胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗及其制備和應(yīng)用，該疫苗為ISCOM-DNA復(fù)合物，其制備方法包括胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4全長(zhǎng)cDNA的克隆，腫瘤壞死因子BAFF全長(zhǎng)cDNA的克隆，重組載體pStar-CPEB4/BAFF的構(gòu)建，pStar-CPEB4/BAFF工程菌的構(gòu)建，CPEB4的誘導(dǎo)表達(dá)，ISCOM-DNA復(fù)合物的制備。該疫苗在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的防治方面具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明具有高效、低毒、制備方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，可用于腫瘤免疫治療的藥物。
【專利說(shuō)明】胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4的免疫增強(qiáng)型疫苗，還涉及該疫苗的制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]腦膠質(zhì)瘤是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤，盡管采取了多種方法進(jìn)行積極治療，但是預(yù)后仍不夠理想。胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白(cytoplasmicpolyadenylation element-binding proteins, CPEBs)是一組介導(dǎo) mRNA 胞質(zhì)多聚腺苷酸化和翻譯的RNA結(jié)合蛋白。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)其在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中有異常表達(dá)現(xiàn)象。隨著CPEBs與腫瘤關(guān)系的研究開(kāi)展，國(guó)外已有研究報(bào)道CPEB4在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中呈陽(yáng)性表達(dá)，并且其陽(yáng)性率與腫瘤惡性程度的呈正相關(guān)。因此，CPEB4有望成為膠質(zhì)瘤的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。
[0003]BAFF是B細(xì)胞存活與成熟的必需因子，也被稱為腫瘤壞死因子和凋亡配體相關(guān)的白細(xì)胞表達(dá)配體，為TNF家族成員，是II型跨膜蛋白，N末端在胞內(nèi)無(wú)信號(hào)肽，C末端為胞外區(qū)，其中47~73位氨基酸為跨膜區(qū)，74~285位氨基酸為胞外區(qū)，133~285位氨基酸為其發(fā)揮功能的主要區(qū)域，128~285位氨基酸殘基區(qū)域含有與受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。BAFF有膜結(jié)合蛋白和可溶性配體(hsBAFF)兩種形式存在。hsBAFF能夠增強(qiáng)B細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞、N K細(xì)胞的活性，使機(jī)體的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。BAFF不僅是B細(xì)胞的存活因子，還對(duì)T細(xì)胞激活有共刺激作用。T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的BAFF可作為T細(xì)胞激活的共刺激因子，人重組或內(nèi)源BAFF刺激T細(xì)胞分泌IFN-Y和IL-2，上調(diào)⑶25 ( IL22受體α鏈)表達(dá)，并以IL-2依賴方式促進(jìn)T細(xì)胞增生。
[0004]免疫刺激復(fù)合物(ISC0M)是一種新型的蛋白質(zhì)疫苗佐劑，可增強(qiáng)蛋白質(zhì)抗原誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，包括抗體的`產(chǎn)生、遲發(fā)性超敏反應(yīng)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活等。ISCOM與裸DNA混合制備DNA疫苗誘導(dǎo)的中和抗體水平和免疫保護(hù)力，明顯高于單獨(dú)使用裸DNA，說(shuō)明ISCOM還具有增強(qiáng)DNA疫苗免疫效果的作用?？赡艿臋C(jī)制是經(jīng)ISCOM包裹的DNA能免受體內(nèi)核酸酶的降解，從而保證DNA疫苗在雞體內(nèi)的持續(xù)表達(dá)。另外，ISCOM的結(jié)構(gòu)特性使其更易于定居在淋巴組織內(nèi)，有利于APC吞噬ISC0M-DNA復(fù)合物。ISCOM具有制備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗及其制備方法，以及基于此疫苗的應(yīng)用，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的治療策略。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下:
一種胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗為ISC0M-DNA復(fù)合物，每毫升中含有0.1mg 膽固醇、0.1mg 卵憐脂、Img QuilA 和 0.5mg 質(zhì)粒 pStar_CPEB4 /BAFF。
[0007]—種胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗的制備方法，包括以下步驟:(1)胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4全長(zhǎng)CDNA的克隆
從膠質(zhì)瘤細(xì)胞提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以該總cDNA為模板，以Fl:5，-aatctgcagatgggggattacgg _3，，R1:5，_tacgaattcgctggaactaa_3，為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性I分鐘、58°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘。
