腫瘤靶向藥物有效性檢測、突變富集方法、引物對及試劑的制作方法
【專利摘要】本申請涉及腫瘤基因領(lǐng)域，公開了腫瘤靶向藥物有效性檢測、富集突變方法、引物對及試劑。本申請的方法，包括檢測受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的基因突變情況，其關(guān)聯(lián)基因包括EGFR、KRAS和BRAF中的至少一個，具體可采用包括COLD-PCR擴增步驟及測序步驟的方法。本申請還公開了一組引物對，一種包括該引物對的試劑和試劑盒。本申請通過對EGFR，KRAS和BRAF三個基因的突變情況進行檢測，可為腫瘤靶向藥物有效性提供指導(dǎo)。通過以本申請公開的引物對進行COLD-PCR擴增可富集突變，將擴增結(jié)果測序可使常規(guī)PCR/sanger測序法檢測突變率的靈敏度從原來的20%提高到1%，大大的降低了檢測的假陰性率。
【專利說明】腫瘤靶向藥物有效性檢測、突變富集方法、引物對及試劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請涉及腫瘤基因領(lǐng)域，尤其涉及一種腫瘤靶向藥物有效性的檢測方法，一種富集腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的突變的方法、一組引物對以及一種試劑及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是當(dāng)今威脅人類健康的最大疾病，人們一直在尋找針對腫瘤的治療藥物。隨著當(dāng)代分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，靶向藥物作為一種新興的高科技藥物逐漸進入腫瘤治療領(lǐng)域，且快速發(fā)展成為治療腫瘤的有效措施。靶向藥物治療就是使藥物瞄準(zhǔn)腫瘤部位，在局部保存相對高的濃度，延長藥物的時間，提高對腫瘤的殺傷力，而對正常組織細(xì)胞作用較小。
[0003]靶向藥物與一般常規(guī)化療藥物不同，靶向藥物通過與腫瘤細(xì)胞的特征性位點結(jié)合，干預(yù)控制腫瘤細(xì)胞生長增殖的基因信號傳導(dǎo)通路。而腫瘤細(xì)胞具有有多樣性，腫瘤細(xì)胞的特征性位點也因人而異。因此在使用腫瘤靶向藥物之前，對患者體內(nèi)的基因進行檢測，以判斷其體內(nèi)是否有符合條件的基因，一定程度上預(yù)知藥物是否會奏效。因此有必要設(shè)計腫瘤靶向藥物有效性的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對上述現(xiàn)狀，本申請的目的在于提供一種腫瘤靶向藥物有效性的檢測方法、一種富集腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的突變的方法、一組引物對和一種試劑及試劑盒。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本申請?zhí)峁┝艘环N腫瘤靶向藥物有效性的檢測方法，包括檢測受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的`基因突變情況，所述腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一種。
[0006]進一步的，上述檢測受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的基因突變情況包括檢測受體內(nèi)以下a-h中至少一組突變位點的突變情況:
[0007]a、EGFR基因第709和/或719號密碼子；
[0008]b、EGFR基因第746-750號密碼子；
[0009]c、EGFR基因第790號密碼子；
[0010]d、EGFR基因第858號密碼子；
[0011]e、KRAS基因第12和/或第13號密碼子；
[0012]f、KRAS基因第61號密碼子；
[0013]g、KRAS基因第146號密碼子；
[0014]h、BRAF基因第600號密碼子。
[0015]本申請中檢測受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的基因突變情況是采用包括COLD-PCR擴增步驟及測序步驟的方法進行。
[0016]進一步的，在所述測序步驟后，包括分析測序結(jié)果，即根據(jù)所述測序結(jié)果判斷腫瘤靶向藥物的有效性。[0017]具體的，上述COLD-PCR擴增步驟包括利用引物對對核酸樣品進行第一擴增步驟和第二擴增步驟，第一擴增步驟結(jié)束后進入第二擴增步驟。
