本發(fā)明屬于獸藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鹿蹄草素包合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

鹿蹄草(又名鹿銜草，英文簡稱PA)為常用中藥, 是鹿蹄草科植物鹿蹄草( P. decorata H. Andres)或普通鹿蹄草( Pyroladecorata H. Andres)的干燥全草, 具有祛風(fēng)濕, 強(qiáng)筋骨, 止血的功能; 用于風(fēng)濕痹痛, 腰膝無力, 月經(jīng)過多, 久咳勞嗽, 中國藥典2000年版收載。自1990年以來，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所通過對鹿蹄草素的化學(xué)合成與在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用進(jìn)行了研究，使產(chǎn)品合成總收率達(dá)到了60％，獸醫(yī)臨床上治療奶牛臨床型乳房炎平均治愈率達(dá)到93．06％，總有效率達(dá)95．83％，對仔豬黃痢、白痢和雞白痢的治愈率達(dá)到85％以上。本成果在合成工藝上突破了傳統(tǒng)的合成方法，建立的新的合成路線流程短，反應(yīng)易于控制，反應(yīng)溫度接近常溫，原料易得成本低廉。進(jìn)行了大量的藥理藥效研究工作。首次將鹿蹄草素應(yīng)用于獸醫(yī)臨床，尤其對奶牛臨床型乳房炎的治療取得了良好的效果，與傳統(tǒng)治療藥物相比具有療程短，效果明顯、成本低的優(yōu)點(diǎn)，可望成為該病的臨床首選治療藥。該成果在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用，可望有效地控制奶牛乳房炎及豬、雞的消化道細(xì)菌性疾病，每年可挽回因此造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失。1993年至1995年，針對奶牛乳房炎的治療，在甘肅、湖北、廣東、北京等10余省市進(jìn)行了鹿蹄草素的推廣與應(yīng)用，累積治療2萬頭，創(chuàng)造直接經(jīng)濟(jì)效益800余萬元。鹿蹄草素的推廣應(yīng)用潛力巨大，隨著推廣區(qū)域的不斷擴(kuò)大，可產(chǎn)生相當(dāng)可觀的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益，對我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展將起很大的促進(jìn)作用。但隨著其廣泛應(yīng)用，臨床表現(xiàn)出其水劑不穩(wěn)定、制作水針劑比較困難，而加一些抗氧化劑往往對使用安全有影響。

包合物的形成能夠有效保護(hù)化合物免于氧化或水解等反應(yīng)，同時(shí)也延長藥物的在體內(nèi)的代謝速度，增強(qiáng)穩(wěn)定性,降低毒副作用，控制藥物釋放提高生物利用率。近來，環(huán)糊精用來改善藥物的物理化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)方面的研究應(yīng)用越來越受到人們的關(guān)注。特別是用來提高疏水藥物的穩(wěn)定性和生物利用度，有一些溶液中包合作用的報(bào)道，而環(huán)糊精鹿蹄草素固體包合物的制備及其性質(zhì)的研究未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種鹿蹄草素包合物及其制備方法，從而解決現(xiàn)有的鹿蹄草素水針劑不穩(wěn)定、制作水針劑困難的問題；并且，在本發(fā)明的制備過程中不加入抗氧化劑，不存在使用安全的問題。

本發(fā)明提供了一種鹿蹄草素包合物的制備方法，所述方法是將鹿蹄草素用倍他環(huán)糊精包合，得到鹿蹄草素包合物。

優(yōu)選地，是將鹿蹄草素與倍他環(huán)糊精混合，加入體積百分比濃度為10-80%的乙醇溶解，在一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間得到的；優(yōu)選地，所述乙醇的體積百分比濃度為50%。

優(yōu)選地，所述鹿蹄草素與倍他環(huán)糊精的摩爾比為1:1-1:3；優(yōu)選地，摩爾比為1:2。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)溫度是20-50℃；優(yōu)選地，反應(yīng)溫度為30℃。

