專利名稱：一種土壤胞外蛋白質(zhì)的提取分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種土壤胞外蛋白質(zhì)的提取分離方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
環(huán)境宏蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來(lái)新出現(xiàn)的一種概念和研究技術(shù)，該技術(shù)可將土壤中復(fù) 雜的生物群體有效地進(jìn)行結(jié)合并分析，為充分及深入揭示土壤生態(tài)系統(tǒng)變化提供了有力的 技術(shù)保障。環(huán)境宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵問(wèn)題在于，土壤中蛋白質(zhì)的提取與分析，其中土壤 胞外蛋白質(zhì)的提取是環(huán)境宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點(diǎn)。土壤胞外蛋白質(zhì)包含著，種植于土壤 中的植物、土壤中的微生物、動(dòng)物等在環(huán)境影響下分泌的蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)在植物、微 生物、動(dòng)物的相互聯(lián)系中起著關(guān)鍵的作用。因此土壤胞外蛋白質(zhì)的提取是環(huán)境宏蛋白質(zhì)組 學(xué)研究的前提，然而由于土壤蛋白質(zhì)提取方法的缺乏，當(dāng)前土壤蛋白質(zhì)組學(xué)研究還未能有 效地開(kāi)展。因此開(kāi)發(fā)一種有效提取土壤胞外蛋白質(zhì)的方法對(duì)于環(huán)境宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究的研 究具有極其重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種有效的土壤胞外蛋白質(zhì)的提取分離方法。本發(fā)明的土壤胞外蛋白質(zhì)的提取分離方法，具體方法如下 (1) 土壤胞外蛋白質(zhì)提取
稱取4-6g 土壤于50mL的離心管中，加入0. 05mol/L, pH8. 0的檸檬酸鈉緩沖液 16-24mL,于漩渦振蕩器中振蕩3_4小時(shí)，期間每隔15分鐘置于冰上冷卻5分鐘，16000rpm 離心30min ；取上清液過(guò)0. 45 μ m的濾膜，取濾液添加pH為8. 0的Tris-飽和酚8_12mL， 置于漩渦振蕩器中振蕩5-20min，靜置25-50min，16000rpm離心30min ；取下層酚相，加入 5倍體積預(yù)冷至4°C的0. lmol/L甲醇-醋酸銨溶液，置于_20°C條件下沉淀、過(guò)夜，然后 16000rpm離心30min，棄上清液，用10_15mL甲醇洗滌沉淀，16000rpm離心30min，去除上清 液，用10-15mL丙酮洗滌沉淀2次，每次洗滌后于16000rpm離心30min，將沉淀于超凈臺(tái)中 吹干，獲得蛋白質(zhì)干粉。(2) 土壤胞外蛋白質(zhì)分離
取1.2mg蛋白質(zhì)干粉，加入300μ 1蛋白質(zhì)裂解液，制成蛋白質(zhì)樣品，進(jìn)行雙向電泳分
1 O雙向電泳的具體步驟選取Mcm IPG膠條，加入蛋白質(zhì)樣品后置于水化盤(pán)上水化 12-24小時(shí)，然后放入IPGphor等電聚焦儀中，等電聚焦儀電泳參數(shù)為500V，1小時(shí)、1000V，6 小時(shí)、8000V，7小時(shí)、3000V，10-30小時(shí)；等電聚焦結(jié)束后，將膠條分別置于平衡緩沖液I和 平衡緩沖液II中，各平衡15分鐘后進(jìn)行SDS-PAGE電泳；SDS-PAGE電泳凝膠底層為10%分 離膠，用0. 8-1%的瓊脂糖溶液封住膠條表面，以15mA恒定電流進(jìn)行電泳，電泳溫度保持在 15-20°C,電泳時(shí)間為7-9小時(shí)；電泳結(jié)束后，卸下膠片，膠片經(jīng)固定、水洗、染色、脫色，最后用掃描儀掃描。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)
