本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，涉及共載藥物聚合物膠束及其在制藥中的應(yīng)用，特別是涉及一種水飛薊賓和化療藥共載的聚合物膠束及其在制藥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤微環(huán)境(tme)，即腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生和生活的內(nèi)環(huán)境，其中不僅包括了腫瘤細(xì)胞本身，還有其周圍的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、免疫、炎性細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞等各種細(xì)胞，同時(shí)也包括附近區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞間質(zhì)、微血管以及浸潤(rùn)在其中的生物分子。之前人們對(duì)于腫瘤的治療總是將思路局限于腫瘤細(xì)胞本身。直到最近，大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤與腫瘤微環(huán)境是一個(gè)不可分割的整體。腫瘤微環(huán)境就像是一個(gè)小的生態(tài)環(huán)境，與其中的腫瘤細(xì)胞有著密切的聯(lián)系。因此，針對(duì)腫瘤微環(huán)境的調(diào)控勢(shì)必也將影響化療藥物的治療效果。

水飛薊素是從菊科植物水飛薊中提取的黃酮類化合物,水飛薊賓是其主要的活性成分，臨床上主要用于治療急、慢性肝炎、肝硬化及肝損傷。近年來(lái)隨著藥理學(xué)的深入研究表明，水飛薊賓除了保肝作用以外還兼有抑制前列腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、肺癌等多種癌癥的作用，這些發(fā)現(xiàn)使得水飛薊賓的藥理活性受到廣泛的關(guān)注。多項(xiàng)動(dòng)物癌癥模型的研究表明，水飛薊賓可以通過(guò)抑制白介素、腫瘤壞死因子(tnf-α)、核轉(zhuǎn)錄因子(nf-κb)、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(stat3)等因子的分泌和表達(dá)，調(diào)控腫瘤微環(huán)境，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制腫瘤新生血管的形成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮免疫和抗腫瘤作用。因此，著手于調(diào)控腫瘤微環(huán)境，促使腫瘤部位血管正常化，實(shí)現(xiàn)化療藥物的深層次遞送已成為腫瘤治療的另一種重要手段。

常規(guī)化療藥物，包括紫杉烷類、環(huán)孢素類、葉酸拮抗劑、嘌呤拮抗劑、嘧啶拮抗劑、黃酮類、喜樹(shù)堿類、二氫吡啶類、長(zhǎng)春堿類、小檗堿類、蒽醌類、鬼臼毒素類等。這些藥物能作用于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的不同階段，抑制或殺死腫瘤細(xì)胞?；熕幬镏委熑允悄壳爸委熉殉舶⑷橄侔?、頭頸部癌、非小細(xì)胞性肺癌及前列腺癌等多種轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的主要手段。

周黎光等通過(guò)將游離水飛薊賓與紫杉醇聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)該組合物對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用顯著高于紫杉醇或水飛薊賓單獨(dú)使用，且水飛薊賓能增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性(周黎光.水飛薊賓對(duì)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性和侵襲力影響的實(shí)驗(yàn)研究[d].山東大學(xué),2008.)。張?jiān)碌葘⒂坞x水飛薊賓與阿霉素聯(lián)合作用于胃癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)水飛薊賓能有效降低阿霉素的給藥濃度，并提升阿霉素誘導(dǎo)凋亡的效果(張?jiān)?葛雅琨,施維.水飛薊賓與阿霉素聯(lián)合作用對(duì)胃癌細(xì)胞sgc-7901凋亡的影響及其機(jī)制[j].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2014,27(5):642-646.)。上述文獻(xiàn)表明將水飛薊賓與化療藥物聯(lián)合使用，均能增敏化藥的療效，通過(guò)藥物組合物的協(xié)同作用共同抑制腫瘤增殖，并降低化藥的毒副作用。

