本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，涉及促進腫瘤細胞攝取的ph敏感聚合物膠束組合物，尤其是包載難溶性抗腫瘤藥物的ph敏感聚合物膠束組合物。

背景技術(shù)：

目前臨床上治療腫瘤的常用化療藥物多為疏水性藥物，其在水中的溶解度非常低，難于制備合適的制劑，往往采取各種方法增加其溶解度，如將其制成鹽類、加入助溶劑及低分子表面活性劑等增溶。由于表面活性劑易得，所以臨床使用時采用低分子表面活性劑增溶往往成為首選。但該劑型血液穩(wěn)定性很差，低分子表面活性劑等輔料的毒副作用也很大，而且釋放行為不易控制。因此，研究開發(fā)難溶性抗腫瘤藥物的載體對臨床腫瘤治療有著重要的意義。近年來，聚合物膠束得到廣泛關(guān)注，目前已有上市產(chǎn)品，如紫杉醇的peg-pla膠束genexol-pm。nk105、nc6004、nc4016和bind-014進入臨床研究階段。

聚合物膠束是兩親性聚合物在水環(huán)境中自組裝形成的獨特的核-殼結(jié)構(gòu)，能夠增溶難溶性藥物，并且其納米級粒徑可避免被巨噬細胞識別和吞噬，通過腫瘤組織epr效應(yīng)而增強被動靶向性，減少藥物不良反應(yīng)，被認(rèn)為是最有前景的抗腫瘤藥物傳遞系統(tǒng)之一。然而，常規(guī)的聚合物膠束存在兩大缺陷：一是膠束在體循環(huán)中過早的釋藥，增加了全身的毒副作用；二是腫瘤部位釋放藥物的濃度或藥物的蓄積不夠，達不到有效治療濃度。因此，降低體內(nèi)循環(huán)時藥物的釋放、控制聚合物膠束到達腫瘤部位或進入腫瘤細胞后再快速釋放藥物是提高抗腫瘤藥物的有效性和安全性的一種有效方式。具有響應(yīng)外部環(huán)境刺激(如溫度、ph、超聲、酶等)而觸發(fā)釋放的智能型聚合物膠束在這方面具有十分明顯的優(yōu)勢，并已經(jīng)成為抗腫瘤藥物制劑的研究熱點，其中ph依賴性釋放藥物的聚合物膠束最為引人關(guān)注。這是因為，一方面，實體瘤的細胞外間質(zhì)phe為6.5-7.2，低于正常組織的ph7.4；細胞內(nèi)部含有ph更低的內(nèi)涵體(ph5.5-6.0)和溶酶體(ph4.5-5.0)。另一方面，聚合物膠束主要通過內(nèi)吞入胞，膠束由胞外內(nèi)化入胞及隨后的過程要經(jīng)歷ph的梯度變化。當(dāng)外部環(huán)境的ph高于形成聚合物膠束的聚合物的pka時，聚合物膠束以緊密完整的形態(tài)包載藥物，基本不釋放；當(dāng)外部環(huán)境的ph低于形成聚合物膠束的聚合物的pka時，膠束急劇膨脹，甚至解聚，藥物便快速釋放。因此，在腫瘤部位或入胞后的膠束響應(yīng)其ph環(huán)境的變化釋藥加快。利用這一特性可以實現(xiàn)體內(nèi)特定部位(腫瘤)或細胞內(nèi)(內(nèi)涵體、溶酶體、細胞質(zhì))靶向給藥。為了將抗腫瘤藥物更加特異性輸送至腫瘤部位，還可用對腫瘤細胞具有特異性識別功能的配基和配體對膠束表面進行修飾，增強腫瘤細胞對載藥膠束的攝取，從而提高藥物的療效。但此法膠束制備步驟繁瑣、費用較高且貯存 條件要求高。

