本發(fā)明涉及四個氯代四氫苯乙基色酮衍生物在預(yù)防或治療炎癥相關(guān)疾病、自身免疫性疾病和器官移植排斥中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體免疫系統(tǒng)包括天然免疫和適應(yīng)性免疫，在防御各種內(nèi)外源因素導(dǎo)致的機(jī)體損傷中起重要作用。但是免疫功能過度激活也會導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷。與免疫功能過度激活相關(guān)的的疾病主要有炎癥相關(guān)疾病、自身免疫性疾病和器官移植排斥。天然免疫過度激活主要導(dǎo)致炎癥相關(guān)疾病或者加重炎癥相關(guān)疾病機(jī)體損傷。適應(yīng)性免疫過度激活導(dǎo)致自身免疫性疾病和器官移植排斥。
目前預(yù)防或治療炎癥相關(guān)疾病的藥物主要有糖皮質(zhì)激素和環(huán)氧化酶抑制劑為代表的非甾體抗炎藥。雖然糖皮質(zhì)激素和非甾體抗炎藥具有較好的抗炎作用，但是藥物不良反應(yīng)嚴(yán)重限制了它們的應(yīng)用。糖皮質(zhì)激素長期應(yīng)用會導(dǎo)致代謝功能紊亂，非甾體抗炎藥長期應(yīng)用會導(dǎo)致胃潰瘍。預(yù)防或治療自身免疫性疾病和器官移植排斥的藥物主要有糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素、他克莫司等適應(yīng)性免疫抑制劑。糖皮質(zhì)激素長期使用會導(dǎo)致代謝功能紊亂，而環(huán)孢素和他克莫司等適應(yīng)性免疫抑制劑又具有較高的腎毒性。因此，開發(fā)新的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的天然免疫和適應(yīng)性免疫抑制劑對于預(yù)防或治療炎癥相關(guān)疾病、自身免疫性疾病和器官移植排斥具有重要意義。
沉香是瑞香科植物白木香含有樹脂的木材。中國藥典記載沉香具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效，用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急。這些功效和治療作用與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的抗炎作用十分相似。本發(fā)明人對廣泛存在于沉香中的苯乙基色酮衍生物進(jìn)行了提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定，并對它們的天然免疫和適應(yīng)性免疫抑制作用進(jìn)行了篩選，以發(fā)現(xiàn)具有新的作用機(jī)制的天然免疫和適應(yīng)性免疫抑制劑用于預(yù)防或治療炎癥相關(guān)疾病、自身免疫性疾病和器官移植排斥。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明人經(jīng)過長期的提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定，從沉香中獲得大量已知和未知的苯乙基色酮衍生物，經(jīng)過藥理篩選和深入的藥效學(xué)研究，首次發(fā)現(xiàn)如下表格的3個已知氯代四氫苯乙基色酮衍生物(G1、G3和G4)(Chem.Pharm.Bull，2003，51(5)：560-564；Helvetica Chimica Acta，2012，95：1657-1665)和1個新的氯代四氫苯乙基色酮衍生物(G2)具有良好的天然免疫和特異性免疫抑制作用。
本發(fā)明的目的在于提供選自上述表格的1個新的氯代四氫苯乙基色酮衍生物(G2)。
本發(fā)明的另一目的在于提供選自上述表格的新的氯代四氫苯乙基色酮衍生物G2的制備方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供選自上述表格中的四個氯代四氫苯乙基色酮衍生物通過天然免疫和特異性免疫抑制在預(yù)防或治療炎癥相關(guān)疾病、自身免疫性疾病和器官移植排斥中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一目的在于提供含有效劑量上述表格中一種或多種化合物的藥物組合物通過天然免疫和特異性免疫抑制在預(yù)防或治療炎癥相關(guān)疾病、自身免疫性疾病和器官移植排斥中的應(yīng)用。
本發(fā)明首次從沉香中發(fā)現(xiàn)一種新的氯代四氫苯乙酮衍生物，具體結(jié)構(gòu)如上述表格化合物G2，其特征在于氯原子和3個羥基在色酮環(huán)兩側(cè)，與化合物G4是立體異構(gòu)體。