現(xiàn)有的文獻(xiàn)都將重點(diǎn)集中在考察游離藥物組合物對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用。然而，這些游離藥物大多存在水溶性差、毒副作用大、生物利用度低等缺陷，極大地影響了藥物組合物對(duì)腫瘤的治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種更易聚集于腫瘤組織釋放藥物，起到減毒增效作用的共載藥物聚合物膠束。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述共載藥物聚合物膠束在制藥中的應(yīng)用。

本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思是聚合物膠束在水溶液中通過(guò)自組裝形成納米粒，將水飛薊賓和化藥共同負(fù)載于膠束的疏水內(nèi)核形成制劑，用于改善腫瘤微環(huán)境，利用水飛薊賓對(duì)腫瘤微環(huán)境的調(diào)控作用，聚合物膠束遞藥系統(tǒng)(粒徑10-1000nm)的分子或顆粒更易聚集于腫瘤組織釋放藥物，達(dá)到“減毒增效”的目的。給藥后后聚合物膠束通過(guò)實(shí)體瘤組織的高通透性和滯留效應(yīng)到腫瘤部位進(jìn)而同步釋藥，顯著提高藥物組合物的協(xié)同效果。

本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種共載藥物聚合物膠束，該共載藥物聚合物膠束采用兩親性聚合物作為膠束的載體共載水飛薊賓和化療藥物，采用下列方法制備得到：

a.將兩親性聚合物溶解或分散于水中，得到聚合物膠束；將化療藥、水飛薊賓用藥學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑溶解后，與上述聚合物膠束混合得預(yù)制溶液；

b.將預(yù)制溶液經(jīng)超聲或高壓均質(zhì)法處理后，采用透析、超濾或蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，制得粒徑為10-1000nm的水飛薊賓、化療藥共載膠束溶液；或者

將預(yù)制溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)于瓶壁上形成薄膜后，以水?dāng)嚢鑿?fù)溶或分散，經(jīng)超聲或高壓均質(zhì)法處理，制得粒徑為10-1000nm的水飛薊賓、化療藥共載膠束溶液。

所述的共載藥物聚合物膠束，還可以將所述水飛薊賓、化療藥共載膠束溶液添加藥學(xué)上可接受的凍干保護(hù)劑，采用冷凍干燥的方法制成凍干粉；所述凍干保護(hù)劑為乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、氯化鈉、氨基酸、枸櫞酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽中的一種或多種。

所述的共載藥物聚合物膠束，其中兩親性聚合物選用聚乙烯亞胺、聚乙二醇、殼聚糖、透明質(zhì)酸、葡聚糖及其衍生物作為親水片段，選用聚乳酸、聚己內(nèi)酯、長(zhǎng)鏈脂肪酸、長(zhǎng)鏈脂肪胺作為疏水片段。兩親性聚合物選用親水片段與疏水片段的摩爾投料比為1:1-1:5。

所述的共載藥物聚合物膠束，其中兩親性聚合物以6-10mg/ml溶解或分散于水中，用化療藥和水飛薊賓的共溶劑同時(shí)溶解兩種藥物，滴入該兩親性聚合物的水溶液中，通過(guò)膠束內(nèi)核與藥物的疏水性相互作用，將化療藥與水飛薊賓同時(shí)負(fù)載于膠束的疏水性內(nèi)核，化療藥物和水飛薊賓的質(zhì)量比包括1:1-1:5。

所述的共載藥物聚合物膠束，其中化療藥包括：紫杉烷類、環(huán)孢素類、葉酸拮抗劑、嘌呤拮抗劑、嘧啶拮抗劑、黃酮類、喜樹(shù)堿類、二氫吡啶類、長(zhǎng)春堿類、小檗堿類、蒽醌類、鬼臼毒素類抗腫瘤藥物中的任意一項(xiàng)。

所述藥學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑為：甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃、n.n-二甲基甲酰胺、二甲亞砜等有機(jī)溶劑或者它們的混合溶劑。

