本發(fā)明涉及一種化合物的新應(yīng)用，特別涉及氯硝柳胺在制備抗致瘤皰疹病毒藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒KSHV（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus）是皰疹病毒家族中的一員。KSHV感染誘生的卡波氏肉瘤KS是艾滋病患者中常見的惡性腫瘤，大約20%的艾滋病病人會(huì)伴有卡波氏肉瘤，并且AIDS-KS病人死亡率極高，其5年生存率只有約8%。正常人群中KSHV感染后95%以上個(gè)體不表現(xiàn)出臨床癥狀和患病。但在免疫抑制的患者，如艾滋病患者、器官移植患者和放化療患者中，KSHV有很高的感染率和極大的危害，可導(dǎo)致卡波氏肉瘤（Kaposi’s sarcoma，KS）、原發(fā)滲出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）以及多中心卡斯特慢?。╩ulticentric castleman disease，MCD）等疾病。近年來在其他疾病中（如HBV慢性肝炎、吸毒和老年性疾病）也發(fā)現(xiàn)很高的KSHV感染率和惡性腫瘤，正逐漸引起重視。

EB病毒（Epstein-barr virus，EBV）與KSHV同屬于γ-皰疹病毒，EBV可通過唾液傳播，而近年來的一些研究顯示這一病毒也能通過性行為傳播。目前EBV感染全世界5歲以上人群中95%以上的個(gè)體，感染之后，EBV終生存在于攜帶者體內(nèi)，呈潛伏感染狀態(tài)，可引發(fā)多種人類疾病，包括傳染性單核細(xì)胞增多癥（Infection Mononucleosis，IM）、口腔毛狀白斑癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病多發(fā)性硬化癥（Multiple Sclerosis，MS）、Gianotti-Crosti綜合征、多形紅斑（Erythema Multiforme，EM）、急性外陰潰瘍以及實(shí)質(zhì)器官移植后多發(fā)的淋巴組織增生性疾病。目前常用的抑制病毒DNA合成來治療皰疹病毒感染的藥物（如無環(huán)鳥苷及其相關(guān)化合物）對(duì)這兩種病毒感染療效較差，疫苗也尚處于研發(fā)階段。

氯硝柳胺作為一種驅(qū)蟲藥，其安全性已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織所認(rèn)可，此外有研究發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺可能對(duì)細(xì)菌感染的治療有一定作用。未有明確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明氯硝柳胺對(duì)KSHV和EBV具有藥物活性的報(bào)導(dǎo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供氯硝柳胺在制備抗致瘤皰疹病毒藥物中的應(yīng)用。

發(fā)明人運(yùn)用Western Bolt以及Real-time quantitative PCR等技術(shù)，檢測KSHV陽性細(xì)胞BCBL1中KSHV相關(guān)基因的表達(dá)、及細(xì)胞外的病毒顆粒的含量；檢測EBV陽性細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞P3HR-1及上皮細(xì)胞HNE1-2089中EBV相關(guān)基因的表達(dá)、細(xì)胞外的病毒顆粒的含量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺處理后的細(xì)胞內(nèi)KSHV或EBV相關(guān)基因的表達(dá)明顯降低，且細(xì)胞外的病毒顆粒釋放也有明顯下降。這些抑制作用呈濃度依賴性，且在沒有明顯毒性的濃度就有很好的抗病毒作用，為進(jìn)一步的抗病毒藥物研發(fā)提供強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有重要的研發(fā)價(jià)值和開發(fā)意義?；诖?，可將氯硝柳胺開發(fā)為安全有效的抗KSHV或EBV藥物。

附圖說明

圖1：氯硝柳胺在BCBL1細(xì)胞內(nèi)對(duì)KSHV潛伏期蛋白LANA、裂解期蛋白R(shí)TA、K8、ORF64的表達(dá)的影響；

圖2：氯硝柳胺在P3HR-1細(xì)胞內(nèi)對(duì)EBV相關(guān)蛋白EA-D、ZTA表達(dá)的作用；

圖3：氯硝柳胺在HNE1-2089細(xì)胞內(nèi)對(duì)EBV相關(guān)蛋白EA-D、ZTA表達(dá)的作用；

圖4：氯硝柳胺對(duì)BCBL1細(xì)胞內(nèi)的病毒產(chǎn)量的影響；

圖5：氯硝柳胺對(duì)P3HR-1細(xì)胞外的病毒產(chǎn)量的影響；

圖6：氯硝柳胺對(duì)HNE-2089細(xì)胞外的病毒產(chǎn)量的影響；

圖7：氯硝柳胺對(duì)PBMC細(xì)胞的存活影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

以下實(shí)驗(yàn)中，除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備和方法為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)采購的試劑、設(shè)備和常規(guī)使用的方法。

