專利名稱：基于分析npc1l1蛋白亞細胞定位變化篩選降膽固醇新藥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細胞生物學以及藥物學領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及基于分析NPC1L1 蛋白亞細胞定位變化篩選降膽固醇新藥的方法；同時，本發(fā)明鑒定了NPC1L1蛋白中 結(jié)合膽固醇的結(jié)構(gòu)域，也可以篩選結(jié)合該結(jié)構(gòu)域的化合物從而得到抑制膽固醇吸收的 物質(zhì)。
背景技術(shù)：
膽固醇是生物膜的重要組成成分，也是合成甾醇類激素和膽汁酸的前體。膽固醇 過多的攝入會導致很多疾病，其中最常見和最嚴重的是動脈粥樣硬化和冠心病。哺乳 動物獲得膽固醇的途徑主要有兩條從頭合成和從食物中吸收。膽固醇生物合成的主 要分子機制已經(jīng)被闡明，但是對于膽固醇的吸收，細胞分子水平的研究并不多。
Nieman-Pick CI Like 1 (NPCILI)最近被報道在膽固醇吸收過程中起著重要的作 用(Altmann, S.W.等(2004)， Niemann-Pick CI Like 1 protein is critical for intestinal cholesterol absorption. Science 303， 1201-1204)。 NPC1L1在人和小鼠的小腸中都有很 高的表達，在人中，肝臟也有很高表達。NPCILI敲除的小鼠從食物中吸收膽固醇的 能力大大下降。除了介導小腸膽固醇吸收外，NPC1L1還介導肝臟膽固醇重吸收，肝 臟過表達NPCILI的轉(zhuǎn)基因小鼠比正常小鼠的膽汁和糞便中的膽固醇下降。
人NPC1L1蛋白含有1332個氨基酸，構(gòu)成13個跨膜區(qū)段(Wang, J.等(2009), Membrane topology of human NPCILI, a key protein in enterohepatic cholesterol absorption. J Lipid Res, Epub ahead of print)。 NPCILI的第3-7區(qū)段含有甾醇感受結(jié)構(gòu) 域，在受甾醇調(diào)節(jié)的NPC1、 HMGCR、禾口SCAP蛋白中也含有此結(jié)構(gòu)域。關(guān)于NPC1L1 蛋白的亞細胞定位一直存在爭議。
Ezetimibe(市場名Zetia)可以減少膽固醇吸收，并被用來臨床治療高膽固醇血癥。 但是Ezetimibe抑制NPClLl蛋白介導膽固醇的吸收的藥物機理一直不清楚。
因此，盡管本領(lǐng)域已知NPC1L1蛋白與膽固醇的吸收相關(guān)，然而并不清楚NPC1L1 蛋白介導的膽固醇吸收的機制，相關(guān)藥物的研究和開發(fā)受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種篩選降膽固醇物質(zhì)的方法。 本發(fā)明的目的在于提供通過所述篩選方法獲得的降膽固醇的物質(zhì)。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種篩選潛在的降膽固醇物質(zhì)的方法，所述方法包括:
(1)用膽固醇處理表達NPC1L1蛋白的細胞，并確定細胞囊泡(一般又稱為膜泡)內(nèi)
5吞NPC1L1蛋白的程度；
(2) 在候選物質(zhì)存在下，如(1)所述處理表達NPC1L1蛋白的細胞，再次確定囊泡內(nèi) 吞NPC1L1蛋白的程度；和
(3) 比較(1)和(2)中囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的差異；
其中，如果(2)中囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度在統(tǒng)計學上低于(優(yōu)選顯著低于，如 低20%，較佳地低40%;更佳地低60%或更低)(1)中囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度， 則所述候選物質(zhì)是潛在的降膽固醇物質(zhì)。
在一個優(yōu)選例中，所述的囊泡內(nèi)吞主要是籠型蛋白(clathrin)介導的內(nèi)吞。
在另一優(yōu)選例中，所述的NPClLl蛋白含有GenBank登錄號FJ481111中第18-260位 的氨基酸序列，該區(qū)域是膽固醇的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
在另一優(yōu)選例中，(1)或(2)中，所述的表達NPC1L1蛋白的細胞在膽固醇處理前預 先經(jīng)過降膽固醇處理。
在另一優(yōu)選例中，所述的降低膽固醇處理是指使細胞內(nèi)膽固醇的量低于正常水 平，從而NPC1L1蛋白被轉(zhuǎn)運到細胞膜區(qū)域。
在另一優(yōu)選例中，(1)或(2)中，還包括確定細胞中籠型蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié) 合程度；并且，(3)中，還包括比較(1)和(2)中籠形蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度；
其中，如果(2)中籠型蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度在統(tǒng)計學上低于(優(yōu)選顯著低 于，如低20%，較佳地低40%;更佳地低60%或更低)(1)中籠型蛋白與NPC1L1蛋白 的結(jié)合程度，則所述候選物質(zhì)是潛在的降膽固醇物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，(1)或(2)中，還包括確定細胞中AP2復合體相關(guān)蛋白與NPC1L1 蛋白的結(jié)合程度；并且，(3)中，還包括比較(1)和(2)中AP2復合體相關(guān)蛋白與NPC1L1 蛋白的結(jié)合程度；
其中，如果(2)中AP2復合體相關(guān)蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度在統(tǒng)計學上低于 (優(yōu)選顯著低于，如低20%，較佳地低40%;更佳地低60%或更低)(1)中AP2復合體相 關(guān)蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度，則所述候選物質(zhì)是潛在的降膽固醇物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，所述的AP2復合體相關(guān)蛋白選自H2、 02、 e2或a亞基。更 佳的，所述的AP2復合體相關(guān)蛋白是tx2亞基。
在另一優(yōu)選例中，所述的細胞是重組細胞，其基因組中含有表達盒，所述表達盒 含有可操作性連接的NPC1L1蛋白的編碼基因和報告基因。
在另一優(yōu)選例中，所述的報告基因是GFP或EGFP。
在另一優(yōu)選例中，所述的細胞是真核細胞。
在另一優(yōu)選例中，通過計量內(nèi)吞小泡的數(shù)量、內(nèi)吞的NPClLl蛋白和/或膽固醇的 量確定細胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度；或者，通過計量細胞膜上NPC1L1蛋白和/ 或膽固醇的量(如發(fā)生了內(nèi)吞，則細胞膜上NPClLl蛋白和/或膽固醇的量減少)確定細 胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度。
6在另一優(yōu)選例中，通過熒光標記或染色的方法來進行定位或定量。 在另一優(yōu)選例中，所述的NPC1L1蛋白是一種融合蛋白，其包含NPC1L1蛋白與標 簽蛋白，且所述的標簽蛋白位于NPC1L1蛋白的胞外區(qū)域(或囊泡內(nèi)側(cè))。
在另一優(yōu)選例中，所述的標簽蛋白位于NPC1L1蛋白的第8跨膜區(qū)與第9跨膜區(qū)之間。
在另一優(yōu)選例中，NPC1L1蛋白與標簽蛋白通過肽鍵相連接。
在另一優(yōu)選例中，所述的NPC1L1蛋白是全長的人NPC1L1蛋白，且所述的標簽蛋 白位于NPClLl蛋白上第986位氨基酸(Ser)與第987位氨基酸(Leu)之間。
在另一優(yōu)選例中，所述的NPClLl蛋白的氨基酸序列如GenBank登錄號FJ481111所示。
在另一優(yōu)選例中，所述的標簽蛋白選自(但不限于) 一個或數(shù)個Myc標簽蛋白(優(yōu) 選3XMyc)， 一個或數(shù)個Flag標簽蛋白， 一個或數(shù)個His6標簽蛋白， 一個或數(shù)個T7標 簽蛋白， 一個或數(shù)個V5標簽蛋白， 一個或數(shù)個HA標簽蛋白， 一個或數(shù)個GST標簽蛋 白，或幾個標簽蛋白的混合使用。
在另一優(yōu)選例中，所述的標簽蛋白選自(但不限于)熒光素酶，e-gal酶。
在另一優(yōu)選例中，通過鑒定細胞標簽蛋白的定位來確定NPC1L1蛋白的定位，進 而確定細胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度。
在另一優(yōu)選例中，當標簽蛋白大部分定位在細胞膜上，則NPC1L1蛋白也大量定 位細胞膜上，細胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度低；當標簽蛋白少部分定位在細胞膜 上，則NPC1L1蛋白大量定位在細胞內(nèi)，細胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度高。
在另一優(yōu)選例中，所述通過鑒定細胞標簽蛋白的定位來確定NPC1L1蛋白的定位， 進而確定細胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度的方法包括
(1) 在不通透細胞的情況下，標記(優(yōu)選利用免疫組化的方法)位于細胞膜上的標簽 蛋白；
(2) 在通透細胞的情況下，標記(優(yōu)選利用免疫組化的方法)全細胞的標簽蛋白；
(3) 分析或計算(1)中細胞膜上標簽蛋白占(2)中全細胞標簽蛋白的百分比；如細胞 膜上的標簽蛋白所占百分比在統(tǒng)計學上明顯增加(優(yōu)選明顯增加20%以上，更優(yōu)選明顯 增加40%以上，進一步優(yōu)選明顯增加60%以上)，則NPC1L1蛋白定位在細胞膜上的比 例明顯增加，進而表明細胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度明顯降低。
在另一優(yōu)選例中，細胞膜上標簽蛋白或全細胞標簽蛋白的觀察或分析定量可利用 熒光顯微鏡或利用流式細胞儀。
在另一優(yōu)選例中，采用去垢劑處理不通透的細胞，形成通透的細胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗 和/或動物試驗，選擇和確定對于降膽固醇有用的物質(zhì)。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種篩選潛在的降膽固醇物質(zhì)的方法，所述方法包括-(a) 用候選物質(zhì)處理表達介導NPC1L1內(nèi)吞的蛋白的細胞；