所述化合物G2提取分離步驟如下：
取沉香藥材粉末，95％乙醇加熱回流提取，減壓濃縮至浸膏狀，加水混懸，分別用石油醚、醋酸乙酯萃取。取醋酸乙酯部位浸膏，加硅膠拌樣，上樣于硅膠柱(200-300目)，依次用石油醚-醋酸乙酯(8∶1-1∶1)、氯仿-甲醇(20∶1-1∶3)梯度洗脫，得到GYF1～GYF7等7個流份。取流份GYF7，進(jìn)一步經(jīng)硅膠(200-300目)柱色譜分離，甲醇-二氯甲烷(1∶12)梯度洗脫，TLC檢測，合并得到GYF7-1～GYF7-6等6個流份。取流份GYF7-3，經(jīng)硅膠(200-300目)柱色譜分離，甲醇-二氯甲烷(1∶12)洗脫，得到GYF7-3-1～GYF7-3-5等5個流份。取流份GYF7-3-3經(jīng)ODS反相柱分離，甲醇-水(50∶50)洗脫，洗脫液經(jīng)半制備液相柱分離，乙腈-水(12∶88)洗脫，得到化合物G2(tR＝90min)。
本發(fā)明的化合物G1、G3和G4可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。
本發(fā)明通過巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞和BV-2細(xì)胞篩選，證明化合物G1、G2、G3和G4具有抑制細(xì)菌脂多糖刺激RAW264.7細(xì)胞和BV-2細(xì)胞分泌一氧化氮的作用。
本發(fā)明通過酶聯(lián)免疫測定，證明抑制巨噬細(xì)胞分泌一氧化氮作用最強(qiáng)的化合物G4具有抑制細(xì)菌脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α和IL-6的作用。
本發(fā)明通過流式細(xì)胞測定，證明G4具有抑制小鼠中性粒細(xì)胞活化的作用。
本發(fā)明通過流式細(xì)胞測定，證明G4具有抑制小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞活化的作用。
本發(fā)明通過小鼠系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)模型，證明通過灌胃給藥化合物G4能夠抑制靜脈注射細(xì)菌脂多糖導(dǎo)致的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。
本發(fā)明通過Western-Blot實驗，證明化合物G4可以通過抑制JNK信號通路抑制天然免疫和特異性免疫。
本發(fā)明通過以上藥理學(xué)實驗證明了化合物G1、G2、G3和G4及其藥物組合物可以通過天然免疫和特異性免疫抑制在預(yù)防或治療炎癥相關(guān)疾病、自身免疫性疾病和器官移植排斥中的應(yīng)用。
本發(fā)明的含化合物G1、G2、G3和G4的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。
本發(fā)明的化合物或含有它們的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為口服、靜脈注射、肌肉注射、鼻腔、口腔粘膜、皮膚或直腸等。
本發(fā)明的化合物或含有它們的藥物組合物的給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其它劑型如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。
本發(fā)明的化合物的藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動物的性別、年齡、體重、性格及個體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍：本發(fā)明涉及的化合物的用量為0.1～10mg/Kg體重，可一次服用或分2～4次服用。本發(fā)明的化合物G1、G2、G3、G4或含有它們的藥物組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用。
本發(fā)明的化合物預(yù)防或治療的炎癥相關(guān)疾病可以是系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)、肺炎、支氣管炎、肝炎、腎炎、胃炎、腸炎、神經(jīng)炎癥、皮膚炎癥等。
本發(fā)明的化合物預(yù)防或治療的自身免疫性疾病可以是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性血管炎、硬皮病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性再生障礙性貧血、橋本甲狀腺炎等。
