本發(fā)明涉及疾病治療藥物領(lǐng)域，特別是涉及一種含有小分子透明質(zhì)酸的注射液及其用于治療多種疾病的用途。
背景技術(shù)：
：透明質(zhì)酸，又稱玻璃酸、糖醛酸、玻尿酸，英文名hyaluronicacid(簡稱ha)，是由d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺組成的高級多糖，雙糖單位可達25000道爾。人體皮下組織、表皮和口咽粘膜等組織含有大量的大分子透明質(zhì)酸。換句話說，大分子透明質(zhì)酸是人類皮膚、粘膜、皮下等各種組織的基本建筑材料，具有保水和保濕功能。市場現(xiàn)有的透明質(zhì)酸產(chǎn)品主要是以添加大分子透明質(zhì)酸為主要功效成分的面部護理或面部美容產(chǎn)品。近年來一系列的研究表明，依據(jù)分子量的大小區(qū)分的小分子透明質(zhì)酸與大分子透明質(zhì)酸在小動物實驗和細胞水平的研究中均顯示出功能上的差異，主流文獻表明小分子透明質(zhì)酸是炎癥的降解產(chǎn)物，和炎癥分布一致，其功能是引發(fā)和促進炎癥反應(yīng)，主要參考文獻包括：[1].jaimem.cyphert,carols.trempus,andstavrosgarantziotis，sizematters:molecularweightspecificityofhyaluronaneffectsincellbiology(reviewarticle)，internationaljournalofcellbiology，volume2015(2015),articleid563818.[2].jiangd1,liangj,noblepw.hyaluronanasanimmuneregulatorinhumandiseases.physiolrev.2011jan；91(1):221-64.pmid:21248167.[3].zgheibc1,xuj1,liechtykw1.targetinginflammatorycytokinesandextracellularmatrixcompositiontopromotewoundregeneration.advwoundcare(newrochelle).2014apr1；3(4):344-355.pmid:24757589.[4].voelckerv1,gebhardtc,averbeckm,saalbacha,wolfv,weihf,sleemanj,andereggu,simonj.hyaluronanfragmentsinducecytokineandmetalloproteaseupregulationinhumanmelanomacellsinpartbysignallingviatlr4.expdermatol.2008feb；17(2):100-7.pmid:18031543.[5].esserpr1,u,dürrc,vonloewenichfd,schemppcm,freudenbergma,jakobt,martinsf.contactsensitizersinduceskininflammationviarosproductionandhyaluronicaciddegradation.plosone.2012；7(7):e41340.pmid:22848468.[6].blackke1,collinssl,haganrs,hamblinmj,chan-liy,hallowellrw,powelljd,hortonmr.hyaluronanfragmentsinduceifnβviaanoveltlr4-trif-tbk1-irf3-dependentpathway.jinflamm(lond).2013may30；10(1):23.pmid:23721397.[7].hortonmr1,mckeecm,baoc,liaof,farberjm,hodge-dufourj,purée,oliverbl,wrighttm,noblepw.hyaluronanfragmentssynergizewithinterferon-gammatoinducethec-x-cchemokinesmigandinterferon-inducibleprotein-10inmousemacrophages.jbiolchem.1998dec25；273(52):35088-94.pmid:9857043.[8].hodge-dufourj1,noblepw,hortonmr,baoc,wysokam,burdickmd,strieterrm,trinchierig,purée.inductionofil-12andchemokinesbyhyaluronanrequiresadhesion-dependentprimingofresidentbutnotelicitedmacrophages.jimmunol.1997sep1；159(5):2492-500.pmid:9278343.[9].mckeecm1,lowensteincj,hortonmr,wuj,baoc,chinby,choiam,noblepw.hyaluronanfragmentsinducenitric-oxidesynthaseinmurinemacrophagesthroughanuclearfactorkappab-dependentmechanism.jbiolchem.1997mar21；272(12):8013-8.pmid:9065473.[10].mckeecm1,pennomb,cowmanm,burdickmd,strieterrm,baoc,noblepw.hyaluronan(ha)fragmentsinducechemokinegeneexpressioninalveolarmacrophages.theroleofhasizeandcd44.jclininvest.1996nov15；98(10):2403-13.pmid:8941660.[11].ghoshs1,hoseltonsa2,wanjarasb2,carlsonj3,mccarthyjb4,dorsamgp2,schuhjm2.hyaluronanstimulatesexvivoblymphocytechemotaxisandcytokineproductioninamurinemodeloffungalallergicasthma.immunobiology.2015feb7.pmid:25698348.[12].ghoshs1,samarasingheae,hoseltonsa,dorsamgp,schuhjm.hyaluronandepositionandco-localizationwithinflammatorycellsandcollageninamurinemodeloffungalallergicasthma.inflammres.2014jun；63(6):475-84.pmid:24519432.[13].nikitovicd1,berdiakia2,galbiativ3,kavasirm2,papalea3,tsatsakisa4,tzanakakisgn2,corsinie3.hyaluronanregulateschemicalallergen-inducedil-18productioninhumankeratinocytes.toxicollett.2014oct1；232(1):89-97.pmid:25280773.[14].fieberc1,baumannp,vallonr,termeerc,simonjc,hofmannm,angelp,herrlichp,sleemanjp.hyaluronan-oligosaccharide-inducedtranscriptionofmetalloproteases.jcellsci.2004jan15；117(pt2):359-67.pmid:14657275.[15].campogm1,avenosoa,d’ascolaa,scuruchim,prestipinov,nastasig,calatronia,campos.theinhibitionofhyaluronandegradationreducedpro-inflammatorycytokinesinmousesynovialfibroblastssubjectedtocollagen-inducedarthritis.jcellbiochem.2012jun；113(6):1852-67.pmid:22234777.