實(shí)驗(yàn)原理：EBV、KSHV作為γ-皰疹病毒，生活周期都分為潛伏期和裂解期，細(xì)胞被感染后經(jīng)過短暫的急性反應(yīng)后迅速進(jìn)入潛伏期，而經(jīng)過特殊的刺激，細(xì)胞進(jìn)入裂解期進(jìn)行病毒擴(kuò)增繁殖。因此，檢測潛伏期和裂解期的相關(guān)蛋白表達(dá)可作為評(píng)估藥物對(duì)于該兩種病毒作用的一種手段。

本發(fā)明中簡寫為：TPA，大戟二萜酯；NaB，丁酸鈉

實(shí)驗(yàn)1：在BCBL1細(xì)胞內(nèi)對(duì)KSHV潛伏期蛋白LANA、裂解期蛋白R(shí)TA、K8、ORF64的表達(dá)的影響

1)取生長良好的BCBL1細(xì)胞，接種于6孔透明平底板中，每孔2×10⁶細(xì)胞。使用的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基：RPMI1640，10%胎牛血清以及1%雙抗，培養(yǎng)條件是5%二氧化碳、37℃；

2)12h后加入誘導(dǎo)劑TPA，終濃度分別20ng/mL；

3)3小時(shí)后加入梯度濃度的氯硝柳胺，終濃度分別為0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM；

4)培養(yǎng)48h后，1000rpm，10min收獲細(xì)胞，進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果如圖1顯示：在BCBL1細(xì)胞內(nèi)KSHV相關(guān)蛋白R(shí)TA、K8、ORF64的表達(dá)受氯硝柳胺濃度的影響，呈一定的濃度依賴性。

實(shí)驗(yàn)2：氯硝柳胺在P3HR-1細(xì)胞內(nèi)對(duì)EBV相關(guān)蛋白EA-D、ZTA表達(dá)的作用

1)取生長良好的P3HR-1細(xì)胞，接種于6孔透明平底板中，每孔2×10⁶細(xì)胞。使用的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基：RPMI1640，10%胎牛血清以及1%雙抗，培養(yǎng)條件是5%二氧化碳、37℃；

2)傳代12h后加入誘導(dǎo)劑TPA(終濃度為20μg/ml)、NaB（終濃度為3mM）；

3)誘導(dǎo)3小時(shí)后加入氯硝柳胺，終濃度分別為0μM、0.01μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM；

4)在加入誘導(dǎo)劑后的48h后，收取細(xì)胞進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果如圖2顯示：在P3HR-1細(xì)胞內(nèi)，EBV相關(guān)蛋白ZTA、EA-D的表達(dá)受氯硝柳胺濃度的影響，呈一定的濃度依賴性。

實(shí)驗(yàn)3：氯硝柳胺在HNE1-2089細(xì)胞內(nèi)對(duì)EBV相關(guān)蛋白EA-D、ZTA表達(dá)的作用

1)取生長良好的HNE1-2089細(xì)胞，1：4接種于6孔透明平底板中；

2)12h細(xì)胞貼壁，加入誘導(dǎo)劑TPA(終濃度為20μg/ml)、NaB（終濃度為3mM）

3)3h后加入梯度濃度的氯硝柳胺，終濃度分別為0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM；

4)培養(yǎng)48h后，用細(xì)胞刮板將細(xì)胞從板里刮取出來，冷的PBS漂洗，1000rpm，10min，4℃離心收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：在HNE1-2089細(xì)胞內(nèi)EBV相關(guān)蛋白ZTA、EA-D的表達(dá)受氯硝柳胺濃度的影響，呈一定的濃度依賴性。

實(shí)驗(yàn)4：氯硝柳胺對(duì)BCBL1細(xì)胞內(nèi)的病毒產(chǎn)量的影響

1)取生長良好的細(xì)胞系BCBL1，種到48孔板中，細(xì)胞用量為1×10⁵/孔，將細(xì)胞分為不誘導(dǎo)組（3孔）和誘導(dǎo)組（21孔）；