另外，在公開的現(xiàn)有技術(shù)中，由于生物相容性和生物可降解性的限制，形成ph敏感聚合物膠束的ph敏感嵌段聚合物的親水鏈段一般僅局限于聚乙二醇(peg)，而處于膠束親水表面的peg可能阻礙膠束的細胞攝取和隨后的胞內(nèi)過程。此外，ph敏感聚合物膠束的ph敏感嵌段普遍是疏水鏈段呈現(xiàn)ph敏感性，由其形成膠束的ph敏感區(qū)域在膠束內(nèi)核，其對外部環(huán)境ph的刺激響應(yīng)較遲緩，因此在弱酸性條件下的釋放雖然快于ph7.4的情況，但還是相對緩慢。專利申請201310141556.8、201310141534.1和201310141558.7分別以聚(2-烷基-2-噁唑啉)(paoz)為ph敏感的親水鏈段，構(gòu)建ph敏感的聚合物膠束，在一定程度上實現(xiàn)了降低體內(nèi)循環(huán)時藥物的釋放、到達腫瘤部位或進入腫瘤細胞后快速釋放藥物的目的。

因此，研制一種降低抗腫瘤藥物對正常細胞或組織的毒副作用、增強細胞的攝取以及促進膠束在腫瘤細胞內(nèi)的快速釋放的聚合物膠束載體系統(tǒng)，有著廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服常規(guī)聚合物膠束過早釋藥、腫瘤細胞攝取不足以及腫瘤部位釋放藥物的濃度或藥物的蓄積不夠的問題。

一方面，本發(fā)明提供一種用于治療腫瘤的包載難溶性抗腫瘤藥物的ph敏感聚合物膠束組合物。該組合物包含ph敏感兩親性嵌段聚合物、在腫瘤部位荷正電的材料和難溶性抗腫瘤活性成分。所述ph敏感兩親性嵌段聚合物的親水鏈段是具有ph敏感性的聚(2-烷基-2-噁唑啉)(paoz)，疏水鏈段選自聚酯(pe)、聚乙二醇維生素e琥珀酸酯(tpgs)和維生素e琥珀酸酯(ves)；所述的ph敏感兩親性嵌段聚合物是二嵌段、三嵌段聚合物和/或它們的混合物。其中，所述的親水鏈段paoz的分子量為600～20000，優(yōu)選1000～15000，更優(yōu)選3000～10000；疏水鏈段中的pe的分子量為800～20000，優(yōu)選1000～15000，更優(yōu)選2000～10000；疏水鏈段中tpgs的聚乙二醇部分的分子量為200～2000，優(yōu)選400～1500，更優(yōu)選600～1200。

所述的聚(2-烷基-2-噁唑啉)(paoz)嵌段中的烷基是含有1-6個碳原子的烷基，優(yōu)選1-4個碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、正丁基，更優(yōu)選甲基或乙基。

所述的疏水鏈段選自聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚丁內(nèi)酯、聚戊內(nèi)酯、聚乙交酯丙交脂、膽酸、tpgs、維生素e琥珀酸酯、磷脂和磷脂衍生物，優(yōu)選選自聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙交酯丙交酯、維生素e琥珀酸酯和磷脂，更優(yōu)選選自聚乳酸、維生素e琥珀酸酯和磷脂。

所述的在腫瘤部位荷正電的材料可以是聚氨基酸，陽離子表面活性劑，以及它們的混合物。所述的ph敏感兩親性嵌段聚合物與在腫瘤部位荷正電的材料的摩爾比為40∶1-1∶2，優(yōu)選20∶1-1∶1，更優(yōu)選10∶1-5∶3。