本發(fā)明的化合物預(yù)防或治療的器官移植排斥可以是腎移植排斥、肝移植排斥、皮膚移植排斥、心臟移植排斥、造血干細(xì)胞移植排斥。
附圖說明
附圖為化合物G4對NF-κB通路和MAPK通路調(diào)節(jié)作用的Western-Blot檢測圖。
具體實施方式
以下將結(jié)合實施例對發(fā)明作進(jìn)一步說明，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1：化合物G2的制備
(1)實驗材料
藥材：沉香。經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代研究中心屠鵬飛教授鑒定為瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg含有樹脂的木材。標(biāo)本(CX2012029)存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代研究中心標(biāo)本庫。
試劑：乙醇、石油醚、醋酸乙酯、氯仿、甲醇、二氯甲烷、乙腈等化學(xué)試劑均為分析純，購自北京化工廠。
儀器及材料：美國Rudolph Autopol IV自動旋光計；日本島津公司UV-2450分光光度計；美國Thermo Nicolet Nexus 470FT-IR傅立葉變換紅外光譜儀；美國Varian Inova-500型核磁共振儀；日本島津離子阱飛行時間質(zhì)譜儀(IT-ToF-MS)；美國Waters2535半制備型高效液相色譜儀；JA50002精密電子天平；DHG-9070B鼓風(fēng)干燥箱；DZF-6090真空干燥箱；薄層色譜用GF254硅膠預(yù)制板和柱色譜用硅膠(200-300目)，購自青島海洋化工廠；德國Merck公司ODS C18色譜柱；瑞典Amersham Biosciences公司Sephadex LH-20色譜柱；分析型HPLC色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(4.6×250mm，5μm)；半制備反相色譜柱：Water XTerra Prep C18色譜柱(10×250mm，5μm)和Shiseido Capcell PAK MG Prep C18色譜柱(10×250mm，5μm)。
(2)實驗方法
取沉香藥材6.9kg，95％乙醇加熱回流提取3次，每次2.5h，合并醇提液，減壓濃縮至浸膏狀(3.39kg)，加水混懸，分別用石油醚和醋酸乙酯萃取。得石油醚部位150g，醋酸乙酯部位600g。取醋酸乙酯部位浸膏(400g)，加硅膠拌樣，行硅膠柱層析(200-300目)，依次用石油醚-醋酸乙酯(8∶1→I∶1)、氯仿-甲醇(20∶1→1∶3)梯度洗脫，得到GYF1～GYF7等7個流份。取流份GYF7(67g)，進(jìn)一步經(jīng)硅膠(200-300目)柱色譜分離，甲醇-二氯甲烷(1∶12)梯度洗脫，TLC檢視，合并相似流份，得到GYF7-1～GYF7-6等6個流份。取流份GYF7-3，行硅膠(200-300目)柱色譜分離，甲醇-二氯甲烷(1∶12)洗脫，得到GYF7-3-1～GYF7-3-5等5個流份。取流份GYF7-3-3經(jīng)ODS反相柱分離，甲醇-水(50∶50)洗脫，目標(biāo)洗脫液經(jīng)半制備液相柱分離，乙腈-水(12∶88)洗脫，得到黃色油狀物G2(13mg，tR＝90min)。對G2進(jìn)行波譜數(shù)據(jù)測定和結(jié)構(gòu)解析。
(3)實驗結(jié)果
黃色油狀物G2，HRESIMS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 401.0545[M+Cl]-(計算值401.0564)，分子式為C18H19O6Cl。IR(KBr)vmax3424，1659，1612，1513，1435，1246，1180，1097，1037，827，796cm-1；1H和13C NMR數(shù)據(jù)見表1。
表1：化合物G2的1H(500MHz)和13C(125MHz)NMR數(shù)據(jù)
實施例2：化合物G1～G4體外抑制小鼠巨噬細(xì)胞和神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮(NO)分泌作用測定
(1)實驗材料
細(xì)胞株：RAW264.7細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；BV-2細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院陳乃宏研究員饋贈。