(b) 檢測所述細胞中所述蛋白的表達或活性；
其中，若所述候選物質(zhì)可降低所述蛋白的表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是潛在 的降膽固醇物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)包括在測試組中，將候選物質(zhì)加入到表達介導NPC1U 內(nèi)吞的蛋白的細胞中；和/或
步驟(b)包括檢測測試組的細胞中所述蛋白的表達或活性，并與對照組比較，其 中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達所述蛋白的細胞；
如果測試組中所述蛋白的表達或活性在統(tǒng)計學上低于(優(yōu)選顯著低于，如低20%， 較佳地低40%;更佳地低60%或更低)對照組，就表明該候選物是潛在的降膽固醇物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，所述的介導NPC1L1內(nèi)吞的蛋白是籠形蛋白和/或AP2復合體。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種抑制NPC1L1蛋白內(nèi)吞的物質(zhì)在制備降膽固醇藥 物中的用途。
在另一優(yōu)選例中，所述抑制NPC1L1蛋白內(nèi)吞的物質(zhì)是抑制籠形蛋白禾口/或AP2復 合體與NPC1L1蛋白相互作用的物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，所述物質(zhì)是e,e-二甲基丙烯酰阿卡寧或25-羥膽固醇。
另一方面，還提供一種降低細胞內(nèi)膽固醇的方法，所述方法包括抑制(或干擾) 籠形蛋白和/或AP2復合體與NPClLl蛋白相互作用。
另一方面，還提供一種篩選潛在的降膽固醇物質(zhì)的方法，所述方法包括
(1) 用膽固醇與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域接觸，檢測膽固醇與NPC1L1蛋白的 NH2端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合情況；
(2) 用膽固醇與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域接觸，并加入候選物質(zhì)，檢測膽固醇 與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合情況；
其中，如(2)中膽固醇與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合強度顯著弱于(優(yōu)選結(jié) 合強度明顯弱20%以上，更優(yōu)選明顯弱40%以上，進一步優(yōu)選明顯弱60%以上)或結(jié) 合量顯著低于(優(yōu)選結(jié)合量明顯低20%以上，更優(yōu)選明顯低40%以上，進一步優(yōu)選明顯 低60。/。以上)(l)中膽固醇與NPClLl蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合強度或結(jié)合量，則所述 候選物質(zhì)是潛在的降膽固醇物質(zhì)。也即，如所述候選物質(zhì)能夠競爭膽固醇與NPC1L1 蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，則所述候選物質(zhì)是潛在的降膽固醇物質(zhì)。
另一方面，還提供一種篩選潛在的降膽固醇物質(zhì)的方法，所述方法包括將候選 物質(zhì)與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域接觸，檢測候選物質(zhì)與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu) 域的結(jié)合情況；如候選物質(zhì)與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域發(fā)生特異結(jié)合，則所述候 選物質(zhì)是潛在的降膽固醇物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，所述的NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域含有GenBank登錄號 FJ48111 l所示序列中第18-260位氨基酸。另一方面，提供采用如所述的篩選方法篩選獲得的物質(zhì)。 在另一優(yōu)選例中，所述的物質(zhì)是25-羥膽固醇或27-羥膽固醇。
另一方面，還提供一種融合蛋白，所述蛋白包含NPC1L1蛋白與標簽蛋白，且所
述的標簽蛋白位于NPC1L1蛋白的胞外區(qū)域(或囊泡內(nèi)側(cè))。
在另一優(yōu)選例中，標簽蛋白位于NPC1L1蛋白的第8跨膜區(qū)與第9跨膜區(qū)之間。 另一方面，還提供一種核酸序列，所述的核酸序列編碼所述的融合蛋白。 另一方面，還提供一種重組載體，所述的重組載體含有所述的核酸序列。 在另一優(yōu)選例中，所述的載體以pEGFP-Nl載體為基礎(chǔ)，其中含有所述的核酸序列。 另一方面，還提供一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有所述的重組載體，或其基
因組中整合有所述的核酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞是大鼠肝癌細胞。
另一方面，還提供所述的宿主細胞的用途，用于分析NPC1L1蛋白的細胞亞定位。


圖l.細胞內(nèi)的膽固醇水平調(diào)節(jié)NPC1L1蛋白在細胞質(zhì)膜和內(nèi)吞循環(huán)體之間的循環(huán) 轉(zhuǎn)運。
A. 處理細胞的流程示意圖在-60分鐘，用環(huán)化糊精(CDX)減少細胞內(nèi)的膽固醇； 然后再在O分鐘遞給細胞CDX包被的膽固醇。
B. CRL-1601/NPC1L1 -EGFP細胞做A中所示的處理，在不同的時間點固定，并用 共聚焦顯微鏡觀察熒光定位。Bar, 10pm。
C. 對B中的細胞熒光定量質(zhì)膜定位的NPC1L1的量。誤差線標準差。
D和E. CRL-1601/NPC1L1 -￡0 (0)和0)2細胞(E)做A中所示處理，在不同的時間 點標記細胞質(zhì)膜蛋白，SDS-PAGE分析。TnR，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。 圖2.NPC1L1蛋白是細胞吸收膽固醇所必需。
A. CRL-1601和CRL-1601/NPC1L1 -EGFP細胞做圖1A中所示的處理，在不同的時 間點固定，F(xiàn)ilipin染色，并用雙光子共聚焦觀察熒光定位。Bar, 10 nm。
B. 對A中的細胞熒光定量質(zhì)膜定位的NPC1L1的量。誤差線標準差。
C. 在L02細胞中用反轉(zhuǎn)錄病毒介導的RNAi降低NPClLl的表達。圖示為western blot結(jié)果。
D. CDX處理L02細胞60分鐘，用15 pg/ml CDX包被的膽固醇處理細胞。在不同的 時間點固定，F(xiàn)ilipin染色，并用雙光子共聚焦顯微鏡比較NPC1L1降低的細胞和對照 細胞的熒光強度。Bar, 10Mm。 DIC表示明場視野。
E. 對D中的細胞熒光定量質(zhì)膜定位的NPC1L1的量。誤差線標準差。
圖3.過量表達NPC1L1蛋白增加細胞對膽固醇吸收。 A. CDX處理細胞后，遞給CRL1601細胞和CRL1601/NPC1L1 -EGFP細胞不同濃度的膽固醇l小時后，封片，F(xiàn)ilipin染色，雙光子共聚焦顯微鏡觀察；Bar, 10 )im。
B. A中細胞熒光定量；誤差線標準差。
C. HEK293T細胞轉(zhuǎn)染NPC1L1 -EGFP質(zhì)粒。24小時后用A中方法處理細胞，固定， 封片，染色。Bar， 10pm。
圖4. AP2復合體中p2亞基作為NPClLl的結(jié)合蛋白的鑒定。
A. 用偶聯(lián)抗EGFP抗體的瓊脂糖做免疫共沉淀，得到的蛋白用SDS-PAGE分離， 銀染；
B. 免疫共沉淀(CoIP)驗證NPClLl與n2的結(jié)合。
圖5.缺失籠形蛋白/AP2降低NPClLl蛋白的內(nèi)吞和膽固醇攝取。
A. Western Blot驗證RNAi效率。
B. CRL-1601/NPC1L1 -EGFP細胞做圖6A中所示的處理，在不同的時間點固定、 染色并用雙光子共聚焦觀察熒光定位。Bar， lO)nm。
C. 對B中的細胞熒光定量胞內(nèi)定位的NPC1L1和膽固醇的量。誤差線標準差。 圖6.siRNA介導的籠型蛋白或者)a2亞基的基因干擾抑制NPClLl蛋白的內(nèi)吞和膽
固醇的細胞吸收，且呈膽固醇濃度依賴性。
A. 處理細胞的示意圖。
B. 檢測RNAiCHC和p2對轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞影響，顯示RNAi效率。
C. 生物素標記細胞膜蛋白實驗驗證籠型蛋白對NPC1L1蛋白內(nèi)吞的必要性。
D. 籠型蛋白和p2亞基對NPClLl蛋白介導膽固醇吸收必須，且呈膽固醇濃度依賴性。
E. D中細胞的熒光定量結(jié)果；誤差線標準差。
圖7. RNAi沉默caveolin-l不影響NPClLl蛋白內(nèi)吞和膽固醇吸收。
A. Western Blot顯示RNAi效率。
B. 對細胞做圖6A中處理；Bar， 10 |am。
C. B中細胞的熒光定量結(jié)果；誤差線標準差。
圖8. Ezetimibe通過影響NPC 1L1蛋白進入籠形蛋白包被的小泡抑制NPC 1 Ll蛋白 和膽固醇內(nèi)吞。
A. 處理細胞的流程示意圖細胞在含有環(huán)化糊精的培養(yǎng)基中處理60min。然后在 培養(yǎng)基A(含有5。/。LPDS， 10 compactin， 50 pM甲羥戊酸)加上Ezetimibe。 60min 后，CDX包被膽固醇的膽固醇直接加入。在不同的時間點固定，染色。
B. CRL-1601/NPC1L1 -EGFP細胞做A中所示的處理，在加入膽固醇60min后固定、 染色，并用雙光子共聚焦顯微鏡觀察熒光定位。Bar， 10pm。
C. 對B中的細胞熒光定量胞內(nèi)定位的NPC1L1蛋白和膽固醇的量。誤差線標準差。
D和F. CRL-1601/NPC1L1 -EGFP (D)或L02細胞(F)做A中所示的處理.在不同
10的時間點進行生物素標記細胞質(zhì)膜試驗。
E. CRL-1601/NPC1L1 -EGFP細胞做A中所示的處理，在不同的時間點進行免疫共 沉淀試驗。
G. L02細胞在含有環(huán)化糊精和Ezetimibe的培養(yǎng)基中處理60min。 CDX包被膽固醇 的膽固醇直接加入60min。固定，染色。用雙光子共聚焦觀察熒光定位。Bar， 10 pm。
H. 對G中的細胞熒光定量胞內(nèi)定位的NPC1L1蛋白和膽固醇的量。誤差線標準差。
圖9.NPC1L1-NH2端18-260氨基酸是膽固醇結(jié)合NPC1L1蛋白所必需，對膽固醇吸 收至關(guān)重要。
