-N-SH、)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(SF268)、非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)、人微血管內(nèi)皮細(xì)胞以及HeLa細(xì)胞等，在實(shí)際的研究中由于RD細(xì)胞和Vero細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性較好，常用于細(xì)胞水平的抗病毒研究。在動(dòng)物模型方面，1-7日齡的小鼠對(duì)病毒敏感，常用作動(dòng)物模型。小鼠接種病毒后3-5天出現(xiàn)拒乳和體重下降等癥狀，6-8天四肢出現(xiàn)僵直性癱瘓等明顯癥狀，9-13天后根據(jù)病情自愈或死亡。
目前，常見(jiàn)的抗手足口病藥物有利巴韋林、阿昔洛韋、伐昔洛韋等，但是這些藥副作用較強(qiáng)。
近年來(lái)，中藥抗手足口病的研究逐漸引起人們的關(guān)注，而且由于很多中藥組分屬于天然提取藥物，具有副作用小等優(yōu)點(diǎn)。
二氫黃酮醇(Kanzonol)和新黃烷酮(Shinflavanone)是從中藥植物中提取的黃酮類成分，藥理研究表明二氫黃酮醇和新黃烷酮具有強(qiáng)心、利尿、降壓、抑菌、能增強(qiáng)肌體免疫等多種作用。
目前未見(jiàn)二氫黃酮醇和新黃烷酮在制備治療手足口病藥物中應(yīng)用的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明提供一種黃酮類化合物的應(yīng)用。本發(fā)明的目的在于提供黃酮類化合物(Ⅰ)，尤其是二氫黃酮醇和新黃烷酮在制備腸道病毒的抑制劑中的應(yīng)用，本發(fā)明研究表明黃酮類化合物(Ⅰ)對(duì)腸道病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變有抑制作用，能提高病毒感染細(xì)胞的存活率，抗病毒活性明顯。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
本發(fā)明提供了黃酮類化合物(Ⅰ)在制備腸道病毒的抑制劑中的應(yīng)用；
其中，R＝OH或H。
當(dāng)R＝OH，該黃酮類化合物(Ⅰ)為二氫黃酮醇；當(dāng)R為H時(shí)，該黃酮類化合物(Ⅰ)為新黃烷酮。
在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述腸道病毒為柯薩奇病毒。
在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒A16型。
在本發(fā)明的另一些具體實(shí)施方案中，所述腸道病毒為腸道病毒EV71型。
在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述黃酮類化合物(Ⅰ)的活性劑量為50～200mg/kg/d。
本發(fā)明還提供了黃酮類化合物(Ⅰ)在制備預(yù)防和/或治療腸道病毒感染的疾病的藥物中的應(yīng)用；
其中，R＝OH或H。
在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述腸道病毒感染的疾病為手足口病。在本發(fā)明中，所述腸道病毒為柯薩奇病毒。優(yōu)選的，所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒A16型。所述腸道病毒還可以為腸道病毒EV71型。
在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述藥物包括黃酮類化合物(Ⅰ)和藥學(xué)上可接受的輔料。
在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述藥物的劑型為任意一種臨床可接受的口服給藥劑型、注射給藥劑型或外用給藥制劑。
在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述口服給藥劑型中，所述乙酰黃芪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5～88％。
在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述藥物的口服或注射計(jì)量為0.5～2.5mg黃酮類化合物(Ⅰ)/kg人體體重/d。
在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述藥物為片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、注射劑、煎膏劑、懸浮劑、分散劑、糖漿劑、栓劑、凝膠劑、氣霧劑、貼劑。