[16].campogm1,avenosoa,d’ascolaa,prestipinov,scuruchim,nastasig,calatronia,campos.4-merhyaluronanoligosaccharidesstimulateinflammationresponseinsynovialfibroblastsinpartviatak-1andinpartviap38-mapk.currmedchem.2013；20(9):1162-72.pmid:23298137.[17].liangj1,jiangd,jungy,xiet,ingramj,churcht,degans,leonardm,kraftm,noblepw.roleofhyaluronanandhyaluronan-bindingproteinsinhumanasthma.jallergyclinimmunol.2011aug；128(2):403-411.pmid:21570715.而申請人近年來的研究成果(專利申請?zhí)?00780052196.7、201310325056.x、201310454955.x、201410153593.5、201510065499.9、201510065498.4、201510067326.0、201510333526.6)卻還提示另一種可能性，即小分子透明質(zhì)酸具有抑制炎癥的功能。這些文獻提示小分子透明質(zhì)酸的這種抑制炎癥的功能與其生產(chǎn)方法有關(guān)，也與分子大小的程度有關(guān)，并且，動物實驗和人體實驗的對比結(jié)果還提示小分子透明質(zhì)酸的功能在小動物和人體中可能完全不同。例如，以上文獻表明小分子透明質(zhì)酸(分子量10-60kd)可以制成體外制劑局部使用(如日用品、衛(wèi)生用品、化妝品、護膚品、消毒用品等)，有助于治療皮膚和粘膜炎癥、實現(xiàn)皮膚美容和抗衰老效果，而小于10kd的小分子透明質(zhì)酸基本沒有上述功效。然而，最近cedars-sinaimedicalcenter的專利wo/2014/165713表明采用細菌streptococci透明質(zhì)酸酶切割產(chǎn)生的小于10kd的小分子透明質(zhì)酸不引起炎癥反應(yīng)，但細菌streptomyces透明質(zhì)酸酶產(chǎn)生的大于10kd的小分子透明質(zhì)酸卻引起炎癥反應(yīng)，提示小分子透明質(zhì)酸的功能還可能與切割酶的種類有關(guān)。以上這些互相矛盾的研究結(jié)果提示小分子透明質(zhì)酸片段的確切功能目前難以確定，而小分子透明質(zhì)酸片段的生產(chǎn)方式、分子量大小、切割酶種類、使用方式都可能影響到其功能表現(xiàn)，而目前除了這些已知可能的因素外，尚有很多科研人員并不能肯定的其他未知因素。也因此，行業(yè)人士雖然寄希望于小分子透明質(zhì)酸的醫(yī)用價值，但是仍很難預測小分子透明質(zhì)酸的臨床研究和成藥性的成功與否，尤其難以確定臨床適應(yīng)癥。而我們在先的研究雖然獲得了一種可行有效的小分子透明質(zhì)酸體外制劑，但由于人體的內(nèi)環(huán)境十分復雜，小分子透明質(zhì)酸的體內(nèi)注射液制劑也可能與體外制劑完全不同，在人和動物體內(nèi)的作用也未必一致，因此，更加有待臨床研究的驗證。并且，作為體內(nèi)注射液制劑使用的小分子透明質(zhì)酸將至少在很多方面有更高的要求，例如需要滿足純度高、無過敏反應(yīng)、需要明確適應(yīng)癥和副作用，明確每次注射劑量、注射途徑、注射劑量等。解決以上這些問題有重大的科研意義和商業(yè)價值。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的是提供一種具有特定生產(chǎn)方法的含有小分子透明質(zhì)酸的注射液。本發(fā)明的另一個目的是提供所述注射液用于治療意外發(fā)現(xiàn)的多種疾病以及制備治療所述多種疾病的藥物的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種含有小分子透明質(zhì)酸的注射液，所述注射液的制備包括以下步驟：a.采用動物細胞或酵母或植物表達生產(chǎn)有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶ph20；b.采用大分子透明質(zhì)酸原料配制成大分子透明質(zhì)酸溶液，引入氯化鈉和鎂離子，加入所述重組人透明質(zhì)酸酶ph20切割所述大分子透明質(zhì)酸，獲得含有分子量10-60kd的透明質(zhì)酸片段的反應(yīng)液；c.對所獲反應(yīng)液中殘留的重組人透明質(zhì)酸酶ph20滅活處理；d.進行細菌過濾、病毒過濾滅活和超濾濃縮。作為進一步地改進，所述制備過程還包括去除所述被滅活的重組人透明質(zhì)酸酶的步驟。所述步驟a中有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶ph20純度>99.0％，所述步驟b中的大分子透明質(zhì)酸原料純度>99.9％。所述步驟b中大分子透明質(zhì)酸原料的分子量為800-1200kd；所述氯化鈉和鎂離子在所述大分子透明質(zhì)酸溶液中的濃度分別為80-90mm、1mm；每克所述大分子透明質(zhì)酸原料對應(yīng)加入20000單位的所述重組人透明質(zhì)酸酶，所述酶切反應(yīng)于37度進行6小時。所述每2-4ml注射液含有所述透明質(zhì)酸片段100mg以及所述滅活的重組人透明質(zhì)酸酶殘留0～20ug，所述鎂離子在注射液中的濃度為1mm，所述氯化鈉在注射液中的濃度為115-125mm。所述注射液用于治療飛蚊癥、玻璃體渾濁及玻璃體渾濁引起的玻璃體剝離和視力下降。所述注射液用于治療來自皮膚、粘膜、結(jié)締組織、肌肉、肌筋膜、肌腱、關(guān)節(jié)、創(chuàng)口、疤痕的疼痛以及來自皮膚、粘膜、創(chuàng)口、疤痕的瘙癢。所述注射液用于治療可引起疼痛或瘙癢的疾病，包括大面積燒傷、創(chuàng)傷疤痕、手術(shù)創(chuàng)口疤痕、神經(jīng)性皮炎、牛皮癬、濕疹、皰疹樣濕疹、汗皰疹。所述注射液用于治療腰背頸肩肌筋膜炎、肌肉肌腱損傷。所述注射液用于治療骨質(zhì)增生、骨刺、椎間盤突出。所述注射液用于治療強直性脊柱炎。所述注射液用于治療有痛經(jīng)的子宮內(nèi)膜異位癥。所述注射液用于治療手術(shù)后或腹膜透析后引發(fā)的腹腔粘膜粘連和盆腔粘膜粘連。所述注射液用于治療固體腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)。所述注射液用于增加體力和精力或固體腫瘤化療后體力和精力的恢復。所述注射液用于促進腦梗死后功能恢復。所述注射液用于面部美容、治療面部衰老。所述注射液用于減少頭、面、頸部皮下脂肪組織或全身皮下脂肪組織。所述注射液用于快速治療牙周疾病、口腔潰瘍和咽喉疾病，包括化療和衰老引起的牙周疾病、口腔潰瘍和咽喉疾病。所述注射液用于治療眼結(jié)膜疾病，包括化療和衰老引起的眼結(jié)膜疾病。所述注射液用于治療有心絞痛的冠心病，治療血管支架后并發(fā)癥，治療心血管疾病。所述注射液的使用方式為腹部皮下脂肪層或痛/癢點部位注射或患病部位注射。所述注射液使用劑量為每日注射1-2次，每次注射劑量中含所述分子量10-60kd的透明質(zhì)酸片段100mg。由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點：(1)所述注射液生產(chǎn)方便，制劑穩(wěn)定，不需面部注射，不引起疼痛和面部炎癥，通過腹部皮下脂肪層注射可以快速有效面部美容和面部抗衰老。(2)本發(fā)明的注射液出乎意料地具有快速止痛、止癢、增加體力精力和減少頭面頸部皮下脂肪的效果。(3)更為神奇地是本發(fā)明的注射液具有治療多種疾病和疾病狀態(tài)的效果，包括肌筋膜炎、肌肉肌腱損傷、有疼痛的骨刺和椎間盤突出、有疼痛的強直性脊柱炎、玻璃體渾濁、有炎癥、瘙癢和疼痛的大面積燒傷疤痕、創(chuàng)傷疤痕、手術(shù)創(chuàng)口疤痕、手術(shù)或腹膜透析后引發(fā)的腹腔粘膜粘連和盆腔粘膜粘連、有痛經(jīng)的子宮內(nèi)膜異位癥、有瘙癢的神經(jīng)性皮炎、牛皮癬、瘙癢的老年濕疹、嬰兒濕疹和皰疹樣濕疹或汗皰疹、固體腫瘤化療后體力精力恢復和防止固體腫瘤轉(zhuǎn)移、腦梗死后功能恢復、牙周疾病和口腔潰瘍、咽喉疾病、眼結(jié)膜疾病、衰老和衰老相關(guān)疾病、冠心病、心肌梗死功能恢復、預防和治療血管支架后并發(fā)癥以及預防和治療心腦血管疾病。