[0008](2)腫瘤壞死因子BAFF全長(zhǎng)cDNA的克隆
提取人脾臟組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以該總cDNA為模板，以F2:5’-gatcggatccatggatgactccacagaaagg-3’ 和 R2:5’ -acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3> 為上下游弓丨物，PCR擴(kuò)增BAFF全長(zhǎng)cDNA，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5分鐘，然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。
[0009](3)重組載體 pStar_CPEB4 /BAFF 的構(gòu)建
將CPEB4全長(zhǎng)cDNA插入pStar載體的IRES上游，再將BAFF全長(zhǎng)cDNA插入pStar載體的IRES下游。
[0010](4)pStar-CPEB4 /BAFF 工程菌的構(gòu)建
將CPEB4原核表達(dá)載體pStar-CPEB4 /BAFF用Sal I酶切使線性化，用電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞，獲得高拷貝CPEB4工程菌。
[0011](5)CPEB4的誘導(dǎo)表達(dá)
用甲醇誘導(dǎo)工程菌表達(dá)CPEB4，并進(jìn)行分離純化，得到高純度的CPEB4。
[0012]純化的方法為:培養(yǎng)上清液加入質(zhì)量百分濃度為80%的硫酸銨使蛋白質(zhì)沉淀，離心棄上清，蛋白質(zhì)沉淀用濃度為0.02mol/L、pH為8.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析脫鹽，再用瓊脂糖凝膠(Q-Sepharose)柱進(jìn)行分離純化,用濃度為lmol/L的氯化鈉溶液線性梯度洗脫，收集含有CPEB4的洗脫液，適當(dāng)濃縮后用葡聚糖凝膠(S印hdex G-25)柱脫鹽。
[0013](6) ISC0M-DNA復(fù)合物的制備
0.lmg/ml 膽固醇、0.lmg/ml 卵憐脂、lmg/ml QuilA 和 0.5mg/ml 質(zhì)粒 pStar_CPEB4/BAFF，反復(fù)混勻并充分乳化使溶液完全清晰，混合物經(jīng)透析后形成微絮狀物即ISC0M-DNA 復(fù)合物。
[0014]一種胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗在神經(jīng)膠質(zhì)瘤防治中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明將CPEB4與BAFF重組真核表達(dá)載體有效地包封在脂質(zhì)體中形成納米級(jí)顆粒，來(lái)發(fā)揮抗腫瘤的作用，具有高效、低毒、制備方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，可用于腫瘤免疫治療的藥物，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的防治方面具有良好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為PCR擴(kuò)增CPEB4基因的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
[0017]圖2為PCR擴(kuò)增BAFF基因的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
[0018]圖3為蛋白免疫印跡(Western Blot)鑒定CPEB4。
[0019]圖4為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)法檢測(cè)激發(fā)T分泌IFN-Y的能力，其中，實(shí)驗(yàn)組為=ISCOM復(fù)合物，空白對(duì)照組為:含有空白質(zhì)粒的復(fù)合物，陰性對(duì)照組為:PBS。
[0020]圖5為51Cr釋放法檢測(cè)激發(fā)T細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的特異性殺傷效應(yīng)，其中，實(shí)驗(yàn)組為=ISCOM復(fù)合物，空白對(duì)照組為:含有空白質(zhì)粒的復(fù)合物，陰性對(duì)照組為:PBS?！揪唧w實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例1
以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J-薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0022]1、CPEB4 全長(zhǎng) cDNA 的克隆
根據(jù)GenBank登錄號(hào)為NM_030627的CPEB4基因序列，設(shè)計(jì)并合成如下引物以PCR擴(kuò)增兩端帶有酶切位點(diǎn)的 CPEB4 cDNA 全長(zhǎng):F1:5，-aatctgcagatgggggattacgg _3’(SEQ IDN0.1)，下劃線部分為 Pst I 酶切位點(diǎn)；R1:5’-tacgaattcgctggaactaa-3，(SEQ ID N0.2),下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn)。
[0023]分離手術(shù)后患者的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2X IO7個(gè)/mL，收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA ;將所得細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以該cDNA為模板、Fl和Rl為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為:94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性I分鐘、58°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與P-T Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，委托上海生工公司測(cè)定質(zhì)粒序列，將插入了CPEB4 cDNA全長(zhǎng)序列(SEQ ID N0.3)的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pT_CPEB4。
