本發(fā)明涉及一種圓柚酮的新用途。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

腦中風(fēng)、老年癡呆、帕金森、腦外傷等腦部疾病嚴(yán)重危害人類健康。腦部疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中，均伴隨著不同程度的神經(jīng)細(xì)胞損傷，例如：在缺血性腦中風(fēng)發(fā)生時，血流減少導(dǎo)致正常細(xì)胞的功能改變，大腦組織對局部缺血非常敏感，即使神經(jīng)元的短時間缺血也會引發(fā)一系列的事件，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡。神經(jīng)保護(hù)可用于急性疾病后防止神經(jīng)系統(tǒng)中腦/神經(jīng)元損傷或退化或防止慢性神經(jīng)退化疾病。神經(jīng)保護(hù)的目的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后減少神經(jīng)元功能障礙/死亡，并嘗試維持大腦細(xì)胞相互作用的最大可能的完整性，從而產(chǎn)生未受干擾的神經(jīng)功能。

圓柚酮，最初是從柚子皮油和阿拉斯加黃柏油中分離出的倍半萜酮，為無色或淡黃色油狀液體，具持久而強(qiáng)的柑橘樣果香，在較低稀釋度時呈典型的柚子香氣。目前，還未見圓柚酮對神經(jīng)保護(hù)作用的相關(guān)研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供了刺參苷M的新用途。

具體地，本發(fā)明提供了圓柚酮或其異構(gòu)體或者它們藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或溶劑合物在制備具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物或保健品中的用途。

進(jìn)一步地，所述藥物或保健品是促進(jìn)NGF、Vimentin、Nestin或GalC表達(dá)的藥物或保健品。

更進(jìn)一步地，所述藥物或保健品是治療或緩解與NGF、Vimentin、Nestin或GalC表達(dá)障礙相關(guān)疾病的藥物。

其中，所述NGF、Vimentin、Nestin或GalC表達(dá)障礙是指NGF、Vimentin、Nestin或GalC表達(dá)絕對不足或相對不足。

NGF(神經(jīng)生長因子)，對中樞神經(jīng)元及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、生長、分化、再生以及功能特性的表達(dá)都有重要的調(diào)控作用。研究表明，NGF對腦缺血過程中的神經(jīng)元有保護(hù)作用。

Nestin(巢蛋白)，作為一種中間絲蛋白，可以和微管、微絲一起構(gòu)成細(xì)胞骨架而達(dá)到維持神經(jīng)前體細(xì)胞的正常形態(tài)，含有Nestin的細(xì)胞骨架有可能增加神經(jīng)細(xì)胞的伸縮性和彈性，這對于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程是必要的。Nestin蛋白作為神經(jīng)肝細(xì)胞的標(biāo)志，也是神經(jīng)肝細(xì)胞的自我更新所需。該蛋白與其共存的Vimentin(波形蛋白)共聚組裝成神經(jīng)前體細(xì)胞內(nèi)的中間絲，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞骨架作用。

其中，所述藥物或保健品是誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的藥物或保健品。

本發(fā)明還提供了圓柚酮或其異構(gòu)體或者它們藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或溶劑合物在制備具有促進(jìn)NGF表達(dá)的藥物或保健品中的用途。

圓柚酮，目前不僅僅可以從柚子皮油和阿拉斯加黃柏油中分離得到，也可以從已知含有此成分的其他原料中進(jìn)行提取分離，如益智仁。當(dāng)然，基于圓柚酮的藥理活性，可以顯而易見地想到，除了圓柚酮純品外，各原料中包含圓柚酮的提取物也可以用于神經(jīng)保護(hù)。

本發(fā)明還提供了一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物組合物，它是以圓柚酮或其異構(gòu)體或者它們藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或溶劑合物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成制劑。