附圖說明上述僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，以下結(jié)合附圖與具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細說明。圖1中(a)(b)是生產(chǎn)高純度的有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶的激流式動物細胞反應(yīng)器放大和大規(guī)模培養(yǎng)車間。圖2是動物細胞(cho細胞)生產(chǎn)的高純度的有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶的酶。圖3是本發(fā)明所述含有小分子透明質(zhì)酸的注射液的制劑形式。圖4顯示分子量10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段的抑菌效果。圖5顯示本發(fā)明注射液對小動物皮膚創(chuàng)口的抗炎癥和抑菌效果。圖6中(a)-(e)分別顯示本發(fā)明的注射液對il-1、il-6、ifn-β、ifn-α、il-10的影響(注:lps＝endotoxin；l+a＝lps+anti-humantlr4singlechainantibody；l+ha＝lps+b-ha)。圖7是患有玻璃體渾濁和玻璃體剝離的受試者眼科實驗室診斷。圖8是部分受試者治療前后照片對比顯示腹部皮下脂肪層注射本發(fā)明注射液對人體面部美容和面部抗衰老的治療效果。圖9是采用本發(fā)明注射液治療大面積燒傷后沒有植皮形成的不斷增厚，瘙癢和有慢性炎癥反應(yīng)的疤痕的效果。圖10是腹部皮下脂肪層注射本發(fā)明注射液治療神經(jīng)性皮炎的效果。圖11是腹部皮下脂肪層注射本發(fā)明注射液治療牛皮癬的效果。具體實施方式首先需要說明的是，市場現(xiàn)有的大分子透明質(zhì)酸注射液主要用于面部美容、面部抗衰老和關(guān)節(jié)腔注射潤滑關(guān)節(jié)。本發(fā)明所述的注射液是含有小分子透明質(zhì)酸的注射液?；谀壳靶袠I(yè)內(nèi)的研究成果，小分子透明質(zhì)酸的確切功能難以確定，甚至基于目前的科學實驗結(jié)果(見前文
背景技術(shù)：
所述)，出現(xiàn)了互相矛盾的功能現(xiàn)象，而這種現(xiàn)象的作用機理尚未完全明確，可能需要限定小分子透明質(zhì)酸的生產(chǎn)方法來明確其功效。因此，小分子透明質(zhì)酸的臨床研究和商品化(即成藥性)前景行業(yè)人士也很難預測。本發(fā)明提供的一種特定生產(chǎn)方法獲得的含有小分子透明質(zhì)酸的注射液，經(jīng)臨床研究發(fā)現(xiàn)發(fā)明人意外地獲得了該注射液治療諸多新適應(yīng)癥的用途，這種用途通過更方便的注射方式如腹部皮下脂肪層注射或痛/癢點部位注射或患病部位注射而得以體現(xiàn)。發(fā)明人采用“說明書外”使用的方法進行所述注射液的美容和抗衰老研究，非常意外發(fā)現(xiàn)本發(fā)明上述含有小分子透明質(zhì)酸的注射液通過腹部皮下脂肪層注射不但能有效促進面部美容和面部抗衰老，還能驚奇地增加體力、精力和減少頭面頸部皮下脂肪，根據(jù)使用者的反饋，本發(fā)明的這種注射液還顯示出快速止痛、止癢的效果，更為神奇地是，進一步深入的研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述的注射液具有治療多種疾病和疾病狀態(tài)的效果，包括肌筋膜炎、肌肉肌腱損傷、有疼痛的骨刺和椎間盤突出、有疼痛的強直性脊柱炎、玻璃體渾濁、有炎癥、瘙癢和疼痛的大面積燒傷疤痕、創(chuàng)傷疤痕、手術(shù)創(chuàng)口疤痕、手術(shù)或腹膜透析后引發(fā)的腹腔粘膜粘連和盆腔粘膜粘連、有痛經(jīng)的子宮內(nèi)膜異位癥、有瘙癢的神經(jīng)性皮炎、牛皮癬、瘙癢的老年濕疹、嬰兒濕疹和皰疹樣濕疹或汗皰疹、固體腫瘤化療后體力精力恢復和防止固體腫瘤轉(zhuǎn)移、腦梗死后功能恢復、牙周疾病和口腔潰瘍、咽喉疾病、眼結(jié)膜疾病、衰老和衰老相關(guān)疾病、冠心病、預防和治療血管支架后并發(fā)癥以及心血管疾病。本發(fā)明所述的含有小分子透明質(zhì)酸的注射液，是通過特定的生產(chǎn)方法獲得的。所述小分子透明質(zhì)酸是由重組人透明質(zhì)酸酶ph20、鈉離子和鎂離子活化大分子透明質(zhì)酸而生產(chǎn)的有治療功效的透明質(zhì)酸片段；所述透明質(zhì)酸注射液所含透明質(zhì)酸片段分子量為10kd-60kd；所述分子量為10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段是由動物細胞chinesehamsterovary細胞或酵母或植物表達生產(chǎn)的有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶在36-37度在存在鎂離子和氯化鈉時切割大分子透明質(zhì)酸5-6小時獲得的；所述注射液的重組人透明質(zhì)酸酶被80度45-60分鐘熱滅活。為確保制劑的安全性，所述有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶ph20優(yōu)選高純度(純度>99.0％為佳)，所述大分子透明質(zhì)酸原料純度采用醫(yī)療級純度>99.9％為佳。實際生產(chǎn)時，可以直接采用高純度的原料，也可以通過對低純度的有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶ph20或者大分子透明質(zhì)酸原料進行純化后再進行后續(xù)步驟。結(jié)合臨床研究，我們發(fā)現(xiàn)含有重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白的透明質(zhì)酸片段腹部皮下脂肪層或痛點部位注射或患病部位注射無過敏反應(yīng)和無副作用。進一步地，采用親和柱層析、沉淀、超濾和透析方法，將滅活的重組人透明質(zhì)酸酶ph20殘留蛋白分離出去，得到只含有10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段、氯化鈉和鎂離子的注射液。結(jié)合人體臨床研究，我們發(fā)現(xiàn)皮下脂肪層或痛點部位注射或患病部位注射含有和不含所述滅活的重組人透明質(zhì)酸酶ph20殘留蛋白的注射液都有治療作用，都無過敏反應(yīng)和無副作用，提示10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段為主要活性成分。進一步地，根據(jù)上述生產(chǎn)方法，本發(fā)明的含有小分子透明質(zhì)酸的注射液制劑至少可以制成以下兩種制劑形式，一種制劑中不含滅活的重組人透明質(zhì)酸酶ph20殘留蛋白，另一種則含有無酶活性的重組人透明質(zhì)酸酶ph20殘留蛋白。較佳地，為使含有無酶活性的重組人透明質(zhì)酸酶ph20殘留蛋白的注射液制劑治療效果更可靠，實際生產(chǎn)中控制這種殘留蛋白小于20微克。作為優(yōu)選的實施例，本發(fā)明按照上述兩種制劑形式制備出以下注射液1(每2-4ml含有分子量為10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段100mg以及滅活的無酶活性的重組人透明質(zhì)酸酶ph20殘留蛋白小于20微克，注射液中氯化鈉濃度為115-125mm、鎂離子濃度為1mm)和注射液2(每2-4ml含有分子量為10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段100mg，注射液中氯化鈉濃度為115-125mm、鎂離子濃度為1mm，不含無酶活性的重組人透明質(zhì)酸酶ph20殘留蛋白)。所述注射液可在4到12度或-8到-70度和室溫儲存2年內(nèi)穩(wěn)定。