本發(fā)明提供黃酮類化合物(Ⅰ)在制備腸道病毒的抑制劑中的應(yīng)用，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃酮類化合物(Ⅰ)對(duì)腸道病毒EV71型、柯薩奇病毒A16型誘導(dǎo)的細(xì)胞病變均有抑制作用，能提高病毒感染細(xì)胞的存活率；同時(shí)在體內(nèi)可以抑制病毒的復(fù)制，提高病毒感染動(dòng)物的生存率，延長(zhǎng)感染動(dòng)物的生存時(shí)間，緩解病毒感染引發(fā)的病癥，從而具有治療手足口病的作用；并可預(yù)防病毒在體內(nèi)的增殖和擴(kuò)散，保護(hù)正常組織免受損傷，起到預(yù)防病毒感染性疾病發(fā)生的作用。
本發(fā)明的有益效果是：
1、二氫黃酮醇和新黃烷酮是一種天然小分子化合物，二氫黃酮醇對(duì)腸道病毒EV71、柯薩奇病毒A16，EC50分別為140.87μmol/L、148.04μmol/L，SI分別為4.54、4.32；新黃烷酮對(duì)腸道病毒EV71、柯薩奇病毒A16，EC50分別為35.89μmol/L、3.69μmol/L，SI分別為37.69、3.51。
2、黃酮類化合物(Ⅰ)能夠劑量依賴地抑制柯薩奇病毒A16、腸道病毒EV71病毒感染，呈劑量依賴關(guān)系。
3、緩解病毒引起的癥狀、減輕病毒感染導(dǎo)致的死亡；延長(zhǎng)病毒感染小鼠生存時(shí)間，提高小鼠存活率。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明公開(kāi)了一種黃酮類化合物的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
本發(fā)明提供了黃酮類化合物(Ⅰ)在制備腸道病毒的抑制劑中的應(yīng)用；
其中，R＝OH或H。
在本發(fā)明中，所述黃酮類化合物(Ⅰ)具有式Ⅰ所示結(jié)構(gòu)，屬于黃酮苷，藥理研究表明，二氫黃酮醇和新黃烷酮具有強(qiáng)心、利尿、降壓、抑菌、能增強(qiáng)肌體免疫等多種作用。
所述黃酮類化合物(Ⅰ)優(yōu)選為黃酮類化合物(Ⅰ)單體和/或黃酮類化合物(Ⅰ)提取物，所述黃酮類化合物(Ⅰ)提取物中，單體黃酮類化合物(Ⅰ)的含量?jī)?yōu)選在90％以上，本發(fā)明可按照常規(guī)方法從含有黃酮類化合物(Ⅰ)的中藥材或者中藥飲片中提取得到，如甘草；也可購(gòu)買黃酮類化合物(Ⅰ)的市售商品。具體的，在本發(fā)明的實(shí)施例中，可采用中國(guó)藥品生物制品檢定所提供的黃酮類化合物(Ⅰ)。
本發(fā)明中，所述腸道病毒為柯薩奇病毒。優(yōu)選的，所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒A16型。
在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述腸道病毒為腸道病毒EV71型。
本發(fā)明還提供了黃酮類化合物(Ⅰ)在制備預(yù)防和/或治療腸道病毒感染的疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了黃酮類化合物(Ⅰ)在制備治療手足口病藥物中的應(yīng)用。其中，所述的引起手足口病的病毒包括腸道病毒。優(yōu)選的，所述的引起手足口病的病毒包括柯薩奇病毒A16型和/或腸道病毒EV71型。
在本發(fā)明中，所述抗手足口病藥物包括黃酮類化合物(Ⅰ)和藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明中，所述藥學(xué)上可接受的載體優(yōu)選包括淀粉、低取代羥丙基纖維素、微粉硅膠、硬脂酸鎂、淀粉漿、蔗糖、糊精、羧甲基淀粉鈉、滑石粉、聚山梨酯、聚乙二醇、注射用大豆磷脂和注射用甘油中的一種或幾種；所述抗手足口病藥物為任意一種臨床可接受的口服給藥劑型、注射給藥劑型或外用給藥制劑。優(yōu)選的，所述抗手足口病藥物為片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、注射劑、煎膏劑、懸浮劑、分散劑、糖漿劑、栓劑、凝膠劑、氣霧劑、貼劑。所述口服給藥劑型的抗手足口病藥物中，黃酮類化合物(Ⅰ)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5～88％，更優(yōu)選為20～80％，最優(yōu)選為25～75％。
本發(fā)明中，所述黃酮類化合物(Ⅰ)的活性劑量?jī)?yōu)選為50-200mg/kg/d；更優(yōu)選為100-200mg/kg/d。
在本發(fā)明中，所述抗手足口病藥物每天的口服劑量為0.5～2.5mg黃酮類化合物(Ⅰ)/kg人體體重，更優(yōu)選為0.625～2.0mg黃酮類化合物(Ⅰ)/kg體重；所述抗手足口病藥物每天的注射劑量為0.5～2.5mg黃酮類化合物(Ⅰ)/kg人體體重，更優(yōu)選為0.625～2.0mg黃酮類化合物(Ⅰ)/kg體重。
本發(fā)明對(duì)所述包含黃酮類化合物(Ⅰ)的抗手足口病藥物的制備方法沒(méi)有特殊的限制，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的制藥方法即可。
本發(fā)明提供了黃酮類化合物(Ⅰ)在制備治療手足口病藥物中的應(yīng)用,本發(fā)明采用了MTT法測(cè)定了黃酮類化合物(Ⅰ)對(duì)柯薩奇病毒A16型和腸道病毒EV71型的抑制活性，結(jié)果表明，二氫黃酮醇對(duì)腸道病毒EV71、柯薩奇病毒A16，EC50分別為140.87μmol/L、148.04μmol/L，SI分別為4.54、4.32；新黃烷酮對(duì)腸道病毒EV71、柯薩奇病毒A16，EC50分別為35.89μmol/L、3.69μmol/L，SI分別為37.69、3.51。