[0018]進一步的，所述突變位點a-h各自對應(yīng)的COLD-PCR的引物對依次為:
[0019]a:引物對A:上游引物為Seq ID N0.1所示序列，下游引物為Seq ID N0.2所示序列；
[0020]b:引物對B:上游引物為Seq ID N0.3所示序列，下游引物為Seq ID N0.4所示序列；
[0021]c:引物對C:上游引物為Seq ID N0.5所示序列，下游引物為Seq ID N0.6所示序列；
[0022]d:引物對D:上游引物為Seq ID N0.7所示序列，下游引物為Seq ID N0.8所示序列；
[0023]e:引物對E:上游引物為Seq ID N0.9所示序列，下游引物為Seq ID N0.10所示序列；
[0024]f:引物對F:上游引物為Seq ID N0.11所示序列，下游引物為Seq ID N0.12所示序列；
[0025]g:引物對G:上游引物為Seq ID N0.13所示序列，下游引物為Seq ID N0.14所示序列；
[0026]h:引物對H:上游引物為Seq ID N0.15所示序列，下游引物為Seq ID N0.16所示`序列。
[0027]上述第一擴增步驟可為常規(guī)PCR擴增，依次包括預(yù)變性、第一循環(huán)和終延伸，該第一循環(huán)依次包括變性、退火和延伸。上述第二擴增依次包括預(yù)變性、第二循環(huán)和終延伸，該第二循環(huán)依次包括變性、雜交溫度處理、臨界溫度(Tc溫度)處理、退火和延伸。
[0028]優(yōu)選的，上述第一擴增步驟中，常規(guī)PCR可采用熒光PCR。
[0029]上述第一循環(huán)和第二循環(huán)的退火中，其引物退火溫度的確定可包括以下步驟:利用上述關(guān)聯(lián)基因的參考序列設(shè)計引物，獲得引物對及引物退火溫度預(yù)定值。利用該引物對，以該引物退火溫度預(yù)定值_5°C所得溫度值的±4°C范圍內(nèi)的不同溫度作為實驗引物退火溫度對核酸樣品進行常規(guī)PCR，得到不同溫度下的常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物。在上述擴增產(chǎn)物中選擇出最優(yōu)擴增產(chǎn)物，以該最優(yōu)擴增產(chǎn)物的實驗引物退火溫度作為引物退火溫度。
[0030]優(yōu)選的，最優(yōu)擴增產(chǎn)物通過擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果確定。
[0031]優(yōu)選的，引物的退火溫度，對應(yīng)上述A-H引物對，依次為:
[0032]引物對A:56_64°C，優(yōu)選 62°C，
[0033]引物對B:56_64°C，優(yōu)選 62°C，
[0034]弓丨物對C:56-64 0C，優(yōu)選 59 O，
[0035]引物對D:56_64°C，優(yōu)選 61°C，
[0036]弓丨物對E: 54-60 V，優(yōu)選 58 V，
[0037]引物對F:56_64°C，優(yōu)選 62°C，
[0038]弓丨物對G: 54-60 V，優(yōu)選 57 O，
[0039]弓丨物對H: 54-60 V，優(yōu)選 58 V。
[0040]上述第二循環(huán)的Tc溫度處理中，其Tc溫度的確定包括以下步驟:以上述引物對和上述引物退火溫度，對核酸樣品進行常規(guī)PCR，確定常規(guī)PCR擴增得到的樣品片段的Tm值。以上述引物對、上述引物退火溫度以及上述Tm值±2°C范圍內(nèi)的不同溫度作為實驗Tc溫度，對突變型樣品進行COLD-PCR，根據(jù)不同實驗Tc溫度下的COLD-PCR擴增結(jié)果確定Tc溫度。
[0041]優(yōu)選的，上述常規(guī)PCR可采用熒光PCR，根據(jù)熒光PCR擴增產(chǎn)物的溶解曲線確定Tm值。
[0042]上述突變型樣品包括突變序列。
[0043]上述突變型樣品可選自真實樣品和模擬樣品中的至少一種。
[0044]上述突變型樣品所含突變大于或等于1%。
[0045]優(yōu)選的，臨界溫度，對應(yīng)上述A-H引物對，依次為:
[0046]引物對A:83.5-85.5°C，優(yōu)選 85°C，
[0047]引物對B:81.5-83.5°C，優(yōu)選 83.1°C,
[0048]引物對C:91.5-93.5°C，優(yōu)選 92.5°C,
[0049]引物對D:86.5-88.5°C，優(yōu)選 87.3°C, [0050]引物對E:81.5-84.5°C，優(yōu)選 83.2V，
[0051]引物對F:81.5-82.8°C，優(yōu)選 81.9°C,