對上述兩種制劑的進一步臨床驗證發(fā)現(xiàn)，皮下或痛/癢點部位注射或患病部位注射所述注射液，每日注射1-2次，每次注射液劑量中含所述透明質(zhì)酸片段100mg，方便有效，無副作用和過敏反應(yīng)，可用于制備生物藥品和3類醫(yī)療器械。以下通過具體的實施例對本發(fā)明進行說明，應(yīng)當理解，此處所描述的實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1目的：研究注射液的生產(chǎn)工藝，分別制造含有和不含重組人透明質(zhì)酸酶ph20殘留蛋白的注射液。方法：利用動物細胞(cho細胞)生產(chǎn)有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶ph20，包括：將有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶ph20的基因cdna人工合成，插入富含gc的pmh3、pmh4、pmh5空表達載體，建成pmh3-ph20、pmh4-ph20、pmh5-ph20表達載體(這里采用公告號為cn102124019a的專利文獻記載的技術(shù)構(gòu)建表達載體以便極高地表達重組蛋白)；再將pmh3-ph20、pmh4-ph20、pmh5-ph20的cdna表達載體轉(zhuǎn)入cho-s細胞系，篩選高表達ph20的cho-s細胞系，在圖1所示的激流式動物細胞反應(yīng)器放大和大規(guī)模培養(yǎng)；將含有ph20的豐收液0.22um過濾后采用離子柱等2-3步分離，再經(jīng)細菌過濾和病毒過濾滅活、超濾濃縮等步驟后，制成圖2所示純度>99.0％的無菌無病毒的有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶ph20。準備注射級分子量為800-1200kd的透明質(zhì)酸原料或透明質(zhì)酸注射液或?qū)⒎亲⑸浼壏肿恿?00-1200kd的透明質(zhì)酸原料純化到注射級透明質(zhì)酸原料；將注射級分子量800-1200kd的透明質(zhì)酸原料一次或分多次加入注射級的純水，再依次加入氯化鈉80-90mm、鎂離子1mm、重組人透明質(zhì)酸酶20000單位(約20微克)/每克透明質(zhì)酸，充分混合，在37度反應(yīng)6小時至透明質(zhì)酸片段的分子量達到10kd-60kd，加氯化鈉35-45mm將滲透壓調(diào)至280-300毫滲量/升(mosm/l)，再經(jīng)加熱80度45-60分鐘、細菌過濾和病毒過濾滅活、超濾濃縮等步驟制成透明質(zhì)酸注射液1(每2-4毫升含有分子量為10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段100mg，還含有無降解透明質(zhì)酸活性的重組人ph20透明質(zhì)酸酶殘留20ug以下，注射液中氯化鈉濃度115-125mm、鎂離子濃度1mm、)。依次或分別使用重組人透明質(zhì)酸酶親和柱層析、柱層析、沉淀、透析、超濾濃縮等，將含有重組人透明質(zhì)酸酶殘留的透明質(zhì)酸片段注射液的重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白去除，制造不含有重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白的透明質(zhì)酸注射液2(每2-4毫升含有分子量為10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段100mg，注射液中氯化鈉含量115-125mm、鎂離子含量1mm)。結(jié)果：圖2為純度>99％的動物細胞(cho細胞)生產(chǎn)的有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶的電泳圖；制造的透明質(zhì)酸注射液1和透明質(zhì)酸注射液2制劑如下：透明質(zhì)酸注射液1：分子量為10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段100mg/2毫升、氯化鈉115-125mm、鎂離子1mm、無降解透明質(zhì)酸活性的重組人ph20透明質(zhì)酸酶殘留蛋白20ug以下(內(nèi)毒素小于0.5iu/ml、無菌、無病毒)。透明質(zhì)酸注射液2：分子量為10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段100mg/2毫升、氯化鈉115-125mm、鎂離子1mm(內(nèi)毒素小于0.5iu/ml、無菌、無病毒)。結(jié)論：結(jié)果表明成功制造了含有和不含重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白的透明質(zhì)酸片段的透明質(zhì)酸注射液1(圖3)和注射液2，明確注射液的生產(chǎn)工藝。實施例2目的：研究實施例1透明質(zhì)酸注射液1的體外實驗、分子細胞學實驗、小動物實驗的抗炎和抑菌效果。方法：使用生理鹽水稀釋1倍的實施例1透明質(zhì)酸注射液1，分別做體外實驗抑菌實驗、分子細胞學實驗、小動物實驗，檢測透明質(zhì)酸注射液的抗炎和抑菌效果。結(jié)果：圖4顯示透明質(zhì)酸注射液抑制了體外實驗中抑制牙齦噗啉單胞菌克隆生長，提示透明質(zhì)酸注射液材料不利于牙齦噗啉單胞菌生長(注：陰性對照為生理鹽水，陽性對照為抗菌素甲硝唑)；圖5顯示透明質(zhì)酸注射液對小動物皮膚創(chuàng)口的抗炎癥和抑菌效果；圖6顯示透明質(zhì)酸注射液促進了人tlr4受體陽性細胞分泌il-10，同時抑制了內(nèi)毒素(endotoxin)引起的tnf，il-1，il-6和interferonbeta的分泌(注：lps＝endotoxin；l+a＝lps+anti-humantlr4singlechainantibody；l+ha＝lps+b-ha)。結(jié)合文獻研究，有文章(cuixiayang,manlincao,hualiu,yiqinghe,jingxu,yandu,yiwenliu,wenjuanwang,liancui,jiajiehu,fenggao,thehighandlowmolecularweightformsofhyaluronanhavedistincteffectsoncd44clustering,publishedonnovember1,2012asmanuscriptm112.349209)表明cd44受體也可能參與了透明質(zhì)酸注射液的作用機制。結(jié)論：透明質(zhì)酸注射液有明顯人體細胞抗炎、小動物皮膚創(chuàng)口抗炎和抑菌的效果，其抗炎抑菌可能通過多種途徑實現(xiàn)，包括內(nèi)毒素受體、beta-defensin分泌，cd44介導的炎癥細胞移走和聚集。實施例3目的：研究以上實施例1中含有(實驗組1)和不含(實驗組2)重組人透明質(zhì)酸酶ph20殘留蛋白的透明質(zhì)酸片段的兩種透明質(zhì)酸注射液的人體面部美容抗衰老效果和安全性。方法：使用含有重組人透明質(zhì)酸酶ph20殘留蛋白的透明質(zhì)酸片段的注射液(分子量為10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段100mg、氯化鈉115-125mm、鎂離子1mm、無降解透明質(zhì)酸活性的重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白小于20微克)為實驗組1，對中國目前空氣污染、飲水污染和工作壓力大的環(huán)境中各種疾病或亞臨床問題多發(fā)的或衰老和衰老相關(guān)疾病多發(fā)的38例受試者(平均年齡61±26歲，男20例，女18例)進行臨床研究；使用不含重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白的透明質(zhì)酸片段注射液(分子量為10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段100mg、氯化鈉115-125mm和鎂離子1mm)為實驗組2，每次100mg(指注射液中含有的所述分子量為10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段100mg，下同)腹部皮下脂肪層注射，每日1-2次，連續(xù)注射至少7天以上，對中國目前空氣污染、飲水污染和工作壓力大的環(huán)境中各種疾病或亞臨床問題多發(fā)的或衰老和衰老相關(guān)疾病多發(fā)的38例受試者(平均年齡62±21歲，男19例，女19例)進行臨床研究；采用受試者治療前后面容觀察或照片對比評分的方法對比兩種注射液美容效果(評分：無效、不能確定、明顯有效)，采用醫(yī)生問詢本人感受、癥狀、體檢和實驗室檢查的方法評價注射液的安全性，即副作用的有無，包括注射部位疼痛的有無、注射前后身體不適、精力體力狀況、身體原有疼痛、身體原有疾病和身體原有各種亞臨床問題的改變情況。