A. 穩(wěn)定表達人NPC1L1蛋白的細胞用偶聯(lián)抗EGFP抗體的瓊脂糖做免疫沉淀，并在 得到的蛋白中加入10-160nM[SH]膽固醇體外結(jié)合，4°C， 4小時后測液閃檢測NPC1L1 與膽固醇的結(jié)合。非特異性條帶為不表達NPC1L1蛋白的細胞重復操作。誤差線標準差。
B. 穩(wěn)定表達人NPC1L1蛋白或NH2-端第18-260氨基酸缺失的NPC1L1蛋白的細胞 用偶聯(lián)抗EGFP抗體的瓊脂糖做免疫沉淀，并在得到的蛋白中加入80 nM卩H]膽固醇體 外結(jié)合，4°C， 4小時后測液閃檢測該蛋白與膽固醇的結(jié)合。非特異性條帶為加入10pM 未標記膽固醇競爭的重復操作。NPC1L1(A 18-260aa): NH2-端第18-260氨基酸缺失的 NPC1L1蛋白。
C. 細胞瞬時表達人NPC1L1蛋白或NH2-端缺失第18-260氨基酸的NPC1L1蛋白，24 小時后用CDX處理細胞，并再次遞給細胞膽固醇，30分鐘，60分鐘分別封片，F(xiàn)ilipin 染色，雙光子共聚焦顯微鏡觀察；對細胞內(nèi)膽固醇的含量和細胞內(nèi)定位的NPC1L1蛋 白進行熒光定量。誤差線標準差。
圖IO.化合物25-羥膽固醇抑制NPClLl蛋白和膽固醇結(jié)合，減少膽固醇的吸收。
A. 膽固醇，25-羥膽固醇的結(jié)構(gòu)示意圖。
B. 穩(wěn)定表達人NPC1L1蛋白的細胞用偶聯(lián)抗EGFP抗體的瓊脂糖做免疫沉淀，并在 得到的蛋白中加入80nM [3司膽固醇，以及250 nM未標記的25-羥膽固醇進行體外結(jié)合 -競爭，4°C， 4小時后測液閃檢測NPClLl與fH]膽固醇的結(jié)合。非特異性條帶為不表 達NPC1L1蛋白的細胞重復操作。誤差線標準差。
C. 穩(wěn)定表達人NPC1L1蛋白的細胞系用25-羥膽固醇預處理1小時，之后CDX處理 細胞，并再次遞給細胞膽固醇，l小時后封片，F(xiàn)ilipin染色，雙光子共聚焦顯微鏡觀 察；對細胞內(nèi)膽固醇的含量和細胞內(nèi)定位的NPC1L1蛋白進行熒光定量。誤差線標 準差。
圖ll.在NPClLl氨基酸序列的986至987位插入3XMyc不影響NPClLl的正常功能。
A.NPC1L1的拓撲結(jié)構(gòu)模式圖以及S986位氨基酸殘基的位點。
11B. 對表達NPClLl/S986-3XMyc-L987蛋白的細胞去除膽固醇后，再給細胞遞送膽 固醇并結(jié)合Ezetimibe處理，F(xiàn)ilipin染色，觀察細胞對膽固醇的吸收情況。
C. 對B中細胞內(nèi)的NPClLl/S986-3XMyc-L987蛋白和膽固醇的定量。誤差線標準差。
圖12.用免疫組化或流式細胞快速簡便地分析NPC1L1蛋白的亞細胞定位。
A. 處理細胞的流程示意圖在-60分鐘，用環(huán)化糊精(CDX)減少細胞內(nèi)的膽固醇； 然后再在O分鐘遞給細胞CDX包被的膽固醇。
B. 瞬時轉(zhuǎn)染NPClLl/S986-3XMyc-L987，在通透和不通透細胞兩種條件下，用 Myc抗體對細胞進行免疫染色后熒光顯微鏡觀察。
C， D.用流式細胞儀檢測NPC1L1細胞定位。1.5n/。環(huán)化糊精(CDX)處理lhr后，在4 'C條件下，用抗Myc的抗體(9E10)溫育30分鐘，然后用偶聯(lián)Alexa555的熒光二抗溫育 30分鐘，流式細胞儀檢測。
圖13.篩選抑制NPC1L1蛋白內(nèi)吞的化合物。
a. e,e-二甲基丙烯酰阿卡寧(c6)的結(jié)構(gòu)式。
B. 用CDX和待篩選藥物(C1-C187)處理CRL1601/NPC1L1 -EGFP細胞，使NPC1L1 蛋白定位于細胞膜。拍照，見圖中的CDX組。去掉CDX，用含有待篩選藥物和膽固醇 的配基處理細胞一個小時。拍照，見圖中chol組。有明顯抑制NPC1L1蛋白內(nèi)吞的化 合物(C6)被選出來。Ez: Ezetimibe。
C. 用CDX和待篩選藥物(C6)處理CRL1601/NPC1L1 -EGFP細胞，使NPC1L1蛋白 定位于細胞膜，固定，見圖中的CDX組。去掉CDX，用含有待篩選藥物和膽固醇的配 基處理細胞，固定，見圖中chol組。將Filipin染色，用雙光子顯微鏡拍照。
D. 熒光定量chol組的細胞內(nèi)的NPClLl和膽固醇。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，發(fā)現(xiàn)NPC1L1蛋白介導膽固醇吸收需要通過囊泡內(nèi)吞 過程，其中籠形蛋白(Clathrin)和AP2復合體被鑒定出來在NPClLl蛋白內(nèi)吞過程中起 到重要的作用，抑制籠形蛋白介導的囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白(即抑制NPC1L1蛋白進入 籠形蛋白包被的囊泡、影響其內(nèi)吞過程)可顯著抑制細胞對膽固醇的吸收。因此，可 基于該機制來篩選對于降低膽固醇有用的藥物。
NPC1L1蛋白是一個多次跨膜蛋白，在膽固醇吸收中發(fā)揮重要的作用。本發(fā)明人 研究發(fā)現(xiàn)膽固醇可以特異的促進NPC1L1蛋白的內(nèi)吞，可以調(diào)節(jié)NPC1L1蛋白在質(zhì)膜和 內(nèi)吞循環(huán)體(Endocytic Recycling Compartment ， ERC)之間的循環(huán)轉(zhuǎn)運，當膽固醇減少 時，NPC1L1蛋白定位在細胞質(zhì)膜，補給細胞膽固醇會使NPC1L1蛋白內(nèi)吞并轉(zhuǎn)運到內(nèi) 吞循環(huán)體。此過程需要籠形蛋白/AP2復合體。阻斷籠形蛋白介導的NPC1L1蛋白的內(nèi)吞會減少膽固醇的吸收，表明NPC1L1蛋白通過囊泡內(nèi)吞運輸來介導膽固醇的運輸。 Ezetimibe抑制NPClLl蛋白進入籠形蛋白包被的囊泡、阻斷其內(nèi)吞過程、進而抑制膽 固醇的吸收?？傊?，本發(fā)明人的研究表明NPC1L1蛋白攜帶膽固醇通過籠形蛋白介導 的囊泡內(nèi)吞進入細胞，從而為篩選新型的膽固醇吸收抑制劑提供了新耙點。
細胞吸收胞外物質(zhì)是通過質(zhì)膜的變形運動將細胞外物質(zhì)轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)的過程(入 胞作用)。其吸收的方式是多種多樣的，根據(jù)入胞機制的不同可將內(nèi)吞作用分為吞噬 作用、胞飲作用、受體介導的內(nèi)吞作用等。例如籠形蛋白，caveolin， flotillin等均可 介導一些物質(zhì)進入到細胞內(nèi)。然而，對于不同的物質(zhì)，入胞的機制可能是不同的，這 與細胞本身的結(jié)構(gòu)、細胞所含的蛋白、所述物質(zhì)本身的特性、以及一些更為復雜的因 素相關(guān)。為了鑒定參與NPC1L1蛋白內(nèi)吞過程的蛋白因子，本發(fā)明人用免疫共沉淀分 離得到了參與NPC1L蛋白內(nèi)吞的復合體，用串聯(lián)質(zhì)譜鑒定和NPC1L1蛋白特異結(jié)合的 蛋白。其中一個蛋白是AP2復合體中的p2亞基。p2亞基在內(nèi)吞過程中可以識別將要發(fā) 生內(nèi)吞的蛋白，與之結(jié)合并募集AP-2的其他亞基。AP-2復合體形成后可以招募籠形 蛋白，隨之發(fā)生內(nèi)吞。為了驗證以上結(jié)果，本發(fā)明人用siRNA介導的RNA干擾來降低 內(nèi)源的籠形蛋白或者AP-2復合體中的p2亞基，發(fā)現(xiàn)兩個基因降低后會影響NPC1L1蛋 白的內(nèi)吞和細胞對膽固醇的吸收。說明NPC1L1蛋白攜帶膽固醇通過籠形蛋白介導的 囊泡內(nèi)吞進入細胞。
篩選降膽固醇的物質(zhì)的方法
在得知了NPC1L1蛋白介導膽固醇吸收需要通過籠形蛋白介導NPC1L1的囊泡內(nèi) 吞這一途徑，抑制NPC1L1蛋白的囊泡內(nèi)吞可顯著抑制細胞對膽固醇的吸收這一機制 后，可以基于該機制篩選降低細胞對膽固醇的吸收的潛在物質(zhì)。從而，可從所述的潛 在物質(zhì)中找到對于預防或治療高膽固醇相關(guān)疾病有用的物質(zhì)。
因此，本發(fā)明提供一種篩選潛在的降膽固醇物質(zhì)的方法，所述的方法包括
(1) 用膽固醇處理表達NPC1L1蛋白的細胞，并確定細胞中的囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋 白的程度；
(2) 在候選物質(zhì)存在下，如(1)所述處理表達NPC1L1蛋白的細胞，再次確定細胞中 囊泡內(nèi)吞的NPC1L1蛋白的程度；和
(3) 比較(1)和(2)中囊泡內(nèi)吞的NPC1L1蛋白的差異；
其中，如果(2)中囊泡內(nèi)吞的NPC1L1蛋白的程度在統(tǒng)計學上低于(1)中，則所述候
選物質(zhì)是潛在的降膽固醇物質(zhì)。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，步驟(1)或(2)中，所述的表達NPC1L1蛋白的細胞預先經(jīng)
過降膽固醇處理。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，對細胞預先進行降膽固醇處理后，可使得 NPC1L1蛋白從胞內(nèi)的內(nèi)吞循環(huán)體(ERC)區(qū)域被轉(zhuǎn)運到細胞膜區(qū)域，為吸收膽固醇作準 備；而膽固醇處理可特異地促進NPC1L1蛋白的內(nèi)吞。因此，藥物篩選時，預先對細
13胞進行降膽固醇處理，之后再給予細胞膽固醇，對于藥物篩選時觀察籠形蛋白介導的 囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白是有利的。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，步驟(1)或(2)中，還包括確定細胞中籠型蛋白和/或AP2 復合體相關(guān)蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度；并且，(3)中，如果(2)中籠型蛋白和/或 AP2復合體相關(guān)蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度在統(tǒng)計學上低于(1)中，則所述候選 物質(zhì)是潛在的降膽固醇物質(zhì)。AP2復合體由oc， (52， p2和cr2等亞基組成，其功能是結(jié) 合蛋白進入籠形蛋白(包括重鏈和輕鏈)包被的小泡中參與內(nèi)吞，因此觀察籠型蛋白和 /或AP2復合體或其相關(guān)蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度也可反映NPC1L1蛋白進入籠 形蛋白包被的囊泡的程度(或量)。
確定存在或不存在候選物質(zhì)的情況下內(nèi)吞或結(jié)合程度的差異可以用計量內(nèi)吞小 泡的數(shù)量、內(nèi)吞的NPClLl蛋白和/或膽固醇的量的增減來實現(xiàn)；或者也可通過計量細 胞膜上NPClLl蛋白和/或膽固醇的量的增減來實現(xiàn)(如發(fā)生了內(nèi)吞，則細胞膜上 NPClLl蛋白和/或膽固醇的量減少)。具體例如可通過熒光標記或染色的方法來進行定 位或定量，此外免疫熒光標記細胞表面蛋白結(jié)合流式細胞儀是有效定量NPC1L1蛋白 細胞膜定位的方法。也可以將細胞種在96孔板中，作相關(guān)藥物處理后用熒光標記細胞 質(zhì)膜定位的NPC1L1蛋白，然后用酶標儀讀數(shù)，如果讀數(shù)高于預設(shè)閾值則此藥物可以 抑制NPC1L1蛋白內(nèi)吞，可能作為潛在的降膽固醇藥物。