[0052]引物對G:76.5-79.5°C，優(yōu)選 78.3°C,
[0053]引物對H:79-81 °C，優(yōu)選 80.4°C。
[0054]另一方面，本申請還公開了一種富集腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的突變的方法，該富集突變的方法包括COLD-PCR擴增步驟。腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一種。
[0055]優(yōu)選的，富集腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的突變包括富集上述突變位點a-h中的至少
一類突變。
[0056]進一步優(yōu)選的，COLD-PCR擴增步驟中采用的引物對選自上述引物對A、B、C、D、E、F、G和H中的至少一對，該引物對A-H與突變位點a-h依次對應(yīng)。具體的，該富集突變的方法中，COLD-PCR擴增步驟包括利用引物對對核酸樣品進行第一擴增步驟和第二擴增步驟，第一擴增步驟結(jié)束后進入第二擴增步驟。
[0057]上述第一擴增步驟可為常規(guī)PCR擴增，依次包括預(yù)變性、第一循環(huán)和終延伸，該第一循環(huán)依次包括變性、退火和延伸。上述第二擴增依次包括預(yù)變性、第二循環(huán)和終延伸，該第二循環(huán)依次包括變性、雜交溫度處理、臨界溫度(Tc溫度)處理、退火和延伸。優(yōu)選的，上述第一擴增步驟中，常規(guī)PCR可采用熒光PCR。
[0058]上述第一循環(huán)和第二循環(huán)的退火中，其引物退火溫度的確定可包括以下步驟:利用上述關(guān)聯(lián)基因的參考序列設(shè)計引物，獲得引物對及引物退火溫度預(yù)定值。利用該引物對，以該引物退火溫度預(yù)定值_5°C所得溫度值的±4°C范圍內(nèi)的不同溫度作為實驗引物退火溫度對核酸樣品進行常規(guī)PCR，得到不同溫度下的常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物。在上述擴增產(chǎn)物中選擇出最優(yōu)擴增產(chǎn)物，以該最優(yōu)擴增產(chǎn)物的實驗引物退火溫度作為引物退火溫度。
[0059]優(yōu)選的，最優(yōu)擴增產(chǎn)物通過擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果確定。
[0060]優(yōu)選的，引物的退火溫度，對應(yīng)上述A-H引物對，依次為: [0061]引物對A:56_64°C，優(yōu)選 62°C，[0062]引物對B:56_64°C，優(yōu)選 62°C，
[0063]引物對C:56_64°C，優(yōu)選 59°C，
[0064]引物對D:56_64°C，優(yōu)選 61°C，
[0065]弓丨物對E: 54-60 V，優(yōu)選 58 V，
[0066]引物對F:56_64°C，優(yōu)選 62°C，
[0067]引物對G:54-60°C，優(yōu)選 57°C，
[0068]弓丨物對H: 54-60 V，優(yōu)選 58 V。
[0069]上述第二循環(huán)的Tc溫度處理中，其Tc溫度的確定包括以下步驟:以上述引物對和上述引物退火溫度，對核酸樣品進行常規(guī)PCR，確定常規(guī)PCR擴增得到的樣品片段的Tm值。以上述引物對、上述引物退火溫度以及上述Tm值±2°C范圍內(nèi)的不同溫度作為實驗Tc溫度，對突變型樣品進行C0LD-PCR，根據(jù)不同實驗Tc溫度下的COLD-PCR擴增結(jié)果確定Tc溫度。
[0070]優(yōu)選的，上述常規(guī)PCR可采用熒光PCR，根據(jù)熒光PCR擴增產(chǎn)物的溶解曲線確定Tm值。
[0071]上述突變型樣品包括突變序列。
[0072]上述突變型樣品可選自真實樣品和模擬樣品中的至少一種。
[0073]上述突變型樣品所含突變大于或等于1%。
[0074]優(yōu)選的，臨界溫度，對應(yīng)上述A-H引物對，依次為:
[0075]引物對A:83.5-85.5°C，優(yōu)選 85°C，
[0076]引物對B:81.5-83.5°C，優(yōu)選 83.1°C,
[0077]引物對C:91.5-93.5°C，優(yōu)選 92.5°C,
[0078]引物對D:86.5-88.5°C，優(yōu)選 87.3°C,
[0079]引物對E:81.5-84.5°C，優(yōu)選 83.2V，
[0080]引物對F:81.5-82.8°C，優(yōu)選 81.9°C, [0081]引物對G:76.5-79.5°C，優(yōu)選 78.3°C,