結(jié)果：表1：兩種注射液治療面部美容抗衰老的效果無效不能確定明顯有效樣本數(shù)實驗組1003838實驗組2003838圖8顯示部分受試者治療前后照片對比，顯示透明質(zhì)酸注射液對人體面部美容和面部衰老的治療效果，還表明透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射明顯減少頭、面、頸、肩、背、腹及上下肢部位皮下脂肪組織厚度。表2：兩種注射液減少皮下脂肪的效果無效不能確定明顯有效樣本數(shù)實驗組1263038實驗組2163138表3：兩種注射液腹部皮下脂肪層深部注射后疼痛、局部紅腫、局部和全身過敏的有無情況無不能確定有樣本數(shù)實驗組1380038實驗組2380038除以上美容效果、安全和副作用外，我們還發(fā)現(xiàn)3例受試者因勞累，在腹部皮下脂肪層注射后感到舒服和有困感；困感持續(xù)0.5-1.5小時，其中1例第一次注射后小睡1.0小時，醒后精神和體力明顯增加；另2例注射2次后不再發(fā)生注射后困感。表4：兩種注射液注射后困感的副作用情況無不能確定有樣本數(shù)實驗組1360238實驗組2370138出乎意外地，所有76例受試者中71例受試者在腹部皮下脂肪層注射后30分鐘后均感到精力體力開始增加，表現(xiàn)為愿意說話、洗碗、做飯、散步、計劃外出旅行、工作和不想休息等，持續(xù)3-4天。表5：兩種注射液精神和體力增加的效果無不能確定明顯有樣本數(shù)實驗組1033538實驗組2023638所有76例受試者(包括實驗組1的20例，實驗組2的17例)中有27例受試者有不同肩背腰腿手臂疼痛，出乎意外地，腹部皮下脂肪層注射后30分鐘后均感疼痛減輕，其中9例追加局部痛點部位50mg注射，疼痛減輕在注射后2分鐘開始出現(xiàn)，和其中4例自述的以前局部利多卡因混合強的松注射封閉治療的效果相當。表6：透明質(zhì)酸注射液的止痛效果所有76例受試者(包括實驗組1的17例，實驗組2的16例)中有33例受試者有不同程度的瘙癢，出乎意外地，腹部皮下脂肪層注射后1天后均感疼痛減輕或消失。表7：透明質(zhì)酸注射液的止癢效果結(jié)論：1、含有和不含重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白的透明質(zhì)酸片段的兩種透明質(zhì)酸注射液都有人體面部美容和面部抗衰老的效果。2、含有和不含重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白的透明質(zhì)酸片段的兩種注射液都明顯減少頭面頸肩背腹上下肢部位皮下脂肪組織厚度。3、含有和不含重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白的透明質(zhì)酸片段的兩種注射液腹部皮下脂肪層注射均未觀察皮膚注射后疼痛、局部紅腫、局部和全身過敏，使用方便。3、含有和不含重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白的透明質(zhì)酸片段的兩種注射液腹部皮下脂肪層注射在第一次注射后感到舒服，有困感，想睡眠，發(fā)生率小于4.0％。4、出乎意外地，含有和不含重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白的透明質(zhì)酸片段的兩種注射液腹部皮下脂肪層注射有明顯的增加精力體力的效果。5、出乎意外地，含有和不含重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白的透明質(zhì)酸片段的兩種注射液腹部皮下脂肪層注射有快速明顯的止痛效果。6、出乎意外地，含有和不含重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白的透明質(zhì)酸片段的兩種注射液腹部皮下脂肪層注射有明顯的止癢效果。實施例4目的：進一步分析透明質(zhì)酸注射液治療前后“實施例3”共76例受試者所患有的疾病和亞臨床問題的改變情況，明確透明質(zhì)酸注射液的新臨床適應(yīng)癥。方法：進一步分析透明質(zhì)酸注射液治療前后“實施例3”共76例受試者所患有的疾病和亞臨床問題的改變情況，包括注射前病史、實驗室檢查結(jié)果和注射后的改變，明確透明質(zhì)酸注射液可能的新臨床適應(yīng)癥。結(jié)果：一、快速有效治療肌筋膜炎和陳舊運動損傷：肌筋膜炎和陳舊運動損傷是運動損傷和老年退化性相關(guān)性疾病，發(fā)病機制不完全明了，美國有專門治療這種疾病的職業(yè)chiropractor，目前還沒有治愈的方法。我們共分析了76例受試者中患有腰背頸上下肢肌筋膜炎受試者7例(實驗組1的4例和實驗組2的3例)和陳舊運動損傷4例(實驗組1的2例和實驗組2的2例)，結(jié)果如表8所示：表8：透明質(zhì)酸注射液治療肌筋膜炎和陳舊運動損傷的效果其中1例57歲男性受試者因陳舊運動損傷17年，患頸背肌筋膜炎3年，每年天氣寒冷時發(fā)作，疼痛非常折磨人，一定肌肉運動牽扯也會引發(fā)疼痛，頸背活動范圍受限。腹部皮下脂肪層一次100mg注射30分鐘后均感疼痛減輕，后來追加頸背局部痛點部位100mg深部注射效果更佳。2個月內(nèi)注射15x100mg后，背部痛點結(jié)節(jié)消失，頸背部肌肉厚度明顯變薄，12個月未再復發(fā)。結(jié)果表明，透明質(zhì)酸注射液除止痛外，最終解決了陳舊運動損傷和肌筋膜炎的炎癥病變，達到了肌肉和肌筋膜重組再生的目的。二、透明質(zhì)酸注射液快速有效治療骨刺和椎間盤突出或腰背頸椎?。汗谴毯妥甸g盤突出或腰背頸椎病是一種老年退化性和運動損傷相關(guān)性疾病，發(fā)病機制不完全明了，目前還沒有治愈的方法。我們共分析了76例受試者中患有腰背頸骨質(zhì)增生和骨刺受試者11例(實驗組1的6例和實驗組2的5例)，結(jié)果如表9所示：表9：透明質(zhì)酸注射液治療骨刺和椎間盤突出或腰背頸椎病的效果其中1例57歲女性受試者患腰背頸骨質(zhì)增生和骨刺14年，時發(fā)作，疼痛非常折磨人，一定肌肉運動牽扯也會引發(fā)疼痛，頸背活動范圍受限，上肢發(fā)麻和工作能力下降。腹部皮下脂肪層100mg注射一天后自述疼痛感減輕50％以上，并能到廚房包餃子做飯；第二天100mg注射后自述疼痛感減輕80％以上；第三天100mg注射后自述疼痛感減輕95％以上。2個月內(nèi)注射15x100mg后2個月未再復發(fā)。結(jié)果表明，透明質(zhì)酸注射液除止痛外，最終開始陳舊損傷的炎癥病變重組再生。其中另一例57歲女性受試者患頸骨質(zhì)增生和骨刺4年，頸背活動范圍受限，時發(fā)作，疼痛折磨人和有面部麻木感，一定肌肉運動牽扯也會引發(fā)疼痛，上肢發(fā)麻和工作能力下降。腹部皮下脂肪層100mg注射一天后自述疼痛感減輕50％以上；第二天100mg注射后自述疼痛感減輕80％以上。2個月內(nèi)注射15x100mg后2個月未再復發(fā)，表明透明質(zhì)酸注射液除止痛外，也開始陳舊損傷的炎癥病變的重組再生過程。注：以上所有受試者繼續(xù)治療，等待6個月以上復發(fā)或未復發(fā)的結(jié)果。三、透明質(zhì)酸注射液快速有效治療玻璃體渾濁：玻璃體渾濁是一種老年退化性疾病，發(fā)病機制不明，目前還沒有有效的治療方法。玻璃體渾濁又稱飛蚊癥，進一步發(fā)展成玻璃體剝離，損害眼底和影響視力。我們共分析了76例受試者中患有玻璃體渾濁和玻璃體剝離的受試者9例(實驗組1的4例和實驗組2的5例)，結(jié)果如表10所示：表10：透明質(zhì)酸注射液治療玻璃體渾濁和玻璃體剝離的效果61歲女性受試者一例，圖7為患有玻璃體渾濁和玻璃體剝離的受試者實驗室診斷，因需面部美容治療，接受透明質(zhì)酸腹部皮下脂肪層100毫克注射治療，注射后第2天偶然發(fā)現(xiàn)眼部視力改善，第三天發(fā)現(xiàn)眼部飛蚊斑點變??