所述的聚氨基酸選自聚組氨酸、聚精氨酸和聚賴氨酸，優(yōu)選選自聚組氨酸和聚賴氨酸。 更優(yōu)選聚組氨酸。

所述的聚氨基酸的分子量為1000～20000，優(yōu)選3000～15000，更優(yōu)選4000～10000。

所述的陽離子表面活性劑選自氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基銨(dotma)、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基銨(dotap)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基銨(dospa)、溴化三甲基十二烷基銨(dtab)、溴化三甲基十四烷基銨(ttab)、溴化三甲基十六烷基銨(ctab)、溴化二甲基雙十八烷基銨(ddab)、溴化二甲基-2-羥乙基-2,3-二油酰氧基丙基銨(dori)、溴化二甲基-2-羥乙基-2,3-二油烯氧基丙基銨(dorie)、溴化二甲基-3-羥丙基-2,3-二油烯氧基丙基銨(dorie-hp)、溴化二甲基-4-羥丁基-2,3-二油烯氧基丙基銨(dorie-hb)、溴化二甲基-5-羥戊基-2,3-二油烯氧基丙基銨(dorie-hpc)、溴化二甲基-2-羥乙基-2,3-雙十六烷氧基丙基銨(dprie)、溴化二甲基-2-羥乙基-2,3-雙十八烷氧基丙基銨(dsrie)、溴化二甲基-2-羥乙基-2,3-雙十四烷氧基丙基銨(dmrie)、n-(2-精胺甲?；?-n’,n’-雙十八烷基甘氨酰胺(dogs)、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油膽堿酯(dosc)、3β-[n-(n’,n’-二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇(dc-chol)和硬脂胺(sa)，優(yōu)選選自氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基銨(dotma)、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基銨(dotap)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基銨(dospa)、n-(2-精胺甲酰基)-n’,n’-雙十八烷基甘氨酰胺(dogs)、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油膽堿酯(dosc)、3β-[n-(n’,n’-二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇(dc-chol)和硬脂胺(sa)，更優(yōu)選選自n-(2-精胺甲?；?-n’,n’-雙十八烷基甘氨酰胺(dogs)、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油膽堿酯(dosc)和3β-[n-(n’,n’-二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇(dc-chol)。

所述的難溶性抗腫瘤活性成分選自但不限于紫杉烷類藥物，例如紫杉醇、喜樹堿類藥物，例如9-硝基喜樹堿、蒽環(huán)類藥物，例如阿霉素、鬼臼毒素半合成衍生物類藥物，例如替尼泊苷、替尼類藥物，例如索尼替尼，優(yōu)選選自紫杉醇、多西紫杉醇和阿霉素。

另外，本發(fā)明的組合物還可以包含藥學(xué)上可接受的添加劑。

本發(fā)明用于治療腫瘤的包載難溶性抗腫瘤藥物的增強腫瘤細胞攝取的ph敏感聚合物膠束組合物可以通過本領(lǐng)域公知的方法制備，例如透析法、薄膜分散法、乳化法、溶劑揮發(fā)法、凍干法、共溶劑揮發(fā)法、注入法等。膠束的平均粒徑在200nm以下，優(yōu)選100nm以下。

另一方面，本發(fā)明還涉及包載難溶性抗腫瘤藥物的增強腫瘤細胞攝取的ph敏感的聚合物膠束組合物用于治療腫瘤的用途。

另一方面，本發(fā)明涉及以下方案：

方案1.一種聚合物膠束組合物，其包含難溶性抗腫瘤藥物、ph敏感的兩親性嵌段聚合物、在腫瘤部位荷正電的材料以及任選的可藥用輔料，優(yōu)選其中所述的ph敏感的兩親性嵌 段聚合物與在腫瘤部位荷正電的材料的摩爾比為40∶1-1∶2，優(yōu)選20∶1-1∶1，更優(yōu)選10∶1-5∶3。

方案2.如方案1所述的聚合物膠束組合物，其中的ph敏感兩親性嵌段聚合物的親水鏈段為600～20000，優(yōu)選1000～15000，更優(yōu)選3000～10000分子量的聚(2-烷基-2-噁唑啉)；疏水鏈段選自聚酯、tpgs、維生素e琥珀酸酯、膽酸、磷脂和磷脂衍生物，優(yōu)選選自聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙交酯丙交酯、維生素e琥珀酸酯和磷脂，更優(yōu)選選自聚乳酸、維生素e琥珀酸酯和磷脂；所述的兩親性嵌段聚合物是二嵌段聚合物、三嵌段聚合物和/或它們的混合物。

方案3.如方案2所述的聚合物膠束組合物，其中聚(2-烷基-2-噁唑啉)中的烷基是含有1-6個碳原子的烷基，優(yōu)選1-4個碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基或正丁基，更優(yōu)選甲基或乙基。

方案4.如方案1-3任一項所述的聚合物膠束組合物，其中兩親性嵌段聚合物具有分子量為800～20000，優(yōu)選1000～15000，更優(yōu)選2000～10000的聚酯作為疏水鏈段，或聚乙二醇部分的分子量為200～2000，優(yōu)選400～1500，更優(yōu)選600～1200的tpgs作為疏水鏈段。

方案5.如方案1-4任一項所述的聚合物膠束組合物，其中的在腫瘤部位荷正電的材料選自聚氨基酸、陽離子表面活性劑，以及它們的混合物。

方案6.如方案5所述的聚合物膠束組合物，其中的聚氨基酸選自分子量為1000～20000，優(yōu)選3000～15000，更優(yōu)選4000～10000的聚組氨酸、聚精氨酸和聚賴氨酸。