[0082]引物對H:79-81 °C，優(yōu)選 80.4°C。
[0083]同時，本申請?zhí)峁┝艘唤M引物對，該引物對選自以上引物對A、B、C、D、E、F、G和H
中的至少一對。
[0084]該引物對可用于腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因、富集腫瘤靶向藥物基因的突變或腫瘤靶向藥物有效性的檢測，該腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因為EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一種。
[0085]具體的，該引物對可用于COLD-PCR擴增，且進行COLD-PCR擴增時的引物退火溫度，對應(yīng)上述A-H引物對，依次為:
[0086]引物對A:56_64°C，優(yōu)選 62°C，
[0087]引物對B:56_64°C，優(yōu)選 62°C，
[0088]引物對C:56_64°C，優(yōu)選 59°C，
[0089]引物對D:56_64°C，優(yōu)選 61°C，
[0090]弓丨物對E: 54-60 V，優(yōu)選 58 V，
[0091]引物對F:56_64°C，優(yōu)選 62°C，[0092]弓丨物對G: 54-60 V，優(yōu)選 57 °C，
[0093]弓丨物對H: 54-60 V，優(yōu)選 58 V。
[0094]該弓丨物對可用于COLD-PCR擴增，且進行COLD-PCR擴增時的Tc溫度，對應(yīng)上述A-H引物對，依次為:
[0095]引物對A:83.5-85.5°C，優(yōu)選 85°C，
[0096]引物對B:81.5-83.5°C，優(yōu)選 83.1°C,
[0097]引物對C:91.5-93.5°C，優(yōu)選 92.5°C,
[0098]引物對D:86.5-88.5°C，優(yōu)選 87.3°C,
[0099]引物對E:81.5-84.5°C，優(yōu)選 83.2V，
[0100]引物對F:81.5-82.8°C，優(yōu)選 81.9°C,
[0101]引物對G:76.5-79.5°C，優(yōu)選 78.3°C,
[0102]引物對H:79-81 °C，優(yōu)選 80.4°C。
[0103]本申請還提供了一種試劑，該試劑包括上述引物對。
[0104]本申請同時還提供了一種`包括上述引物對或試劑的試劑盒。
[0105]本申請的有益效果是:通過對EGFR，KRAS和BRAF三個基因的突變情況進行檢測，可以為腫瘤靶向藥物有效性提供指導(dǎo)。
[0106]進一步的，本申請針對EGFR，KRAS和BRAF三個基因的8類突變位點，通過采用以本申請公開的引物對進行COLD-PCR擴增后測序的方法，可使得常規(guī)的PCR/sanger測序法檢測突變率的靈敏度從原來的20%提高到1%，從而大大的降低了檢測的假陰性率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0107]圖1為本申請的一種【具體實施方式】中，采用引物對A對樣品進行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴增后的產(chǎn)物電泳圖以及對擴增產(chǎn)物進行sanger測序的測序結(jié)果圖；
[0108]圖2為本申請的一種【具體實施方式】中，采用引物對B對樣品進行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴增后的產(chǎn)物電泳圖以及對擴增產(chǎn)物進行sanger測序的測序結(jié)果圖；
[0109]圖3為本申請的一種【具體實施方式】中，采用引物對C對樣品進行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴增后的產(chǎn)物電泳圖以及對擴增產(chǎn)物進行sanger測序的測序結(jié)果圖；
[0110]圖4為本申請的一種【具體實施方式】中，采用引物對D對樣品進行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴增后的產(chǎn)物電泳圖以及對擴增產(chǎn)物進行sanger測序的測序結(jié)果圖；
[0111]圖5為本申請的一種【具體實施方式】中，采用引物對E對樣品進行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴增后的產(chǎn)物電泳圖以及對擴增產(chǎn)物進行sanger測序的測序結(jié)果圖；