所述的共載藥物聚合物膠束在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

上述共載藥物聚合物膠束可以制成注射劑，所述注射劑包括：將膠束溶液或固體粉末，按注射液或注射用制劑常用工藝，直接分散于西林瓶中制得；或?qū)⒐腆w粉末溶解后，按注射劑制備常用工藝，制成注射液或注射用制劑。

本發(fā)明的有效效果：

本發(fā)明提供的共載藥制劑具有下列優(yōu)點(diǎn)：

通過(guò)聚合物膠束的疏水內(nèi)核增溶水飛薊賓與化療藥物，提高了藥物的溶解度，并通過(guò)透析和旋蒸除去有機(jī)溶劑，避免了游離藥物使用有機(jī)溶劑溶解而產(chǎn)生的毒副作用。該共載藥膠束易于靶向到腫瘤部位，提高了藥物組合物的生物利用度。

所述的將共載藥制劑用于改善腫瘤微環(huán)境的應(yīng)用包括：共載藥制劑在動(dòng)物給藥周期結(jié)束后，腫瘤部位新生血管的減少和通透性的增加，膠原成分和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的減少。

水飛薊賓和化療藥物共同負(fù)載于聚合物膠束的疏水內(nèi)核，靶向到腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)兩種藥物的同步釋放，利用水飛薊賓對(duì)腫瘤微環(huán)境的調(diào)控作用，實(shí)現(xiàn)化療藥物向腫瘤組織的深層次遞送，并增敏化療藥物的療效。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例13共載藥物膠束給藥后腫瘤微環(huán)境膠原的圖片。

圖2為實(shí)施例16共載藥物膠束給藥后腫瘤通透性的圖片。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明加以進(jìn)一步的說(shuō)明，但下述實(shí)施例并不限制本專利的權(quán)利范圍。

實(shí)施例1

取0.1mmol的透明質(zhì)酸、0.3mmol的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和0.3mmol的n-羥基硫代琥珀酰亞胺溶于10ml甲酰胺，常溫活化半小時(shí)。將0.2mmol的十八胺溶于5mln.n-二甲基甲酰胺，滴入活化好的透明質(zhì)酸溶液中，繼續(xù)反應(yīng)24h后，使用丙酮將產(chǎn)物沉淀出來(lái)，沉淀物用20ml蒸餾水復(fù)溶，置于透析袋(mwco＝3500)中透析2天，凍干后即得透明質(zhì)酸-十八胺聚合物膠束。

實(shí)施例2

取0.1mmol的葡聚糖、0.2mmol的脫氧膽酸和10mg的4-二甲氨基吡啶溶于10ml二甲亞砜，室溫條件下反應(yīng)24h后，使用乙醇將產(chǎn)物沉淀出來(lái)，沉淀物用20ml蒸餾水復(fù)溶，置于透析袋(mwco＝3500)中透析2天，凍干后即得葡聚糖-脫氧膽酸聚合物膠束。

實(shí)施例3

取0.1mmol的殼聚糖、0.2mmol的丁二酸酐、0.3mmol的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和0.3mmol的n-羥基硫代琥珀酰亞胺溶于10ml二甲亞砜，反應(yīng)24h后，使用丙酮將產(chǎn)物沉淀出來(lái)，沉淀物用20ml蒸餾水溶解，置于透析袋(mwco＝3500)中透析2天，凍干后得到游離一端羧基的殼聚糖中間體。將0.1mmol殼聚糖中間體和0.4mmol的辛胺溶于水和甲醇(v/v＝1:1)中，0.3mmol的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和0.3mmol的n-羥基硫代琥珀酰亞胺為催化劑，反應(yīng)24h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，置于透析袋(mwco＝3500)中透析2天，凍干后即得殼聚糖-辛胺聚合物膠束。