如果內(nèi)吞或結(jié)合的差異是顯著的或者超過了某個閾值，則候選試劑可能對于降膽 固醇是有效的。如果差異不顯著，則可以用另一候選物質(zhì)重復所述步驟進行篩選。通 常，本領(lǐng)域技術(shù)人員可同時試驗多種候選物質(zhì)，例如通過使用多孔板或其它高通量方 法。
本發(fā)明提供了一種優(yōu)選的確定NPC1L1蛋白內(nèi)吞情況的方式，將標簽蛋白偶聯(lián)或 連接于NPC1L1蛋白序列上合適的位置(優(yōu)選所述的標簽蛋白位于NPC1L1蛋白的第8 跨膜區(qū)與第9跨膜區(qū)之間)，通過鑒定細胞質(zhì)膜上標簽蛋白的定位來確定NPC1L1蛋白 的定位，進而確定細胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度。當標簽蛋白大部分定位在細胞 膜上，則表明NPC1L1蛋白大量定位細胞質(zhì)膜上，細胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度?。?當標簽蛋白少量的定位在細胞質(zhì)膜上，則表明NPC1L1蛋白大部分定位在細胞內(nèi)，細 胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度大。
將標簽蛋白偶聯(lián)或連接到NPC1L1蛋白序列上的方法是本領(lǐng)域人員已知的。優(yōu)選 地，NPC1L1蛋白與標簽蛋白通過肽鍵相連接。更優(yōu)選地，所述的標簽蛋白位于NPC1L1 蛋白上第986位氨基酸(Ser)與第987位氨基酸(Leu)之間。
標簽蛋白的選擇是本領(lǐng)域人員己知的，當用于本發(fā)明時，長度在4-300個氨基酸的 標簽蛋白是優(yōu)選的。所述的標簽蛋白選自(但不局限于) 一個或數(shù)個Myc標簽蛋白， 一個或數(shù)個Flag標簽蛋白， 一個或數(shù)個His6標簽蛋白， 一個或數(shù)個T7標簽蛋白，一個 或數(shù)個V5標簽蛋白， 一個或數(shù)個HA標簽蛋白， 一個或數(shù)個GST標簽蛋白，以及幾個
14標簽的混合使用。或者，所述的標簽蛋白選自某些酶(但不限于)熒光素酶，P-gal 酶。最優(yōu)選的，所述的標簽蛋白是Myc標簽蛋白(特別是3XMyc)。
當NPC1L1蛋白與標簽蛋白通過肽鍵相連接時，構(gòu)成了一種融合蛋白。編碼所述 融合蛋白的核酸序列，含有所述核酸序列的重組載體和宿主細胞均包括在本發(fā)明中， 它們可以作為分析NPC1L1蛋白在細胞中亞定位的材料。
本發(fā)明中，對于所用的細胞沒有特別的限制，只要在生長或代謝過程中需要吸收 膽固醇(例如其需要膽固醇作為生物膜的組成成分；或需要膽固醇來合成甾醇類激素
或膽汁酸的前體)；并且，其含有NPC1L1蛋白以及籠形蛋白和域AP2復合體。較佳的， 所述的細胞是一種真核細胞。在本發(fā)明的實施方式中，所述的細胞選自CRL-1601 (McArdleRH7777大鼠肝癌細胞)，L02 (人肝細胞系)，HuH7 (人肝癌細胞系)，或HEK 293細胞等。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細胞是重組細胞，其基因組中含有表達盒，所述 表達盒含有可操作性連接的NPC1L1蛋白的編碼基因和報告基因。所述的報告基因 例如是綠色熒光蛋白(GFP)或增效的綠色熒光蛋白(EGFP)，它們的內(nèi)源熒光基團在受 到紫外光或藍光激發(fā)時可高效發(fā)射清晰可見的綠光，從而可直觀且準確地用于 NPC1L1蛋白的定位和定量。
基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，另一種篩選潛在的降膽固醇物質(zhì)的方法包括
(a) 用候選物質(zhì)處理表達籠形蛋白和/或AP2復合體的細胞；
(b) 檢測所述細胞中籠形蛋白和/或AP2復合體的表達或活性；
其中，若所述候選物質(zhì)可降低籠形蛋白和/或AP2復合體的表達或活性，則表明該 候選物質(zhì)是潛在的降膽固醇物質(zhì)。
作為一種優(yōu)選的方式，在進行篩選時，為了更易于觀察到籠形蛋白和/或AP2復合 體表達或活性的改變，還可設(shè)置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的 表達籠形蛋白和/或AP2復合體的細胞。
作為一種優(yōu)選的方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞 實驗和/或動物試驗，選擇和確定對于降膽固醇有用的物質(zhì)。
采用所述篩選方法獲得的潛在的降膽固醇物質(zhì)也包括在本發(fā)明內(nèi)。
降膽固醇的物質(zhì)
基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供了一種抑制或干擾細胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1 蛋白的物質(zhì)，所述的物質(zhì)可用于制備對于降膽固醇有用的藥物。任何可抑制或干擾細 胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為潛在的降膽固醇物質(zhì)。
基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供了一種抑制(或干擾)籠形蛋白和/或AP2復 合體與NPC1L1蛋白相互作用(如結(jié)合)的物質(zhì)，所述的物質(zhì)可用于制備對于降膽固醇有用的藥物。任何可抑制或干擾籠形蛋白和/或AP2復合體與NPClLl蛋白相互作用， 降低籠形蛋白和/或AP2復合體與NPClLl蛋白相互作用的穩(wěn)定性，抑制籠形蛋白和/ 或AP2復合體的表達，或抑制籠形蛋白和/或AP2復合體相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的物質(zhì) 均可用于本發(fā)明，作為潛在的降膽固醇物質(zhì)。
這些初歩篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠 對于預防或治療高膽固醇相關(guān)疾病確定有用的物質(zhì)。
利用本發(fā)明的篩選方法，本發(fā)明人獲得了一種可以抑制NPC1L1蛋白內(nèi)吞的化合
物一一p,e-二甲基丙烯酰阿卡寧。因此，本發(fā)明還提供了e,P-二甲基丙烯酰阿卡
寧在制備降膽固醇藥物中的用途。
此外，本發(fā)明還提供一種降低細胞內(nèi)膽固醇的方法，所述方法包括抑制(或干擾) 籠形蛋白和/或AP2復合體與NPC1L1蛋白相互作用(如內(nèi)吞、結(jié)合或結(jié)合)，從而阻 止膽固醇的吸收。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
(1) 首次發(fā)現(xiàn)，NPC1L1蛋白介導膽固醇吸收需要通過籠形蛋白介導的囊泡內(nèi)吞 NPC1L1蛋白這一途徑，抑制籠形蛋白介導的囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白可顯著抑制細胞對 膽固醇的吸收。
(2) 解決了現(xiàn)有技術(shù)中不知道細胞內(nèi)NPC1L1蛋白通過怎樣的途徑來轉(zhuǎn)運膽固醇、 難以開發(fā)更多更有效藥物的缺陷，從而為篩選降膽固醇藥物提供了新的便捷的途徑。
(3) 發(fā)展了快速簡便分析NPC1L1蛋白亞細胞定位的方法，可以用于高通量化合物 篩選。
(4) 鑒定出NPC1L1蛋白結(jié)合膽固醇的結(jié)構(gòu)域并闡明其功能，可以篩選結(jié)合該結(jié)構(gòu) 域的化合物從而得到抑制膽固醇吸收活性的物質(zhì)。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)
明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說 明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文 中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
試驗材料和方法
材料和質(zhì)粒辣根過氧化物酶結(jié)合的驢抗鼠和抗兔IgG:獲自Jackson免疫研究實驗室。 菲律賓菌素(Filipin)獲自Sigma。
sulfosuccinimidyl 6-(生物素氨基)hexanoate禾口NeutrAvidin-瓊月旨糖獲自Pierce。 甲基-P -環(huán)化糊精(CDX):獲自Cyclodextrin Technologies Development Inc.。
膽固醇純化為高于99%的純度。
去脂血清(LPDS， d> 1.215 g/ml):從新生小牛血清通過超離心獲得。 人源NPC1L1蛋白的編碼區(qū)來自以5，-actggatccatggcggaggccggcctgagg-3，(SEQ ID NO: 1)和5，-actggatccgaactgccgcccattgttggg-3'(SEQ ID NO: 2)作為引物，PCR擴增人肝 cDNA獲得，并通過bamHI單酶切位點克隆接入載體pEGFP-Nl(購自Clontech)。以 5，-actgaattctatgggcacccgcgacgacga-3' (SEQ ID NO: 3) 禾卩
5'-actgaattcttagatgttctgacagcact-3' (SEQ ID NO: 4)作為引物，并通過EcoRI單酶切位點 克隆接入載體pDsRed-monomer-C 1 (購自Clontech)。
細胞培養(yǎng)
CRL-1601 (McArdleRH7777大鼠肝癌細胞)，L02 (人肝細胞系)和HuH7 (人肝癌細 胞系)(均購自ATCC)單細胞層在37。C和5。/。C02中，細胞生長在培養(yǎng)基A (Dulbecco，s 改良的Eagle's培養(yǎng)基，含有100單位/ml青霉素和100iag/ml鏈霉素)再加上10% FBS。 膽固醇-缺陷(depleting)培養(yǎng)基是培養(yǎng)基A加上5。/。去脂血清(LPDS)， 10 pM美伐他汀 (隱pactin)， 50 |aM甲羥戊酸(mevalonate)和1.5%環(huán)化糊精(CDX)。膽固醇-補充 (replenishing)培養(yǎng)基含有培養(yǎng)基A加上5%LPDS， 10pM美伐他汀，50 ^M甲羥戊酸 和不同濃度的CDX包被的膽固醇。CDX包被甾醇的方法見已有報道(Brown,A.J等 (2002》 Cholesterol addition to ER membranes alters conformation of SCAP, the SREBP escort protein that regulates cholesterol metabolism. Mol. Cell 10， 237-245)。