試劑：化合物G1～G4由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代研究中心從沉香中提取分離；DMEM高糖培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基均購自康寧公司；細(xì)菌脂多糖購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限責(zé)任公司(貨號：L2880)；一氧化氮測定試劑盒(Griess試劑)購自普利萊基因技術(shù)有限公司(貨號：E1030)；噻唑蘭購自Amresco公司(貨號：0793)；分析純二甲基亞砜，購自北京化工廠。
儀器：Enspire Multimode Plate Reader購自德國鉑金愛爾默公司。
(2)實驗方法
將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞(DMEM高糖培養(yǎng)基)和BV-2細(xì)胞(DMEM/F12培養(yǎng)基)接種到96孔板中，接種濃度均為20000細(xì)胞/孔，體積100μl，37℃和5％CO2孵育24小時后，加入化合物G1～G4，每個化合物設(shè)置7個濃度(無細(xì)胞毒作用)，各濃度設(shè)3個復(fù)孔，1小時后，加入細(xì)菌脂多糖(LPS)至終 濃度0.5μg/ml，繼續(xù)孵育24小時。取50μl細(xì)胞上清，加入Griess試劑100μl，反應(yīng)10分鐘后，測定540nm波長的吸光度，并計算四個化合物對兩種細(xì)胞分泌NO的半數(shù)抑制濃度(IC50)。另將細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)基棄去，加入100μl MTT試劑(PBS配制的0.5mg/ml噻唑蘭溶液)，細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4h，然后棄去MTT試劑，各孔加入150μl的二甲基亞砜溶解甲瓚，測定570nm波長的吸光度，并計算各濃度化合物對RAW264.7細(xì)胞和BV-2細(xì)胞的生長抑制率。
(3)實驗結(jié)果
通過分泌一氧化氮模型篩選，發(fā)現(xiàn)化合物G1～G4均能顯著抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7和小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2在脂多糖刺激后的一氧化氮分泌，其半數(shù)抑制濃度(IC50)如表2所示；化合物G1～G4在最高濃度達(dá)到100μM時仍對RAW264.7和小膠質(zhì)細(xì)胞無生長抑制作用。
表2：化合物G1～G4體外抑制NO分泌作用測定
實施例3：化合物G4體外抑制小鼠巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌作用測定
(1)實驗材料
細(xì)胞株：RAW264.7細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。
試劑：化合物G4由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代研究中心從沉香中提取分離；DMEM高糖培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基均購自康寧公司；細(xì)菌脂多糖購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限責(zé)任公司(貨號：L2880)；測定TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司(貨號：EK0527和EK0411)。
儀器：Enspire Multimode Plate Reader購自德國鉑金愛爾默公司。
(2)實驗方法
將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞接種到96孔板中，接種濃度為50000細(xì)胞/孔，體積100μl，37℃和5％CO2孵育24小時后，加入化合物G4以及陽性藥地塞米松(Dexamethasone，DEX)，地塞米松終濃度10μM(無細(xì)胞毒作用)，化合物G4終濃度分別為5、10、20μM，，各化合物各濃度設(shè)3個復(fù)孔，1小時后，加入細(xì)菌脂多糖(LPS)至終濃度0.5μg/ml，繼續(xù)孵育24小時。取細(xì)胞上清，利用ELISA試劑盒測定細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6濃度。
(3)實驗結(jié)果