實(shí)施例4

取葡聚糖-脫氧膽酸聚合物載體，以6mg/ml溶解于水中，用丙酮：乙醇(1:1，v/v)作為混合溶劑溶解水飛薊賓和紫杉醇(紫杉醇濃度為15mg/ml；水飛薊賓濃度為30mg/ml)。將該溶液逐滴滴加到聚合物膠束溶液中，劇烈攪拌10min。45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，將形成的混合物薄膜重新分散于水中，100w功率冰浴條件下探頭超聲半小時(shí)后過(guò)0.80μm濾膜，即得共載藥膠束溶液。該膠束平均粒徑為189.6nm，zeta電位為-12.5mv。水飛薊賓載藥量為12.6％，紫杉醇載藥量為10.5％。將膠束水溶液加入1.0％的甘露醇凍干，即得凍干固體粉末。使用前用0.9％的生理鹽水或5％的葡萄糖復(fù)溶，該膠束可用于靜脈注射。

實(shí)施例5

取葡聚糖-脫氧膽酸聚合物載體，以6mg/ml溶解于水中，用二甲亞砜作為溶劑溶解水飛薊賓和阿霉素(阿霉素濃度為15mg/ml；水飛薊賓濃度為30mg/ml)。將該溶液逐滴滴加到聚合物膠束溶液中，避光劇烈攪拌10min。100w功率冰浴條件下探頭超聲半小時(shí)。膠束溶液置于透析袋中(mwco＝3500)中透析12h，過(guò)0.80μm濾膜，即得共載藥膠束溶液。該膠束平均粒徑為176.5nm,zeta電位為-12.0mv。水飛薊賓載藥量為13.3％，阿霉素載藥量為11.2％。將膠束水溶液加入1.0％的甘露醇凍干，即得凍干固體粉末。使用前用0.9％的生理鹽水或5％的葡萄糖復(fù)溶，該膠束可用于靜脈注射。

實(shí)施例6

取葡聚糖-脫氧膽酸聚合物載體，以6mg/ml溶解于水中，用n.n-二甲基甲酰胺作為溶劑溶解水飛薊賓和順鉑(順鉑濃度為15mg/ml；水飛薊賓濃度為30mg/ml)。將該溶液逐滴滴加到聚合物膠束溶液中，避光劇烈攪拌10min。100w功率冰浴條件下探頭超聲半小時(shí)。膠束溶液置于透析袋中(mwco＝3500)中透析12h，過(guò)0.80μm濾膜，即得共載藥膠束溶液。該膠束平均粒徑為189.2nm,zeta電位為-11.6mv。水飛薊賓載藥量為14.2％，順鉑載藥量為10.1％。將膠束水溶液加入1.0％的甘露醇凍干，即得凍干固體粉末。使用前用0.9％的生理鹽水或5％的葡萄糖復(fù)溶，該膠束可用于靜脈注射。

實(shí)施例7

取透明質(zhì)酸-十八胺聚合物載體，以6mg/ml溶解于水中，用丙酮：乙醇(1:1，v/v)作為混合溶劑溶解水飛薊賓和紫杉醇(紫杉醇濃度為15mg/ml；水飛薊賓濃度為30mg/ml)。將該溶液逐滴滴加到聚合物膠束溶液中，劇烈攪拌10min。45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，將形成的混合物薄膜重新分散于水中，100w功率冰浴條件下探頭超聲半小時(shí)后過(guò)0.80μm濾膜，即得共載藥膠束溶液。該膠束平均粒徑為186.3nm,zeta電位為-12.1mv。水飛薊賓載藥量為13.1％，紫杉醇載藥量為11.2％。將膠束水溶液加入1.0％的甘露醇凍干，即得凍干固體粉末。使用前用0.9％的生理鹽水或5％的葡萄糖復(fù)溶，該膠束可用于靜脈注射。