其中，所述制劑為口服或外用制劑。

本發(fā)明所述藥學(xué)上可接受的輔料，是指除活性成分以外包含在劑型中的物質(zhì)，包括但不僅限于填充劑(稀釋劑)、潤滑劑(助流劑或抗粘著劑)、分散劑、濕潤劑、粘合劑、調(diào)節(jié)劑、增溶劑、抗氧劑、抑菌劑、乳化劑、崩解劑等。粘合劑包含糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃芪膠、纖維素及其衍生物(如微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素或羥丙甲基纖維素等)、明膠漿、糖漿、淀粉漿或聚乙烯吡咯烷酮等；填充劑包含乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纖維素及其衍生物、無機(jī)鈣鹽(如硫酸鈣、磷酸鈣、磷酸氫鈣、沉降碳酸鈣等)、山梨醇或甘氨酸等；潤滑劑包含微粉硅膠、硬脂酸鎂、滑石粉、氫氧化鋁、硼酸、氫化植物油、聚乙二醇等；崩解劑包含淀粉及其衍生物(如羧甲基淀粉鈉、淀粉乙醇酸鈉、預(yù)膠化淀粉、改良淀粉、羥丙基淀粉、玉米淀粉等)、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纖維素等；濕潤劑包含十二烷基硫酸鈉、水或醇等；抗氧劑包含亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、二丁基苯酸等；抑菌劑包含0.5％苯酚、0.3％甲酚、0.5％三氯叔丁醇等；調(diào)節(jié)劑包含鹽酸、枸櫞酸、氫氧化鉀(鈉)、枸櫞酸鈉及緩沖劑(包括磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉)等；乳化劑包含聚山梨酯-80、沒酸山梨坦、普流羅尼克F-68，卵磷酯、豆磷脂等；增溶劑包含吐溫-80、膽汁、甘油等。

所述藥學(xué)上可接受的輔助性成分，它具有一定生理活性，但該成分的加入不會改變上述化合物或衍生物在疾病治療過程中的主導(dǎo)地位，而僅僅發(fā)揮輔助功效，這些輔助功效僅僅是對該成分已知活性的利用，是醫(yī)藥領(lǐng)域慣用的輔助治療方式。若將上述輔助性成分與本發(fā)明化合物配合使用，仍然應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”指本發(fā)明化合物與酸或堿所形成的適合用作藥物的鹽。上述酸堿為廣義的路易斯酸堿。

本發(fā)明中，所述“氘代”指化合物或基團(tuán)中的一個或多個氫被氘所取代。氘代可以是一取代、二取代、多取代或全取代。在另一優(yōu)選例中，氘在氘取代位置的氘同位素含量是大于天然氘同位素含量(0.015％)，更佳地大于50％，更佳地大于75％，更佳地大于95％，更佳地大于97％，更佳地大于99％，更佳地大于99.5％。

本發(fā)明化合物或藥物組合物的施用方式?jīng)]有特別限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、腸胃外(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下)、和局部給藥。

用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在這些固體劑型中，活性化合物與至少一種常規(guī)惰性賦形劑(或載體)混合，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，或與下述成分混合：(a)填料或增容劑，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合劑，例如，羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；(c)保濕劑，例如，甘油；(d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些復(fù)合硅酸鹽、和碳酸鈉；(e)緩溶劑，例如石蠟；(f)吸收加速劑，例如，季胺化合物；(g)潤濕劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如，高嶺土；和(i)潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉，或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑中，劑型也可包含緩沖劑。

固體劑型如片劑、糖丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可采用包衣和殼材制備，如腸衣和其它本領(lǐng)域公知的材料。它們可包含不透明劑，并且，這種組合物中活性化合物或化合物的釋放可以延遲的方式在消化道內(nèi)的某一部分中釋放。可采用的包埋組分的實例是聚合物質(zhì)和蠟類物質(zhì)。必要時，活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。

用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。除了活性化合物外，液體劑型可包含本領(lǐng)域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例如，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質(zhì)的混合物等。

除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料。

除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質(zhì)的混合物等。

用于局部給藥的本發(fā)明化合物的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑和吸入劑。活性成分在無菌條件下與生理上可接受的載體及任何防腐劑、緩沖劑，或必要時可能需要的推進(jìn)劑一起混合。