；繼續(xù)采用15x100毫克每三天注射一次，視力繼續(xù)改善(由0.2改善到0.5)和飛蚊斑點繼續(xù)變薄變淺，兩個月內(nèi)無明顯反復。以上結(jié)果表明透明質(zhì)酸注射液驚奇的快速有效治療玻璃體混濁(飛蚊癥)和玻璃體剝離。四、透明質(zhì)酸注射液治療有瘙癢(慢性炎癥)和疼痛(炎癥性疼痛)的創(chuàng)口疤痕：有疤痕體質(zhì)人的輕微創(chuàng)口可逐漸形成大型疤痕，不斷增厚和瘙癢，治療目標是止癢和減少疤痕增厚；大面積燒傷后沒有植皮形成的疤痕不斷增厚，瘙癢和有慢性炎癥反應(yīng)(圖9)，治療目標是止癢、消除炎癥和減少疤痕增厚；手術(shù)創(chuàng)口主要是紅腫、疼痛、炎癥反應(yīng)性滲出和繼發(fā)感染，治療目標是加速愈合和減少疤痕形成。我們共分析了76例受試者中患有瘙癢(慢性炎癥)和疼痛(炎癥性疼痛)的創(chuàng)口疤痕的受試者8例(實驗組1的4例和實驗組2的4例)，結(jié)果如表11所示：表11：透明質(zhì)酸注射液治療有瘙癢(慢性炎癥)和疼痛(炎癥性疼痛)的創(chuàng)口疤痕的效果63歲女性12年前下肢大面積燒傷，未植皮，嚴重瘙癢，入睡困難，疤痕周邊有炎癥。透明質(zhì)酸注射2x100mg連續(xù)3天后疤痕變薄、疤痕周邊炎癥消失、瘙癢明顯減輕、疼痛明顯減輕；透明質(zhì)酸連續(xù)注射30x100mg后疤痕和周邊皮膚明顯改善，包括疤痕變薄、炎癥消失、瘙癢減輕，但未徹底消失(圖9)。五、透明質(zhì)酸注射液快速有效治療手術(shù)或腹膜透析后引發(fā)的腹腔粘膜粘連：手術(shù)損傷、腹腔透析等幾乎均引起腹腔粘膜炎癥和粘連，根據(jù)輕重程度的不同可以引發(fā)癥狀和病理改變，包括腹痛、腹部壓痛、腹部包塊和腸梗阻。目前，還沒有可行的辦法根除腹腔粘連。我們共分析了76例受試者中患有手術(shù)或透析后腹腔粘膜粘連的受試者3例(實驗組1的1例和實驗組2的2例)，結(jié)果如表12所示：表12：透明質(zhì)酸注射液快速有效治療手術(shù)或腹膜透析后引發(fā)的腹腔粘連43歲女性胃大部切除和周圍淋巴結(jié)掃除后一個月，開始進非流食后，發(fā)現(xiàn)腹部有硬塊和疼痛，進食后嘔吐，嚴重消瘦和身體虛弱，經(jīng)臨床診斷為腹腔粘連引發(fā)腸梗阻。透明質(zhì)酸腹部皮下脂肪層注射5x100mg后，以上癥狀和體征全部消失，進非流食后無腸梗阻再發(fā)生，精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。治療結(jié)果表明透明質(zhì)酸注射治療可能是通過減少腹腔粘膜處的炎癥，最終達到了消除腹腔粘連癥狀和體征。六、透明質(zhì)酸注射液治療有痛經(jīng)的子宮內(nèi)膜異位癥或盆腔粘膜粘連：子宮內(nèi)膜異位癥經(jīng)常伴有不孕不育和痛經(jīng)；不孕不育和痛經(jīng)可能跟盆腔粘膜炎癥和粘連有關(guān)；治療痛經(jīng)和子宮內(nèi)膜異位癥或盆腔粘膜粘連和尚無有效方法；我們共分析了76例受試者中患有盆腔粘膜粘連和痛經(jīng)的受試者3例(實驗組1的2例和實驗組2的1例)，結(jié)果如表13所示：表13：透明質(zhì)酸注射液治療有痛經(jīng)的子宮內(nèi)膜異位癥或盆腔粘膜粘連以上結(jié)果表明透明質(zhì)酸注射明顯減輕了痛經(jīng)，表明透明質(zhì)酸注射減少了盆腔內(nèi)子宮內(nèi)膜異位癥的炎癥程度和盆腔粘連引起的牽涉痛的程度，提示透明質(zhì)酸注射液也可能用來治療子宮內(nèi)膜異位癥和盆腔粘連引起的輸卵管蠕動不良造成的不孕不育。七、透明質(zhì)酸注射液治療有瘙癢的神經(jīng)性皮炎、牛皮癬、瘙癢的老年濕疹、皰疹樣濕疹或汗皰疹：我們共分析了76例受試者中患有神經(jīng)性皮炎、牛皮癬、瘙癢的老年濕疹、皰疹樣濕疹或汗皰疹受試者19例(實驗組1的9例和實驗組2的10例)，結(jié)果如表14所示：表14：透明質(zhì)酸注射液治療有瘙癢的神經(jīng)性皮炎和牛皮癬的效果表14中的其中一例神經(jīng)性皮炎受試者(男，57歲)患神經(jīng)性皮炎8年，雙側(cè)對稱性多處皮膚病變，嚴重瘙癢和局部皮膚炎癥性皮損。之前采用stelara(抗il-12/23抗體)注射治療，效果受試者不滿意。采用透明質(zhì)酸注射液20x100mg腹部皮下脂肪層注射后瘙癢基本消失、皮膚炎癥性皮損基本恢復(圖10)，效果受試者滿意。表14中的其中一例牛皮癬受試者(男，52歲)患牛皮癬18年，腹部、上肢和下肢多處局部皮膚炎癥性皮損和皮損處增厚，伴有瘙癢癥狀。兩年前曾使用stelara(抗il-12/23抗體)注射治療，效果受試者不滿意。采用透明質(zhì)酸注射液10x100mg腹部皮下脂肪層注射后，瘙癢基本消失，增厚皮損明顯變薄，皮膚炎癥性皮損明顯恢復(圖11)，效果受試者滿意。表15：透明質(zhì)酸注射液治療有瘙癢的老年濕疹和皰疹樣濕疹或汗皰疹的效果表15中的其中一例汗皰疹受試者(女，33歲)患汗皰疹9年，每年夏季發(fā)病。采用透明質(zhì)酸注射液20x100mg腹部皮下脂肪層注射后，注射期間和注射后1年沒再發(fā)生汗皰疹。表14、15的結(jié)果表明透明質(zhì)酸注射液腹部皮下脂肪層注射能有效治療有瘙癢的神經(jīng)性皮炎、牛皮癬、瘙癢的老年濕疹、皰疹樣濕疹或汗皰疹。八、透明質(zhì)酸注射液快速治療牙周炎癥、口腔潰瘍、咽喉炎癥、眼結(jié)膜炎癥：牙周炎癥、口腔潰瘍、咽喉炎癥、眼結(jié)膜炎癥老年人多發(fā)，是衰老相關(guān)疾病，也與中國目前空氣污染、飲水污染和工作壓力大的環(huán)境相關(guān)聯(lián)。我們共分析了76例受試者中患有牙周炎癥、口腔潰瘍、咽喉炎癥、眼結(jié)膜炎癥受試者26例(實驗組1的16例和實驗組2的10例)，結(jié)果如表16所示：表16：透明質(zhì)酸注射液治療牙周炎癥、口腔潰瘍、咽喉炎癥、眼結(jié)膜炎癥的效果表16的結(jié)果表明透明質(zhì)酸注射液比我們以前局部使用透明質(zhì)酸注射液噴涂有更快速的治療牙周炎癥、口腔潰瘍、咽喉炎癥、眼結(jié)膜炎癥的效果。九、透明質(zhì)酸注射液有效治療強直性脊柱炎：強直性脊柱炎是炎癥性疼痛和脊柱嚴重變型的疾病。我們共分析了76例受試者中患有強直性脊柱炎的受試者2例(實驗組1的1例和實驗組2的1例)，結(jié)果如表17所示：表17：透明質(zhì)酸注射液治療強直性脊柱炎的效果強直性脊柱炎是炎癥性疼痛的疾病，透明質(zhì)酸注射液治療的止痛效果表明強直性脊柱炎的炎癥減退或消除，提示炎癥引起的脊柱嚴重變型不會繼續(xù)發(fā)展。十、透明質(zhì)酸注射液用于固體腫瘤化療后體力精力恢復和防止固體腫瘤轉(zhuǎn)移：我們共分析了76例受試者中有固體腫瘤化療后需要體力精力恢復和防止固體腫瘤轉(zhuǎn)移的受試者4例(實驗組1的4例和實驗組3的4例)，結(jié)果如表18所示：表18：透明質(zhì)酸注射液治療固體腫瘤化療后體力精力恢復和防止固體腫瘤轉(zhuǎn)移的效果胰頭癌是一種非常惡性的腫瘤，轉(zhuǎn)移后發(fā)展迅速，最快的90天內(nèi)死亡。國外的研究表明炎癥可能是胰頭癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要促進因素。表18中的胰頭癌化療后受試者(男，46歲)因黃疸發(fā)現(xiàn)胰頭癌轉(zhuǎn)移到肝臟，堵塞膽管造成黃疸，經(jīng)手術(shù)放入支架和鼻膽管引流術(shù)解決了黃疸問題，每月化療，同時采用中藥治療。采用透明質(zhì)酸注射液5x100mg腹部皮下脂肪層注射，體力精力恢復；透明質(zhì)酸注射液20x100mg腹部皮下脂肪層注射后超聲檢查顯示胰頭癌和轉(zhuǎn)移到肝臟的包塊開始縮小，受試者患者正常工作超過90天。以上結(jié)果表明透明質(zhì)酸注射液可以促進治療固體腫瘤化療后體力精力恢復和可能通過抑制炎癥防止了胰頭癌的發(fā)展和進一步轉(zhuǎn)移。