生物素標記細胞質(zhì)膜蛋白
用PBS洗細胞兩遍，加入lmg/ml的生物素(sulfosuccinimidyl 6-(生物素氨基) hexanoate)4。C標記40min。緩沖液A (20 mM Tris-HCl (pH 8.0)和150 mM NaCl)洗2遍 細胞然后將細胞置于緩沖液A 15 min。將細胞裂解于緩沖液B (10 mM Tris-HCl (pH 8.0)， 150 mM NaCl和l。/。 NP-40)。每個樣品加100 pi 50% (v/v) NeutrAvidin-瓊脂糖，4
'C結(jié)合過夜。瓊脂糖珠用緩沖液B洗3遍。然后將瓊脂糖珠于上樣緩沖液37'C中溫浴 30min。離心取上清，走SDS-PAGE。
RNA干擾
雙鏈siRNA由Genepharma合成。靶向大鼠籠形蛋白重鏈(CHC)的siRNA參見 Radulescu, A.E.等(2007)， A role for clathrin in reassembly of the Golgi apparatus. Mol.Biol. Cell 18, 94-105 。革巴向大鼠AP2卞2亞基和Caveolin-1的siRNA序列分別是 5'-aaggcatgaaggaatcacaga-3' (SEQ ID NO: 5)禾卩5'-aagcaagtgtacgacgcgcac-3' (SEQ ID NO: 6)。耙向VSV-G的siRNA參見Song,B丄.(2007), Ufdl is a cofactor of gp78 and plays a key role in cholesterol metabolism by regulating the stability of HMG-CoA reductase. Cell Metab 6, 115-128，用作對照(Control siRNA)。 siRNA轉(zhuǎn)染見Sever,N.等(2003)， Insig-dependent ubiquitination and degradation of mammalian 3-hydroxy-3-methylglutaryl- CoA reductase stimulated by sterols and geranylgeraniol. J. Biol. Chem. 278， 52479-524卯。
Filipin染色
配制新鮮5 mg/ml Filipin儲液。細胞固定后用50 pg/ml Filipin染色30min。 Filipin 信號用Zeiss LSM 510 confocal microsc叩e雙光子觀察，激發(fā)光720nm。
免疫共沉淀
將細胞進行相關(guān)處理后，裂解于IP緩沖液中(PBS， 5mM EGTA， 5mMEDTA， 0.5%Digitonin)。離心取上清和含有GFP抗體的瓊脂糖珠混合，4"C結(jié)合2小時。去上清， 用IP緩沖液洗瓊脂糖珠5遍。用PH2.8的醋酸/甘氨酸洗脫液洗脫。-70"丙酮沉淀過夜， 離心棄上清。將沉淀溶于上樣緩沖液，SDS-PAGE分析。
熒光定量
在每次實驗里的每個實驗組中，任意選擇100個細胞作為定量對象。用Image Pro Plus 5.01軟件熒光定量。細胞總的熒光強度定量的方法是用AOI選擇該細胞，計算熒 光強度后剪去背景。細胞內(nèi)的熒光強度定量的方法是用AOI緊貼著細胞膜下畫一個 圈，定量圈內(nèi)的熒光強度。圖中顯示的是細胞內(nèi)熒光強度比細胞總的熒光強度。
3印膽固醇結(jié)合實驗
將細胞進行相關(guān)處理后，裂解于結(jié)合IP緩沖液中(PBS, l%NP-40， 5mMEGTA, 5mMEDTA)。離心取上清和含有EGFP抗體的瓊脂糖珠混合，4"C結(jié)合2小時，進行免 疫沉淀。用結(jié)合物IP緩沖液洗瓊脂糖珠5遍，分別加入合適濃度的[3司標記的膽固醇， 最終^H]標記的膽固醇濃度為10-400nM，最終體積為100ul，溶解在結(jié)合緩沖液(PBS， 0.001。/。NP-40)中。4'C結(jié)合4小時，用結(jié)合緩沖液洗瓊脂糖珠5遍，用PH2.8的醋酸/甘 氨酸洗脫液洗脫。結(jié)合的[3司標記的膽固醇用閃爍液測液閃計數(shù)。對于競爭實驗，在 溶解好[3司標記的膽固醇的結(jié)合緩沖液中，分別加入終濃度為10wM非同位素標記的 甾醇。其中，[SH]標記的膽固醇購自PerkinElmer公司。
18流式細胞檢測
將細胞進行相關(guān)處理，胰酶消化后，吹散成單細胞。然后與Anti-Myc單克隆抗體 IgG-9E10在冰上孵育30分鐘，PBS洗兩遍。Anti-mouse IgG熒光二抗孵育30分鐘后， PBS洗兩遍。用BD LSRII SORP流式細胞儀分析。其中，Anti-Myc單克隆抗體 IgG-9E10購自Roche公司，Anti-mouse IgG熒光二抗購自invitrogen公司。
實施例l膽固醇調(diào)節(jié)NPC1L1蛋白在內(nèi)吞循環(huán)體(ERC)和細胞質(zhì)膜之間的轉(zhuǎn)運
將含有NPClLl蛋白編碼區(qū)的pEGFP-Nl載體轉(zhuǎn)染大鼠的肝細胞系CRL1601，獲得 穩(wěn)定表達NPC1L1 -EGFP的穩(wěn)定表達株，命名為CRL1601/NPC1L1 -EGFP。
常規(guī)的WesteraBlot實驗結(jié)果表明，NPC1L1 -EGFP在穩(wěn)定表達株中的表達量和一 些人肝細胞系(HepG2， huh7和L02)中內(nèi)源NPClLl蛋白的表達量類似。因此本發(fā)明人 用這個細胞株來研究NPC1L1蛋白的定位。
處理CRL1601/NPC1L1 -EGFP細胞的流程見圖IA，在-60min用膽固醇(Cho1)-缺陷 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，在Omin除去前述培養(yǎng)基，換用膽固醇(Chol)-補充培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞， 直至第120min。也即先用CDX減少細胞內(nèi)的膽固醇，然后再遞給細胞CDX包被的膽 固醇。
在前述處理細胞的過程中，在不同的時間點固定細胞，并用共聚焦觀察熒光定位。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常條件下NPC1L1蛋白主要定位在核旁的區(qū)域。當膽固醇減少時 NPC1L1蛋白被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)膜(圖1B，時間從-60至0min)。當再遞給膽固醇的時候。 NPC1L1蛋白又內(nèi)吞到細胞內(nèi)并最終定位到ERC(圖1B，時間從30至120min)。 NPC1L1 蛋白在細胞質(zhì)膜上的定位見圖1C。
將CRL-1601/NPC1L1-EGFP細胞作圖1A中所示處理，在不同的時間點標記細胞質(zhì) 膜蛋白。從而用生物素標記質(zhì)膜蛋白的方法肯定了以上的現(xiàn)象，見圖1D。
為了排除細胞克隆之間的影響，本發(fā)明人在L02細胞中用生物素標記質(zhì)膜蛋白的 方法檢測了不同條件下內(nèi)源NPC1 Ll蛋白的定位。結(jié)果表明內(nèi)源的NPC1 Ll蛋白也同樣 受到膽固醇水平的調(diào)控，見圖1E。這說明CRL1601/NPC1L1-EGFP穩(wěn)定表達的NPC1L1 蛋白可以模擬內(nèi)源NPC1L1蛋白的特性。
實施例2 NPC1L1蛋白對游離膽固醇的吸收是必須的
細胞吸收低密度脂蛋白(LDL)中的膽固醇是通過LDL受體的內(nèi)吞來實現(xiàn)的。 NPC1L1蛋白的內(nèi)吞提示NPC1L1蛋白可能通過類似的過程介導膽固醇的吸收。為了驗 證這個想法，本發(fā)明人用Filipin來染細胞內(nèi)的膽固醇。CRL-1601和 CRL-1601/NPC1L1-EGFP細胞作圖1A中所示的處理，在不同的時間點固定，F(xiàn)ilipin染 色，并用雙光子共聚焦觀察熒光定位。結(jié)果如圖2A所示，用環(huán)化糊精(CDX)處理細胞 來降低膽固醇后，幾乎看不到Filipin的信號，說明細胞內(nèi)膽固醇的量很低；與此同時NPC1L1蛋白也定位在細胞質(zhì)膜(時間點為0 min)。用遞給膽固醇的培養(yǎng)基處理細胞可 以看到細胞內(nèi)Filipin信號逐漸增強，提示膽固醇增多。并且，CRL1601/NPC1L1-EGFP 細胞對膽固醇的吸收多于對照的CRL-1601細胞(時間點從30-120 min)。隨著NPC1L1 蛋白的內(nèi)吞，膽固醇也發(fā)生內(nèi)吞。含有NPC1U蛋白的囊泡和膽固醇的囊泡有很好的 共定位。熒光定量表明CRL1601/NPC1L1-EGFP細胞攝取的膽固醇是對照細胞的兩倍 (圖2B，時間點從30-120min)。用不同濃度(7.5 w g/ml， 15Pg/ml， 30 w g/ml)的膽固醇 遞給細胞也得到了類似的結(jié)果(圖3A和B)。
為了進一步確認以上現(xiàn)象，本發(fā)明人將含有NPClLl蛋白編碼區(qū)的pEGFP-Nl載體轉(zhuǎn)染 HEK293T細胞，在HEK293T細胞中瞬時表達NPC1L1-EGFP。發(fā)現(xiàn)NPC1L1-EGFP的定位也 受到調(diào)控，而且過表達NPC1L1-EGFP的細胞比對照的細胞吸收更多的膽固醇(圖3C)。
本發(fā)明人接下來用反轉(zhuǎn)錄病毒介導的RNAi來減少L02細胞內(nèi)源的NPClLl蛋白的 表達，由圖2C可知，RNAi可有效減低細胞內(nèi)NPClLl蛋白的表達。發(fā)現(xiàn)當NPC1L1蛋 白表達降低后，膽固醇的攝取也降低了60。/。左右(圖2D-E)。在Huh7細胞中也得到了類 似的效果。
此外，本發(fā)明人也觀察了膽固醇的外排，發(fā)現(xiàn)NPC1L1蛋白并不影響膽固醇外排。
實施例3缺失籠形蛋白/AP2降低NPClLl蛋白的內(nèi)吞和膽固醇攝取
為了尋找參與NPC1L1蛋白內(nèi)吞的因子，本發(fā)明人進行了大量的免疫共沉淀。對 于NPC1L1蛋白特異性的條帶用串聯(lián)質(zhì)譜進行了鑒定。其中一個蛋白是AP2復合體的 p2亞基。AP2復合體由a， (32， 口和a2等組成，已知其功能是結(jié)合蛋白進入籠形蛋白 包被的小泡中參與內(nèi)吞。免疫共沉淀驗證了質(zhì)譜的結(jié)果，說明NPC1L1-EGFP， p2和 CHC在同一個復合體中，見圖4。
對圖4A中各NPClLl蛋白結(jié)合蛋白(Bandl-7)的質(zhì)譜鑒定見表l，其中Band5是AP2 復合體的M2亞基。表l
Band蛋白名稱蛋白序列
1Simiia''o Putative pie-mRNA-splicing factor AT.P-d鄰endenl ANA helicase DHX15 XP—214053RE.VDDLGPEV 3DIKI RFAHIDGOHLTUNVYHAFKQ AHOSFVLVGETGSGKT RTLATDILMGVLKE
2Heat shock 79 kD protein 5 NP ■037215KDAGTIAC，LNV國 KDNHLLGTFDLTGIPPAPRG KE丄田VQPIISK丄..