優(yōu)選地，在所述反應(yīng)時(shí)進(jìn)行攪拌，轉(zhuǎn)速為300-1200 r·min^-1 ；優(yōu)選地，轉(zhuǎn)速為800r·min^-1。

通過攪拌法所制備的PA -β-CD 具有較高的包合率及收得率，且工藝穩(wěn)定易操作，因此選擇攪拌法作為制備PA -β-CD的方法。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供應(yīng)用上述的方法制備得到的鹿蹄草素包合物。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種鹿蹄草素水針劑，所述鹿蹄草素水針劑是上述的鹿蹄草素包合物的水溶液。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種鹿蹄草素水針劑的制備方法，是將權(quán)利要求7所述的鹿蹄草素包合物溶于純凈水得到的。

其中，鹿蹄草素的化學(xué)式如下：

本發(fā)明對包合條件進(jìn)行了優(yōu)化：

1、原料不同比例對包合的影響

鹿蹄草素與β-CD，溫度為30℃，時(shí)間2h，以不同摩爾比混合，按照上述方法進(jìn)行包合，測定包合物的吸光值；其中，以1:2摩爾比混合時(shí),吸光值相差最大,由此結(jié)果提示兩者以1:2比例進(jìn)行包合的可能性最大。詳見表1。

表1鹿蹄草素的不同比例β-CD包合紫外吸收度差

2、反應(yīng)溫度對包合的影響

鹿蹄草素與 β-CD 以 1:2 摩爾比混合時(shí),時(shí)間2h，在不同溫度下按照上述方法進(jìn)行包合，測定包合物吸光值；其中，反應(yīng)溫度30℃吸光值相差最大,由此結(jié)果提示反應(yīng)溫度30℃進(jìn)行包合的可能性最大。詳見表2。

表2鹿蹄草素比β-CD的摩爾比為1:2時(shí)不同反應(yīng)溫度包合紫外吸收度差

3、反應(yīng)時(shí)間對包合的影響

鹿蹄草素與β-CD 以 1:2摩爾比混合時(shí),混合溫度30℃，在不同反應(yīng)時(shí)間下，按照上述方法進(jìn)行包合，測定包合物吸光值；其中，反應(yīng)時(shí)間為2h吸光值相差最大,由此結(jié)果提示混合反應(yīng)時(shí)間為2h進(jìn)行包合的可能性最大。詳見表3。

表3鹿蹄草素與β-CD不同反應(yīng)時(shí)間包合紫外吸收度差

由于β-CD具有獨(dú)特的內(nèi)疏水外親水的結(jié)構(gòu)而與許多尺寸適宜的客體分子形成包合物，通過β-CD對鹿蹄草素包合可形成液態(tài)包合物。包合物的形成能夠有效保護(hù)化合物免于氧化或水解等反應(yīng)，同時(shí)也降低毒副作用，控制藥物釋放提高生物利用率。

應(yīng)用本發(fā)明的方法得到的鹿蹄草素的倍他環(huán)糊精包合物具備良好的穩(wěn)定性：含量高，包合率高：3份PA-β-CD包合率分別為：64.65%、63.96%、63.72%，包合率平均值為：64.11%，RSD為0.75%，說明該工藝穩(wěn)定可行。

應(yīng)用本發(fā)明的方法制備得到的鹿蹄草素水針劑具備良好的穩(wěn)定性：六個(gè)月內(nèi)在加速條件下含量略有下降,但外觀性狀、pH值、澄明度都無明顯變化，加速條件為：40±2℃、相對濕度75±5%。

附圖說明

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。

圖1為鹿蹄草素倍他環(huán)糊精包合的紫外掃描圖；其中1. 鹿蹄草素溶解在甲醇中的圖；2. 鹿蹄草素倍他環(huán)糊精包合水溶液的圖；3. 鹿蹄草素倍他環(huán)糊精包合甲醇提取后的圖；4. 倍他環(huán)糊精水溶液的圖；