本發(fā)明實驗發(fā)現(xiàn)，圓柚酮能夠通過nestin、galc、ngf、vimentin等的表達(dá)，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)活性。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其他多種形式的修改、替換或變更。

以下通過具體實施例的形式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1圓柚酮NGF模型篩選結(jié)果

圖2 Nestin基因的mRNA表達(dá)情況

圖3 GalC基因的mRNA表達(dá)情況

圖4 NGF基因的mRNA表達(dá)情況

圖5 Vimentin基因的mRNA表達(dá)情況

圖6 NSE基因的mRNA表達(dá)情況

圖7圓柚酮的免疫熒光結(jié)果，其中，A：圓柚酮Nestin免疫熒光，B：圓柚酮NGF免疫熒光，C：圓柚酮GalC免疫熒光，D：圓柚酮Vimentin免疫熒光。

具體實施方式

實施例1 圓柚酮的神經(jīng)保護(hù)作用

1試劑及儀器設(shè)備

材料：圓柚酮(美國sigma公司，生產(chǎn)批號：101340870，純度>99％)；人胚腎上皮細(xì)胞HEK293細(xì)胞株、NGF質(zhì)粒均由四川大學(xué)生物醫(yī)學(xué)材料工程研究中心505實驗室保存提供；

NGF質(zhì)粒的制備方法如下：以大鼠基因組DNA為模板，設(shè)計引物在rNGF啟動子序列的上下游分別引入MluⅠ和AflⅡ酶切位點PCR擴(kuò)增得到啟動子片段：rNGFpro(縮寫為Np)(-615bp～+50bp)(+1為基因轉(zhuǎn)錄起始位點)，正向引物序列見SEQ NO.2，反向引物序列見SEQ NO.3。1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，乙醇沉淀回收得到各啟動子片段。分別雙酶切載體pSC-E2及各啟動子片段(Np)，1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段，連接載體與啟動子片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，氨芐青霉素平板抗性篩選，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行快速裂解鑒定，陽性者擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和PCR鑒定，對鑒定成功的質(zhì)粒進(jìn)行測序，最后獲得重組質(zhì)粒pNp-E2。同理制備獲得重組質(zhì)粒pNp-Luc。

試劑：DMEM-高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司；PBS購自成都哈里生物公司；哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine^TM2000)購自Invitrogen公司；細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8)購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；熒光素酶檢測試劑盒(Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer)購自Promega公司；蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(BCA Protein Assay Kit)購自Thermo公司；G418購自Amresco公司、二甲亞砜(DMSO)購自Sigma公司；胎牛血清(FBS)、雙抗(100×penicillin-streptomycin)、Imedium、胰蛋白酶(0.25％Trypsin/EDTA)均購自Gibco公司；Trizol試劑、氯仿、異丙醇、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(invitrogen)、瓊脂糖、TAE緩沖液、Real-TimePCR試劑盒、PCR試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)皿購自Thermo公司、各種規(guī)格培養(yǎng)板購自Corning公司、其它化學(xué)試劑除注明外均為國產(chǎn)分析純。

儀器：倒置相差熒光顯微鏡(DMI 4000B,Leica)、CO2培養(yǎng)箱(MACO-15AC,SANYO)、nanadrop2000、超凈工作臺(SW-CJ-2N型，哈爾濱東聯(lián)公司)、恒溫水浴鍋、PCR凝膠電泳儀、恒溫金屬浴、PCR儀、紫外透射檢測儀、Bio-Rad CFX Manager、剪刀、鑷子、手術(shù)刀、5mL無菌注射器等。滅菌鍋(DSX-280A，上海申安醫(yī)療器械廠)、渦旋儀(XW-80A，上海青浦滬西儀器廠)、離心機(jī)(Centrifuge 5424和5415R,Eppendorf)、顯微鏡(DMIL,Leica)、倒置相差熒光顯微鏡(DMI 4000B,Leica)、CO2培養(yǎng)箱(MACO-15AC,SANYO)、超凈工作臺(SW-CJ-2N型，哈爾濱東聯(lián)公司)、酶標(biāo)儀(Flash,Thermo Scientific)。