[0024]PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I泳道為PCR產(chǎn)物，可見(jiàn)PCR產(chǎn)物在約2000bp處呈單一特異性條帶，與目的片段大小相符。
[0025]2、BAFF 全長(zhǎng) cDNA 的克隆
按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取人脾臟組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以該總cDNA為模板，以 F2:5，_gatcggatccatggatgactccacaga aagg_3’(SEQ ID N0.4,下劃線部分為BamHI 酶切位點(diǎn))和 R2:5，-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’ (SEQ ID N0.5,下劃線部分為Sal I酶切位點(diǎn))為上下游引物，PCR擴(kuò)增BAFF全長(zhǎng)cDNA，PCR反應(yīng)體系為50 μ 1，循環(huán)條件參數(shù)為:94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與pT-Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定，將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pT-BAFF。
[0026]瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖2，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I泳道為PCR產(chǎn)物。結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物在約SOObp處呈單一特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符；測(cè)序結(jié)果顯示陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的插入基因序列與GenBank登錄號(hào)為NM_006573的BAFF全長(zhǎng)cDNA序列一致(SEQ IDN0.6)。
[0027]3、重組載體 pStar_CPEB4 /BAFF 的構(gòu)建
根據(jù)CPEB4和BAFF全長(zhǎng)cDNA兩端所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，首先將CPEB4全長(zhǎng)cDNA插入pStar載體的IRES上游，再將BAFF全長(zhǎng)cDNA插入pStar載體的IRES下游。具體方法為:先將PT-CPEB4載體用Pst I和EcoR I雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與同樣經(jīng)Pst I和EcoR I雙酶切的pStar載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，Pst I和EcoR I雙酶切鑒定，將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pStar-CPEB4 ;再將pT_BAFF載體用BamH I和Sal I雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與同樣經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切的pStar-CPEB4載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，BamH I和Sal I雙酶切鑒定，將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pStar-CPEB4 -1RES-BAFF。
[0028]4、pStar-CPEB4 /BAFF 工程菌的構(gòu)建
將CPEB4原核表達(dá)載體pStar-CPEB4 /BAFF用Sal I酶切使線性化，用電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于MD平板，30°C培養(yǎng)3~4天，挑取白色酵母菌落，分別點(diǎn)接于YPD平板(1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉)、MD和麗平板，30°C培養(yǎng)3飛天(每天向麗平板中添加甲醇100 μ L)，挑取MD平板上生長(zhǎng)明顯快于MM平板的酵母菌落，點(diǎn)接于含有濃度為4mg/mL的G418的YPD平板，30°C培養(yǎng)7天，所得酵母單菌落為高拷貝CPEB4工程菌。
[0029]5、CPEB4的誘導(dǎo)表達(dá) 將高拷貝CPEB4工程菌于30°C培養(yǎng)至0D600為2，按10%接種量接入BMGY培養(yǎng)基(ρΗ6.0, IOOmM磷酸鹽緩沖液，酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甘油10mL/L)中，30°C培養(yǎng)24小時(shí)，5000g離心5分鐘，棄上清，菌體用無(wú)菌水洗滌2次后，重懸于等體積的BMMY培養(yǎng)基(pH6.0, IOOmM磷酸鹽緩沖液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L,甲醇5mL/L)中，30°C誘導(dǎo)表達(dá)3天(每24小時(shí)補(bǔ)加誘導(dǎo)劑甲醇至最終體積百分濃度為0.5%)，40C、6000g離心5分鐘，收集上清，加入質(zhì)量百分濃度為80%的硫酸銨使蛋白質(zhì)沉淀，離心棄上清，蛋白質(zhì)沉淀用濃度為0.02mol/L、pH為8.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析脫鹽，再用瓊脂糖凝膠(Q-Sepharose)柱進(jìn)行分離純化,用濃度為lmol/L的氯化鈉溶液線性梯度洗脫，收集含有CPEB4的洗脫液，適當(dāng)濃縮后用葡聚糖凝膠(S印hdex G-25)柱脫鹽，即得純化的CPEB4。