實(shí)施例8

取透明質(zhì)酸-十八胺聚合物載體，以6mg/ml溶解于水中，用二甲亞砜作為溶劑溶解水飛薊賓和阿霉素(阿霉素濃度為15mg/ml；水飛薊賓濃度為30mg/ml)。將該溶液逐滴滴加到聚合物膠束溶液中，避光劇烈攪拌10min。100w功率冰浴條件下探頭超聲半小時(shí)。膠束溶液置于透析袋中(mwco＝3500)中透析12h，過(guò)0.80μm濾膜，即得共載藥膠束溶液。該膠束平均粒徑為200.2nm,zeta電位為-10.8mv。水飛薊賓載藥量為13.6％，阿霉素載藥量為10.5％。將膠束水溶液加入1.0％的甘露醇凍干，即得凍干固體粉末。使用前用0.9％的生理鹽水或5％的葡萄糖復(fù)溶，該膠束可用于靜脈注射。

實(shí)施例9

取透明質(zhì)酸-十八胺聚合物載體，以6mg/ml溶解于水中，用n.n-二甲基甲酰胺作為溶劑溶解水飛薊賓和順鉑(順鉑濃度為15mg/ml；水飛薊賓濃度為30mg/ml)。將該溶液逐滴滴加到聚合物膠束溶液中，避光劇烈攪拌10min。100w功率冰浴條件下探頭超聲半小時(shí)。膠束溶液置于透析袋中(mwco＝3500)中透析12h，過(guò)0.80μm濾膜，即得共載藥膠束溶液。該膠束平均粒徑為196.3nm,zeta電位為-12.3mv。水飛薊賓載藥量為16.8％，順鉑載藥量為11.5％。將膠束水溶液加入1.0％的甘露醇凍干，即得凍干固體粉末。使用前用0.9％的生理鹽水或5％的葡萄糖復(fù)溶，該膠束可用于靜脈注射。

實(shí)施例10

取殼聚糖-辛胺聚合物載體，以6mg/ml溶解于水中，用丙酮：乙醇(1:1，v/v)作為混合溶劑溶解水飛薊賓和紫杉醇(紫杉醇濃度為15mg/ml；水飛薊賓濃度為30mg/ml)。將該溶液逐滴滴加到聚合物膠束溶液中，劇烈攪拌10min。45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，將形成的混合物薄膜重新分散于水中，100w功率冰浴條件下探頭超聲半小時(shí)后過(guò)0.80μm濾膜，即得共載藥膠束溶液。該膠束平均粒徑為156..2nm,zeta電位為-15.4mv。水飛薊賓載藥量為20.1％，紫杉醇載藥量為15.3％。將膠束水溶液加入1.0％的甘露醇凍干，即得凍干固體粉末。使用前用0.9％的生理鹽水或5％的葡萄糖復(fù)溶，該膠束可用于靜脈注射。

實(shí)施例11

取殼聚糖-辛胺聚合物載體，以6mg/ml溶解于水中，用二甲亞砜作為溶劑溶解水飛薊賓和阿霉素(阿霉素濃度為15mg/ml；水飛薊賓濃度為30mg/ml)。將該溶液逐滴滴加到聚合物膠束溶液中，避光劇烈攪拌10min。100w功率冰浴條件下探頭超聲半小時(shí)。膠束溶液置于透析袋中(mwco＝3500)中透析12h，過(guò)0.80μm濾膜，即得共載藥膠束溶液。該膠束平均粒徑為145.6nm,zeta電位為-10.8mv。水飛薊賓載藥量為19.2％，阿霉素載藥量為15.1％。將膠束水溶液加入1.0％的甘露醇凍干，即得凍干固體粉末。使用前用0.9％的生理鹽水或5％的葡萄糖復(fù)溶，該膠束可用于靜脈注射。