方案7.如方案5所述的聚合物膠束組合物，其中的陽離子表面活性劑選自氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基銨、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基銨、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基銨、溴化三甲基十二烷基銨、溴化三甲基十四烷基銨、溴化三甲基十六烷基銨、溴化二甲基雙十八烷基銨、溴化二甲基-2-羥乙基-2,3-二油酰氧基丙基銨、溴化二甲基-2-羥乙基-2,3-二油烯氧基丙基銨、溴化二甲基-3-羥丙基-2,3-二油烯氧基丙基銨、溴化二甲基-4-羥丁基-2,3-二油烯氧基丙基銨、溴化二甲基-5-羥戊基-2,3-二油烯氧基丙基銨、溴化二甲基-2-羥乙基-2,3-雙十六烷氧基丙基銨、溴化二甲基-2-羥乙基-2,3-雙十八烷氧基丙基銨、溴化二甲基-2-羥乙基-2,3-雙十四烷氧基丙基銨、n-(2-精胺甲酰基)-n’,n’-雙十八烷基甘氨酰胺、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油膽堿酯和3β-[n-(n’,n’-二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇和硬脂胺，優(yōu)選選自氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基銨、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基銨、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基銨、n-(2-精胺甲?；?-n’,n’-雙十八烷基甘氨酰胺、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油膽堿酯和3β-[n-(n’,n’-二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇和硬脂胺，更優(yōu)選選自n-(2-精胺甲?；?-n’,n’-雙十八烷基甘氨酰胺、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油膽堿酯和3β-[n-(n’,n’-二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇。

方案8.如方案1-7任一項所述的聚合物膠束組合物，其中的難溶性抗腫瘤藥物選自紫杉 烷類藥物，例如紫杉醇、喜樹堿類藥物，例如9-硝基喜樹堿、蒽環(huán)類藥物，例如阿霉素、鬼臼毒素半合成衍生物類藥物，例如替尼泊苷，和替尼類藥物，例如索尼替尼，優(yōu)選選自紫杉醇、多西紫杉醇和阿霉素。

方案9.如方案1-8任一項所述的聚合物膠束組合物，其中膠束的平均粒徑在200nm以下，優(yōu)選100nm以下。

方案10.如方案1-9任一項所述的聚合物膠束組合物用于制備治療腫瘤的藥物的用途。

為了達到本發(fā)明的目的，本發(fā)明進行了本發(fā)明組合物的體外釋放試驗、細胞攝取試驗、細胞毒性試驗。體外釋放試驗用于說明本發(fā)明組合物的ph敏感性，細胞攝取試驗和細胞毒性試驗用于說明本發(fā)明組合物的抗腫瘤活性。

附圖說明參考附圖1-圖5，通過本發(fā)明的以下描述，本發(fā)明的上述及其它目的和特征將是顯而易見的。

附圖1為本發(fā)明實施例1聚合物的核磁氫譜圖。

附圖2顯示了本發(fā)明實施例12膠束的粒徑分布。

附圖3顯示了本發(fā)明實施例9、12膠束的體外釋放圖。

附圖4顯示了本發(fā)明實施例9、11、12膠束對人乳腺癌細胞mcf-7的細胞攝取圖。

附圖5顯示了本發(fā)明實施例9、11、12膠束被人乳腺癌細胞mcf-7的細胞毒性圖。

如上所述，本發(fā)明的組合物具有顯著的ph敏感性、增強的腫瘤細胞攝取性能和抗腫瘤活性，從而可實現(xiàn)腫瘤治療的有效性。

具體實施方式

以下實施例用于進一步詳細說明本發(fā)明，但絕對不是對本發(fā)明范圍的限制。

實施例1聚(2-乙基-2-噁唑啉)-聚乳酸(peoz3700-pla2200)的合成

在裝有攪拌器的三口燒瓶中，加入2-乙基-2-噁唑啉(10g,150mmol)、乙腈(40ml)、對甲苯磺酸甲酯(0.35g)，在80℃的油浴溫度下、氮氣氛攪拌反應(yīng)36h。冷卻后，加入koh的甲醇溶液后，繼續(xù)反應(yīng)4h。除去溶劑，殘余物用thf溶解，過硅膠柱，流出液倒入過量的冷乙醚中沉淀、抽濾，真空干燥12h。將丙交酯用乙酸乙酯重結(jié)晶3次，室溫下真空干燥，測定其熔點為127℃。