[0030]Western Blot鑒定:取純化的CPEB4，加入上樣緩沖液，100°C加熱3~5分鐘，用質(zhì)量百分濃度為12%的分離膠、質(zhì)量百分濃度為5%的積層膠進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完畢后，將分離產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用質(zhì)量百分濃度為5%的脫脂牛奶封膜，加入鼠抗人CPEB4單克隆抗體，溫度37°C孵育I小時(shí)，洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG，溫度37°C孵育I小時(shí)，洗膜，顯色；同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(不加入純化的CPEB4 )。
[0031]結(jié)果見(jiàn)圖3，其中I泳道為純化的CPEB4，2泳道為陰性對(duì)照，可見(jiàn)I泳道有一明顯蛋白條帶，而2泳道未見(jiàn)相應(yīng)條帶。
[0032]6、免疫刺激復(fù)合物(ISC0M-DNA)的制備
每毫升ISC0M-DNA復(fù)合物中含有0.1mg膽固醇、0.1mg卵磷脂、Img QuilA和0.5mg質(zhì)粒pStar-CPEB4 /BAFF反復(fù)混勻并充分乳化使溶液完全清晰，混合物經(jīng)透析后形成微絮狀物即ISC0M-DNA復(fù)合物，并進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和物理性狀檢驗(yàn)。
[0033]7、ISC0M-DNA 的免疫
(I)體外誘導(dǎo)特異性的CTL
采用聚蔗糖-泛影葡氨分層液密度梯度離心法從HLA-A*0201陽(yáng)性健康者的外周血濃縮白細(xì)胞中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。將PBMC用RPMI 1640培養(yǎng)基在溫度37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下孵育2小時(shí)，分離非貼壁細(xì)胞[主要為淋巴細(xì)胞(PBL)]和貼壁細(xì)胞[樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)]。將DC按細(xì)胞密度為2X 106/3ml加入含有濃度為800IU/ml的集落刺激因子(GM-CSF)、濃度為1000 IU/ml的白介素4 (IL-4)以及濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基，在溫度為37°C、C02氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，每2天半量換液并補(bǔ)充GM-CSF和IL-4，第5天加入終濃度為10ng/ml的腫瘤壞死因子(TNF-α )，第7天獲得成熟DC。向成熟DC中加入終濃度為IOM的ISCOM，在溫度37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下孵育2小時(shí)，30Gy放射性處理，獲得負(fù)載肽的DC。按PBL與DC的數(shù)量比為3:1飛:I向PBL中加入負(fù)載肽的DC，再按PBL細(xì)胞密度為1.5 X 106/2ml加入含有濃度為10ng/ml的白介素7 (IL-7)以及濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基，在溫度為37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，第11天加入負(fù)載肽的DC再次刺激培養(yǎng)的PBL，24~48小時(shí)后向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度為10IU/ml的白介素2 (IL-2)并補(bǔ)充IL-7至終濃度為10ng/ml，之后每隔7天按照上述相同方法再次刺激培養(yǎng)的PBL，連續(xù)刺激4次，獲得肽特異性CTL，用含有濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整至適當(dāng)濃度，作為效應(yīng)細(xì)胞。
[0034](2)特異性CTL對(duì)靶細(xì)胞的體外殺傷能力檢測(cè)
將I X IO6個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251轉(zhuǎn)移至離心管中，用含有濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌I次，吸除大部分上清液，剩余約0.1ml培養(yǎng)基于管底，重懸細(xì)胞，加入相應(yīng)量的51Cr溶液，在溫度為37°C、C02氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)2小時(shí)，獲得51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞。在96孔板中，每孔分別按效靶比(E/T)為100: 1、50: I和25: I加入效應(yīng)細(xì)胞與上述51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞，每種效靶比設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)最大釋放孔(用濃度為2mol/L的鹽酸替代效應(yīng)細(xì)胞)和最小釋放孔[用含有濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI1640培養(yǎng)基替代效應(yīng)細(xì)胞]。將96孔板1200r/min離心30秒，溫度37°C孵育4小時(shí)，向最大釋放孔中加入終濃度為2% (w/w)的Tri ton X-100并吹打混勻，孵育10分鐘，再將96孔板1200r/min離心5分鐘，分別吸取各孔上清液至SiCr計(jì)數(shù)管，用計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，計(jì)算不同效靶比時(shí)的殺傷率。