本發(fā)明以灌胃(口服)的方式進(jìn)行了二氫黃酮醇對(duì)腸道病毒EV71型所致小鼠感染的療效測(cè)試，結(jié)果表明，二氫黃酮醇在劑量50/100/200mg/kg/day時(shí)灌胃給藥5天，小鼠的存活率分別為30％、50％和70％，死亡保護(hù)率分別為12.5％、37.5％和62.5％，陽(yáng)性對(duì)照藥利巴韋林的小鼠存活率為70％，死亡保護(hù)率62.5％；本發(fā)明以灌胃(口服)的方式進(jìn)行了二氫黃酮醇對(duì)柯薩奇病毒A16型所致小鼠感染的療效測(cè)試，結(jié)果表明，二氫黃酮醇在劑量50/100/200mg/kg/day時(shí)灌胃(口服)給藥5天，死亡保護(hù)率分別為14.29％、42.86％和71.43％，陽(yáng)性對(duì)照藥利巴韋林的小鼠存活率為80％，死亡保護(hù)率71.43％，
本發(fā)明以注射的方式進(jìn)行了二氫黃酮醇對(duì)腸道病毒EV71型所致小鼠感染的療效測(cè)試，結(jié)果表明，二氫黃酮醇在劑量50/100/200mg/kg/day時(shí)注射給藥5天，死亡保護(hù)率分別為33.33％、55.56％、77.78％；本發(fā)明以注射的方式進(jìn)行了二氫黃酮醇對(duì)柯薩奇病毒A16型所致小鼠感染的療效測(cè)試，結(jié)果表明，二氫黃酮醇在劑量50/100/200mg/kg/day時(shí)注射給藥5天，死亡保護(hù)率分別為37.50％、50.00％、87.50％。
可見(jiàn)，二氫黃酮醇和新黃烷酮與陽(yáng)性對(duì)照藥利巴韋林對(duì)柯薩奇病毒A16型和腸道病毒EV71型的抑制效果相似，黃酮類化合物(Ⅰ)可以抑制病毒的復(fù)制，提高病毒感染動(dòng)物的生存率，延長(zhǎng)感染動(dòng)物的生存時(shí)間，緩解病毒感染引發(fā)的病癥，從而具有治療手足口病的作用。
為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的黃酮類化合物(Ⅰ)在制備治療手足口病藥物中的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)描述，但不能將其理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
本發(fā)明提供的黃酮類化合物的應(yīng)用中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。
下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
實(shí)施例1二氫黃酮醇對(duì)EV71和CoxA16病毒感染細(xì)胞的保護(hù)作用
1、實(shí)驗(yàn)材料：
柯薩奇病毒A16型(CoxA16)和腸道病毒71型(EV71)，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究免疫學(xué)研究室提供，由江蘇康緣現(xiàn)代中藥研究院保存，在Vero細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)傳代，-80℃保存。
非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)，購(gòu)于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，由江蘇康緣現(xiàn)代中藥研究院保存。
DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20141024，細(xì)胞生長(zhǎng)液中含10％胎牛血清、1×105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素。細(xì)胞維持液中除含2％胎牛血清外，其它同細(xì)胞生長(zhǎng)液。利巴韋林，購(gòu)自哈藥三精制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字H19993937，規(guī)格：1ml:0.1g，批號(hào)：140312。
M2e型酶標(biāo)儀，Molecular Devices；移液器，eppendorf公司；生物安全柜，購(gòu)自Heal Force公司，型號(hào)：HFsafe-1200；二氧化碳培養(yǎng)箱，購(gòu)自Thermo Scientific公司，型號(hào)：FormaSteri-Cycle 371。
2、實(shí)驗(yàn)方法：
Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)用含2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基按5×104個(gè)/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，置37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜形成細(xì)胞單層。棄上清后，用PBS將細(xì)胞洗滌1次，以洗去殘留的胎牛血清，加入用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至100TCID50各株病毒(EV71和CoxA16)，每孔100μl，35℃孵育2h后，棄去病毒液。用2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將二氫黃酮醇配制成不同濃度，分別加入單層Vero細(xì)胞中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，Vero細(xì)胞于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，每日觀察細(xì)胞病變現(xiàn)象。48h后，棄上清后，加入100μl 10％甲醛固定1h，0.1％(w/v)結(jié)晶紫染色15min，酶標(biāo)儀570nm測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。計(jì)算病毒抑制率，并計(jì)算二氫黃酮醇對(duì)兩種病毒的EC50(半數(shù)有效濃度)、SI(選擇指數(shù))。
表1二氫黃酮醇體外抗病毒試驗(yàn)(μM)
表1結(jié)果顯示：二氫黃酮醇在體外對(duì)EV71和CoxA16病毒所致細(xì)胞病變具有明顯抑制作用，其EC50分別為140.87、148.04μM，SI分別為4.54、4.32；具備應(yīng)用于抗手足口病毒感染治療的體外藥效學(xué)基礎(chǔ)。
實(shí)施例2二氫黃酮醇口服給藥對(duì)EV71感染的治療作用
1、實(shí)驗(yàn)材料：
腸道病毒71型(EV71)，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究免疫學(xué)研究室提供，由江蘇康緣現(xiàn)代中藥研究院保存，在Vero細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)傳代，-80℃保存。
SPF級(jí)懷孕15-16日BALB/c孕鼠，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育場(chǎng)，飼養(yǎng)在IVC系統(tǒng)中(溫度18～28℃，40～70％相對(duì)濕度，機(jī)械送排風(fēng)；明暗周期：12h/12h；150～300Lux照度)，取3日齡新生乳鼠開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。
利巴韋林，購(gòu)自哈藥三精制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字H19993937，規(guī)格：1ml:0.1g，批號(hào)：140312。
2、實(shí)驗(yàn)方法：
3日齡BALB/c乳鼠按窩隨機(jī)分為正常組、模型組、利巴韋林顆粒組100mg/kg/d、二氫黃酮醇低劑量組50mg/kg/d，中劑量組100mg/kg/d，高劑量組200mg/kg/d，每組10只，除正常對(duì)照組外，其余各組腹腔注射EV71病毒懸液(107TCID50)進(jìn)行感染，0.1mL/只，各給藥組以灌胃給藥，每次0.1ml，連續(xù)5天，每次給藥或感染后均用75％乙醇噴灑乳鼠包裹墊料后，放回籠中與母鼠共同飼養(yǎng)，正常對(duì)照組和病毒對(duì)照組給予蒸餾水。感染后每日觀察乳鼠的生存狀態(tài)，共觀察14d，并根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，計(jì)算感染的嚴(yán)重程度0分：健康；1分：弓背、豎毛(長(zhǎng)出毛后觀察)、消瘦、活動(dòng)減少等；2分：后肢力量減弱；3分：?jiǎn)蝹?cè)后肢麻痹或癱瘓；4分：雙側(cè)后肢麻痹或癱瘓；5分：瀕死或死亡。計(jì)算各組死亡率和生命延長(zhǎng)率并用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
表2二氫黃酮醇灌胃給藥對(duì)EV71感染BALB/c乳鼠感染程度的影響(n＝10)
P與模型組比較
表3二氫黃酮醇灌胃給藥對(duì)EV71感染Babl/c乳鼠的死亡保護(hù)作用
**P<0.01，*P<0.05與模型組比較
表2結(jié)果顯示，二氫黃酮醇各劑量組灌胃給藥后，可以顯著減緩EV71和CoxA16病毒感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量減弱，單側(cè)后肢癱瘓等癥狀，其感染程度積分與模型組比較均具有顯著性差異；表3結(jié)果顯示，二氫黃酮醇高、中、低劑量的死亡保護(hù)率分別為62.50％、37.50％、12.5％，生命延長(zhǎng)率分別為78.45％、52.36％、32.16％，表明二氫黃酮醇各劑量組感染程度均明顯減少EV71病毒感染乳鼠死亡率和感染程度，延長(zhǎng)其生存時(shí)間，與模型組比較具有顯著性差異，提示二氫黃酮醇對(duì)手足口病毒感染具有治療作用。