將得到的peoz-oh粉末置于100ml圓底燒瓶中，加入約70ml甲苯，采用分水器共沸除水，使揮發(fā)出來的甲苯變澄清后停止加熱。然后加入需要量的重結(jié)晶后的丙交酯和催化劑辛酸亞錫，抽真空通氮氣保護，140℃下反應(yīng)36h。旋蒸除去甲苯后，用二氯甲烷復(fù)溶，滴加至劇烈攪拌的0℃的無水乙醚中沉淀、過濾，沉淀復(fù)溶后，再用冷乙醚沉淀、真空干燥得到本發(fā)明的二嵌段共聚物peoz3723-pla2173。附圖1為聚合物的核磁氫譜圖。

實施例2聚(2-乙基-2-噁唑啉)-聚乳酸-聚(2-乙基-2-噁唑啉)(peoz5000-pla3000-peoz5000)的合成

在裝有攪拌器的三口燒瓶中，加入2-乙基-2-噁唑啉(10g,150mmol)、乙腈(40ml)、對甲苯磺酸甲酯(0.47g)，在80℃的油浴溫度下、氮氣氛攪拌反應(yīng)30h。冷卻后，加入koh的甲醇溶液后，繼續(xù)反應(yīng)4h。除去溶劑，殘余物用thf溶解，過硅膠柱，流出液倒入過量的冷乙醚中沉淀、抽濾，真空干燥12h。將得到peoz-oh粉末(4g)溶于氯苯(80ml)，在氮氣氛下加入d,l-丙交酯(6.3g)和辛酸亞錫(0.63g)，在140℃溫度下反應(yīng)24h。將反應(yīng)液倒入過量的乙醚中沉淀、過濾，在室溫下真空干燥12h。將得到的peoz-pla(0.47g)和4-二甲氨基吡啶(0.47g)溶于二氯甲烷中，并用冰水混合物冷卻至0℃，然后將交聯(lián)劑己二酰氯(0.47g)的二氯甲烷溶液滴入上述溶液中，回流反應(yīng)48h；反應(yīng)后的溶液用水洗滌兩次，無水硫酸鎂干燥，乙醚中沉淀，真空干燥即得本發(fā)明的三嵌段共聚物peoz5000-pla3000-peoz5000。

實施例3聚乳酸-聚(2-乙基-2-噁唑啉)-聚乳酸(pla2000-peoz8000-pla2000)的合成

將2-乙基-2-噁唑啉(9.9g)和1,4-二溴-2-丁烯(420mg)溶于丙酮(40ml)，在氮氣氛下于100℃攪拌回流20h。冷卻至室溫后，向反應(yīng)瓶中加入0.1mol/lkoh的甲醇溶液(40ml)后，繼續(xù)反應(yīng)4h。過硅膠柱，流出液倒入過量的冷乙醚中沉淀、抽濾，真空干燥24h。將得到ho-peoz-oh粉末(2g)溶于氯苯(20ml)，在氮氣氛下加入d,l-丙交酯(0.58g)和辛酸亞錫(30mg)，在140℃溫度下反應(yīng)24h。將反應(yīng)液倒入過量的乙醚中沉淀、過濾，在室溫下真空干燥12h，得到本發(fā)明的三嵌段共聚物pla2000-peoz8000-pla2000。

實施例4聚丙交酯乙交酯-聚(2-乙基-2-噁唑啉)-聚丙交酯乙交酯(plga3000-peoz10000-plga3000)的合成

將2-乙基-2-噁唑啉(9.9g)和1,4-二溴-2-丁烯(0.47g)溶于丙酮(40ml)，在氮氣氛下于100℃攪拌回流20h。冷卻至室溫后，向反應(yīng)瓶中加入0.1mol/lkoh的甲醇溶液(40ml)后，繼續(xù)反應(yīng)4h。過硅膠柱，流出液倒入過量的冷乙醚中沉淀、抽濾，真空干燥24h。將得到ho-peoz-oh粉末(2g)溶于氯苯(20ml)，在氮氣氛下加入d,l-丙交酯(1.26g)、乙交酯(0.51g)和辛酸亞錫(30mg)，在140℃溫度下反應(yīng)24h。將反應(yīng)液倒入過量的乙醚中沉淀、過濾，在室溫下真空干燥12h，得到本發(fā)明的三嵌段共聚物plga3000-peoz10000-plga3000。