[0112]圖6為本申請的一種【具體實施方式】中，采用引物對F對樣品進行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴增后的產(chǎn)物電泳圖以及對擴增產(chǎn)物進行sanger測序的測序結(jié)果圖；
[0113]圖7為本申請的一種【具體實施方式】中，采用引物對G對樣品進行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴增后的產(chǎn)物電泳圖以及對擴增產(chǎn)物進行sanger測序的測序結(jié)果圖；
[0114]圖8為本申請的一種【具體實施方式】中，采用引物對H對樣品進行COLD-PCR和常規(guī)PCR擴增后的產(chǎn)物電泳圖以及對擴增產(chǎn)物進行sanger測序的測序結(jié)果圖。
【具體實施方式】[0115]目前，市場上已有的一些腫瘤靶向藥物主要是單克隆抗體藥物、小分子藥物和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)藥物。例如，易瑞沙和特羅凱作為表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)是用于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)靶向治療的主要藥物。EGFR基因突變是癌癥患者是否對TKI敏感的強預(yù)測因子。研究發(fā)現(xiàn)KRAS基因、BRAF基因處于EGFR信號通路的下游，KRAS.BRAF基因突變時，可以導(dǎo)致EGRF信號通路持續(xù)激活。研究還表明，抗EGFR單克隆抗體類藥物療效與結(jié)直腸癌患者KRAS基因突變有明顯相關(guān)，只有KRAS基因野生型患者才可能對藥物治療有效，而突變型患者對藥物治療無效。BRAF基因突變的腫瘤患者對EGFR-TKI及EGFR單抗藥物治療不敏感，更易發(fā)生腫瘤惡化，總生存率低。由于瘤細(xì)胞生長增殖的基因信號傳導(dǎo)通路十分復(fù)雜涉及上游、下游的多個基因，因此有必要設(shè)計更有針對性的腫瘤靶向藥物有效性檢測方法。因此，本申請中對受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的基因突變情況進行檢測，該關(guān)聯(lián)基因包括EGFR基因，KRAS基因和BRAF基因中的至少一種。本申請中受體是指靶向藥物的被施予者，該受體可以是人體或動物體等，具體可根據(jù)基因檢測的常規(guī)技術(shù)手段采用受體的離體樣品例如血液或毛發(fā)等提取出核酸樣品作為具體的檢測對象。通過對上述基因的檢測可為腫瘤靶向藥物有效性提供指導(dǎo)。
[0116]本申請主要是檢測EGFR，KRAS和BRAF三個基因中的8類突變位點的突變情況，涉及EGFR基因的第18、19、20、21外顯子，KRAS基因的第2、3外顯子，BRAF基因的第15號外顯子。本申請中檢測的突變位點具體為:
[0117]a、EGFR基因第709和/或719號密碼子，均位于EGFR基因第18外顯子上；
[0118]b、EGFR基因第746-750號密碼子，位于EGFR基因第19外顯子上，本申請中主要檢測該段基因是否缺失；
[0119]c、EGFR基因第790號密碼子，位于EGFR基因第20外顯子上； [0120]d、EGFR基因第858號密碼子，位于EGFR基因第21外顯子上；
[0121]e、KRAS基因第12和/或第13號密碼子，位于KRAS基因第2外顯子；
[0122]f、KRAS基因第61號密碼子，位于KRAS基因第3外顯子；
[0123]g、KRAS基因第146號密碼子，位于KRAS基因第3外顯子；
[0124]h、BRAF基因第600號密碼子，位于EGFR基因第15外顯子上。
[0125]檢測位點的詳細(xì)信息可參見下表1:
[0126]表1、關(guān)聯(lián)基因突變位點的詳細(xì)信息表點
[0127]
【權(quán)利要求】
1.一種腫瘤靶向藥物有效性的檢測方法，包括檢測受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的基因突變情況，其特征在于，所述腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一種；優(yōu)選的，所述檢測受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的基因突變情況包括檢測受體內(nèi)以下a-h中至少一類突變位點中的突變情況: a、EGFR基因第709和/或719號密碼子； b、EGFR基因第746-750號密碼子； c、EGFR基因第790號密碼子； d、EGFR基因第858號密碼子； e、KRAS基因第12和/或第13號密碼子； f、KRAS基因第61號密碼子； g、KRAS基因第146號密碼子； h、BRAF基因第600號密碼子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測受體內(nèi)腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的基因突變情況是采用包括COLD-PCR擴增步驟及測序步驟的方法進行； 其中，所述COLD-PCR擴增步驟包括利用引物對進行第一擴增步驟和第二擴增步驟:所述第一擴增步驟為常規(guī)PCR擴增，包括預(yù)變性、第一循環(huán)和終延伸，所述第一循環(huán)包括變性、退火和延伸； 所述第二擴增包括預(yù)變性、第二循環(huán)`和終延伸，所述第二循環(huán)包括變性、雜交溫度處理、臨界溫度處理、退火和延伸； 優(yōu)選的，所述引物對，對應(yīng)所述a-h突變位點，依次為: a:引物對A:上游引物為Seq ID N0.1所示序列，下游引物為Seq ID N0.2所示序列， b:引物對B:上游引物為Seq ID N0.3所示序列，下游引物為Seq ID N0.4所示序列， c:引物對C:上游引物為Seq ID N0.5所示序列，下游引物為Seq ID N0.6所示序列， d:引物對D:上游引物為Seq ID N0.7所示序列，下游引物為Seq ID N0.8所示序列， e:引物對E:上游引物為Seq ID N0.9所示序列，下游引物為Seq ID N0.10所示序列， f:引物對F:上游引物為Seq ID N0.11所示序列，下游引物為Seq ID N0.12所示序列， g:引物對G:上游引物為Seq ID N0.13所示序列，下游引物為Seq ID N0.14所示序列， h:引物對H:上游引物為Seq ID N0.15所示序列，下游引物為Seq ID N0.16所示序列； 優(yōu)選的，所述常規(guī)PCR為熒光PC R; 優(yōu)選的，所述退火中，其引物退火溫度的確定包括: 利用所述關(guān)聯(lián)基因的參考序列設(shè)計引物，獲得引物對及引物退火溫度預(yù)定值； 利用所述引物對，以所述引物退火溫度預(yù)定值-5度所得溫度值的±4度范圍內(nèi)的溫度作為實驗引物退火溫度對核酸樣品進行常規(guī)PCR，得到擴增產(chǎn)物； 選擇擴增產(chǎn)物中的最優(yōu)擴增產(chǎn)物，以所述最優(yōu)擴增產(chǎn)物的實驗引物退火溫度作為所述引物退火溫度； 優(yōu)選的，所述引物的退火溫度，對應(yīng)所述A-H引物對，依次為: 引物對A:56-64°C，優(yōu)選62 °C， 引物對B:56-64°C，優(yōu)選62 °C，引物對C: 56-64 °C，優(yōu)選59 °C, 引物對D:56-64°C，優(yōu)選61°C， 引物對E: 54-60 V，優(yōu)選58 V， 引物對F:56-64°C，優(yōu)選62 °C， 引物對G: 54-60 V，優(yōu)選57 °C, 引物對H: 54-60 V，優(yōu)選58 V ； 優(yōu)選的，所述最優(yōu)擴增產(chǎn)物通過擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果確定； 優(yōu)選的，所述第二循環(huán)中，其臨界溫度的確定包括: 以引物對和引物退火溫度，對核酸樣品進行常規(guī)PCR，確定常規(guī)PCR擴增得到的樣品擴增產(chǎn)物的Tm值； 以所述引物對、所述引物退火溫度以及所述Tm值±2度范圍內(nèi)的溫度作為實驗臨界溫度，對突變型樣品進行COLD-PCR，根據(jù)COLD-PCR擴增結(jié)果確定臨界溫度； 優(yōu)選的，所述臨界溫度，對應(yīng)所述A-H引物對，依次為:
引物對 A:83.5-85.5°C，優(yōu)選 85°C，
引物對 B:81.5-83.5°`C，優(yōu)選 83.1°C,
引物對 C:91.5-93.5°C，優(yōu)選 92.5°C,
引物對 D:86.5-88.5°C，優(yōu)選 87.3 °C,
引物對 E:81.5-84.5°C，優(yōu)選 83.2V，
引物對 F:81.5-82.8°C，優(yōu)選 81.9°C,