[0035]結(jié)果如圖4所示，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組在各效靶比對(duì)U251細(xì)胞均有特異性殺傷作用，且隨著效靶比增大，特異性殺傷作用逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明ISCOM復(fù)合物能有效激發(fā)CTL的細(xì)胞毒活性，從而特異性殺傷靶細(xì)胞。
[0036](3)特異性CTL分泌IFN- Y的能力檢測(cè)
采用ELISP0T檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū):調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞密度至IX 106/ml，取100 μ I鋪板，加入終濃度為10Μ的肽(按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)肽)，刺激48小時(shí)后去除細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書(shū)依次加入一抗、二抗和顯色劑進(jìn)行反應(yīng)，顯色晾干后讀數(shù)。
[0037]結(jié)果如圖5所示，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組的斑點(diǎn)數(shù)均明顯高于陰性對(duì)照組，說(shuō)明ISCOM復(fù)合物具有良好的免疫原性，能夠有效激發(fā)CTL分泌IFN- Y。
[0038]最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗，其特征在于:該疫苗為ISCOM-DNA復(fù)合物，每毫升中含有0.1mg膽固醇、0.1mg卵磷脂、Img QuilA和0.5mg質(zhì)粒pStar-CPEB4 /BAFF。
2.一種如權(quán)利要求1所述的胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4全長(zhǎng)cDNA的克隆； (2)腫瘤壞死因子BAFF全長(zhǎng)cDNA的克??； (3)重組載體pStar-CPEB4/BAFF的構(gòu)建:將CPEB4全長(zhǎng)cDNA插入pStar載體的IRES上游，再將BAFF全長(zhǎng)cDNA插入pStar載體的IRES下游； (4)pStar-CPEB4/BAFF工程菌的構(gòu)建:將CPEB4原核表達(dá)載體pStar_CPEB4 /BAFF用Sal I酶切使線性化，用電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，獲得高拷貝CPEB4工程菌； (5)CPEB4的誘導(dǎo)表達(dá):用甲醇誘導(dǎo)工程菌表達(dá)CPEB4，并進(jìn)行分離純化，得到高純度的 CPEB4 ； (6)ISC0M-DNA復(fù)合物的制備。
3.如權(quán)利要求2所述的 胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗的制備方法，其特征在于:所述的步驟(1)從膠質(zhì)瘤細(xì)胞提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以該總cDNA為模板，以Fl:5，_aatctgcagatgggggattacgg _3，，R1:5，_tacgaattcgctggaactaa_3，為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性I分鐘、58°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘。
4.如權(quán)利要求2所述的胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗的制備方法，其特征在于:所述的步驟(2)提取人脾臟組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以該總cDNA為模板，以F2:5’-gatcggatccatggatgactccacaga aagg-3’和 R2:5’-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’為上下游引物，PCR擴(kuò)增BAFF全長(zhǎng)cDNA，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5分鐘，然后94°C變性50秒，58 °C退火50秒，72 °C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。
5.如權(quán)利要求2所述的胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗的制備方法，其特征在于:所述的步驟(5)純化的方法為:培養(yǎng)上清液加入質(zhì)量百分濃度為80%的硫酸銨使蛋白質(zhì)沉淀，離心棄上清，蛋白質(zhì)沉淀用濃度為0.02mol/L、pH為8.0的磷酸鹽緩沖液透析脫鹽，再用瓊脂糖凝膠Q-Sepharose柱進(jìn)行分離純化,用濃度為lmol/L的氯化鈉溶液線性梯度洗脫，收集含有CPEB4的洗脫液，適當(dāng)濃縮后用葡聚糖凝膠S印hdex G-25柱脫鹽。
6.如權(quán)利要求2所述的胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗的制備方法，其特征在于:所述的步驟(6) 0.lmg/ml膽固醇、0.lmg/ml卵磷脂、lmg/ml QuilA和0.5mg/ml質(zhì)粒pStar-CPEB4 /BAFF，反復(fù)混勻并充分乳化使溶液完全清晰，混合物經(jīng)透析后形成微絮狀物即ISC0M-DNA復(fù)合物。
7.—種如權(quán)利要求1飛所述的胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗在神經(jīng)膠質(zhì)瘤防治中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/84GK103705920SQ201310593368
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年11月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月23日
【發(fā)明者】袁邦清, 陳羽建, 沈汗超, 林立, 吳賢群 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院四七六醫(yī)院