本發(fā)明涉及一種萜類莰復(fù)合酯，尤其是涉及一種萜類莰復(fù)合酯的用途。

背景技術(shù)：

化合物Tschimgine是可以從傘形科阿魏屬植物Ferula ovina的根部提取出來(lái)的一種萜類莰復(fù)合酯，分子式為C₁₇H₂₂O₃，結(jié)構(gòu)式如下：

有報(bào)道表明，Tschimgine具有對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 209)、大腸桿菌(Escherichia coli WF+)和白色念珠菌(Candida albicans 562)具有抗菌功能。

MTT實(shí)驗(yàn)表明，Tschimgine還能抑制黑色素瘤細(xì)胞(SK-MEL-28)、卵巢癌細(xì)胞(CH1)、肺癌細(xì)胞(A549)和乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的生長(zhǎng)。

糖尿病、脂肪肝、肝硬化、肥胖癥、高血糖、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、心血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化、肝損傷、炎癥、腎臟疾病等疾病嚴(yán)重危害人類的健康和生命，發(fā)現(xiàn)預(yù)防或治療這些疾病的新藥將具有重要的社會(huì)價(jià)值和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種萜類莰復(fù)合酯的用途。

所述萜類莰復(fù)合酯為化合物Tschimgine，分子式為C₁₇H₂₂O₃，結(jié)構(gòu)式如下：

所述萜類莰復(fù)合酯可在制備預(yù)防或治療糖尿病、脂肪肝、肥胖癥、肝硬化、高血糖癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、肝損傷、炎癥、腎臟疾病等 藥物中應(yīng)用。

所述萜類莰復(fù)合酯可在制備預(yù)防或治療糖尿病、脂肪肝、肥胖癥、肝硬化、高血糖、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、肝損傷、炎癥、腎臟疾病等保健品中應(yīng)用。

所述糖尿病可以包括但不限于具有高血糖癥狀的糖尿病。

所述脂肪肝可以包括但不限于非酒精性脂肪肝和/或具有高血脂癥狀的脂肪肝。

所述肝硬化可以包括但不限于具有肝臟膠原過(guò)度沉積和肝纖維化表現(xiàn)的肝硬化。

所述肥胖癥可以包括但不限于具有高血脂、高血糖癥狀的肥胖癥。

所述心血管疾病可以包括但不限于具有高血糖、高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥癥狀的心血管疾病。

所述動(dòng)脈粥樣硬化可以包括但不限于具有高膽固醇血癥和/或高血脂癥狀的動(dòng)脈粥樣硬化。

所述腎臟疾病可以包括但不限于具有血尿素氮水平異常表現(xiàn)、腎實(shí)質(zhì)性病變、尿毒癥等腎臟疾?。凰瞿I實(shí)質(zhì)性病變可以包括但不限于腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、急慢性腎功能衰竭、腎內(nèi)占位性和破壞性病變等腎實(shí)質(zhì)性病變。

所述肝損傷可以包括但不限于由于服用有肝損傷副作用藥物引起的肝損傷、由于酒精引起的急性肝損傷、由酒精性脂肪肝引起的肝損傷、免疫性或化學(xué)性因素引起的肝損傷、病毒感染引起的肝損傷；所述有肝損傷副作用的藥物包括但不限于以對(duì)乙酰氨基酚為主要活性成分的藥物。

所述炎癥可以包括但不限于由于服用有炎癥反應(yīng)副作用藥物所引起的炎癥、由細(xì)菌引起的炎癥、病毒性肝炎、由于酒精引起的急性肝炎、由酒精性脂肪肝引起的肝炎、由非酒精性脂肪肝引起的肝炎，由于糖尿病或肥胖癥并發(fā)癥引起的肝炎或腎炎，所述有炎癥反應(yīng)副作用藥物包括但不限于以對(duì)乙酰氨基酚為主要活性成分的藥物。