實(shí)施例3二氫黃酮醇口服給藥對(duì)CoxA16感染的治療作用
1、實(shí)驗(yàn)材料：
柯薩奇病毒A16型(Cox A16)，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究免疫學(xué)研究室提供，由江蘇康緣現(xiàn)代中藥研究院保存，在Vero細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)傳代，-80℃保存。
SPF級(jí)懷孕15-16日BALB/c孕鼠，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育場(chǎng)，飼養(yǎng)在IVC系統(tǒng)中(溫度18～28℃，40～70％相對(duì)濕度，機(jī)械送排風(fēng)；明暗周期：12h/12h；150～300Lux照度)，取3日齡新生乳鼠開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。
二氫黃酮醇，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司自制，純度97.64％。利巴韋林，購(gòu)自哈藥三精制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字H19993937，規(guī)格：1ml：0.1g，批號(hào)：140312。
2、實(shí)驗(yàn)方法：
3日齡BALB/c乳鼠按窩隨機(jī)分為正常組、模型組、利巴韋林顆粒組200mg/kg/d、二氫黃酮醇低劑量組50mg/kg/d，中劑量組100mg/kg/d，高劑量組200mg/kg/d，每組10只，除正常對(duì)照組外，其余各組腹腔注射CoxA16病毒懸液(107TCID50)進(jìn)行感染，0.1mL/只，各給藥組以灌胃給藥，每次0.1ml，連續(xù)5天，每次給藥或感染后均用75％乙醇噴灑乳鼠包裹墊料后，放回籠中與母鼠共同飼養(yǎng)，正常對(duì)照組和病毒對(duì)照組給予蒸餾水。感染后每日觀察乳鼠的生存狀態(tài)，共觀察14d，并根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，計(jì)算感染的嚴(yán)重程度0分：健康；1分：弓背、豎毛(長(zhǎng)出毛后觀察)、消瘦、活動(dòng)減少等；2分：后肢力量減弱；3分：?jiǎn)蝹?cè)后肢麻痹或癱瘓；4分：雙側(cè)后肢麻痹或癱瘓；5分：瀕死或死亡。計(jì)算各組死亡率和生命延長(zhǎng)率并用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
表4二氫黃酮醇灌胃給藥對(duì)CoxA16感染BALB/c乳鼠感染程度的影響(n＝10)
P與模型組比較
表5二氫黃酮醇灌胃給藥對(duì)CoxA16感染Babl/c乳鼠的死亡保護(hù)作用
**P<0.01，*P<0.05與模型組比較
表4結(jié)果顯示，二氫黃酮醇各劑量組灌胃給藥后，可以顯著減緩CoxA16病毒感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量減弱，單側(cè)后肢癱瘓等癥狀，其感染程度積分與模型組比較均具有顯著性差異；表5結(jié)果顯示，二氫黃酮醇高、中、低劑量的死亡保護(hù)率分別為71.43％、42.86％、14.29％，生命延長(zhǎng)率分別為80.45％、55.37％、35.18％，表明二氫黃酮醇各劑量組感染程度均明顯減少CoxA16病毒感染乳鼠死亡率和感染程度，延長(zhǎng)其生存時(shí)間，與模型組比較具有顯著性差異，提示二氫黃酮醇對(duì)手足口病毒感染具有治療作用。
實(shí)施例4新黃烷酮對(duì)EV71和CoxA16病毒感染細(xì)胞的保護(hù)作用
1、實(shí)驗(yàn)材料：
柯薩奇病毒A16型(Cox A16)和腸道病毒71型(EV71)，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究免疫學(xué)研究室提供，由江蘇康緣現(xiàn)代中藥研究院保存，在Vero細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)傳代，-80℃保存。
非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)，購(gòu)于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，由江蘇康緣現(xiàn)代中藥研究院保存。
DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20141024，細(xì)胞生長(zhǎng)液中含10％胎牛血清、1×105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素。細(xì)胞維持液中除含2％胎牛血清外，其它同細(xì)胞生長(zhǎng)液。新黃烷酮，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司自制，純度98.97％。利巴韋林，購(gòu)自哈藥三精制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字H19993937，規(guī)格：1ml：0.1g，批號(hào)：140312。
M2e型酶標(biāo)儀，Molecular Devices；移液器，eppendorf公司；生物安全柜，購(gòu)自Heal Force公司，型號(hào)：HFsafe-1200；二氧化碳培養(yǎng)箱，購(gòu)自Thermo Scientific公司，型號(hào)：FormaSteri-Cycle 371。
2、實(shí)驗(yàn)方法：
新黃烷酮毒性測(cè)定Vero細(xì)胞用胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml，每孔100μl接種96孔培養(yǎng)板，置37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后棄上清，加入200μl含新黃烷酮(DMSO溶)培養(yǎng)基(藥物從400μM起4倍稀釋7個(gè)梯度，2.5％FBS)，設(shè)對(duì)照組(含1/1000DMSO)，每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72h后MTS試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力，490nm檢測(cè)吸光度，計(jì)算各劑量新黃烷酮對(duì)細(xì)胞毒性。在GraphPad Prism5統(tǒng)計(jì)軟件中，運(yùn)用非線性回歸構(gòu)建各藥物劑量與毒性效應(yīng)關(guān)系曲線，計(jì)算新黃烷酮對(duì)Vero細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度(TC0)和半數(shù)毒性濃度(TC50)。
新黃烷酮對(duì)EV71和CoxA16致細(xì)胞病變作用的影響取已長(zhǎng)滿單層細(xì)胞的培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，以100TCID50對(duì)應(yīng)的病毒攻擊量加入細(xì)胞，每孔100μl，Vero細(xì)胞用含2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基按5×104個(gè)/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱吸附2h后，棄去病毒液。用2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將新黃烷酮配制成最大無(wú)毒濃度，加入單層Vero細(xì)胞中，設(shè)6個(gè)復(fù)孔。利巴韋林為陽(yáng)性對(duì)照藥物，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組(不加病毒不加藥)、病毒對(duì)照組(加病毒但不加藥物)和空白對(duì)照組(無(wú)細(xì)胞，不加病毒不加藥)。37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后MTS試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力，490nm檢測(cè)吸光度A。按下列公式計(jì)算新黃烷酮對(duì)病毒的抑制率。
病毒抑制率＝(A490藥物-A490病毒)/(A490正常-A490病毒)×100％
EC50和SI測(cè)定Vero細(xì)胞用含2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基按5×104個(gè)/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜形成細(xì)胞單層。棄上清后，用PBS將細(xì)胞洗滌1次，以洗去殘留的胎牛血清，加入用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至100TCID50病毒，每孔100μl，35℃孵育2h后，棄去病毒液。用2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將新黃烷酮配制成不同濃度，分別加入單層Vero細(xì)胞中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，Vero細(xì)胞于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，每日觀察細(xì)胞病變現(xiàn)象。48h后，棄上清后，加入100μl 10％甲醛固定1h，0.1％(w/v)結(jié)晶紫染色15min，酶標(biāo)儀570nm測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。計(jì)算病毒抑制率，并計(jì)算新黃烷酮對(duì)兩種流感病毒細(xì)胞的EC50(半數(shù)有效濃度)和SI(選擇指數(shù))。