通過分泌炎癥因子測定，發(fā)現(xiàn)化合物G4處理組細(xì)胞上清TNF-α和IL-6濃度顯著低于LPS處理組，如表3所示(*P＜0.05vs LPS)。表明化合物G4能夠抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在脂多糖刺激后的TNF-α和IL-6分泌。
表3：化合物G4體外抑制炎癥因子分泌作用測定
實施例4：化合物G4體外抑制中性粒細(xì)胞活化作用測定
(1)實驗材料
動物：Balb/c小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司。
試劑：化合物G4由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代研究中心從沉香中提取分離；PE標(biāo)記大鼠抗小鼠CD11b抗體，購自美國BD Biosciences公司(貨號：557397)。
儀器：FACSCantoTMII流式細(xì)胞儀購自美國BD Biosciences公司。
(2)實驗方法
頸椎脫臼處死1只Balb/c小鼠，75％酒精浸泡5分鐘，然后超凈工作臺內(nèi)無菌去小鼠兩側(cè)股骨，剪開股骨膝關(guān)節(jié)端，利用1ml注射器吸取IMDM培養(yǎng)基(含2％胎牛血清)將股骨中骨髓細(xì)胞沖洗到離心管中。經(jīng)40μm孔徑無菌濾網(wǎng)過濾細(xì)胞和白細(xì)胞計數(shù)，然后將細(xì)胞接種到24孔板中，保持白細(xì)胞濃度1×106個/孔，加入IMDM培養(yǎng)基(含2％胎牛血清)至每孔培養(yǎng)基總體積1ml。再加入化合物G4以及陽性藥地塞米松，地塞米松終濃度10μM(無細(xì)胞毒作用)，化合物G4終濃度分別為5、10、20μM，，各化合物各濃度設(shè)3個復(fù)孔，37℃和5％CO2孵育1小時后，加入250μl條件培養(yǎng)基(利用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)0.5μg/ml的LPS刺激24小時，TNF-α濃度30ng/ml)，37℃和5％CO2繼續(xù)孵育1.5h。然后將細(xì)胞收集到離心管中，4℃，200g離心5分鐘，倒去上清，250μl含1％牛血清白蛋白(BSA)的冰冷PBS重懸細(xì)胞，加入PE標(biāo)記大鼠抗小鼠CD11b抗體，冰上孵育1小時。然后加入1ml含1％BSA的PBS，4℃，200g離心5分鐘，倒去上清，再加入1ml含1％BSA的PBS，4℃，200g離心5分鐘，倒去上清。最后加入300μl含1％BSA的PBS重懸細(xì)胞，利用BD FACSCantoTM II流式細(xì)胞儀檢測骨髓細(xì)胞中中性粒細(xì)胞CD11b標(biāo)記的平均熒光強(qiáng)度。
(3)實驗結(jié)果
通過流式細(xì)胞測定，發(fā)現(xiàn)化合物G4處理組CD11b平均熒光強(qiáng)度顯著低于LPS處理組，如表4所示(*P＜0.05vs LPS)。表明化合物G4能夠抑制小鼠中性粒細(xì)胞在炎癥因子刺激后的活化。
表4：化合物G4體外抑制中性粒細(xì)胞活化作用測定
實施例5：化合物G4體內(nèi)抗炎作用測定
(1)實驗材料
動物：Balb/c小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司。
試劑：化合物G4由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代研究中心從沉香中提取分離；細(xì)菌脂多糖購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限責(zé)任公司(貨號：L2880)；測定TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司(貨號：EK0527和EK0411)。
儀器：Enspire Multimode Plate Reader購自德國鉑金愛爾默公司。
(2)實驗方法
將36只8周齡Balb/c小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，然后將動物隨機(jī)平均分為6組，溶媒對照組(Vehicle)、脂多糖組(LPS)、地塞米松組(DEX)、化合物G4低、中、高劑量組。通過灌胃給予化合物G4各劑量組和地塞米松組相應(yīng)劑量化合物G4和地塞米松，Vehicle和LPS組給予等體積溶媒(含1％羧甲基纖維素鈉的5％葡萄糖溶液)。給藥后1小時，通過靜脈注射給予Vehicle組以外5組動物10mg/kg脂多糖，Vehicle 組給予相應(yīng)體積生理鹽水。1.5h后，通過摘取眼球采集各組動物靜脈血，4℃凝固1h后，4℃，800g離心取血清。利用ELISA試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)測定血清中TNF-α和IL-6濃度。