所述萜類莰復(fù)合酯可作為活性成份與其它藥物，與制藥中可以接受的賦形劑/或給藥載體混合后，按常規(guī)的制藥方法和工藝要求，制成的藥物組合物，所述藥物組合物可采用口服型制劑或注射型制劑藥物等，所述口服型制劑可采用片劑、丸劑、膠囊、沖劑或糖漿等；所述注射型制劑可采用注射液或凍干粉針劑型等。

實(shí)驗(yàn)證明，Tschimgine在治療糖尿病、脂肪肝、肥胖癥、高血糖、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、心血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的作用。利用糖尿病、肥胖癥模型小鼠db/db，腹腔注射Tschimgine 11天后，檢測(cè)代謝相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果表明，相比空白對(duì)照，Tschimgine 處理的模型小鼠血清中葡萄糖、膽固醇、甘油三酯和自由脂肪酸的水平明顯降低。小鼠肝臟石蠟切片HE染色和冰凍切片油紅染色結(jié)果表明，Tschimgine處理組的小鼠肝臟組織中脂肪的量明顯低于對(duì)照組小鼠。這些結(jié)果表明，Tschimgine在治糖尿病、脂肪肝、肥胖癥、高血糖、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、心血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病方面具有良好療效。

實(shí)驗(yàn)證明，Tschimgine能下調(diào)肝臟中肝纖維化的標(biāo)志基因的表達(dá)，能減緩肝臟炎癥反應(yīng)，能有效消除肝臟中膠原的積累，表明Tschimgine對(duì)肝硬化的治療功能。

實(shí)驗(yàn)證明，Tschimgine在腎臟功能上的作用。血尿素氮是腎功能主要指標(biāo)之一，血尿素氮過(guò)高，預(yù)示各種腎實(shí)質(zhì)性病變，如腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、急慢性腎功能衰竭、腎內(nèi)占位性和破壞性病變以及尿毒癥等。小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Tschimgine能有效降低血尿素氮水平，表明Tschimgine具有治療腎臟疾病和保護(hù)腎臟功能的作用。

實(shí)驗(yàn)證明，利用肝損傷模型小鼠證明Tschimgine的肝臟保護(hù)和修復(fù)功能。本發(fā)明給C57B6/J小鼠腹腔注射Tschimgine，然后注射過(guò)量對(duì)乙酰氨基酚(N-acetyl-para-aminophenol，縮寫為APAP)引起肝損傷，24h候后檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，在對(duì)照組表現(xiàn)出嚴(yán)重肝損傷的情況下，注射了Tschimgine的小鼠肝臟形態(tài)和肝功能表現(xiàn)基本正常。表明Tschimgine在肝損傷方面具有優(yōu)秀的預(yù)防和治療功能。

實(shí)驗(yàn)證明，在小鼠模型上證明Tschimgine在炎癥方面的治療作用。過(guò)量使用APAP會(huì)引起小鼠肝臟發(fā)生炎癥。本發(fā)明給C57B6/J小鼠腹腔注射Tschimgine 5天，然后注射過(guò)量APAP引起肝臟炎癥，檢測(cè)小鼠肝臟組織中炎癥因子的水平。結(jié)果表明，相比空白對(duì)照處理的小鼠，腹腔注射了Tschimgine的小鼠肝臟組織中多種炎癥因子的基因表達(dá)水平顯著降低。細(xì)胞水平的實(shí)施例結(jié)果顯示Tschimgine能下調(diào)由于LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)。表明Tschimgine在炎癥治療方面具有很好的功能。

Tschimgine是從植物中提取的天然產(chǎn)物，迄今未見(jiàn)任何有關(guān)其在治療糖尿病、脂肪肝、肥胖癥、高血糖、高甘油三酯血癥、心血管疾病、高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、肝損傷、炎癥、腎臟疾病等疾病的制藥方面的報(bào)道。因此本發(fā)明給出的Tschimgine在這些疾病方面具有治療功能，都是關(guān)于Tschimgine的新功能。