1、國(guó)際上首次提出土壤胞外蛋白質(zhì)提取方法。2、提取的土壤胞外蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后條帶清晰。3、提取的土壤胞外蛋白質(zhì)經(jīng)雙向電泳分離后蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰。


圖1為采用本發(fā)明方法提取的土壤胞外蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖，其中1表示水稻土 壤，2表示甘蔗土壤，3表示煙草土壤；
圖2為采用本發(fā)明方法分離的水稻土壤胞外蛋白質(zhì)的雙向電泳圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的土壤胞外蛋白質(zhì)的提取分離方法，具體方法如下 (1) 土壤蛋白質(zhì)提取劑的配置
IOOmL的0. 05mol/L的檸檬酸鈉緩沖液配置方法稱取1. 4705g 2水合檸檬酸鈉采用 雙蒸水溶解并定溶至IOOmL,并用0. lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0 ;100mL的0. Imol/ L的NaOH溶液配制方法稱取0. 4g NaOH，采用雙蒸水溶解并定溶至100mL。IOmL的SDS凝膠緩沖液配置方法首先稱取0. 121g Tris定容到lmL，加入濃HCL 調(diào)PH值到6. 8，其次加入0. 25g SDS，0. 31g 二硫蘇糖醇(DTT)，2mL甘油，0. 02g溴酚藍(lán)加水 定容至10ml。5mL的蛋白質(zhì)裂解液配置方法稱取0.76g硫脲、2. Ig尿素、0. 05g 二硫蘇糖醇、 0. 2g 3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)于IOmL離心管中，加雙蒸水 溶解并定容至5mL。IOOmL的0. lmol/L甲醇-醋酸銨溶液配置方法稱取0. 771g醋酸銨，加入40mL的 甲醇溶解，再用甲醇定溶至100mL。IOmL的平衡緩沖液I配置方法稱取0. 12g的Tris溶于670 μ L的雙蒸水，HCl調(diào) 節(jié)PH值至8. 8，加入7. 21g的尿素，6. 9mL的甘油，0. 4g的SDS，0. Ig 二硫蘇糖醇(DTT)， 加入0. 001 g的溴酚藍(lán)，雙蒸水定容至10mL。IOmL的平衡液緩沖II配置方法稱取0. 12g的Tris溶于670 μ L的雙蒸水，HCl調(diào) 節(jié)pH值至8. 8，加入7. 21g的尿素，6. 9mL的甘油，0. 4g的SDS, 0. 4g碘乙酰銨，加入0. 001 g的溴酚藍(lán)，雙蒸水定容至10mL。IOOOmL的固定液配置方法量取500 mL甲醇、500mL乙酸充分混勻后即可。500mL的染色液配置方法稱取0. 6g的G-250，加入50mL的磷酸，50mL的硫酸銨、 IOOmL的甲醇，蒸餾水定容至500mL。(2) 土壤胞外蛋白質(zhì)提取
稱取4-6g土壤于50 mL的離心管中，加入0. 05mol/L，pH8. 0的檸檬酸鈉緩沖液16-24mL mL,于漩渦振蕩器中振蕩3-4小時(shí)，期間每隔15分鐘置于冰上冷卻5分鐘，16000rpm離心 30min ；取上清液過(guò)0. 45 μ m的濾膜，取濾液添加pH為8. 0的Tris-飽和酚8_12mL，置于漩 渦振蕩器中振蕩5-20min，靜置25_50min，16000rpm離心30min ；取下層酚相，加入5倍體積預(yù)冷至4°C的0. lmol/L甲醇-醋酸銨溶液，置于_20°C條件下沉淀、過(guò)夜，然后16000rpm 離心30min，棄上清液，用10-15mL甲醇洗滌沉淀，16000rpm離心30min，去除上清液，用 10-15mL丙酮洗滌沉淀2次，每次洗滌后于16000rpm離心30min，將沉淀于超凈臺(tái)中吹干，
獲得蛋白質(zhì)干粉。(3) 土壤胞外蛋白質(zhì)分離