(3)實驗結(jié)果
通過ELISA測定，發(fā)現(xiàn)化合物G4給藥組動物血清中TNF-α和IL-6濃度顯著低于LPS處理組，如表5所示(*P＜0.05vs LPS)。表明化合物G4具有良好體內(nèi)抗炎作用。
表5：化合物G4體內(nèi)抗炎作用測定
實施例6：化合物G4體外抑制CD4+T細(xì)胞活化作用測定
(1)實驗材料
動物：Balb/c小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司。
試劑：化合物G4由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代研究中心從沉香中提取分離；地鼠抗小鼠CD3e抗體(貨號：557306)、地鼠抗小鼠CD28抗體(貨號：557393)、FITC標(biāo)記大鼠抗小鼠CD4抗體(貨號：553046)、PE標(biāo)記地鼠抗小鼠CD69抗體(貨號：553237)，購自美國BD Biosciences公司。
儀器：FACSCantoTM II流式細(xì)胞儀購自美國BD Biosciences公司。
(2)實驗方法
取無菌24孔培養(yǎng)板，設(shè)置溶媒對照組(Vehicle)、模型組(Model)、地塞米松組(DEX)、化合物G45、10、20μM等劑量組，各組設(shè)3個復(fù)孔，溶媒對照組各孔加入1ml的PBS，其它各組每孔加入1ml含2μg/ml地鼠抗小鼠CD3e抗體的PBS，4℃孵育過夜。頸椎脫臼處死1只Balb/c小鼠，75％酒精浸泡5分鐘，然后超凈工作臺內(nèi)無菌取小鼠脾臟，在50ml離心管上，架設(shè)40μm孔徑尼龍濾網(wǎng)，將脾臟放到濾網(wǎng)上，緩緩加入20ml的PBS，并用5ml注射器芯桿平端研磨脾臟。將過濾的脾臟細(xì)胞200g離心5分鐘，倒去上清，加入5ml含10胎牛血清的1640RPMI培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并對白細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。然后吸去24孔板中的PBS，用1640RPMI培養(yǎng)基清洗2次，再將脾細(xì)胞接種到24孔板中，保持白細(xì)胞濃度1×106個/孔，加入含10胎牛血清的1640RPMI培養(yǎng)基至每孔培養(yǎng)基總體積1ml。再在地塞米松和化合物G4各劑量組孔中加入陽性藥地塞米松以及化合物G4，地塞米松終濃度10μM(無細(xì)胞毒作用)，化合物G4各劑量組終濃度分別為5、10、20μM，37℃和5％CO2條件下繼續(xù)孵育。1小時后，CD3e包被孔中加入地鼠抗小鼠CD28抗體，濃度2μg/ml，繼續(xù)孵育16小時。然后將細(xì)胞收集到離心管中，4℃，200g離心5分鐘，倒去上清，250μl含1％牛血清白蛋白(BSA)的冰冷PBS重懸細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記大鼠抗小鼠CD4抗體和PE標(biāo)記地鼠抗小鼠CD69抗體，冰上孵育1小時。然后加入1ml含1％BSA的PBS，4℃，200g離心5分鐘，倒去上清，再加入1ml含1％BSA的PBS，4℃，200g離心5分鐘，倒去上清。最后加入300μl含1％BSA的PBS重懸細(xì)胞，利用BD FACSCantoTM II流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞活化標(biāo)志物CD69平均熒光強(qiáng)度。
(3)實驗結(jié)果
通過流式細(xì)胞測定，發(fā)現(xiàn)化合物G4各劑量組CD4+細(xì)胞CD69平均熒光強(qiáng)度顯著低于Model組，如表6所示(*P＜0.05vs Model)。表明化合物G4能夠抑制小鼠CD4+T細(xì)胞的活化。
表6：化合物G4體外抑制CD4+T細(xì)胞活化作用測定
實施例7：化合物G4抗炎作用機(jī)制研究
(1)實驗材料
細(xì)胞株：RAW264.7細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。