國外報道(halozymereceivesorphandrugdesignationforpegylatedrecombinanthumanhyaluronidaseph20forpancreaticcancerat：http：//www.halozyme.com/investors/news-releases/news-release-details/2014/halozyme-receives-orphan-drug-designation-for-pegylated-recombinant-human-hyaluronidase-ph20-for-pancreatic-cancer/default.aspx#sthash.aljvxtoq.dpuf)長效透明質(zhì)酸酶pegph20結(jié)合化療有效延長胰腺導管癌病人的生存時間，其作用機制可能是利用人體內(nèi)透明質(zhì)酸生產(chǎn)類似本發(fā)明所述的含有小分子透明質(zhì)酸的注射液。表18中的卵巢癌手術(shù)化療后受試者(女，62歲)因淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移化療和放療，身體極度虛弱，24小時臥床。采用透明質(zhì)酸注射液20x100mg腹部皮下脂肪層注射，體力精力注射1x100mg后第二天開始恢復，全部注射完20x100mg后ca125從治療前500u/ml驚奇地降到50u/ml，腫瘤和轉(zhuǎn)移包塊縮小，表明透明質(zhì)酸注射液可以促進治療卵巢癌化療后體力精力恢復和可能通過抑制炎癥防止了卵巢癌的發(fā)展和進一步轉(zhuǎn)移。表18中的64歲女性受試者被診斷為右肺肺癌，伴有左肺、腦、骨、縱膈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，已無法手術(shù)切除治療，采用了放療和特羅凱化療。受試者放療和化療后身體虛弱，透明質(zhì)酸注射液10x100mg腹部皮下脂肪層注射，體力精力在注射1x100mg后第一天開始恢復，全部注射完10x100mg后經(jīng)ct檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤和轉(zhuǎn)移包塊縮小，表明透明質(zhì)酸注射液可以促進肺癌放療和化療后體力精力恢復，還可能通過抑制炎癥防止了肺癌的發(fā)展和進一步轉(zhuǎn)移。十一、透明質(zhì)酸注射液治療腦膜瘤手術(shù)后復發(fā)：我們共分析了76例受試者中有腦膜瘤手術(shù)后復發(fā)的受試者2例(實驗組1的1例和實驗組2的1例)，結(jié)果如表19所示：表19：透明質(zhì)酸注射液治療腦膜瘤手術(shù)后復發(fā)的效果表19中的一例女性受試者(61歲)，2007年因頭痛頻發(fā)，經(jīng)ct診斷為腦膜瘤，同年手術(shù)后，頭痛消失。2015年開始頭痛頻發(fā)，經(jīng)ct診斷為腦膜瘤復發(fā)，即腦膜明顯增厚。透明質(zhì)酸注射液腹部皮下脂肪層注射15x100mg，頭痛發(fā)作減少，最后完全終止，ct檢查結(jié)果表明以前增生的腦膜明顯變薄，治療后90天不再有頭疼發(fā)作。以上結(jié)果表明透明質(zhì)酸注射液可以用于治療腦膜瘤或腦膜瘤手術(shù)后復發(fā)。十二、透明質(zhì)酸注射液用于腦栓塞后功能恢復：我們共分析了76例受試者中有腦栓塞后功能恢復需要的受試者4例(實驗組1的1例和實驗組2的3例)，結(jié)果如表20所示：表20：透明質(zhì)酸注射液用于腦栓塞后功能恢復的效果表20中的一例男性受試者(67歲)腦栓塞后30天，半身軟，走路無力，透明質(zhì)酸注射液10x100mg腹部皮下脂肪層注射后，半身軟明顯好轉(zhuǎn)、走路有力，表明透明質(zhì)酸注射液可用于腦栓塞后的功能恢復。表20中的另一例男性受試者(59歲)腦栓塞后4天，視力受損，只能看見20cm內(nèi)的物體，透明質(zhì)酸注射液10x100mg腹部皮下脂肪層注射后，視力明顯好轉(zhuǎn)，可以看見40cm內(nèi)的物體，表明透明質(zhì)酸注射液可用于腦栓塞后的功能恢復。十三、透明質(zhì)酸注射液用于冠心病、防止血管支架后并發(fā)癥以及預防心血管疾?。汗谛牟　⒀苤Ъ芎蟛l(fā)癥以及其它心血管疾病本質(zhì)上可能是慢性炎癥性疾病，急需有效的防治方法。我們共分析了76例受試者中有冠心病和血管支架后并發(fā)癥的受試者6例(實驗組1的3例和實驗組2的3例)，結(jié)果如表21所示：表21：透明質(zhì)酸注射液用于治療冠心病、防止血管支架后并發(fā)癥以及預防心血管疾病的效果表21的結(jié)果表明透明質(zhì)酸注射液可用于治療冠心病、防止血管支架后并發(fā)癥以及可能有預防心血管疾病的效果。結(jié)論：1、透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射或痛點部位注射或患病部位注射用于治療有疼痛的腰背頸肩肌筋膜炎和肌肉肌腱損傷；2、透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射或痛點部位注射或患病部位注射用于治療有疼痛的骨質(zhì)增生、骨刺、椎間盤突出；3、透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射用于治療疼痛的強直性脊柱炎；4、透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射用于治療飛蚊癥或玻璃體渾濁和其引起的玻璃體剝離和視力下降；5、透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射用于治療有炎癥、瘙癢和疼痛的大面積燒傷、創(chuàng)傷疤痕、手術(shù)創(chuàng)口疤痕；6、透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射或患病處使用治療手術(shù)后、腹膜透析后引發(fā)的腹腔粘膜粘連和盆腔粘膜粘連；7、透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射用于治療痛經(jīng)的子宮內(nèi)膜異位癥；8、透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射用于治療瘙癢的神經(jīng)性皮炎、牛皮癬、瘙癢的老年濕疹和皰疹樣濕疹或汗皰疹；9、透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射用于固體腫瘤化療后體力精力恢復和防止固體腫瘤轉(zhuǎn)移；10、透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射用于促進腦梗死后功能恢復；11、透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射用于快速治療牙周疾病和口腔潰瘍，包括化療和衰老引起的牙周疾病和口腔潰瘍；12、透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射用于快速治療咽喉疾病，包括化療和衰老引起的咽喉疾??；13、透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射用于快速治療眼結(jié)膜疾病，包括化療和衰老引起的眼結(jié)膜疾??；14、透明質(zhì)酸注射液通過腹部皮下脂肪層注射用于治療有心絞痛的冠心病、預防和治療血管支架后并發(fā)癥、預防和治療心血管疾??；實施例5目的：探討其它種類透明質(zhì)酸酶切方法活化和商業(yè)化生產(chǎn)有實施例3-4所表現(xiàn)出來的治療作用的透明質(zhì)酸注射液1或2。方法：(1)研究現(xiàn)有文獻中已發(fā)現(xiàn)的多種透明質(zhì)酸酶的生產(chǎn)方法和酶切大分子透明質(zhì)酸的結(jié)果；(2)采用自主或合作或合同生產(chǎn)不同透明質(zhì)酸酶，驗證其酶切和活化大分子透明質(zhì)酸的可行性；(3)研究什么樣的透明質(zhì)酸酶可以切割活化大分子透明質(zhì)酸到什么樣大小的分子量？什么樣的酶切割末端結(jié)構(gòu)能夠活化小分子透明質(zhì)酸有實施例3-4的透明質(zhì)酸注射液所表現(xiàn)出來的治療作用？什么樣的透明質(zhì)酸酶殘留不引起人類過敏反應(yīng)？結(jié)果和討論：我們結(jié)合現(xiàn)有文獻研究了多種透明質(zhì)酸酶的生產(chǎn)方法，以及它們酶切大分子透明質(zhì)酸的方法，現(xiàn)將研究結(jié)果分別報告如下：1、除本文研究的中性人精子頂體透明質(zhì)酸酶ph20(或hyal3或spam1)外，人類還有細胞內(nèi)的酸性透明質(zhì)酸酶hyal1和hyal2。