取1.2mg蛋白質(zhì)干粉，加入300μ L蛋白質(zhì)裂解液，用于蛋白質(zhì)雙向電泳分離。雙向電 泳具體步驟選取24cm IPG膠條，加入蛋白質(zhì)樣品后置于水化盤(pán)上水化12- 小時(shí)，放入 IPGphor等電聚焦儀中，等電聚焦儀電泳參數(shù)為500V，1小時(shí)、1000V，6小時(shí)、8000V，7小時(shí)、 3000V, 10-30小時(shí)；等電聚焦結(jié)束后，將每根膠條分別置于平衡緩沖液I和平衡緩沖液II 中平衡15分鐘后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE電泳凝膠底層為10%分離膠，用0. 8-1%的 瓊脂糖溶液封住膠條表面，以15mA恒定電流進(jìn)行電泳，電泳溫度保持在15-20°C，電泳時(shí)間 為7-9小時(shí)。電泳結(jié)束后，卸下膠片，先用固定液固定1小時(shí)，水洗3次，每次5分鐘，然后 用300mL的考馬斯亮藍(lán)G-250染色液染色過(guò)夜。染色完成，水洗脫色2天，最后用掃描儀掃 描檢測(cè)蛋白質(zhì)提取與分離效果。為充分公開(kāi)本發(fā)明的一種有效的土壤胞外蛋白質(zhì)提取方法，以下結(jié)合方法驗(yàn)證和 實(shí)施實(shí)例加以說(shuō)明。實(shí)施例1
(1) 土壤蛋白質(zhì)提取步驟
稱取5g水稻土壤于50mL的離心管中加入0. 05mol/L檸檬酸鈉緩沖液20mL。于漩渦振 蕩器中充分振蕩3小時(shí)。振蕩結(jié)束后，將離心管置于預(yù)冷至4°C的離心機(jī)中16000rpm離心 30min。取上清液過(guò)0.45 μ m的濾膜并轉(zhuǎn)移至一新的50mL離心管中，添加IOmL Tris-飽和 酚(PH8.0)，置于漩渦振蕩器中振蕩lOmin，靜置30min。然后將離心管置于預(yù)冷至4°C的離 心機(jī)中16000rpm離心30min，取下層苯酚液體于一新的50mL離心管中，并加入5倍體積預(yù) 冷的0. lmol/L甲醇-醋酸銨溶液，置于_20°C條件下沉淀過(guò)夜。將沉淀后的溶液于預(yù)冷至 4°C的離心機(jī)中16000rpm離心30min。倒掉上清液，用IOmL甲醇洗滌沉淀后4°C的離心機(jī) 中16000rpm離心30min，去除甲醇溶液，IOmL丙酮洗滌沉淀2次，每次洗滌后于4。C的離心 機(jī)中16000rpm離心30min。將沉淀于超凈臺(tái)中吹干。吹干后的沉淀用蛋白裂解液溶解，采 用SDS-PAGE檢測(cè)土壤胞外蛋白質(zhì)提取效果。SDS-PAGE電泳條件凝膠規(guī)格為102X84X2. 4mm,分離膠為10%聚丙烯酰胺凝 膠，用1%瓊脂糖(電泳緩沖液配置)封閉；電泳槽加入電極緩沖液；15mA恒流進(jìn)行電泳，室 溫，待溴酚藍(lán)離底部0. 5cm即可停止電泳，電泳2小時(shí)；電泳槽電極緩沖液配比25mmol/L Tris, 192mmol/L 甘氨酸，0. 1%SDS。如圖1所示，采用本發(fā)明方法提取不同作物土壤胞外蛋白質(zhì)結(jié)果表明，提取土壤 胞外蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后條帶清晰。(2) 土壤蛋白質(zhì)分離步驟
取1.2mg水稻土壤蛋白質(zhì)干粉，加入300μ 1蛋白質(zhì)裂解液，用于蛋白質(zhì)雙向電泳分離。 雙向電泳具體步驟選取Mcm IPG膠條，加入蛋白質(zhì)樣品后置于水化盤(pán)上水化12小時(shí)，放 入IPGphor等電聚焦儀中，等電聚焦儀電泳參數(shù)為500V，1小時(shí)、1000V，3小時(shí)、8000V，6小 時(shí)、3000V，10小時(shí)；等電聚焦結(jié)束后，將每根膠條分別置于平衡緩沖液I和平衡緩沖液II中平衡15分鐘后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE電泳凝膠底層為10%分離膠，用1%的瓊 脂糖溶液封住膠條表面，以15mA恒定電流進(jìn)行電泳，電泳溫度保持在15°C，電泳時(shí)間為9小 時(shí)。