2研究方法

用構(gòu)建好的ProNGF-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎上皮細(xì)胞(Hek293)，挑選可穩(wěn)定傳代的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存，建成Hek293-NGF細(xì)胞模型。CCK8試劑盒測定化合物細(xì)胞毒性，確定篩選的安全濃度范圍。用模型對圓柚酮進(jìn)行活性篩選，熒光素酶試劑盒測定篩選結(jié)果，與空白對照比較以相對熒光素酶活性大于150％為初篩陽性，并計算最佳有效濃度。全骨髓貼壁法分離體外培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，初篩陽性單體加藥誘導(dǎo)11天，設(shè)1D、3D、5D、7D、11D五個時間點，按時觀察細(xì)胞形態(tài)變化情況并拍照記錄后收集細(xì)胞。提取細(xì)胞總RNA后進(jìn)行定量PCR實驗和免疫熒光實驗，分析實驗結(jié)果并得出結(jié)論。

3研究內(nèi)容

3.1細(xì)胞篩選模型的構(gòu)建

人胚腎上皮細(xì)胞(HEK293)的培養(yǎng)條件為DMEM-高糖培養(yǎng)基(含10％FBS+0.1％雙抗)，10CM培養(yǎng)皿置于5％CO₂，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至P3代以適當(dāng)密度接種至24孔板，設(shè)轉(zhuǎn)染組和對照組，每組3個平行，于5％CO₂，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

當(dāng)24孔板中細(xì)胞融合度達(dá)90％左右開始轉(zhuǎn)染。將NGF質(zhì)粒以opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，使其終濃度為500-800ng/ul，另將Lipofectamine^TM2000以opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至相同體積，輕柔混勻后室溫孵育5min。將稀釋后的NGF質(zhì)粒加入Lipofectamine^TM2000中，輕柔混勻室溫孵育20min，使形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。棄掉培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染組每孔加入無血清無雙抗培養(yǎng)基后加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物100μL，對照組更換無血清無雙抗培養(yǎng)基及100ulopti-MEM和Lipofectamine^TM2000混合物培養(yǎng)基，來回輕晃使混合均勻。于5％CO₂，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h后更換培養(yǎng)基為含10％FBS和0.1％雙抗的DMEM-高糖培養(yǎng)基。

24h后用G418選擇培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，設(shè)置1000μg/mL、800μg/mL、600μg/mL、400μg/mL、200μg/mL五個篩選濃度。從最高濃度逐級篩選，至濃度降為200μg/mL時細(xì)胞生長狀況基本穩(wěn)定，維持篩選壓力一周。顯微鏡下標(biāo)記并挑取單克隆細(xì)胞至6孔板，擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)染基因表達(dá)檢測并凍存。

整個模型建立方法和功能評價，具體參見“腦缺血藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建及應(yīng)用研究，盧瓊，西南交通大學(xué)，2014年”以及專利申請?zhí)?CN201610064454.4、CN201610064398.4、CN201610090360.4。

3.2圓柚酮的cck-8細(xì)胞毒活性測定

以CCK-8試劑盒檢測各單體毒性，設(shè)置100μm、10μm、1μm、0.1μm四個濃度梯度，同時設(shè)置溶劑對照組(DMSO終體積分?jǐn)?shù)為0.1％)，酶標(biāo)儀上450nm處測定OD值，計算細(xì)胞相對存活率。以相對存活率≥90％對應(yīng)的藥物濃度作為該單體成分篩選的安全濃度。

相對存活率＝[OD(加藥)-OD(空白)]/[OD(DMSO)-OD(空白)]×100％

3.3圓柚酮的活性篩選

本實驗建立的NGF細(xì)胞模型在NGF啟動子上連接了報告基因Luc(熒光素酶)，對細(xì)胞進(jìn)行加藥處理觀察該成分能使Luc表達(dá)上調(diào)作為檢測指標(biāo)。具體步驟如下：