實(shí)施例12

取殼聚糖-辛胺聚合物載體，以6mg/ml溶解于水中，用n.n-二甲基甲酰胺作為溶劑溶解水飛薊賓和順鉑(順鉑濃度為15mg/ml；水飛薊賓濃度為30mg/ml)。將該溶液逐滴滴加到聚合物膠束溶液中，避光劇烈攪拌10min。100w功率冰浴條件下探頭超聲半小時(shí)。膠束溶液置于透析袋中(mwco＝3500)中透析12h，過(guò)0.80μm濾膜，即得共載藥膠束溶液。該膠束平均粒徑為156.3nm,zeta電位為-13.3mv。水飛薊賓載藥量為19.6％，順鉑載藥量為15.5％。將膠束水溶液加入1.0％的甘露醇凍干，即得凍干固體粉末。使用前用0.9％的生理鹽水或5％的葡萄糖復(fù)溶，該膠束可用于靜脈注射。

實(shí)施例13

共載藥物膠束對(duì)腫瘤微環(huán)境中膠原的影響

(1)實(shí)驗(yàn)方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的a549細(xì)胞，胰酶消化后加含血清培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞，以0.9％的氯化鈉注射液重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至10⁶cell/只于無(wú)菌條件下接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，建立a549荷瘤裸鼠模型。待腫瘤長(zhǎng)至50-80mm³時(shí)隨機(jī)分為5組，每組5只，第一次給藥記作第0天。以葡聚糖-脫氧膽酸膠束為例，按以下組別進(jìn)行設(shè)置:對(duì)照組：5％的葡萄糖溶液；a組：紫杉醇和水飛薊賓游離藥物組合物；b組：載紫杉醇的葡聚糖-脫氧膽酸膠束；c組：載水飛薊賓的葡聚糖-脫氧膽酸膠束；d組：共載紫杉醇和水飛薊賓的葡聚糖-脫氧膽酸膠束；分別于0、3、6、9、12、15、18天尾靜脈注射給藥，停藥后第3天處死并解剖裸鼠，取裸鼠的腫瘤組織進(jìn)行石蠟包埋，制成石蠟切片。將裸鼠腫瘤的石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；利用massontrichrome試劑盒進(jìn)行染色，封片后于倒置熒光顯微鏡下觀察腫瘤部位的膠原數(shù)量。結(jié)果見(jiàn)圖1。

(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：腫瘤部位致密的胞外基質(zhì)和膠原構(gòu)成增加了腫瘤間質(zhì)壓，阻礙了納米粒在腫瘤組織的有效遞送，從而影響藥效。膠原是腫瘤基質(zhì)的主要組成部分，是腫瘤微環(huán)境的保護(hù)屏障。該實(shí)驗(yàn)中膠原被標(biāo)記為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被染成紅色。結(jié)果表明，給藥周期結(jié)束后共載藥膠束與其余各組相比，顯著降低腫瘤組織的膠原成分。然而，游離藥物組合物的治療效果沒(méi)有共載藥物膠束的效果顯著。

實(shí)施例14

共載藥物膠束對(duì)腫瘤微環(huán)境中癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的影響

(1)實(shí)驗(yàn)方法：裸鼠造模及分組給藥方法同實(shí)施例13所述。將裸鼠腫瘤的石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；用ph9.0的edta抗原修復(fù)液(含tris30.27g，edta1.461g，蒸餾水500ml)進(jìn)行修復(fù)并用正常兔血清(boster)封閉；兔抗鼠α-sma孵育并置于4℃冰箱過(guò)夜；fitc標(biāo)記的山羊抗兔孵育；最后染細(xì)胞核及封片。于倒置熒光顯微鏡下觀察腫瘤部位的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的數(shù)量。

(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：膠原由腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌，而α-sma是腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物。與實(shí)施例13結(jié)果一致，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腫瘤部位的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞十分豐富。游離藥物組合物對(duì)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的作用不明顯?；熕幵趯?duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡作用的同時(shí)也能減少腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的數(shù)量。共載藥物膠束中由于水飛薊賓的存在，對(duì)腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生調(diào)控作用。兩種藥物共同負(fù)載于膠束能顯著降低腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)納米粒在腫瘤組織的有效遞送。