電泳結(jié)束后，卸下膠片，先用固定液固定1小時(shí)，水洗3次，每次5分鐘，然后用300mL 的考馬斯亮藍(lán)G-250染色液染色過(guò)夜。染色完成，水洗脫色2天，最后用掃描儀掃描。如圖 2所示，采用本發(fā)明方法提取分離的水稻土壤胞外蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)果表明，提取的土壤胞 外蛋白質(zhì)分離效果良好，土壤蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰，分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)多。實(shí)施例2
(1) 土壤胞外蛋白質(zhì)提取
稱取4g甘蔗土壤于50mL的離心管中，加入0. 05mol/L, pH8. 0的檸檬酸鈉緩沖液16mL， 于漩渦振蕩器中振蕩3小時(shí)，期間每隔15分鐘置于冰上冷卻5分鐘，16000rpm離心30min ； 取上清液過(guò)0. 45 μ m的濾膜，取濾液添加pH為8. 0的Tris-飽和酚8mL，置于漩渦振蕩器 中振蕩5min，靜置25min，16000rpm離心30min ；取下層酚相，加入5倍體積預(yù)冷至4°C的 0. lmol/L甲醇-醋酸銨溶液，置于_20°C條件下沉淀、過(guò)夜，然后16000rpm離心30min，棄 上清液，用IOmL甲醇洗滌沉淀，16000rpm離心30min，去除上清液，用IOmL丙酮洗滌沉淀2 次，每次洗滌后于16000rpm離心30min，將沉淀于超凈臺(tái)中吹干，獲得蛋白質(zhì)干粉。(2) 土壤胞外蛋白質(zhì)分離
取1.2mg蛋白質(zhì)干粉，加入300μ 1蛋白質(zhì)裂解液，制成蛋白質(zhì)樣品，進(jìn)行雙向電泳分
1 O雙向電泳的具體步驟選取Mcm IPG膠條，加入蛋白質(zhì)樣品后置于水化盤(pán)上水化 12小時(shí)，然后放入IPGphor等電聚焦儀中，等電聚焦儀電泳參數(shù)為500V，1小時(shí)、1000V，6小 時(shí)、8000V，7小時(shí)、3000V，10小時(shí)；等電聚焦結(jié)束后，將膠條分別置于平衡緩沖液I和平衡 緩沖液II中，各平衡15分鐘后進(jìn)行SDS-PAGE電泳；SDS-PAGE電泳凝膠底層為10%分離膠， 用0. 8%的瓊脂糖溶液封住膠條表面，以15mA恒定電流進(jìn)行電泳，電泳溫度保持在15-20°C， 電泳時(shí)間為7小時(shí)；電泳結(jié)束后，卸下膠片，膠片經(jīng)固定、水洗、染色、脫色，最后用掃描儀掃 描。如圖2所示，結(jié)果表明，提取的土壤胞外蛋白質(zhì)分離效果良好，土壤蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰，分離 的蛋白質(zhì)點(diǎn)多。實(shí)施例3
(1) 土壤胞外蛋白質(zhì)提取
稱取6g煙草土壤于50mL的離心管中，加入0. 05mol/L, pH8. 0的檸檬酸鈉緩沖液24mL， 于漩渦振蕩器中振蕩4小時(shí)，期間每隔15分鐘置于冰上冷卻5分鐘，16000rpm離心30min ； 取上清液過(guò)0. 45 μ m的濾膜，取濾液添加pH為8. 0的Tris-飽和酚12mL，置于漩渦振蕩器 中振蕩5-20min，靜置50min，16000rpm離心30min ；取下層酚相，加入5倍體積預(yù)冷至4°C 的0. lmol/L甲醇-醋酸銨溶液，置于_20°C條件下沉淀、過(guò)夜，然后16000rpm離心30min， 棄上清液，用15mL甲醇洗滌沉淀，16000rpm離心30min，去除上清液，用15mL丙酮洗滌沉淀 2次，每次洗滌后于16000rpm離心30min，將沉淀于超凈臺(tái)中吹干，獲得蛋白質(zhì)干粉。(2) 土壤胞外蛋白質(zhì)分離
取1.2mg蛋白質(zhì)干粉，加入300μ 1蛋白質(zhì)裂解液，制成蛋白質(zhì)樣品，進(jìn)行雙向電泳分