以CCK-8試劑盒檢測得到的安全濃度作為圓柚酮的篩選濃度，同時設(shè)置陰性溶劑對照，37℃,5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后加藥處理，相同條件下連續(xù)培養(yǎng)24-48h后Reporter Lysis 1×Buffer收集細(xì)胞，BCA蛋白試劑盒測定相對熒光素酶活性^[4]。計算公式為：

相對熒光素酶活性＝熒光素酶活性/BSA蛋白含量

與陰性溶劑對照組比較計算各單體成分對NGF基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，以上調(diào)改變率≥150％作為篩選活性判斷標(biāo)準(zhǔn)。計算公式為：

上調(diào)改變率＝(實驗組相對熒光素酶活性/對照組相對熒光素酶活性)×100％

3.4 rMSC的分離培養(yǎng)

(1)購買4-6周齡SD雄性大鼠分離rMSCs。脫頸處死，腿部酒精消毒取帶肉脛骨部分。

(2)75％酒精浸泡3min后移入超凈工作臺。轉(zhuǎn)至PBS中涮洗幾次，于干凈的培養(yǎng)皿中晾干。

(3)用鑷子，手術(shù)剪等去除脛骨上的肌肉，剪去脛骨兩端，露出骨髓腔。用5mL注射器吸取一定體積的L-DMEM培養(yǎng)基(含血清15％、1％雙抗)沖洗骨髓腔，反復(fù)幾次至骨髓腔發(fā)白。

(4)沖洗液置于培養(yǎng)皿中，吹打均勻后置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

根據(jù)細(xì)胞貼壁情況進(jìn)行換液(24-48h)，換液時動作緩慢、輕柔，避免將貼壁的MSC吸走。以后每2～3天換液。至細(xì)胞達(dá)到60％～70％匯合，用胰酶25℃消化2min，1:3比例傳代。每天觀察細(xì)胞生長情況并及時換液，14天左右得到純化的MSC細(xì)胞。

3.5 Real-Time定量PCR

加藥誘導(dǎo)rMSCs，設(shè)置圓柚酮為實驗組，加維甲酸(RA)的為陽性對照組，加DMSO的為陰性對照組，以及空白對照組。每3天更換一次新鮮含藥培養(yǎng)基，按時間節(jié)點收集細(xì)胞，Trizol試劑盒提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。經(jīng)過查閱大量文獻(xiàn)資料，本實驗選取了Nestin，Vimentin，NGF，GalC，NSE五個與神經(jīng)細(xì)胞密切相關(guān)的標(biāo)志物作為檢測rMSC誘導(dǎo)分化的指標(biāo)，并選取β248作為內(nèi)參標(biāo)志物，以每1個反應(yīng)10μl反應(yīng)體系，按照下表所示依次加入反應(yīng)組分至0.5mL無菌EP管中：

β248反應(yīng)體系(表1)：

PCR反應(yīng)條件：94℃，3min；(94℃，30s；63℃，30s；72℃，30s)×24cycles；72℃，5min。

Nestin，Vimentin，NGF，GalC，NSE反應(yīng)體系(表2)：

PCR反應(yīng)條件：94℃，3min；(94℃，30s；65℃，30s；72℃，30s)×35cycles；72℃，5min。

3.6免疫熒光

分析定量PCR數(shù)據(jù)結(jié)果，最終確定免疫熒光實驗的濃度選擇10um，時間段選擇3D。

(1)分離并培養(yǎng)SD大鼠MSCs，待細(xì)胞長至第P3代，細(xì)胞形態(tài)及生長狀況良好方可取適量細(xì)胞接種至小玻璃培養(yǎng)皿。