引物對 G: 76.5-79.5°C，優(yōu)選 78.3 °C, 引物對 H:79-81°C，優(yōu)選 80.40C ； 優(yōu)選的，所述常規(guī)PCR采用熒光PCR，根據(jù)熒光PCR擴增產(chǎn)物的溶解曲線確定Tm值； 優(yōu)選的，所述突變型樣品包括突變序列； 優(yōu)選的，所述突變型樣品選自真實樣品和模擬樣品中的至少一種； 優(yōu)選的，所述突變型樣品所含突變大于或等于1%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于，在所述測序步驟后，進一步包括分析測序結(jié)果，根據(jù)所述測序結(jié)果判斷腫瘤靶向藥物有效性。
4.一種富集腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的突變的方法，其特征在于，所述富集突變的方法包括COLD-PCR擴增步驟； 所述腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一種； 優(yōu)選的，所述富集腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的突變包括富集以下a-h中的至少一類突變: a、EGFR基因第709和/或719號密碼子， b、EGFR基因第746-750號密碼子， c、EGFR基因第790號密碼子， d、EGFR基因第858號密碼子， e、KRAS基因第12和/或第13號密碼子， f> KRAS基因第61號密碼子， g、KRAS基因第146號密碼子，h、BRAF基因第600號密碼子； 優(yōu)選的，所述COLD-PCR擴增步驟包括利用引物對進行第一擴增步驟和第二擴增步驟:所述第一擴增步驟為常規(guī)PCR擴增，包括預(yù)變性、第一循環(huán)和終延伸，所述第一循環(huán)包括變性、退火和延伸； 所述第二擴增包括預(yù)變性、第二循環(huán)和終延伸，所述第二循環(huán)包括變性、雜交溫度處理、臨界溫度處理、退火和延伸； 優(yōu)選的，所述引物對，對應(yīng)所述a-h突變位點，依次為； a:引物對A:上游引物為Seq ID N0.1所示序列，下游引物為Seq ID N0.2所示序列， b:引物對B:上游引物為Seq ID N0.3所示序列，下游引物為Seq ID N0.4所示序列， c:引物對C:上游引物為Seq ID N0.5所示序列，下游引物為Seq ID N0.6所示序列， d:引物對D:上游引物為Seq ID N0.7所示序列，下游引物為Seq ID N0.8所示序列， e:引物對E:上游引物為Seq ID N0.9所示序列，下游引物為Seq ID N0.10所示序列， f:引物對F:上游引物為Seq ID N0.11所示序列，下游引物為Seq ID N0.12所示序列， g:引物對G:上游引物為Seq ID N0.13所示序列，下游引物為Seq ID N0.14所示序列， h:引物對H:上游引物為Seq ID N0.15所示序列，下游引物為Seq ID N0.16所示序列； 優(yōu)選的，所述常規(guī)PCR為熒光PCR; 優(yōu)選的，所述退火中，其引物退火溫度的確定包括: 利用所述關(guān)聯(lián)基因的參考序列設(shè)計引物，獲得引物對及引物退火溫度預(yù)定值； 利用所述引物對，以所述引物退火溫度預(yù)定值-5度所得溫度值的±4度范圍內(nèi)的溫度作為實驗引物退火溫度對核酸樣品進行常規(guī)PCR，得到擴增產(chǎn)物； 選擇擴增產(chǎn)物中的最優(yōu)擴增產(chǎn)物，以所述最優(yōu)擴增產(chǎn)物的實驗引物退火溫度作為所述引物退火溫度； 優(yōu)選的，所述引物的退火溫度，對應(yīng)所述A-H引物對，依次為: 引物對A:56-64°C，優(yōu)選62 °C， 引物對B:56-64°C，優(yōu)選62 °C， 引物對C: 56-64 °C，優(yōu)選59 °C, 引物對D:56-64°C，優(yōu)選61°C， 引物對E: 54-60 V，優(yōu)選58 V， 引物對F:56-64°C，優(yōu)選62 °C， 引物對G: 54-60 V，優(yōu)選57 °C, 引物對H: 54-60 V，優(yōu)選58 V ； 優(yōu)選的，所述最優(yōu)擴增產(chǎn)物通過擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果確定； 優(yōu)選的，所述第二循環(huán)中，其臨界溫度的確定包括: 以引物對和引物退火溫度，對核酸樣品進行常規(guī)PCR，確定常規(guī)PCR擴增得到的樣品擴增產(chǎn)物的Tm值； 以所述引物對、所述引物退火溫度以及所述Tm值±2度范圍內(nèi)的溫度作為實驗臨界溫度，對突變型樣品進行C0LD-PCR，根據(jù)COLD-PCR擴增結(jié)果確定臨界溫度； 優(yōu)選的，所述臨界溫度，對應(yīng)所述A-H引物對，依次為:引物對 A:83.5-85.5°C，優(yōu)選 85°C，