3Heat shock protein 8 NP—077327KDNNLLCiKF KHWPFMVVNDAGRPKV Kl—DKSQIH。I、幾VGGGTRI
4Riix,phorin I NP一037柳KAVTS&AVLQSRL KDIPAYSQDTFKV KGEDEEONNLEVRE
5AP2 (.—;c'n、;piex subu〔"t NP ...446289KA3ENAIVWKI KLNYSDHDVIKW RSPVT眼RT
6AAP3 adiii-ielate(j pioiein 3 homolog NP_112330KDY[ :EIGTOIORH KEFNKYDTDGSKW KERYSYVCPDLVKE KNIVLSGGSTMFRD
Cleavage and polyadenylation specificity factor 5KKLFLVQLQEKA KLFLVQLQEKA KLPGGELNPGEDEVEGLKRL RGVNQR3MKY
MP 001034093接下來本發(fā)明人用RNAi方法來降低內(nèi)源p2和CHC的表達，Western blot驗證RNAi 干擾效率(圖5A)。 RNAi p2和CHC抑制了轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tranferrin， TnR)的內(nèi)吞，說明RNAi 有效(圖6B)。
將CRL-1601/NPC1L1-EGFP細胞作圖6A中所示的處理，在不同的時間點固定、染 色并用雙光子共聚焦觀察熒光定位。對NPC1L1蛋白內(nèi)吞分析發(fā)現(xiàn)NPC1L1蛋白的內(nèi)吞 也依賴于此途徑，RNAi ^2或者CHC會抑制50。/。 NPC1L1蛋白的內(nèi)吞和膽固醇的攝取 (圖5B)。用生物素標記細胞質(zhì)膜的實驗也證明了以上結(jié)論(圖5C)。生物素標記細胞膜 蛋白實驗還證明，籠型蛋白對NPC1L1蛋白內(nèi)吞是必要的(圖6C)。
進一步試驗還發(fā)現(xiàn)，當遞給細胞不同濃度(7.5y g/ml， 15yg/ml， 30yg/ml)的膽固 醇時，RNAi p2或者CHC也會抑制NPClLl蛋白的內(nèi)吞和膽固醇攝取(圖6D-E)。
此夕卜，RNAi沉默降低內(nèi)源的Caveolin-l的表達不影響NPClLl蛋白和膽固醇的內(nèi)吞 (圖7)。
實施例4 Ezetimibe抑制NPClLl蛋白和膽固醇內(nèi)吞
Ezetimibe是膽固醇吸收的有效的抑制劑，而且已被認可到臨床治療高膽固醇血 癥。并且已知NPClLl蛋白結(jié)合Ezetimibe。但是Ezetimibe怎樣抑制NPClLl蛋白介導
膽固醇的吸收還不明確。
本發(fā)明人用CDX降低細胞內(nèi)的膽固醇使NPC1L1蛋白定位在細胞質(zhì)膜，用不同濃 度的藥物(Ezetimibe或U18666A)處理細胞后再給細胞遞送膽固醇(圖8A)。發(fā)現(xiàn)隨著 Ezetimibe濃度的提高，NPC1L1蛋白的內(nèi)吞受到抑制，膽固醇的攝取也減少(圖8B、
21C)。 U18666A是影響LDL來源的膽固醇運輸?shù)乃幬?，其靶點可能是NPC1，其不影響 NPC1L1蛋白的內(nèi)吞。
用生物素標記質(zhì)膜蛋白的方法也證明了以上的現(xiàn)象(圖8D)， Ezetimibe不影響轉(zhuǎn)鐵 蛋白受體的內(nèi)吞。說明Ezetimibe的作用是特異的。
接下來的免疫共沉淀試驗表明，Ezetimibe膽固醇誘導的NPC1L1蛋白的內(nèi)吞是通 過抑制NPC1L1蛋白進入籠形蛋白包被的小泡來實現(xiàn)的(圖8E)。在L02細胞中內(nèi)源的 NPClLl蛋白的內(nèi)吞和膽固醇的攝取也受到Ezetimibe的抑制(圖8F、 G、 H)。
總之，Ezetimibe通過抑制NPC1L1蛋白進入籠形蛋白包被的小泡來抑制NPC1L1蛋 白的內(nèi)吞和膽固醇的攝取。
實施例5NPClLl蛋白的NH2-結(jié)構(gòu)域(18-260氨基酸)結(jié)合膽固醇，對膽固醇吸收至 關(guān)重要
為了檢測NPC1 Ll蛋白是否結(jié)合膽固醇，發(fā)明人利用免疫沉淀的方法從 CRL1601/NPC1L1-EGFP細胞中純化出其羧基端帶有EGFP的人全長的NPC1L1蛋白 (GenBank登錄號FJ481111)，再加入[3司標記的膽固醇后，檢測NPC1L1蛋白能結(jié)合 [3司膽固醇，如圖9A所示，隨著[3司膽固醇量的增加，NPC1L1蛋白與[SH]膽固醇的結(jié) 合呈飽和曲線，該結(jié)果表明NPC1L1蛋白特異性結(jié)合膽固醇分子。
進而，本發(fā)明人采用常規(guī)方法將NPClLl蛋白NH2端區(qū)域(18-260氨基酸)進行缺 失，發(fā)現(xiàn)缺失氨基酸18-260顯著影響NPC1L1蛋白結(jié)合膽固醇的能力，這表明NPC1L1 蛋白NH2端區(qū)域的18-260氨基酸是膽固醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖9B)。
為了研究NPClLl蛋白NH2端18-260氨基酸結(jié)構(gòu)域?qū)δ懝檀嘉盏挠绊?，在大鼠?細胞CRL-1601中，分別瞬時轉(zhuǎn)染表達人NPC1L1-EGFP蛋白，或NHr端18-260氨基酸 缺失的人NPC1L1-EGFP蛋白，在不同的時間點進行固定，filipin染色，并用雙光子共 聚焦顯微鏡觀察。通過對各個時間點細胞內(nèi)膽固醇含量，以及胞內(nèi)NPC1L1蛋白進行 定量分析，發(fā)現(xiàn)全長NPC1L1蛋白逐漸回到細胞內(nèi)，同時吸收大量膽固醇進入細胞； 而表達NH2-端18-260氨基酸缺失NPC1L1蛋白回到細胞內(nèi)及介導的膽固醇吸收都顯 著減少(圖9C)。表明人NPClLl蛋白NH2-端結(jié)構(gòu)域(18-260氨基酸)能夠結(jié)合膽固醇分 子，并且對于膽固醇吸收至關(guān)重要。
實施例6化合物25-羥膽固醇抑制NPClLl蛋白和膽固醇結(jié)合，進而減少膽固醇的 吸收
由于NPC1L1蛋白能夠與膽固醇特異性結(jié)合，本發(fā)明人設(shè)想，如果找到一種化合 物競爭NPC1L1蛋白與膽固醇的結(jié)合，就能起到抑制膽固醇吸收的作用。根據(jù)這個假 說，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)25-羥膽固醇(結(jié)構(gòu)見圖10A)，能夠競爭^H]標記的膽固醇與NPC1L1 蛋白的結(jié)合(圖10B)。進一步，用25-羥膽固醇處理CRL-1601/NPClLl-EGFP細胞，在不同的時間點固定、 染色并用雙光子共聚焦顯微鏡觀察熒光定位，通過對細胞內(nèi)膽固醇含量及細胞內(nèi) NPC1L1蛋白的定位進行定量分析，發(fā)現(xiàn)25-羥膽固醇能夠顯著抑制膽固醇的吸收及 NPC1L1蛋白的內(nèi)吞(圖10C)。
綜上所述，化合物25-羥膽固醇能夠通過競爭膽固醇與NPClLl的結(jié)合，從而抑制 細胞對膽固醇的攝取。因此，NPClLl蛋白的NH2-結(jié)構(gòu)域(18-260氨基酸)可以作為篩選 膽固醇吸收抑制劑的靶點；25-羥膽固醇及其類似物可能作為新的膽固醇吸收抑制劑。
實施例7在NPClLl氨基酸序列的986和987位插入3XMyc后，NPC1L1仍具有正
常的生理功能
為了進一步研究NPC1L1的拓撲結(jié)構(gòu)和功能，本發(fā)明人經(jīng)過大量探索，鑒定出在 NPClLl蛋白的第986位氨基酸殘基后插入3XMyc標簽不影響NPClLl的轉(zhuǎn)運和對膽 固醇的吸收(圖ll， 12)。
正常培養(yǎng)條件下，NPClLl/S986-3XMyc-L987主要定位在細胞核旁的區(qū)域(圖llB， -60 min)。當用1.5。/。的環(huán)化糊精處理細胞1個小時(圖12B, 0min)，使細胞膽固醇水平 降低，NPClLl/S986-3XMyc-L987蛋白被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)膜。當再給細胞遞送環(huán)化糊精 包被的膽固醇1個小時后，NPC1 Ll/S986-3 X Myc-L987又內(nèi)吞到細胞質(zhì)內(nèi)并定位到 ERC(圖12B， 60min)。該循環(huán)定位與野生型的NPC1L1相一致。
為了更進一步驗證NPClLl/S986-3 XMyc-L987蛋白對膽固醇吸收的功能是否正 常，本發(fā)明人用Filipin染色的方法來定量細胞內(nèi)的膽固醇。首先用環(huán)化糊精去除細胞 膜的膽固醇，然后再遞送膽固醇，用Filipin染色觀察膽固醇的吸收情況。如圖11B， IIC所示，在沒有Ezetimibe存在的條件下，NPC1L1/S986-3 XMyc-L987能夠攜帶大量 膽固醇進入細胞。在10pM Ezetimibe處理的條件下，NPC1L1/S986-3 XMyc-L987部分 被內(nèi)吞進細胞質(zhì)，膽固醇也部分被吸收。然而當用40iaM Ezetimibe處理細胞， NPClLl/S986-3XMyc-L987完全被抑制在細胞質(zhì)膜上，膽固醇同時不能被內(nèi)吞進入細 胞。
因此，NPClLl/S986-3XMyc-L987與野生型NPClLl表現(xiàn)出相同的特性，即細胞內(nèi) 的膽固醇水平調(diào)節(jié)NPC1L1蛋白在細胞質(zhì)膜和內(nèi)吞循環(huán)體之間的循環(huán)轉(zhuǎn)運，這一蛋白 能介導膽固醇的吸收，并且吸收過程能被Ezetimibe特異性抑制。
本實施例所用的細胞是CRL1601，用瞬時轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染入含有NPClLl/S986-3 X Myc-L987表達框的pEGFP-N 1質(zhì)粒。
實施例8用免疫組化、流式細胞檢測的方法分析NPC1L1在細胞內(nèi)的定位 根據(jù)發(fā)明人對NPC1L1拓撲結(jié)構(gòu)的研究，發(fā)明人認為，當 NPClLl/S986-3xMyc-L987蛋白轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)膜上時，3xMyc標簽將會暴露到細胞外基質(zhì)。如果不通透的細胞(不通透是指不通透細胞膜，在此條件下，外界小分子(如 抗體)不能進入細胞內(nèi)，抗體只標記細胞膜表面的NPC1L1，不能標記細胞內(nèi)的NPC1L1) 與抗Myc的抗體孵育，只有細胞膜上的NPClLl/S986-3xMyc-L987可以被Myc抗體檢 測，因此可以利用這 一 特點來標記細胞膜上的N P C1L1 。
如圖12B所示，在沒有通透的細胞中加入Myc抗體，然后用熒光標記的二抗檢測， 只有細胞膜上的NPClLl/S986-3 X Myc-L987被檢觀lJ(圖12B， Omin)，細胞內(nèi)的 NPClLl/S986-3XMyc-L987則不能被檢測至l」(圖12B， -60mir^tJ60min)。而在完全通透 的細胞(通透是指在細胞膜上打孔，這樣外界的小分子(如抗體)就能進入細胞膜， 因此能夠標記細胞內(nèi)和細胞膜表面的NPC1L1蛋白)中，細胞內(nèi)外的NPC1L1/S986-3X Myc-L987都可以被抗Mye抗體檢測到(圖12B，通透細胞染色)。該方法可以快速簡便 地分析NPC1L1的亞細胞定位。