1 O雙向電泳的具體步驟選取Mcm IPG膠條，加入蛋白質(zhì)樣品后置于水化盤(pán)上水化24小時(shí)，然后放入IPGphor等電聚焦儀中，等電聚焦儀電泳參數(shù)為500V，1小時(shí)、1000V，6小 時(shí)、8000V，7小時(shí)、3000V，O小時(shí)；等電聚焦結(jié)束后，將膠條分別置于平衡緩沖液I和平衡 緩沖液II中，各平衡15分鐘后進(jìn)行SDS-PAGE電泳；SDS-PAGE電泳凝膠底層為10%分離膠， 用1%的瓊脂糖溶液封住膠條表面，以15mA恒定電流進(jìn)行電泳，電泳溫度保持在15-20°C， 電泳時(shí)間為9小時(shí)；電泳結(jié)束后，卸下膠片，膠片經(jīng)固定、水洗、染色、脫色，最后用掃描儀掃 描。如圖2所示，結(jié)果表明，提取的土壤胞外蛋白質(zhì)分離效果良好，土壤蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰，分離 的蛋白質(zhì)點(diǎn)多。
權(quán)利要求
1.一種土壤胞外蛋白質(zhì)的提取分離方法，其特征在于所述方法的具體步驟如下(1)土壤胞外蛋白質(zhì)提取稱取4-6g 土壤于50mL的離心管中，加入0. 05mol/L, pH8. 0的檸檬酸鈉緩沖液 16-24mL,于漩渦振蕩器中振蕩3_4小時(shí)，期間每隔15分鐘置于冰上冷卻5分鐘，16000rpm 離心30min ；取上清液過(guò)0. 45 μ m的濾膜，取濾液添加pH為8. 0的Tris-飽和酚8_12mL， 置于漩渦振蕩器中振蕩5-20min，靜置25-50min，16000rpm離心30min ；取下層酚相，加入 5倍體積預(yù)冷至4°C的0. lmol/L甲醇-醋酸銨溶液，置于_20°C條件下沉淀、過(guò)夜，然后 16000rpm離心30min ；棄上清液，用10_15mL甲醇洗滌沉淀，16000rpm離心30min，去除上清 液，用10-15mL丙酮洗滌沉淀2次，每次洗滌后于16000rpm離心30min ；將沉淀于超凈臺(tái)中 吹干，獲得蛋白質(zhì)干粉；(2)土壤胞外蛋白質(zhì)分離取1.2mg蛋白質(zhì)干粉，加入300μ 1蛋白質(zhì)裂解液，制成蛋白質(zhì)樣品，進(jìn)行雙向電泳分1 O
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤胞外蛋白質(zhì)的提取分離方法，其特征在于步驟(2) 所述雙向電泳的具體步驟為選取Mcm IPG膠條，加入蛋白質(zhì)樣品后置于水化盤(pán)上水化12-24小時(shí)，然后放入 IPGphor等電聚焦儀中，等電聚焦儀電泳參數(shù)為500V，1小時(shí)、1000V，6小時(shí)、8000V，7小時(shí)、 3000V, 10-30小時(shí)；等電聚焦結(jié)束后，將膠條分別置于平衡緩沖液I和平衡緩沖液II中，各 平衡15分鐘后進(jìn)行SDS-PAGE電泳；SDS-PAGE電泳凝膠底層為10%分離膠，用0. 8-1%的瓊 脂糖溶液封住膠條表面，以15mA恒定電流進(jìn)行電泳，電泳溫度保持在15-20°C，電泳時(shí)間為 7-9小時(shí)；電泳結(jié)束后，卸下膠片，膠片經(jīng)固定、水洗、染色、脫色，最后用掃描儀掃描。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種土壤胞外的蛋白質(zhì)提取分離方法，該方法采用土壤的檸檬酸鈉提取液，經(jīng)Tris-飽和酚、甲醇-醋酸銨等進(jìn)一步進(jìn)行胞外蛋白質(zhì)的提取，然后通過(guò)雙向電泳分離。提取的土壤胞外蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后條帶、蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰，是國(guó)際上首次提出的土壤胞外蛋白質(zhì)的提取分離方法。
文檔編號(hào)C07K1/36GK102079776SQ20101058515
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者何海斌, 俞振明, 吳林坤, 張志興, 林文雄, 王海斌 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)