引物對 B:81.5-83.5°C，優(yōu)選 83.1°C,
引物對 C:91.5-93.5°C，優(yōu)選 92.5°C,
引物對 D:86.5-88.5°C，優(yōu)選 87.3°C,
引物對 E:81.5-84.5°C，優(yōu)選 83.2V，
引物對 F:81.5-82.8°C，優(yōu)選 81.9°C,
引物對 G:76.5-79.5°C，優(yōu)選 78.3°C, 引物對 H:79-81°C，優(yōu)選 80.4°C ； 優(yōu)選的，所述常規(guī)PCR采用熒光PCR，根據(jù)熒光PCR擴增產(chǎn)物的溶解曲線確定Tm值； 優(yōu)選的，所述突變型樣品包括突變序列； 優(yōu)選的，所述突變型樣品選自真實樣品和模擬樣品中的至少一種； 優(yōu)選的，所述突變型樣品所含突變大于或等于1%。
5.一組引物對，其特征在于，所述引物對選自以下引物對A、B、C、D、E、F、G和H中的至少一對: 引物對A:上游引物為Seq ID N0.1所示序列，下游引物為Seq ID N0.2所示序列； 引物對B:上游引物為Seq ID N0.3所`示序列，下游引物為Seq ID N0.4所示序列； 引物對C:上游引物為Seq ID N0.5所示序列，下游引物為Seq ID N0.6所示序列； 引物對D:上游引物為Seq ID N0.7所示序列，下游引物為Seq ID N0.8所示序列； 引物對E:上游引物為Seq ID N0.9所示序列，下游引物為Seq ID N0.10所示序列； 引物對F:上游引物為Seq ID N0.11所示序列，下游引物為Seq ID N0.12所示序列; 引物對G:上游引物為Seq ID N0.13所示序列，下游引物為Seq ID N0.14所示序列; 引物對H:上游引物為Seq ID N0.15所示序列，下游引物為Seq ID N0.16所示序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物對，其特征在于，所述引物對用于腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的檢測、富集腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因的突變或腫瘤靶向藥物有效性的檢測，所述腫瘤靶向藥物關(guān)聯(lián)基因為EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物對，其特征在于:所述引物對用于COLD-PCR擴增，且進行COLD-PCR擴增時的臨界溫度分別為:
引物對 A:83.5-85.5 °C，優(yōu)選 85 °C ;
引物對 B:8L 5-83.5°C，優(yōu)選 83.1°C ;
引物對 C:9L 5-93.5°C，優(yōu)選 92.5°C ;
引物對 D:86.5-88.5 °C，優(yōu)選 87.3 °C ;
引物對 E:8L 5-84.5°C，優(yōu)選 83.2°C ; 引物對？:81.5-82.81:，優(yōu)選81.91:;
引物對 G:76.5-79.5°C，優(yōu)選 78.3°C ；
弓 I 物對 H: 79-81V，優(yōu)選 80.40C ο
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物對，其特征在于:所述引物對用于COLD-PCR擴增，且進行COLD-PCR擴增時的退火溫度分別為: 引物對A:56-64°C，優(yōu)選62 °C， 引物對B:56-64°C，優(yōu)選62 °C，引物對C: 56-64 °C，優(yōu)選59 °C, 引物對D:56-64°C，優(yōu)選61°C， 引物對E: 54-60 V，優(yōu)選58 V， 引物對F:56-64°C，優(yōu)選62 °C， 引物對G: 54-60 V，優(yōu)選57 °C, 引物對H: 54-60 V，優(yōu)選58 V。
9.一種試劑或試劑盒，其特征在于，所述試劑包括如權(quán)利要求5-8任一項所述的引物對，所述試劑盒包括所述`試劑或權(quán)利要求5-8任一項所述的引物對。
【文檔編號】C12Q1/68GK103865993SQ201210551712
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月18日
【發(fā)明者】林楚瑜, 王靜靜, 席鳳, 管彥芳 申請人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司