2)3h后誘導(dǎo)組加入誘導(dǎo)劑TPA，終濃度為20ng/mL；

3)3h后加入相應(yīng)濃度的氯硝柳胺，濃度分別0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM，每個(gè)濃度3個(gè)孔；

4)120h后收獲細(xì)胞，10000g，4℃取上清液；

5)提取細(xì)胞外病毒DNA，方法如下：

a)取200μL上清液，加入2μL DNase I，20μL10×DNase I buffer，在37℃溫箱中孵育1h；

b)向上述液體中加入0.5M EDTA 10μL，混勻，終止反應(yīng)；

c)80℃水浴滅活10min；

d)加入20μL proteinase K溶液，緊接著加入200μL AL buffer，渦旋混勻，56℃水浴10min；

e)加入440μL酚氯仿抽提病毒顆粒內(nèi)DNA，渦旋混勻；

f)12000rpm，4℃離心10min；

g)離心后分層，取上清液約300μL，至另一ep管中。避免抽到下層的酚氯仿；

h)加入5M NaCl溶液6μL，加入無水乙醇750μL，最后加入糖原1μL；

i)充分混勻后放入-80℃冰箱，放置1h；

j) 將樣品從冰箱拿出，12000rpm，4℃，30min離心后去除上清；

k)Ep管內(nèi)底部出現(xiàn)DNA沉淀，用1mL70%冰乙醇洗，蓋上蓋，上下顛倒幾次；

l)12000rpm，4℃離心10min，棄上清；

m)12000rpm，4℃離心10min，除去殘余的酒精；

n)打開蓋子，讓多余的酒精揮發(fā)；

o)3min后加入40μL ddH₂O溶解DNA；

6)Real-time quantitative PCR 檢測病毒含量。

結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，氯硝柳胺對(duì)于KSHV在BCBL1細(xì)胞外的產(chǎn)量呈濃度依賴性抑制。

實(shí)驗(yàn)5：氯硝柳胺對(duì)P3HR-1細(xì)胞外的病毒產(chǎn)量的影響；

1)取生長良好的細(xì)胞系P3HR-1，種到48孔板中，細(xì)胞用量為1×10⁵/孔，將細(xì)胞分為不誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)組；

2)3h后加入誘導(dǎo)組加入誘導(dǎo)劑TPA、NaB，終濃度分別為20ng/mL、3mM；

3)誘導(dǎo)3h后加入相應(yīng)濃度的氯硝柳胺，濃度分別0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔；

4)120h后收獲細(xì)胞，10000g離心10分鐘，4℃取上清液；

5)提取病毒DNA，方法如下：

a)A．取200μL上清液，加入2μL DNase I，20μL10×DNase I buffer，在37℃溫箱中孵育1h；

b)向上述液體中加入0.5M EDTA 10μL，混勻，終止反應(yīng)；

c)80℃水浴滅活10min；

d)加入20μL proteinase K溶液，緊接著加入200μL AL buffer，渦旋混勻，56℃水浴10min；

e)加入440μL酚氯仿抽提病毒顆粒內(nèi)DNA，渦旋混勻；

f)12000rpm，4℃離心10min；

g)離心后分層，取上清液約300μL，至另一ep管中。避免抽到下層的酚氯仿；

h)加入5M NaCl溶液6μL，加入無水乙醇750μL，最后加入糖原1μL；

i)充分混勻后放入-80℃冰箱，放置1h；

j)將樣品從冰箱拿出，12000rpm，4℃，30min離心后去除上清；

k)Ep管內(nèi)底部出現(xiàn)DNA沉淀，用1mL70%冰乙醇洗，蓋上蓋，上下顛倒幾次；

l)12000rpm，4℃離心10min，棄上清；

m)12000rpm，4℃離心10min，除去殘余的酒精；

n)打開蓋子，讓多余的酒精揮發(fā)；

o)3min后加入40μL ddH₂O溶解DNA；

6)Real-time quantitative PCR 檢測病毒含量。

結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，氯硝柳胺對(duì)于EBV能抑制EBV細(xì)胞外的病毒釋放，且呈濃度依賴性抑制。

實(shí)驗(yàn)6：氯硝柳胺對(duì)HNE-2089細(xì)胞外的病毒產(chǎn)量的影響；

1)取生長良好的細(xì)胞系HNE1-2089，種到24孔板中，細(xì)胞用量為2×10⁵/孔，將細(xì)胞分為不誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)組；