圖2為鹿蹄草素倍他環(huán)糊精包合的TLC圖；其中，1. 鹿蹄草素溶解在甲醇中的圖；2. 鹿蹄草素倍他環(huán)糊精包合水溶液的圖；3. 鹿蹄草素倍他環(huán)糊精包合甲醇提取后的圖； 4. 倍他環(huán)糊精水溶液的圖；可見：PA標(biāo)準(zhǔn)品溶解在甲醇中顯示左面黃色斑點(diǎn)（1）；PA-β-CD：經(jīng)甲醇提取后的溶液在同一位置顯相同顏色的右面黃色斑點(diǎn)（3）； PA-β-CD的水溶液（2）與β-CD（4）的水溶液無此斑點(diǎn)顯示。

圖3為鹿蹄草素高效液相標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

本發(fā)明中的β-CD購自西安藻露堂藥業(yè)集團(tuán)康復(fù)醫(yī)藥有限公司。

實(shí)施例1

本發(fā)明的鹿蹄草素包合物的制備方法如下：

分別稱取PA 5mg 與β-CD90mg置于燒杯中，加入50%乙醇10ml 使二者溶解后，置磁力加熱攪拌器上，在30℃下，固定轉(zhuǎn)速為800r·min^-1，攪拌2h，室溫靜置。將溶液減壓蒸發(fā)除去乙醇，用0.45μm的微孔濾膜過濾除去未被包合的PA，將濾液在30℃下進(jìn)行真空干燥，得到PA-β-CD。

以上述工藝平行制備3批樣品，按照含量測定方法測定PA的含量，3份PA-β-CD包合率分別為：64.65%、63.96%、63.72%，包合率平均值為：64.11%，RSD為0.75%，說明該工藝穩(wěn)定可行。

將得到的PA-β-CD溶于純凈水即得到鹿蹄草素水針劑。

一、本發(fā)明實(shí)施例1制備的包合物的物相鑒定

1、紫外分光光度法驗(yàn)證PA-β-CD的形成：

結(jié)果如圖1所示。通過對PA標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇溶液、PA-β-CD的水溶液、PA-β-CD經(jīng)甲醇提取后的溶液及β-CD的水溶液進(jìn)行光譜掃描后，結(jié)果顯示，PA包合前后，紫外吸收峰變化很大，包合后PA在254nm的特征吸收峰消失，說明 PA經(jīng)包合后進(jìn)入了β-CD分子腔內(nèi)形成了穩(wěn)定的包合物。PA-β-CD經(jīng)甲醇提取后又重現(xiàn)包合前的吸收特征，說明包合物中的PA被甲醇提取出來。

2、薄層色譜法驗(yàn)證PA-β-CD的形成：

結(jié)果如圖2所示。將PA標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇溶液、PA-β-CD的水溶液、PA-β-CD經(jīng)甲醇提取后的溶液及β-CD的水溶液點(diǎn)在硅膠板上，經(jīng)展開劑展開后，在紫外燈下觀察。結(jié)果顯示：PA標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇溶液與 PA-β-CD經(jīng)甲醇提取后的溶液在同一位置顯相同顏色的黃色斑點(diǎn)，而 PA-β-CD的水溶液與 β-CD的水溶液無此斑點(diǎn)顯示，說明PA已被β-CD包合，包合物已經(jīng)形成。

二、本發(fā)明實(shí)施例1制備的包合物的穩(wěn)定性試驗(yàn)

1、鹿蹄草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取鹿蹄草素標(biāo)準(zhǔn)液3、4、5、6、7、8ml，分別置于10ml內(nèi)標(biāo)物貯備液，用流動(dòng)相（流動(dòng)相為純凈水）溶解至刻度，制成濃度分別為60、80、100、120、140μg/ml的溶液，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.0086X+0.004，r²=0.9998。參見圖3。