表6新黃烷酮體外抗病毒試驗(yàn)(μM)
表7新黃烷酮對(duì)EV71和Cox A16致細(xì)胞病變的抑制率(％)
*P<0.05，**P<0.01，與病毒對(duì)照比較；△P<0.05，△△P<0.01，與利巴韋林比較
表6結(jié)果顯示：新黃烷酮對(duì)腸道病毒型EV71、CoxA16病毒具有一定的抑制作用，EC50分別為35.89、37.69μM，SI分別為3.69、3.51；表7結(jié)果顯示：新黃烷酮在最大無(wú)毒濃度下對(duì)EV71和Cox A16均由明顯的抑制作用，與病毒對(duì)照組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明新黃烷酮對(duì)以上毒株體外復(fù)制具有抑制作用，提高了病毒感染細(xì)胞的存活率。
實(shí)施例5新黃烷酮對(duì)腸道病毒EV71感染的治療作用
1、實(shí)驗(yàn)材料：
腸道病毒71型(EV71)，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究免疫學(xué)研究室提供，由江蘇康緣現(xiàn)代中藥研究院保存，在Vero細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)傳代，-80℃保存。
SPF級(jí)懷孕15-16日BALB/c孕鼠，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育場(chǎng)，飼養(yǎng)在IVC系統(tǒng)中(溫度18～28℃，40～70％相對(duì)濕度，機(jī)械送排風(fēng)；明暗周期：12h/12h；150～300Lux照度)，取3日齡新生乳鼠開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。
新黃烷酮，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司自制，純度98.97％。利巴韋林，購(gòu)自哈藥三精制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字H19993937，規(guī)格：1ml:0.1g，批號(hào)：140312。2、實(shí)驗(yàn)方法：
3日齡BALB/c乳鼠按窩隨機(jī)分為正常組、模型組、利巴韋林組100mg/kg/d、新黃烷酮低劑量組50mg/kg/d，中劑量組100mg/kg/d，高劑量組200mg/kg/d，每組10只，除正常對(duì)照組外，其余各組腹腔注射腸道病毒EV71病毒液(107TCID50)進(jìn)行感染，0.1mL/只，各給藥組以灌胃給藥，每次0.1ml，連續(xù)5天，每次給藥或感染后均用75％乙醇噴灑乳鼠包裹墊料后，放回籠中與母鼠共同飼養(yǎng)，正常對(duì)照組和病毒對(duì)照組給予蒸餾水。感染后每日觀察乳鼠的生存狀態(tài)，共觀察14d，并根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，計(jì)算感染的嚴(yán)重程度0分：健康；1分：弓背、豎毛(長(zhǎng)出毛后觀察)、消瘦、活動(dòng)減少等；2分：后肢力量減弱；3分：?jiǎn)蝹?cè)后肢麻痹或癱瘓；4分：雙側(cè)后肢麻痹或癱瘓；5分：瀕死或死亡。計(jì)算各組死亡率和生命延長(zhǎng)率并用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
表8新黃烷酮治療給藥對(duì)腸道病毒EV71感染BALB/c乳鼠感染程度的影響(n＝10)
*P<0.05，**P<0.01，與模型組比較
表8結(jié)果顯示，新黃烷酮各劑量組進(jìn)行治療性給藥后，可以顯著減緩腸道病毒EV71感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量減弱，單側(cè)后肢癱瘓等癥狀，其感染程度積分與模型組比較均具有顯著性差異。
表9新黃烷酮治療給藥腸道病毒EV71感染乳鼠生存率與生存時(shí)間(n＝10)
*P<0.05，**P<0.01，與模型組比較
表9結(jié)果顯示，新黃烷酮高、中、低劑量的死亡保護(hù)率分別為77.78％、55.56％、33.33％，生命延長(zhǎng)率分別為48.96％、40.39％、28.89％，表明新黃烷酮各劑量組感染程度均明顯減少腸道病毒EV71感染乳鼠死亡率和感染程度，延長(zhǎng)其生存時(shí)間，與模型組比較具有顯著性差異，提示新黃烷酮對(duì)腸道病毒EV 71感染具有治療作用。
實(shí)施例6新黃烷酮對(duì)柯薩奇病毒A16型感染的治療作用
1、實(shí)驗(yàn)材料：