為了對NPC1L1的蛋白定位更深入研究，發(fā)明人將含有NPClLl/S986-3 XMyc-L987 蛋白編碼框的pEGFP-Nl載體轉(zhuǎn)染大鼠的肝細胞系CRL1601 ，獲得穩(wěn)定表達 NPC1L1/S986-3 X Myc-L987-EGFP的細胞株，命名為CRL1601/NPC1L1/S986-3 X Myc-L987-EGFP。利用CRL1601/ NPC1L1/S986-3 XMyc-L987-EGFP細胞，發(fā)明人用 流式細胞儀分析了在環(huán)化糊精(CDX)抽提膽固醇前后，NPC1L1/S986-3 X Myc-L987-EGFP蛋白的細胞亞定位變化。可以很明顯的發(fā)現(xiàn)，CDX處理后，細胞膜上 的NPClLl/S986-3XMyc-L987-EGFP的量明顯增力Q(圖12 C， D)。這又是一種快速簡便 地分析NPC1L1蛋白亞細胞定位的方法。
通透細胞的制備方法本領(lǐng)域已知，本實施例中，采用0.1-0.2。/。的TritonX IOO處理 細胞5分鐘，獲得通透細胞。
實施例7至實施例8表明，發(fā)明人構(gòu)建了一個新的帶有3XMyc標簽的NPClLl蛋白 表達質(zhì)粒，當表達的NPC1L1定位在細胞膜上時，3XMyc標簽會暴露在細胞外基質(zhì)。 利用這一特點，發(fā)明人用免疫組化的方法標記膜上的NPC1L1蛋白，并且利用流式細 胞檢測也能簡便的鑒定NPC1L1的亞細胞定位。因此，本發(fā)明人成功創(chuàng)建了一種新的 分析NPC1L1亞細胞定位的方法，利用這一方法，能夠快速簡便地識別出NPC1L1在細 胞內(nèi)的定位。這一方法的建立，為高通量分析NPC1L1在細胞內(nèi)的定位奠定了基礎(chǔ)。
實施例9藥物篩選方法 一.篩選方法如下 1.初篩
以約20種化合物為一次篩選，將表達NPC1L1-EGFP的細胞種于12孔板； 48小時后用CDX處理細胞，減少細胞內(nèi)的膽固醇，使NPC1L1蛋白定位于細胞膜； 用待選藥物處理細胞一個小時；
將含有待選藥物的培養(yǎng)基中加入CDX包被的膽固醇；一個小時后觀察NPC1L1蛋白的定位，找出影響NPC1L1蛋白定位的藥物。
結(jié)果，本發(fā)明人在最初篩選的180多種化合物中發(fā)現(xiàn)了一個可以抑制NPC1L1蛋白
內(nèi)吞的化合物P,e-二甲基丙烯酰阿卡寧(/3，j3-DIMETHYLACRYL ALKANNIN,
C6)(圖13A-B)。 2.細篩
選擇初篩中的陽性藥物，用前述類似的方法處理細胞； 在不同的時間點固定，F(xiàn)ilipin染色和封片；
用雙光子顯微鏡觀察，拍照，熒光定量細胞內(nèi)的NPC1L1和膽固醇(圖13C-D)?？?見，e ，e-二甲基丙烯酰阿卡寧(C6),可以抑制大概50。/。左右的NPClLl的內(nèi)吞和膽固醇 的吸收。所以e,e-二甲基丙烯酰阿卡寧可以作為一個潛在的抑制膽固醇吸收的化合 物。
二.篩選方法如下
本篩選方法采用的細胞是CRL1601，其中轉(zhuǎn)染入含有NPClLl蛋白的NH2-結(jié)構(gòu)域 (18-260氨基酸)表達框的pEGFP-Nl質(zhì)粒，從而使細胞穩(wěn)定表達NPC1L1蛋白的NH^結(jié) 構(gòu)域(18-260氨基酸)-EGFP，所述細胞命名為CRL-1601/NPClLl(18-260)-EGFP，細胞 裂解后，利用抗EGFP抗體免疫純化得到NPClLl(18-260)-EGFP蛋白，并在蛋白中加 入[3印標記的膽固醇，將上述制得的混合樣品分為兩組
測試組NPClLl(18-260)-EGFP蛋白，其中加入候選物質(zhì)； 對照組NPClLl(18-260)-EGFP蛋白，其中不加入候選物質(zhì)。 檢測兩組中[SH]標記的膽固醇與NPClLl蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域(18-260氨基酸)的結(jié) 合情況，如測試組中膽固醇與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合量顯著低于對照組 中[^H]標記的膽固醇與NPClLl蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合量(低30。/。以上)，則所述候
選物質(zhì)是降膽固醇物質(zhì)。
以25-羥膽固醇或27-羥膽固醇作為候選物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們均能夠競爭性地與 NPClLl蛋白的NH2-結(jié)構(gòu)域(18-260氨基酸)結(jié)合，從而抑制膽固醇與NPC1L1蛋白的 NH2-結(jié)構(gòu)域(18-260氨基酸)的結(jié)合。
討論
本發(fā)明人的數(shù)據(jù)表明Ezetimibe通過抑制NPClLl蛋白的內(nèi)吞來抑制膽固醇的吸 收。其分子機制是Ezetimibe影響NPClLl蛋白進入籠形蛋白包被的小泡。有趣的是 Ezetimibe不影響轉(zhuǎn)鐵蛋白和LDL的內(nèi)吞。這些結(jié)果均表明Ezetimibe是NPC 1L1蛋白有 效和特異的抑制劑。但是Ezetimibe怎樣影響NPClLl蛋白進入籠形蛋白包被的小泡還 不知道。要闡明此問題，本發(fā)明人從NPC1L1蛋白內(nèi)吞的初始階段入手。NPC1L1蛋白 含有甾醇感受結(jié)構(gòu)域。人基因組中有6個蛋白含有此結(jié)構(gòu)域HMGCR， SCAP， NPC1， Patched, TRC8，和NPC1L1。可以推測NPC1L1蛋白的甾醇感受域可能直接結(jié)合膽固 醇，通過構(gòu)象變化從而與籠形蛋白/AP2復合體結(jié)合導致內(nèi)吞。Ezetimibe可能競爭膽固
25醇與NPC1L1蛋白的結(jié)合。另一種可能是Ezetimib會影響NPClLl蛋白的構(gòu)象導致膽固 醇不能促進NPC1L1蛋白與籠形蛋白/AP2復合體結(jié)合。Ezetimibe也可能影響NPClLl 蛋白周圍的膽固醇的分布導致NPC1L1蛋白內(nèi)吞的阻抑。
人通過從頭合成和食物吸收獲得膽固醇。與抑制膽固醇合成的藥物(如他汀類) 相比，Ezetimibe是市場上唯一的抑制膽固醇吸收的藥物。由于不同的個體基因型的差 異導致不同人對Ezetimibe的敏感程度不同。因此，尋找更多的膽固醇吸收抑制劑顯得 尤為重要。本發(fā)明人的工作揭示了膽固醇吸收的分子機制，可以為新藥篩選奠定生物 學基礎(chǔ)。同時，本發(fā)明人建立的細胞水平觀察NPC1L1蛋白亞細胞定位的系統(tǒng)可以用 于篩選NPC1L1蛋白內(nèi)吞的抑制劑，這些抑制劑具有抑制膽固醇吸收藥物的可能性。
細胞從外界物質(zhì)交換主要通過四種方式自由擴散、協(xié)助擴散、主動運輸和胞吞 和胞吐。其中自由擴散是疏水和簡單的小分子直接通過細胞質(zhì)膜磷脂雙分子層，此過
程不需要蛋白參與；協(xié)助擴散是細胞質(zhì)膜上的通道蛋白介導的小分子從濃度高的一側(cè) 到低的一側(cè)，如離子通道等；主動運輸需要消耗能量，其也是蛋白介導的，如離子泵 等；胞吞是通過細胞質(zhì)膜的內(nèi)陷介導的物質(zhì)交換，包括吞噬作用和胞飲，胞飲又包括 網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞，caveolin介導的內(nèi)吞和其他未知形式的內(nèi)吞。
協(xié)助擴散和主動運輸?shù)慕閷У鞍资峭ǖ赖鞍?，其特點是此類蛋白是單體或者多聚 體在細胞膜形成通道，讓物質(zhì)直接進出細胞膜，這些物質(zhì)多為單分子小物質(zhì)如水、葡 萄糖和氨基酸等。內(nèi)吞是通過細胞膜上的受體介導的。
LDL受體是膽固醇運輸和內(nèi)吞常見的分子受體，其特征是一次跨膜的膜蛋白。它 的胞外區(qū)域可以結(jié)合LDL或者VLDL，然后通過胞質(zhì)內(nèi)一些特殊的motif募集內(nèi)吞相關(guān) 的蛋白進行內(nèi)吞。而對于NPC1L1來說，它含有大概13次跨膜區(qū)域，而且NPC1L1促進 的是單分子物質(zhì)膽固醇的吸收，因此無論是在拓撲結(jié)構(gòu)和配體方面，NPC1L1和LDL 受體都大不相同，因此通常人們不會認為NPC1L1的功能和LDL受體類似。有意思的 是參與膽固醇外排的蛋白ABCG5/8是由兩個六次跨膜的蛋白組成的雙分子復合體，其 拓撲結(jié)構(gòu)和NPC1L1有類似之處。有預測ABCG5/8通過類似于泵的方式通過水解ATP 來外排膽固醇，與ABCG5/8很相似的ABCG1和ABCA1也被推測是分子泵。NPC1是和 NPC1L1同源性很高的蛋白(同源性50。/。)，其拓撲結(jié)構(gòu)和NPC1L1非常相似。NPC1在膽 固醇從溶酶體向外(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜)運輸過程中起到關(guān)鍵作用。有報道表明體外表達的 NPC1蛋白有泵脂肪酸的能力，但是不能泵膽固醇。結(jié)合ABCG5/8和NPC1研究，本領(lǐng) 域人員通常很自然會推測NPC1L1可能是一個分子泵，通過向細胞內(nèi)泵膽固醇來促進 膽固醇的吸收。
而本發(fā)明人的實驗結(jié)果卻恰恰出乎意料。首先是如果NPC1L1是一個分子泵，那 么無論在人體內(nèi)還是細胞培養(yǎng)中，游離的單分子膽固醇將是最有效的底物。但是在人 體中膽固醇要和膽汁酸形成micelle才能被有效吸收，而且在細胞培養(yǎng)中用CDX包被的
膽固醇比游離的膽固醇更容易被NPC1L1吸收；其次，如果NPC1L1是一個分子泵，那 么當給細胞膽固醇時，應該看到膽固醇先進入細胞，但是本發(fā)明人看到的是NPC1L1 和膽固醇同時進入細胞內(nèi)；最后，如果NPC1L1是一個分子泵，無論用微絲抑制劑還
26是沉默網(wǎng)格蛋白來降低NPC1L1內(nèi)吞，都將增加膽固醇的吸收，但是本發(fā)明人看到的 是膽固醇吸收也被抑制住了。這些結(jié)果不但不支持NPC1L1是分子泵的假說，反而證 明了NPC1L1介導的膽固醇的吸收是類似于LDL受體內(nèi)吞的方式。其實在NPC1的報道 中不難看出在NPC1的體外實驗中的分子泵底物是脂肪酸而不是其生理條件下的底物 膽固醇，這說明NPC1在體內(nèi)運輸膽固醇的方式不像是分子泵，況且游離的單分子膽 固醇對細胞有毒性，如果NPC1或者NPC1L1直接將游離單分子膽固醇泵入細胞質(zhì)中， 對細胞健康十分不利。
以上說明NPC1L1類似于膽固醇的受體，NPC1L1通過囊泡內(nèi)吞的方式吸收膽固 醇。目前現(xiàn)有技術(shù)中沒有任何證據(jù)說明NPC1L1是膽固醇的受體而不是膽固醇通道， 也沒有說明當NPC1L1蛋白定位于細胞膜時是怎樣吸收膽固醇的。并且現(xiàn)有技術(shù)中還 沒有提出具體的將NPC1L1蛋白作為靶點來篩選降膽固醇藥物的方案。本發(fā)明第一次 揭示了從NPC1L1蛋白的功能入手來篩選潛在降膽固醇物質(zhì)，這比體外結(jié)合實驗更可 靠。正是由于首次揭示了NPC1L1蛋白通過囊泡內(nèi)吞途徑吸收膽固醇，所以本發(fā)明人 才提出該發(fā)明，即通過分析NPC1L1蛋白內(nèi)吞來篩選潛在的降膽固醇物質(zhì)，并且篩選 獲得了一種活性化合物。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書 所限定的范圍。序列表
<110〉中國科學院上海生命科學研究院