2)12h后細(xì)胞貼壁，加入誘導(dǎo)劑TPA、NaB，終濃度分別為20ng/mL、3mM；

3)誘導(dǎo)3h后加入相應(yīng)濃度的氯硝柳胺，濃度分別0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔；

4)120h后收獲細(xì)胞，10000g離心10分鐘，4℃取上清液；

5)提取病毒DNA，方法如下：

a)取200μL上清液，加入2μL DNase I，20μL10×DNase I buffer，在37℃溫箱中孵育1h；

b)向上述液體中加入0.5M EDTA 10μL，混勻，終止反應(yīng)；

c)80℃水浴滅活10min；

d)加入20μL proteinase K溶液，緊接著加入200μL AL buffer，渦旋混勻，56℃水浴10min；

e)加入440μL酚氯仿抽提病毒顆粒內(nèi)DNA，渦旋混勻；

f)12000rpm，4℃離心10min；

g)離心后分層，取上清液約300μL，至另一ep管中。避免抽到下層的酚氯仿；

h)加入5M NaCl溶液6μL，加入無水乙醇750μL，最后加入糖原1μL；

i)充分混勻后放入-80℃冰箱，放置1h；

j)將樣品從冰箱拿出，12000rpm，4℃，30min離心后去除上清；

k)Ep管內(nèi)底部出現(xiàn)DNA沉淀，用1mL70%冰乙醇洗，蓋上蓋，上下顛倒幾次；

l)12000rpm，4℃離心10min，棄上清；

m)12000rpm，4℃離心10min，除去殘余的酒精；

n)打開蓋子，讓多余的酒精揮發(fā)；

o)3min后加入40μL ddH₂O溶解DNA

6)Real-time quantitative PCR 檢測病毒含量。

結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，氯硝柳胺對(duì)于感染EBV的上皮細(xì)胞，能抑制EBV細(xì)胞外的病毒產(chǎn)量，且呈濃度依賴性抑制。

實(shí)驗(yàn)7：氯硝柳胺對(duì)PBMC細(xì)胞的存活影響

MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboymethoyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium, inner salt)是一種新合成的四唑類化合物，可被活細(xì)胞線粒體中的多種脫氫酶還原成各自有色的甲瓚產(chǎn)物，其顏色深淺與某些敏感細(xì)胞株的活細(xì)胞數(shù)在一定范圍內(nèi)呈高度相關(guān)。根據(jù)測得的490n的吸光度值（OD值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)，則表示藥物毒性越小。具體實(shí)驗(yàn)操作如下：

1)接種細(xì)胞，用含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液將人外周血單核細(xì)胞PBMC以每孔10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100ul ；

2)12h后加入氯硝柳胺，終濃度分別為0μM、0.01μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM 、10μM 、20μM、40μM、80μM；

3)培養(yǎng)48h后，每孔加MTS溶液20ul，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2~4 h；

4)選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，觀察化合物對(duì)PBMC細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CC50>80μM，抗病毒化合物毒性較低，在PBMC細(xì)胞中均呈現(xiàn)成無細(xì)胞毒現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氯硝柳胺處理后的細(xì)胞內(nèi)KSHV或EBV相關(guān)基因的表達(dá)明顯降低，且細(xì)胞外的病毒顆粒釋放也有明顯下降。這些抑制作用呈濃度依賴性，且在沒有明顯毒性的濃度就有很好的抗病毒作用，為進(jìn)一步的抗病毒藥物研發(fā)提供強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有重要的研發(fā)價(jià)值和開發(fā)意義。

因此，氯硝柳胺可以通過抑制KSHV和EBV的復(fù)制和表達(dá)，對(duì)KSHV和EBV引起的疾病起到較好的治療作用，特別是對(duì)KSHV引起的卡波氏肉瘤、原發(fā)滲出性淋巴瘤、多中心卡斯特慢病具有較好的預(yù)防及治療作用。

氯硝柳胺可以和其他抗致瘤皰疹病毒的活性成分聯(lián)合使用，通過多種途徑抑制KSHV和EBV的復(fù)制和表達(dá)，對(duì)KSHV和EBV引起的疾病，特別是KSHV引起的卡波氏肉瘤、原發(fā)滲出性淋巴瘤、多中心卡斯特慢病起到更好的治療作用。