Tschimgine是從傘形科阿魏屬植物中提取出來(lái)的天然產(chǎn)物，已經(jīng)是商業(yè)化的產(chǎn)品，容易獲得藥物原材料。糖尿病、脂肪肝、肥胖癥、高血糖、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、心血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化、肝損傷、炎癥、腎臟疾病等疾病是影響人類健康和生命的重大疾病，因此，本發(fā)明給出的這種已經(jīng)商業(yè)化的化合物Tschimgine在制備治療這些重大疾病的藥物制劑方面的實(shí)用功能，具有重要的社會(huì)價(jià)值和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述方法中的化合物可配制成藥物組合物在一些給藥方案中應(yīng)用。本發(fā)明藥物的組合物可包含所述化合物自身和其給藥可用的鹽或給藥載體。這樣的組合物還可選擇性地包含其它治療劑。

“給藥載體”一詞指可與本發(fā)明化合物一起用于病人且不破壞其藥理學(xué)活性的無(wú)毒藥物載體。上述藥物組合物中的可用給藥載體包括但不限于：離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白如人血清白蛋白，緩沖介質(zhì)如磷酸鹽，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠體二氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素制劑，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，羊毛脂和自乳化藥物遞送系統(tǒng)如α生育酚、聚乙二醇1000琥珀酸酯，或其它類似的聚合物遞送模式。

本發(fā)明所用的“代謝性疾病”指與代謝相關(guān)的任何疾病或紊亂癥。例如，代謝疾病包括但不限于：高血糖癥、胰島素抵抗、高脂血癥、高血膽固醇癥、糖尿病、肥胖癥、代謝綜合征、代謝紊亂及相關(guān)疾病、肝臟的疾病(肝疾病)、脂肪肝疾病(肝脂質(zhì)沉著癥)、非酒精性脂肪肝疾病、肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝纖維化、慢性和急性肝功能衰竭、膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、膽汁淤積、膽石動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、癌癥，以及上述疾病的的共發(fā)癥。

在某些僅以此處所述化合物作為其活性成分的藥物組合物中，其給藥方法還可包括用其他的藥劑或療法對(duì)所述受試者進(jìn)行治療。這樣的藥劑療法包括但不限于：貧血癥治療，糖尿病療法，高血壓治療，膽固醇療法，神經(jīng)藥物，調(diào)節(jié)心血管功能的藥物，調(diào)節(jié)炎癥、免疫功能、血細(xì)胞生成的藥物；激素和拮抗劑，影響胃腸功能、微生物疾病的化學(xué)治療藥物，和/或腫瘤疾病的化學(xué)治療。

某些藥劑或療法可與本發(fā)明所述化合物進(jìn)行聯(lián)合給藥，如基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、脂氧合酶抑制劑、細(xì)胞因子拮抗劑、免疫抑制劑、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、免疫調(diào)節(jié)劑、前列腺素或抗血管過(guò)度增生化合物。

本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“組合”及其相關(guān)詞匯依次對(duì)應(yīng)的是治療劑與本發(fā)明化合物是同時(shí)或按順序施用的。例如，所述某化合物可以同時(shí)或相繼與另一治療劑在單一單位劑型中施用。因此，本發(fā)明提供一種單一單位劑型，包含所述化合物、一種額外的治療劑。在許多給藥方案中，當(dāng)患者或個(gè)體同時(shí)暴露于兩種或更多藥劑時(shí)，如果患者或個(gè)體在某個(gè)特定靶組織或樣本(例如，在腦部，在血清等)同時(shí)顯示出所用試劑的相關(guān)治療效果，通常認(rèn)為它們是以“組合”的形式發(fā)揮作用的。

如若這些化組合物是本發(fā)明化合物的藥學(xué)可用鹽制品，那用到的鹽應(yīng)優(yōu)先來(lái)自無(wú)機(jī)或有機(jī)酸和堿。酸性鹽包括：乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來(lái)酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過(guò)硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸、甲苯磺酸鹽和十一酸鹽。堿鹽包括銨鹽、堿金屬鹽(如鈉和鉀鹽)、堿土金屬鹽(如鈣和鎂鹽)與有機(jī)堿鹽(如二環(huán)己基胺鹽、N-甲基-D-葡糖胺鹽、或帶有氨基酸如精氨酸、賴氨酸等的鹽)。