<120>基于分析NPC1L1蛋白亞細胞定位變化篩選降膽固醇新藥的方法
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raisc—feature 寡核^F酸
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aagcaagtgt acgacgcgca c 2權(quán)利要求
1.一種篩選潛在的降膽固醇物質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括(1)用膽固醇處理表達NPC1L1蛋白的細胞，并確定細胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度；(2)在候選物質(zhì)存在下，如(1)所述處理表達NPC1L1蛋白的細胞，再次確定囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度；和(3)比較(1)和(2)中囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的差異；其中，如果(2)中囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度在統(tǒng)計學上低于(1)中囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度，則所述候選物質(zhì)是潛在的降膽固醇物質(zhì)。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，(1)或(2)中，所述的表達NPC1L1蛋白 的細胞在膽固醇處理前預先經(jīng)過降膽固醇處理。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，(1)或(2)中，還包括確定細胞中籠型 蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度；并且，(3)中，還包括比較(1)和(2)中籠形蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度； 其中，如果(2)中籠型蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度在統(tǒng)計學上低于(I)中籠型 蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度，則所述候選物質(zhì)是潛在的降膽固醇物質(zhì)。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，(1)或(2)中，還包括確定細胞中AP2 復合體相關(guān)蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度；并且，(3)中，還包括比較(1)和(2)中AP2復合體相關(guān)蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度； 其中，如果(2)中AP2復合體相關(guān)蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度在統(tǒng)計學上低于(1)中AP2復合體相關(guān)蛋白與NPC1L1蛋白的結(jié)合程度，則所述候選物質(zhì)是潛在的降膽固醇物質(zhì)。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的細胞是重組細胞，其基因組中 含有表達盒，所述表達盒含有可操作性連接的NPC1L1蛋白的編碼基因和報告基因。
6. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的NPC1L1蛋白是一種融合蛋白， 其包含NPC1L1蛋白與標簽蛋白，且所述的標簽蛋白位于NPC1L1蛋白的胞外區(qū)域。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的標簽蛋白位于NPC1L1蛋白的第 8跨膜區(qū)與第9跨膜區(qū)之間。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的標簽蛋白位于NPC1L1蛋白上第 986位氨基酸與第987位氨基酸之間。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，通過鑒定細胞標簽蛋白的定位來確定 NPC1L1蛋白的定位，進而確定細胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述通過鑒定細胞標簽蛋白的定位來 確定NPC1L1蛋白的定位，進而確定細胞囊泡內(nèi)吞NPC1L1蛋白的程度的方法包括(1) 在不通透細胞的情況下，標記位于細胞膜上的標簽蛋白；(2) 在通透細胞的情況下，標記全細胞的標簽蛋白；(3) 分析或計算(1)中細胞膜上標簽蛋白占(2)中全細胞標簽蛋白的百分比；如細胞 膜上的標簽蛋白所占百分比在統(tǒng)計學上明顯增加，則NPC1L1蛋白定位在細胞膜上的 比例明顯增加，進而表明細胞囊泡內(nèi)吞NPC 1 Ll蛋白的程度明顯降低。
11. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括對獲得的潛在物 質(zhì)進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，選擇和確定對于降膽固醇有用的物質(zhì)。
12. —種篩選潛在的降膽固醇物質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括(a) 用候選物質(zhì)處理表達介導NPC1L1內(nèi)吞的蛋白的細胞；(b) 檢測所述細胞中所述蛋白的表達或活性；其中，若所述候選物質(zhì)可降低所述蛋白的表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是潛在 的降膽固醇物質(zhì)。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，步驟(a)包括在測試組中，將候選物質(zhì)加入到表達介導NPC1L1內(nèi)吞的蛋白的細 胞中；和/或步驟(b)包括檢測測試組的細胞中所述蛋白的表達或活性，并與對照組比較，其 中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達所述蛋白的細胞；如果測試組中所述蛋白的表達或活性在統(tǒng)計學上低于對照組，就表明該候選物是 潛在的降膽固醇物質(zhì)。
14. 如權(quán)利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述介導NPC1L1內(nèi)吞的蛋白是 籠形蛋白和/或AP2復合體。
15. —種抑制NPC1L1蛋白內(nèi)吞的物質(zhì)在制備降膽固醇藥物中的用途。
16. 如權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于，所述抑制NPC1LI蛋白內(nèi)吞的物質(zhì)是 抑制籠形蛋白和/或AP2復合體與NPClLl蛋白相互作用的物質(zhì)。
17. 如權(quán)利要求15或16所述的用途，其特征在于，所述抑制NPC1L1蛋白內(nèi)吞的物 質(zhì)是0 ,e -二甲基丙烯酰阿卡寧或25-羥膽固醇。
18. —種篩選潛在的降膽固醇物質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括(1) 用膽固醇與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域接觸，檢測膽固醇與NPC1L1蛋白的 NH2端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合情況；(2) 用膽固醇與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域接觸，并加入候選物質(zhì)，檢測膽固醇 與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合情況；其中，如(2)中膽固醇與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合強度顯著弱于或結(jié)合量 顯著低于(1)中膽固醇與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合強度或結(jié)合量，則所述候選物質(zhì)是潛在的降膽固醇物質(zhì)。
19. 一種篩選潛在的降膽固醇物質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括將候選物質(zhì)與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域接觸，檢測候選物質(zhì)與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu) 域的結(jié)合情況；如候選物質(zhì)與NPC1L1蛋白的NH2端結(jié)構(gòu)域發(fā)生特異結(jié)合，則所述候 選物質(zhì)是潛在的降膽固醇物質(zhì)。
20. 如權(quán)利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述的NPC1L1蛋白的NH2端結(jié) 構(gòu)域含有GenBank登錄號F J4 81111所示序列中第18-260位氨基酸。
21. 采用如權(quán)利要求18或19所述的方法篩選獲得的物質(zhì)。
22. —種融合蛋白，其特征在于，所述蛋白包含NPC1L1蛋白與標簽蛋白，且所述 的標簽蛋白位于NPC1L1蛋白的胞外區(qū)域。
23. —種核酸序列，其特征在于，所述的核酸序列編碼權(quán)利要求22所述的融合蛋 白。
24. —種重組載體，其特征在于，所述的重組載體含有權(quán)利要求23所述的核酸序列。
25. —種宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞含有權(quán)利要求24所述的重組載 體，或其基因組中整合有權(quán)利要求23所述的核酸序列。
26. 權(quán)利要求25所述的宿主細胞的用途，其特征在于，用于分析NPC1L1蛋白的細胞亞定位。
全文摘要
本發(fā)明公開了篩選潛在的降膽固醇物質(zhì)的方法，所述方法包括在候選物質(zhì)存在或不存在下，根據(jù)細胞內(nèi)吞NPC1L1蛋白的差異來篩選，或根據(jù)與NPC1L1相互作用蛋白的活性的差異來篩選，或根據(jù)膽固醇與NPC1L1蛋白的NH₂端結(jié)構(gòu)域結(jié)合的差異來篩選。本發(fā)明還提供了利用所述方法獲得的降膽固醇物質(zhì)。
文檔編號G01N33/92GK101580871SQ20091014142
公開日2009年11月18日 申請日期2009年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月13日
發(fā)明者宋保亮, 張錦輝, 煒 戚, 曲玉秀, 李培山, 婧 王, 江 王, 繆紅華, 亮 葛 申請人:中國科學院上海生命科學研究院