實施例5聚(2-乙基-2-噁唑啉)-聚乳酸(peoz6000-pla3000)的合成

將2-乙基-2-噁唑啉(10g)和對甲苯磺酸甲酯(510mg)溶于乙腈(40ml)，在氮氣氛下攪拌回流20h。冷卻至室溫后，加入koh的甲醇溶液，繼續(xù)反應(yīng)4h。除去溶劑，殘余 物用thf溶解，過硅膠柱，流出液倒入過量的冷乙醚中沉淀、抽濾，真空干燥12h，得到端基為甲基和羥基、分子量為6000的peoz(簡寫為peoz-oh)。

將得到peoz-oh粉末(2g)溶于氯苯(20ml)，在氮氣氛下加入d,l-丙交酯(0.82g)和辛酸亞錫(30mg)，在140℃溫度下反應(yīng)24h。將反應(yīng)液倒入過量的乙醚中沉淀、過濾，在室溫下真空干燥12h，得到本發(fā)明的二嵌段共聚物peoz6000-pla3000。

實施例6peoz2000-ves的合成

將對甲苯磺酸甲酯(150mg)和2-乙基-2-噁唑啉(5g)溶于乙腈(80ml)，在氮氣氛下加熱攪拌回流12h。冷卻至室溫后，以nh3為終止劑，冷乙醚沉淀精制后真空干燥，制備得到端基分別為甲基和氨基、分子量為2000的peoz(簡寫為peoz-nh2)。取適量ves、edc和nhs，在二氯甲烷中反應(yīng)2h，即得ves的活潑酯(ves-nhs)。然后加入適量peoz-nh2，以tea為催化劑，反應(yīng)4h后，冷乙醚沉淀精制，真空干燥即得本發(fā)明的peoz2000-ves。

實施例7包載阿霉素的ph敏感聚合物膠束的制備

采用透析法。預(yù)先將鹽酸阿霉素(dox·hcl)溶于dmso中，加入過量三乙胺(與dox·hcl摩爾比為5:1)，避光攪拌過夜，使鹽酸與三乙胺充分反應(yīng)。然后將適量peoz3700-pla2200和聚組氨酸(分子量為5000)溶于dmso中，加入上述dox溶液，三者的質(zhì)量比為2:0.5:10，混合均勻后裝入透析袋(mwco＝3500)中，用透析袋夾封住兩端，浸入1000ml去離子水的透析液中并攪拌。透析持續(xù)12h，每隔2～3h換水一次。將透析袋內(nèi)溶液經(jīng)0.45μm濾膜過濾即得本發(fā)明膠束組合物。

實施例8包載阿霉素的ph敏感聚合物膠束的制備

采用透析法。預(yù)先將鹽酸阿霉素(dox·hcl)溶于dmso中，加入過量三乙胺(與dox·hcl摩爾比為5:1)，避光攪拌過夜，使鹽酸與三乙胺充分反應(yīng)。然后將peoz6000-pla3000和dogs以摩爾比5:2溶于dmso中，加入上述dox溶液，藥材質(zhì)量比為10:1，混合均勻后裝入透析袋(mwco＝1000)中，用透析袋夾封住兩端，浸入1000ml去離子水的透析液中并攪拌。透析持續(xù)12h，每隔2～3h換水一次。將透析袋內(nèi)溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾即得本發(fā)明膠束組合物，凍干可得膠束粉末。

實施例9包載紫杉醇的ph敏感聚合物膠束的制備

采用薄膜分散法制備。將1mg紫杉醇、20mg的peoz3700-pla2200充分溶于適量甲醇中，在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加預(yù)熱50℃的水，渦旋振蕩5min使薄膜完全水化，經(jīng)0.2μm的微孔濾膜過濾即得本發(fā)明膠束組合物，凍干可得膠束粉末。

實施例10包載紫杉醇的ph敏感聚合物膠束的制備

采用薄膜分散法制備。將1mg紫杉醇、20mg的peoz3700-pla2200和dc-chol(摩爾 比為20:1)溶于適量甲醇中，在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加預(yù)熱50℃的水，渦旋振蕩5min使薄膜完全水化，經(jīng)0.2μm的微孔濾膜過濾即得本發(fā)明膠束組合物，凍干可得膠束粉末。