通過文獻“recombinanthumanhyaluronidasehyal-1:insectcellsversusescherichiacoliasexpressionsystemandidentificationoflowmolecularweightinhibitors，glycobiology，17(4):444-53，2007”，我們發(fā)現(xiàn)昆蟲細胞drosophilaschneider-2(ds-2)生產(chǎn)的重組人hyal1透明質(zhì)酸酶比活性8.6u/mg，最佳反應(yīng)ph值3.5-4.0，但產(chǎn)量太低，不適合用于活化和商業(yè)化生產(chǎn)分子量10-60kd的透明質(zhì)酸注射液。另外，未經(jīng)人體試用很難確定重組人hyal1透明質(zhì)酸酶切割大分子透明質(zhì)酸形成的分子量10-60kd的透明質(zhì)酸注射液會有實施例3-4所表現(xiàn)出來的治療作用。我們使用動物細胞(cho-s細胞)、富含gc的pmh3、pmh4、pmh5表達載體和人hyal1和hyal2cdna生產(chǎn)重組人hyal1和hyal2蛋白，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸酶的活性遠小于我們目前生產(chǎn)的ph20(1x105u/mg酶蛋白)，提示重組人hyal1和hyal2不適用于動物細胞生產(chǎn)。2、酵母表達的中性人精子頂體透明質(zhì)酸酶ph20(或hyal3或spam1)產(chǎn)量可達到商業(yè)化水平，比活性可達到1萬iu/mg酶蛋白，適合用于酶切活化和商業(yè)化生產(chǎn)有實施例3-4所表現(xiàn)出來的治療作用的透明質(zhì)酸注射液。我們使用酵母表達的中性人精子頂體透明質(zhì)酸酶ph20，酶切后依次或分別使用重組人透明質(zhì)酸酶親和柱層析、沉淀、柱層析、透析、超濾濃縮等，將含有重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白去除，制造不含有重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白的類似實施例1中的透明質(zhì)酸注射液2(分子量為10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段100mg/2毫升、氯化鈉115-125mm、鎂離子1mm)，并對各種衰老相關(guān)疾病多發(fā)的38例受試者進行臨床研究，表21的結(jié)果表明酵母表達的中性人精子頂體透明質(zhì)酸酶ph20雖然比活性小，對透明質(zhì)酸注射液的純度有一定影響，將含有重組人透明質(zhì)酸酶殘留蛋白去除，可以用于制造有實施例3-4所表現(xiàn)出來的治療作用和無過敏副作用的透明質(zhì)酸注射液2。表22：使用酵母表達的中性人精子頂體透明質(zhì)酸酶ph20制造的透明質(zhì)酸注射液2對各種衰老相關(guān)疾病多發(fā)的38例受試者的臨床效果3、我們通過合作實驗室使用植物擬南芥arabidopsisthaliana生產(chǎn)含油種子表達系統(tǒng)生產(chǎn)中性人精子頂體透明質(zhì)酸酶ph20融合蛋白，發(fā)現(xiàn)可以用于生產(chǎn)上述有實施例3-4所表現(xiàn)出來的治療作用和無過敏副作用的透明質(zhì)酸注射液2，具體效果見表23。但相較于采用動物細胞生產(chǎn)重組透明質(zhì)酸酶，透明質(zhì)酸酶ph20融合蛋白成本低，產(chǎn)量大，活性低，去除含有的透明質(zhì)酸酶ph20融合蛋白殘留成本高，與動物細胞chinesehamsterovary細胞生產(chǎn)的高純度的有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶比較，更適合用于生產(chǎn)純度要求低的外用有治療作用的透明質(zhì)酸霧化機、噴劑和凝膠。表23：使用植物表達的中性人精子頂體透明質(zhì)酸酶ph20制造的透明質(zhì)酸注射液2對各種衰老相關(guān)疾病多發(fā)的35例受試者的臨床效果4、羊或牛睪丸提取的透明質(zhì)酸酶主要為中性羊或牛精子頂體透明質(zhì)酸酶ph20，人使用前需做皮膚過敏實驗。雖然成本低，但純度也低，去除含有的羊或牛透明質(zhì)酸酶蛋白殘留的成本高，經(jīng)與動物細胞chinesehamsterovary細胞生產(chǎn)的>99.0％純度的有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶比較，認為不適合生產(chǎn)純度要求高的有實施例3-4所表現(xiàn)出來的治療作用和無過敏副作用的透明質(zhì)酸注射液1或2。另外，羊或牛睪丸提取的透明質(zhì)酸酶切割大分子透明質(zhì)酸形成的分子量在10-60kd之間的透明質(zhì)酸片段未經(jīng)人體臨床實驗很難確定會有實施例3-4所表現(xiàn)出來的治療作用。5、cedars-sinaimedicalcenter的專利wo/2014/165713表明細菌streptococci透明質(zhì)酸酶產(chǎn)生的小于10kd的小分子透明質(zhì)酸不引起炎癥反應(yīng)，但細菌streptomyces透明質(zhì)酸酶產(chǎn)生的大于10kd的小分子透明質(zhì)酸引起炎癥反應(yīng)，這和我們用重組人透明質(zhì)酸酶和鎂離子切割活化大分子透明質(zhì)酸而生產(chǎn)的有治療功效的分子量為10kd-60kd的透明質(zhì)酸片段相互矛盾，重要的是細菌透明質(zhì)酸酶殘留蛋白可能會對人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)，不適合生產(chǎn)純度要求高的有實施例3-4所表現(xiàn)出來的治療作用和無過敏副作用的透明質(zhì)酸注射液1或2。6、蜜蜂毒液中的透明質(zhì)酸酶過敏原性很強，除促進蜂毒吸收外，還對人引起過敏反應(yīng)。提取和微生物表達的蜜蜂毒液中的透明質(zhì)酸酶都不適合生產(chǎn)純度要求高的有實施例3-4所表現(xiàn)出來的治療作用和無過敏副作用的透明質(zhì)酸注射液1或2。另外，蜜蜂的透明質(zhì)酸酶切割大分子透明質(zhì)酸形成的分子量在10-60kd之間的透明質(zhì)酸片段未經(jīng)人體臨床實驗很難確定會有實施例3-4所表現(xiàn)出來的治療作用。7、吸血的水蛭分泌水蛭透明質(zhì)酸酶，可以溶解皮膚，幫助水蛭進入人體吸血。文獻“enzymaticproductionofspecificallydistributedhyaluronanoligosaccharides，carbohydrpolym，2015，129:194-200”和“high-yieldnovelleechhyaluronidasetoexpeditethepreparationofspecifichyaluronanoligomers(2014)，scientificreports4,article#4471”表明水蛭透明質(zhì)酸酶融合蛋白在酵母表達的產(chǎn)量、酶切活性、成本都能達到商業(yè)化要求，并能將大分子透明質(zhì)酸切割成分子量10-60kd之間的小分子透明質(zhì)酸。但是，水蛭透明質(zhì)酸酶切割大分子透明質(zhì)酸形成的分子量在10-60kd之間的透明質(zhì)酸片段未經(jīng)人體臨床實驗很難確定會有實施例3-4所表現(xiàn)出來的治療作用。水蛭透明質(zhì)酸酶殘留會引起過敏反應(yīng)，需徹底清除方有可能用來生產(chǎn)有實施例3-4所表現(xiàn)出來的治療作用和無過敏副作用的透明質(zhì)酸注射液2。我們比較了水蛭透明質(zhì)酸酶和動物細胞chinesehamsterovary細胞生產(chǎn)的>99.0％純度的有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶，認為水蛭透明質(zhì)酸酶不適合生產(chǎn)純度要求高的有實施例3-4所表現(xiàn)出來的治療作用和無過敏副作用的透明質(zhì)酸注射液1或2。最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12