試劑及材料：化合物G4由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代研究中心從沉香中提取分離；DMEM高糖培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基均購自康寧公司；細(xì)菌脂多糖購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限責(zé)任公司(貨號：L2880)；RIPA裂解液(貨號：P0013B)、BCA蛋白定量試劑盒(貨號：P0010)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(貨號：P0012A)、SDS-PAGE電泳液(貨號：P0014B)、Westernblot轉(zhuǎn)膜液(貨號：P0021B)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號：P0018)、PVDF膜(貨號：FFP39)購自碧云天生物技術(shù)研究所；NF-κB Pathway Sampler Kit(貨號：9936)、MAPK Family Antibody Sampler Kit(貨號：9926)和Phospho-MAPK Family Antibody Sampler Kit(貨號：9910)購自Cell Signalling Technology公司。
儀器：ImageQuantLAS4000mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀，購自General Electric公司。
(2)實驗方法
接種細(xì)胞：將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞接種到6孔板中，接種濃度為200000細(xì)胞/孔，體積2ml，37℃和5％CO2孵育24小時；藥物處理細(xì)胞：將6孔板細(xì)胞設(shè)溶媒對照組(Vehicle)、模型組(Model)、化合物G4各劑量組(5、10、20μM)，化合物G4各劑量組加入化合物G4至終濃度為5、10、20μM，1小時后，加入細(xì)菌脂多糖(LPS)至模型組和G4各劑量組至終濃度0.5μg/ml，繼續(xù)孵育6小時；收集細(xì)胞：棄細(xì)胞培養(yǎng)基，用冰冷PBS沖洗細(xì)胞2次，然后各孔加入2ml冰冷PBS，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞到2ml離心管中，4℃、300g離心5分鐘，棄上清；裂解細(xì)胞：各管細(xì)胞中加入400μl的RIPA裂解液，冰浴裂解30分鐘，4℃、10000g離心10分鐘，收集上清；蛋白濃度定量：利用BCA蛋白定量試劑盒測定各樣品蛋白濃度，并用RIPA裂解液將各樣品濃度調(diào)到同一濃度；制備蛋白電泳樣品：吸取上述蛋白樣品各200μl，加入50μl蛋白電泳上樣緩沖液(5×)，混勻后99℃金屬浴10分鐘，然后冷卻至室溫；蛋白電泳：利用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配制10％聚丙烯酰胺凝膠，然后將上述蛋白樣品各上樣10μl，90V恒壓電泳2小時：蛋白電轉(zhuǎn)：將海綿墊、濾紙、甲醇浸泡過的PVDF膜和完成電泳操作的聚丙烯酰胺凝膠、濾紙、海綿墊按順序放到電轉(zhuǎn)夾中，再固定到電轉(zhuǎn)槽內(nèi)，120V恒壓冰浴電轉(zhuǎn)1.5小時；封閉：將電轉(zhuǎn)后的膜取出，放入TBS溶液配制的5％脫脂牛奶中封閉1小時；一抗孵育：將封閉后的PVDF膜按目的條帶所在位置剪成小條，然后分別加入5％脫脂牛奶配制的兔抗小鼠Actin抗體、p65抗體、phospho-p65抗體、p38抗體、phospho-p38抗體、Erk抗體、phospho-Erk抗體、Jnk抗體、phospho-Jnk抗體(均為1∶1000稀釋)，4℃塑封袋中孵育過夜；洗滌：將孵育一抗后的PVDF膜用TBST洗滌3次，每次5分鐘；二抗孵育：再將PVDF膜裝入塑封袋中，加入TBST配制的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育2h；洗滌：將孵育二抗后的PVDF膜用TBST洗滌3次，每次5分鐘；化學(xué)發(fā)光成像：將PVDF膜逐條放入ImageQuantLAS4000mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀中，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光液，拍攝化學(xué)發(fā)光圖片。
濃度。
(3)實驗結(jié)果
通過上述Westernblot檢測，發(fā)現(xiàn)化合物G4處理RAW264.7細(xì)胞，對LPS活化NF-κB通路的p65沒有抑制作用，對MAPK通路的p38和Erk通路活化也沒有抑制作用，但是化合物G4中高劑量對Jnk通路活化 具有顯著的抑制作用(見附圖)，表明抑制Jnk通路活化可能是化合物G4發(fā)揮抗炎作用及其它天然免疫抑制和適應(yīng)性免疫抑制的關(guān)鍵機(jī)制。