實施例11包載紫杉醇的ph敏感聚合物膠束的制備

采用薄膜分散法制備。將1mg紫杉醇、20mg的peoz3700-pla2200和dc-chol(摩爾比為10:1)溶于適量甲醇中，在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加預(yù)熱50℃的水，渦旋振蕩5min使薄膜完全水化，經(jīng)0.2μm的微孔濾膜過濾即得本發(fā)明膠束組合物，凍干可得膠束粉末。

實施例12包載紫杉醇的ph敏感聚合物膠束的制備

采用薄膜分散法制備。將1mg紫杉醇、20mg的peoz3700-pla2200和dc-chol(摩爾比為5:1)溶于適量甲醇中，在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加預(yù)熱50℃的水，渦旋振蕩5min使薄膜完全水化，經(jīng)0.2μm的微孔濾膜過濾即得本發(fā)明膠束組合物，凍干可得膠束粉末。

將得到的膠束溶液采用malvern使zetasizernanozs儀進行進行動態(tài)光散射(dynamiclightscattering，dls)分析，測定膠束的粒徑及其分布。儀器的激光束波長設(shè)定為525nm，入射光與散射光束的夾角為173°，測定溫度為25℃。測定結(jié)果見附圖2。由圖可見，該實施例的本發(fā)明膠束的平均粒徑約為49nm，粒度分布均勻，多分散性指數(shù)為0.18。

實施例13包載紫杉醇的ph敏感聚合物膠束的制備

采用薄膜分散法制備。將1mg紫杉醇、20mg的pla2000-peoz8000-pla2000和dosc(摩爾比為10:3)充分溶于適量甲醇中，在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加預(yù)熱50℃的水，渦旋振蕩5min使薄膜完全水化，經(jīng)0.2μm的微孔濾膜過濾即得本發(fā)明膠束組合物，凍干可得膠束粉末。

實施例14包載紫杉醇的ph敏感聚合物膠束的制備

采用薄膜分散法制備。將1mg紫杉醇、10mg的peoz6000-pla3000和dosc(摩爾比為5:2)溶于適量甲醇中，在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加預(yù)熱50℃的水，渦旋振蕩5min使薄膜完全水化，經(jīng)0.2μm的微孔濾膜過濾即得本發(fā)明膠束組合物，加入適量的peg6000，凍干可得膠束粉末。

實施例15包載多西紫杉醇的ph敏感聚合物膠束的制備

采用薄膜分散法制備。將1mg多西紫杉醇、10mg的peoz2000-ves和dc-chol(摩爾比為10:3)溶于適量甲醇中，在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加預(yù)熱50℃的水，渦旋振蕩5min使薄膜完全水化，經(jīng)0.2μm的微孔濾膜過濾即得本發(fā)明膠束組合物，凍干可得膠束粉末。

實施例16包載多西紫杉醇的ph敏感聚合物膠束的制備

采用薄膜分散法制備。將2mg多西紫杉醇、20mg的peoz5000-pla3000-peoz5000和聚組氨酸(分子量為4000)(摩爾比為10:2)充分溶于適量甲醇中，在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶 劑，加預(yù)熱50℃的水，渦旋振蕩5min使薄膜完全水化，經(jīng)0.2μm的微孔濾膜過濾即得本發(fā)明膠束組合物，凍干可得膠束粉末。

實施例17包載替尼泊苷的ph敏感聚合物膠束的制備

采用薄膜分散法制備。將1mg替尼泊苷、20mg的peoz3700-pla2200和dc-chol(摩爾比為10:3)充分溶于適量甲醇中，在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加預(yù)熱50℃的水，渦旋振蕩5min使薄膜完全水化，經(jīng)0.2μm的微孔濾膜過濾即得本發(fā)明膠束組合物，凍干可得膠束粉末。

試驗例1ph敏感聚合物膠束的體外釋放試驗

為了評價本發(fā)明膠束組合物的ph敏感性，如下對實施例9、12的本發(fā)明組合物在不同ph下的體外釋放進行考察。

采用透析袋法。分別吸取一定體積的載藥膠束溶液置于活化好的透析袋(mwco：3500)中，并用透析夾密封，然后置于裝有35ml、ph分別為5.0、7.4的pbs緩沖液(10mm，含0.2％的tween80)的50ml三角瓶中，于37℃、100rpm的水浴搖床中振蕩。分別在1、2、4、8、12、24和48h取出1ml釋放液，同時補充1ml新鮮的釋放介質(zhì)。將各時間點的釋放液樣品經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，用hplc方法分析測定紫杉醇的含量，并計算藥物的累積釋放百分?jǐn)?shù)數(shù)。結(jié)果見圖3。