本發(fā)明所述化合物組合物還可包括，依賴所需制劑的、可藥用的無(wú)毒載體或稀釋劑。通常將其定義為配制動(dòng)物或人用的藥物組合物的媒介物。應(yīng)選擇合適的稀釋劑從而不影響組合物的生物學(xué)活性。這樣的稀釋劑有：蒸餾水、生理磷酸緩沖鹽溶液、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank氏溶液。此外，藥物組合物或制劑還可包括其他載體、佐劑、或無(wú)毒的非治療性非免疫原性的穩(wěn)定劑等。

本發(fā)明所述化合物組合物還可包括，潤(rùn)濕劑、乳化劑和潤(rùn)滑劑，如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑也可存在于組合物中。可藥用的抗氧化劑包括：水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α-生育酚等；和金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

本發(fā)明的藥物組合物可配制成固體或液體的形式。包括以下適合的給藥形式：(1)口服給藥，如灌藥劑(水性或非水性溶液或懸浮液)，片劑，頰、舌下和全身吸收劑，大丸劑，散劑，顆粒劑，舌下用的糊劑；(2)腸胃外給藥，制備為無(wú)菌溶液或懸浮液或持續(xù)釋放劑，通過(guò)皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或硬膜外注射；(3)局部應(yīng)用，如乳膏，軟膏，用于皮膚、肺或口腔的釋放受控貼劑或噴霧劑；(4)直腸內(nèi)給藥，如作為乳劑或泡沫；(5)其他：舌下含服，眼用，經(jīng)皮或經(jīng)鼻、肺和其它粘膜攝入。

所述化合物的藥物組合物的制備方法包括用任意工序?qū)⒈景l(fā)明化合物與載體或多種輔助成分組合。通常情況下，可將本發(fā)明化合物與載體(液體載體、細(xì)碎固體載體或兩者均有)均勻緊密地組合制備，且根據(jù)需要將產(chǎn)物賦形。

某些情況中，可通過(guò)減緩藥物從皮下或肌肉注慢吸收的速度以延長(zhǎng)藥效?？梢酝ㄟ^(guò)制備 水溶性差的結(jié)晶或無(wú)定形物質(zhì)的液體懸浮液來(lái)實(shí)現(xiàn)這一目的。藥物的吸收速率取決于其溶解速度，其溶解速率又可能取決于晶體大小和結(jié)晶形式?；蛘?，通過(guò)將藥物溶解或懸浮于油性載體中以延遲胃腸外給藥吸收。

可通過(guò)將所述化合物與微囊基質(zhì)中可生物降解的聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)結(jié)合制成其可注射藥物儲(chǔ)庫(kù)劑型。根據(jù)藥物與聚合物的比例及所用特定聚合物的性質(zhì)，可控制藥物釋放的速率。其它可生物降解的聚合物包括聚原酸酯和聚酸酐。也可通過(guò)將藥物包埋在脂質(zhì)體或微乳中，以制備與身體組織相容的可注射藥物儲(chǔ)庫(kù)劑型。

本發(fā)明的藥物成分可以任意口服可接受劑型口服給藥，劑型包括但不限于：膠囊，片劑，以及水懸浮液和溶液。對(duì)于口服片劑而言，其常用包膜有乳糖和玉米淀粉，通常還會(huì)加入潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂。對(duì)于口服膠囊制劑而言，可用的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當(dāng)以水懸浮液和溶液及丙二醇制劑口服給藥時(shí)，藥物活性成分與乳化劑和懸浮劑結(jié)合。如有需要，可加入某些甜味劑和/或調(diào)味劑和/或著色劑。