(2)在培養(yǎng)皿中細(xì)胞用1×PBS漂洗3次，每次5min；用4％的多聚甲醛固定細(xì)胞30min，用1×PBS漂洗3次，每次5min；

(3)0.2％Triton X-100(PBS配制)室溫通透15min；

1×PBS漂洗3次，每次5min，5％的BSA 4℃冰箱過夜；

(4)稀釋一抗(100μL，覆蓋玻底皿即可)常溫孵育1-2h，用1×PBS漂洗3次，每次5min；

(5)加二抗常溫孵育(100μL，覆蓋玻底皿即可)30min-1h，放在搖床里搖(避光)。用1×PBS漂洗3次，每次5min。

(6)復(fù)染核：DAPI Solution染細(xì)胞核，37℃烘箱孵育40min，需要避光(關(guān)細(xì)胞房以及超凈工作臺照明燈，稀釋過的DAPI Solution用錫箔紙包一下)，用1×PBS漂洗3次，每次5min；最后加1mL 1×PBS到波底皿里面，避免細(xì)胞干掉。照激光共聚焦。

4實驗結(jié)果

4.1圓柚酮的cck-8細(xì)胞毒活性測定

圓柚酮安全濃度大于100μm，對細(xì)胞毒性較小，確定篩選最大濃度為100μm。

4.2圓柚酮的活性篩選

根據(jù)細(xì)胞毒性實驗結(jié)果，選取100μm作為最大篩選濃度，設(shè)置100μm、10μm、1μm、0.1μm四個篩選梯度，以Hek293-NGF細(xì)胞模型進(jìn)行篩選，相熒光素酶活性測定結(jié)果表明，編號為圓柚酮對HEK293-NGF細(xì)胞NGF基因的表達(dá)改變率≥150％，均有上調(diào)作用。1μm時圓柚酮誘導(dǎo)NGF表達(dá)上調(diào)率達(dá)到峰值，故選用1μm作為定量PCR實驗rMSCs的誘導(dǎo)濃度。具體結(jié)果如圖1。

4.3 rMSC的分離培養(yǎng)

原代細(xì)胞分離后24-48h開始出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，呈長三角形，72h后貼壁細(xì)胞數(shù)量增多半量換液，以后每3D換一次液，連續(xù)培養(yǎng)一周，發(fā)現(xiàn)雜細(xì)胞不斷減少貼壁細(xì)胞不斷增多，細(xì)胞呈長三角形或圓形、少數(shù)呈多角形，并聚集成集落生長，繼續(xù)相同條件下培養(yǎng)14天，雜細(xì)胞完全消失，貼壁細(xì)胞集落逐漸融合成片，呈長三角形螺旋生長或梭形成纖維狀排列整齊緊密，此即為原代rMSC。待細(xì)胞匯合度達(dá)到85％左右即用胰酶消化，按1:3比例傳代。實驗選用第三代細(xì)胞。

4.4 Real-Time定量PCR

從定量PCR數(shù)據(jù)可看出圓柚酮組誘導(dǎo)的rMSCs在第5天時NGF和Vimentin基因表達(dá)上調(diào)均達(dá)到峰值，相對而言其他組上調(diào)都不明顯，Nestin、GalC則是在第7D達(dá)到峰值。在第3D時，各組的NSE基因相對表達(dá)量都達(dá)到峰值。與陽性對照RA比較，誘導(dǎo)趨勢基本一致。這提示加入誘導(dǎo)劑后rMSCs可能朝神經(jīng)元產(chǎn)生了分化，但具體分化為哪種細(xì)胞或分化情況有待進(jìn)一步研究。具體結(jié)構(gòu)參見圖2-圖6，各圖中，1為圓柚酮。

4.5免疫熒光

根據(jù)定量PCR結(jié)果，對圓柚酮進(jìn)行免疫熒光實驗，免疫熒光1μm為加藥濃度，3D為時間點。選擇四個基因nestin、galc、ngf、vimentin進(jìn)行檢測。四個基因均有熒光產(chǎn)生，結(jié)果見圖7。

5討論

用圓柚酮加藥處理HEK293-NGF細(xì)胞模型，與對照組相比，加藥組報告分子熒光素酶表達(dá)量均明顯上調(diào)。該成分能夠通過nestin、galc、ngf、vimentin等的表達(dá)，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)活性。