2、鹿蹄草素的含量測定方法研究

準(zhǔn)確量取供試品（鹿蹄草素原料藥，未包合，批號(hào)見表4）溶液5ml置于10ml容量瓶中，測定其中鹿蹄草素的百分含量，測定結(jié)果見表4。

表4 鹿蹄草素含量測定結(jié)果

3、穩(wěn)定性試驗(yàn)

對比試驗(yàn)：將批號(hào)070103、070106、070109的供試品溶液在溫度20±2℃的水中放置10d，結(jié)果參見表5。

加速試驗(yàn)：取本發(fā)明實(shí)施例1制備的鹿蹄草素包合物的溶液于溫度40±2℃、相對濕度75±5%條件下放置不同時(shí)間，測定包合物穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果參見表6。

表5鹿蹄草素原料藥水分的影響試驗(yàn)結(jié)果

由表5結(jié)果可以看出,鹿蹄草素原料藥在水中的條件下放置10d,于第5d和第10d取樣檢測發(fā)現(xiàn)顏色先變?yōu)槌渭t色后變?yōu)樽丶t色,鹿蹄草素含量明顯下降,且隨著放置時(shí)間越長溶液越渾濁,說明鹿蹄草素原料藥在水溶液中很不穩(wěn)定。

表6鹿蹄草素的倍他環(huán)糊精(PA -β-CD)包合物水溶液加速實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表6可以看出,3批鹿蹄草素的倍他環(huán)糊精(PA -β-CD)包合物水溶液在六個(gè)月內(nèi)在加速條件（加速條件為：40±2℃、相對濕度75±5%）下含量略有下降,但外觀性狀、pH值、澄明度都無明顯變化,表明本發(fā)明的鹿蹄草素的倍他環(huán)糊精(PA -β-CD)包合物的水溶液在加速條件下較穩(wěn)定。本試驗(yàn)結(jié)果表明,鹿蹄草素原料藥水溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)條件下很不穩(wěn)定,而鹿蹄草素包合物在加速條件(溫度40±2℃、相對濕度75±5%)下很穩(wěn)定,其原因是鹿蹄草素形成了穩(wěn)定的包合物。

實(shí)施例2

本發(fā)明的鹿蹄草素包合物的制備方法如下：

分別稱取PA 5mg與β-CD 135mg 置于燒杯中，加入80%乙醇10ml 使二者溶解后，置磁力加熱攪拌器上，在20℃下，固定轉(zhuǎn)速為1200r·min^-1，攪拌3h，室溫靜置。將溶液減壓蒸發(fā)除去乙醇，用0.45μm的微孔濾膜過濾除去未被包合的PA，將濾液進(jìn)行真空干燥(30℃)，得到PA-β-CD。

將得到的PA-β-CD溶于純凈水即得到鹿蹄草素水針劑。

實(shí)施例3

本發(fā)明的鹿蹄草素包合物的制備方法如下：

分別稱取PA 5mg與β-CD 45mg 置于燒杯中，加入50%乙醇10ml 使二者溶解后，置磁力加熱攪拌器上，在50℃下，固定轉(zhuǎn)速為800r·min^-1，攪拌0.5h，室溫靜置。將溶液減壓蒸發(fā)除去乙醇，用0.45μm的微孔濾膜過濾除去未被包合的PA，將濾液進(jìn)行真空干燥(30℃)，得到PA-β-CD。

將得到的PA-β-CD溶于純凈水即得到鹿蹄草素水針劑。

實(shí)施例4

本發(fā)明的鹿蹄草素包合物的制備方法如下：

分別稱取PA 5mg與β-CD 60mg 置于燒杯中，加入10%乙醇10ml 使二者溶解后，置磁力加熱攪拌器上，在40℃下，固定轉(zhuǎn)速為300r·min^-1，攪拌1h，室溫靜置。將溶液減壓蒸發(fā)除去乙醇，用0.45μm的微孔濾膜過濾除去未被包合的PA，將濾液進(jìn)行真空干燥(30℃)，得到PA-β-CD。

將得到的PA-β-CD溶于純凈水即得到鹿蹄草素水針劑。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。