結(jié)果顯示，實施例9、12的本發(fā)明膠束組合物的體外釋放具有ph依賴性，而且實施例12的ph敏感性更優(yōu)，說明實施例9、12的本發(fā)明膠束組合物在進入腫瘤細胞內(nèi)能快速釋放。

試驗例2ph敏感聚合物膠束的細胞攝取試驗

為了評價本發(fā)明膠束組合物被腫瘤細胞的攝取情況，如下對實施例9、11、12中的本發(fā)明組合物進行細胞攝取試驗。為了便于測定，以熒光探針香豆素-6代替紫杉醇，按照實施例9、11、12的方法制備膠束。

用無血清的rpmi-1640培養(yǎng)液分別復(fù)溶實施例9、11、12中的凍干膠束粉末，使香豆素-6的濃度皆為1mg/ml。

將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞mcf-7用0.25％胰酶消化，離心后制成單細胞懸液并接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)液體積為3ml，細胞數(shù)為8×10⁵個/孔，在37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。棄去培養(yǎng)液，將2ml上述各待測液分別加入相應(yīng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時間后，吸去培養(yǎng)液，用3ml冷pbs輕洗細胞3次，每孔加入0.4ml0.25％胰蛋白酶消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育5min，待細胞消化成圓球狀后，每孔加入0.6ml含血清培養(yǎng)液終止消化并吹打成單細胞懸液，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。1500rpm離心5min，用預(yù)冷的pbs漂洗兩次并用1mlpbs重懸細胞，吹打成單細胞懸液。將上述細胞懸液過300目細胞篩后轉(zhuǎn)移至流式管 中，用流式細胞儀測定細胞攝取的香豆素-6的熒光強度(激發(fā)波長488nm/測定波長521nm)，比較各測試樣品在細胞內(nèi)的攝取情況。每次分析所用細胞數(shù)不少于10⁵，收集的細胞數(shù)為10000個。數(shù)據(jù)使用fcsexpressv3軟件進行分析。結(jié)果見圖4。

結(jié)果顯示，對于腫瘤細胞mcf-7，實施例11、12的細胞攝取明顯高于實施例9，實施例12的細胞攝取明顯高于實施例11，表明膽固醇的加入使得膠束組合物具有顯著增強的細胞攝取性能，且在一定范圍內(nèi)具有含量依賴性。

試驗例3ph敏感聚合物膠束的細胞毒性試驗

為了評價本發(fā)明膠束組合物對腫瘤細胞生長的抑制作用，如下對實施例9、11、12中的本發(fā)明組合物進行細胞毒性試驗。

采用mtt法。將融合達到90％的腫瘤細胞mcf-7消化后計數(shù)。按照5×10⁴細胞/ml的密度接種于96孔板中。將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，移去培養(yǎng)液，每孔加入不同濃度的實施例9、11、12的膠束待測液200μl，每個濃度設(shè)6個平行孔，以1640完全培養(yǎng)液為空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48h，移去待測液，每孔加入含10％mtt的1640完全培養(yǎng)液200μl，在培養(yǎng)箱中染色4h。移去mtt培養(yǎng)液，每孔加入200μldmso，振蕩10min充分溶解，在酶標(biāo)儀上490nm處測定各孔吸光度值(od值)，計算細胞相對存活率。結(jié)果見圖5。

結(jié)果顯示，實施例9中膠束的ic50為52.42±7.46ng/ml，實施例11中膠束的ic50為41.47±2.97ng/ml，實施例12中膠束的ic50為39.78±2.01ng/ml，說明實施例11、12中的膠束組合物具有增強的抗腫瘤活性，表明膽固醇的加入使得膠束組合物的細胞攝取增強，也確實增強了其細胞毒性。

雖然已利用上述具體的實施方案對本發(fā)明進行了描述，但應(yīng)認(rèn)識到，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可進行各種的改進和改變，而且它們也應(yīng)如權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。