實(shí)施例15

共載藥物膠束對(duì)腫瘤微環(huán)境中微血管密度的影響

(1)實(shí)驗(yàn)方法：裸鼠造模及分組給藥方法同實(shí)施例13所述。將裸鼠腫瘤的石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；用ph9.0的edta抗原修復(fù)液(含tris30.27g，edta1.461g，蒸餾水500ml)進(jìn)行修復(fù)并用正常兔血清(boster)封閉；兔抗鼠cd31孵育并置于4℃冰箱過(guò)夜；fitc標(biāo)記的山羊抗兔孵育；最后染細(xì)胞核及封片。于倒置熒光顯微鏡下觀察腫瘤部位的微血管密度。

(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：腫瘤部位的血管生成為腫瘤侵襲性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供必要條件，與正常血管不同，腫瘤血管組成異常，構(gòu)成了腫瘤部位的生理學(xué)屏障，阻礙了治療物質(zhì)向腫瘤部位的遞送。因此，將化療藥物和抗血管生成藥物聯(lián)合使用，可以抑制腫瘤血管生成和促進(jìn)腫瘤部位血管正?；岣咻d藥納米粒的治療效果。給藥周期結(jié)束后，對(duì)照組血管豐富且呈現(xiàn)狹長(zhǎng)狀態(tài)，游離藥物組合物組血管仍然豐富。而單載水飛薊賓和共載藥物組均顯示出顯著的腫瘤血管數(shù)量的減少。此外，由于水飛薊賓對(duì)腫瘤微環(huán)境的調(diào)控作用，在含有水飛薊賓的治療組中都能觀察到腫瘤組織血管正?；膮^(qū)域。腫瘤部位的血管正?；茉黾友髁浚岣呒{米粒向腫瘤組織的深層次遞送。

實(shí)施例16

共載藥物膠束對(duì)腫瘤通透性的影響

(1)實(shí)驗(yàn)方法：裸鼠造模及分組給藥方法同實(shí)施例13所述。腫瘤治療的給藥周期結(jié)束后，裸鼠尾靜脈注射載活體染料dil的葡聚糖-脫氧膽酸膠束，經(jīng)24h后處死并解剖裸鼠，取裸鼠的腫瘤組織制成冰凍切片。該冰凍切片于室溫放置30min后，冷丙酮固定10min，pbs清洗后用正常兔血清(boster)封閉，在切片上滴加兔抗鼠cd31孵育并置于4℃冰箱過(guò)夜；fitc標(biāo)記的山羊抗兔孵育；最后染細(xì)胞核及封片。于倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇區(qū)域進(jìn)行拍照，觀察活體成像染料在腫瘤部位的分布狀況。結(jié)果見(jiàn)圖2。

(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：該實(shí)驗(yàn)中血管被標(biāo)記為綠色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色，dil染料為紅色。實(shí)施例13、實(shí)施例14、實(shí)施例15皆已證實(shí)，共載藥物膠束通過(guò)減少膠原和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，最終可以調(diào)控腫瘤基質(zhì)。并且與對(duì)照組相比，共載藥物膠束能抑制腫瘤新生血管生成、促使腫瘤部位血管正?；?。對(duì)照組由于沒(méi)有經(jīng)過(guò)治療，腫瘤間質(zhì)壓較高，紅色熒光擴(kuò)散程度小，熒光強(qiáng)度低。游離藥物組由于生物利用度低，雖然經(jīng)過(guò)治療但藥效不理想，熒光強(qiáng)度依舊很弱。對(duì)于共載藥物膠束，由于該制劑對(duì)腫瘤部位生理學(xué)屏障的消除作用，紅色熒光在腫瘤基質(zhì)中擴(kuò)散程度大，熒光強(qiáng)度高。