本發(fā)明描述的適合口服給藥的劑型可以是膠囊劑，扁囊劑，丸劑，片劑，錠劑(通常用蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠作為矯味物質(zhì))，粉劑，顆粒劑，或溶于水性或非水性液體中制成溶液或懸浮液，或作為油包水或水包油液體乳劑，或作為酏劑或糖漿，或作為軟錠劑(使用惰性基質(zhì)，如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)和/或漱口等方式。各種劑型含有預(yù)定量的本發(fā)明化合物作為其活性成分之一。本發(fā)明所述的化合物也可以大丸劑、藥糖劑或糊劑使用。

本發(fā)明化合物口服給藥的液體劑型包括可藥用的的乳劑、微乳劑、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。除活性成分外，液體劑型還可含有在本領(lǐng)域中通常使用的惰性稀釋劑，諸如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑，如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯醇、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油類(特別是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇、聚乙二醇和脂肪酸酯山梨糖醇，以及它們的混合物。

當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物對(duì)目標(biāo)治療區(qū)域或器官通過(guò)局部施用更易起效時(shí)，即可選擇這種給藥方式。為了局部施用于皮膚，可將活性組分懸浮或溶解在給藥載體中，再將此藥物組合物配制成軟膏劑。本發(fā)明化合物的局部給藥載體包括但不限于：礦物油、液體石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水?；蛘撸蓪⒒钚曰衔飸腋』蛉芙庥谳d體中，再將該藥物組合物制成適當(dāng)?shù)南磩┗蛩獎(jiǎng)?，這類載體包括但不限于：礦物油、脫水山梨醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鯨蠟酯、鯨蠟硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。本發(fā)明的藥物組合物還可通過(guò)制成直腸栓劑或適當(dāng)?shù)墓嗄c制劑局部應(yīng)用于下腸道。本發(fā)明還包括將化合物制備成局部給藥透皮貼劑。

可通過(guò)將本發(fā)明的藥物成分制成氣霧劑或吸入劑給藥。這樣的藥劑可根據(jù)制藥配方領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的技術(shù)制備，也將其制備為鹽水溶液。這類現(xiàn)有技術(shù)常使用芐醇或其它適當(dāng)?shù)姆栏瘎?、碳氟化合物?或其他增溶劑或分散劑、吸收促進(jìn)劑以提高其生物利用率。

透皮貼劑的額外優(yōu)勢(shì)是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明化合物對(duì)機(jī)體的受控遞送?？蓪⒃摶衔锶芙饣蚍稚⒃谶m當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中制作這種劑型。可以用吸收增強(qiáng)劑增加皮膚對(duì)化合物的吸收。也可通過(guò)采用速率控制膜或者將化合物分散于聚合物基質(zhì)或凝膠中的方式，實(shí)現(xiàn)化合物通過(guò)皮膚速率的控制。

附圖說(shuō)明

圖1為Tschimgine處理能降低db/db小鼠血糖。

圖2為Tschimgine處理能降低db/db小鼠血清甘油三酯水平。

圖3為Tschimgine處理能降低db/db小鼠血清自由脂肪酸水平。

圖4為Tschimgine處理能降低db/db小鼠血清總膽固醇水平。

圖5為Tschimgine處理能降低db/db小鼠血尿素氮水平。

圖6為肝臟石蠟切片HE染色表明Tschimgine處理減少了db/db小鼠肝臟組織中的脂肪泡。

圖7為肝臟組織冰凍切片油紅染色表明Tschimgine處理能降低db/db小鼠肝臟組織中的脂肪。

圖8為小鼠肝臟石蠟切片HE染色表明Tschimgine能修復(fù)APAP誘導(dǎo)的肝損傷。

圖9為Tschimgine處理能降低APAP誘導(dǎo)肝損傷的小鼠血清中的AST和ALT活性。

圖10為Tschimgine處理能降低APAP誘導(dǎo)肝損傷的小鼠血清中LDH活性。

圖11為Tschimgine處理能調(diào)節(jié)APAP誘導(dǎo)肝損傷的小鼠中與肝修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)水平。