柯薩奇病毒A16型(Cox A16)，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究免疫學(xué)研究室提供，由江蘇康緣現(xiàn)代中藥研究院保存，在Vero細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)傳代，-80℃保存。
SPF級(jí)懷孕15-16日BALB/c孕鼠，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育場(chǎng)，飼養(yǎng)在IVC系統(tǒng)中(溫度18～28℃，40～70％相對(duì)濕度，機(jī)械送排風(fēng)；明暗周期：12h/12h；150～300Lux照度)，取3日齡新生乳鼠開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。
新黃烷酮，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司自制，純度98.97％。利巴韋林，購(gòu)自哈藥三精制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字H19993937，規(guī)格：1ml：0.1g，批號(hào)：140312。2、實(shí)驗(yàn)方法：
3日齡BALB/c乳鼠按窩隨機(jī)分為正常組、模型組、利巴韋林組100mg/kg/d、新黃烷酮低劑量組50mg/kg/d，中劑量組100mg/kg/d，高劑量組200mg/kg/d，每組10只，除正常對(duì)照組外，其余各組腹腔注射柯薩奇病毒A16型(Cox A16)病毒液(107TCID50)進(jìn)行感染，0.1mL/只，各給藥組以灌胃給藥，每次0.1ml，連續(xù)5天，每次給藥或感染后均用75％乙醇噴灑乳鼠包裹墊料后，放回籠中與母鼠共同飼養(yǎng)，正常對(duì)照組和病毒對(duì)照組給予蒸餾水。感染后每日觀察乳鼠的生存狀態(tài)，共觀察14d，并根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，計(jì)算感染的嚴(yán)重程度0分：健康；1分：弓背、豎毛(長(zhǎng)出毛后觀察)、消瘦、活動(dòng)減少等；2分：后肢力量減弱；3分：?jiǎn)蝹?cè)后肢麻痹或癱瘓；4分：雙側(cè)后肢麻痹或癱瘓；5分：瀕死或死亡。計(jì)算各組死亡率和生命延長(zhǎng)率并用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
表10新黃烷酮治療給藥對(duì)柯薩奇病毒A16型感染BALB/c乳鼠感染程度的影響(n＝10)
*P<0.05，**P<0.01，與模型組比較
表10結(jié)果顯示，新黃烷酮各劑量組進(jìn)行治療性給藥后，可以顯著減緩柯薩奇病毒A16型感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量減弱，單側(cè)后肢癱瘓等癥狀，其感染程度積分與模型組比較均具有顯著性差異。
表11新黃烷酮治療給藥后柯薩奇病毒A16型感染乳鼠生存率與生存時(shí)間(n＝10)
*P<0.05，**P<0.01，與模型組比較
表11結(jié)果顯示，新黃烷酮高、中、低劑量的死亡保護(hù)率分別為87.50％、50.00％、37.50％，生命延長(zhǎng)率分別為41.43％、28.04％、22.12％，表明新黃烷酮各劑量組感染程度均明顯減少柯薩奇病毒A16型(Cox A16)感染乳鼠死亡率和感染程度，延長(zhǎng)其生存時(shí)間，與模型組比較具有顯著性差異，提示新黃烷酮對(duì)柯薩奇病毒A16型(Cox A16)感染具有治療作用。
實(shí)施例7二氫黃酮醇在制備膠囊劑藥物中的應(yīng)用
將350g二氫黃酮醇和32g淀粉、6g低取代羥丙基纖維素、4.5g微粉硅膠、1.5g硬脂酸鎂、及適量10％淀粉漿混合，裝入膠囊，得到二氫黃酮醇的膠囊制劑1000粒。每日3次，每次1粒。
實(shí)施例8新黃烷酮在制備顆粒劑藥物中的應(yīng)用
將350g新黃烷酮和1000g蔗糖及500g糊精混合，按照常規(guī)方法制成1000包新黃烷酮顆粒劑。每日3次，每次1粒。
實(shí)施例9二氫黃酮醇在制備片劑藥物中的應(yīng)用
將350g二氫黃酮醇和50g淀粉、7.5g羧甲基淀粉鈉、0.8g滑石粉、50g糊精、0.8g硬脂酸鎂及適量10％淀粉漿適混合，按照常規(guī)方法制成二氫黃酮醇片劑1000片。每日3次，每次1片。
實(shí)施例10新黃烷酮在制備丸劑藥物中的應(yīng)用
將350g新黃烷酮和12g聚乙二醇-6000、80.5g聚山梨酯-80、適量液狀石蠟混合，按照常規(guī)方法制成新黃烷酮丸劑1000粒。每日3次，每次1粒。
實(shí)施例11二氫黃酮醇在制備注射劑藥物中的應(yīng)用
將200g二氫黃酮醇和15g注射用大豆磷脂、25g注射用甘油，注射用水定容至1000mL，按照常規(guī)方法制成二氫黃酮醇注射劑1000支。每日1次，每次1支，至少采用250mL 5％葡萄糖注射液稀釋后靜脈滴注。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。