圖12為Tschimgine能抑制由于APAP引起的炎癥反應(yīng)。

圖13為Tschimgine能抑制由LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中炎癥因子MIP-1α的表達(dá)水平。

圖14為Tschimgine能抑制由LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中炎癥因子iNOS的表達(dá)水平。

圖15為Tschimgine能抑制由LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中炎癥因子TNFα的表達(dá)水平。

圖16為Tschimgine能抑制由LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中炎癥因子IFNγ的表達(dá)水平。

圖17為Tschimgine能抑制由LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中炎癥因子IL-1β的表達(dá)水平。

圖18為Tschimgine能抑制由LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中炎癥因子IL-6的表達(dá)水平。

圖19為Tschimgine能抑制由LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中炎癥因子CD36的表達(dá)水平。

圖20為Masson染色顯示Tschimgine能減少小鼠肝臟膠原沉積。

圖21為天狼星紅染色顯示Tschimgine能減少小鼠肝臟膠原纖維。

圖22為Tschimgine能下調(diào)肝臟中肝纖維化標(biāo)志基因的表達(dá)。

在圖1～5,9～12和圖22中，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一：Tschimgine在治療代謝性疾病方面的作用。

試驗(yàn)方法：db/db小鼠(品系名稱BKS.Cg‐Dock7^m+/+Lepr^db/Jnju)屬Ⅱ型糖尿病模型，動(dòng)物在一個(gè)月時(shí)開(kāi)始貪食及發(fā)胖，繼而產(chǎn)生高血糖、高血胰島素等癥狀。

用10周齡左右的db/db小鼠，在廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)別動(dòng)物房，用常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。Tschimgine用DMSO高濃度溶解，再用40％HBC(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin)配置成工作濃度，使DMSO濃度為10％，并且使腹腔注射100μl Tschimgine溶液最終工作濃度分別為10mg/kg(藥物/小鼠體重)。空白對(duì)照組直接用等量的DMSO稀釋在40％HBC溶液。每天上午9點(diǎn)注射，每日一次。注射Tschimgine第6天后禁食16h，剪鼠尾用德國(guó)貝朗(B/BRAUN)倍佳血糖儀和貝朗倍佳血糖試紙測(cè)血糖。注射第11天后禁食6h，收集小鼠血清，用于檢測(cè)血清中糖脂代謝的相關(guān)指標(biāo)，包括血清膽固醇、自由脂肪酸和甘油三酯的水平，分別按照以下試劑盒方法檢測(cè)：總膽固醇(TCHO)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)、小鼠游離脂肪酸(FFA)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)(R&D，美國(guó))、甘油三酯(血液)酶法測(cè)定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。收集小鼠肝組織，取部分肝臟組織用多聚甲醛固定，按常規(guī)方法進(jìn)行包埋石蠟，切出厚度5微米的切片，常規(guī)方法HE染色。取部分組織冰凍切片，用于油紅染色。

油紅染色方法：肝臟組織在異戊烷中，在液氮中快速冷凍，嵌入最佳切削溫度，在低溫恒溫器上切削。

油紅燃料配制：油紅O 0.5g，異丙醇(含量98％以上)100ml，24h 60℃烘箱中，充分溶解后作為儲(chǔ)存液。臨用時(shí)取染色原液6ml，加蒸餾水4ml，稀釋，靜置5～10min后過(guò)濾，此液保存不能超過(guò)1～2h。

染色方法：

(1)冰凍切片10um厚，10％多聚甲醛固定10～15min后進(jìn)行水洗；

(2)置于密封容器盛裝的油紅染液5h；

(3)用60％乙醇分色，浸泡切片至細(xì)胞質(zhì)為紅色，底色呈白色為止；

(4)水洗，37℃5min；

(5)蘇木精淡染核10～20s；水或1％磷酸氫二甲沖洗變藍(lán)；

(7)甘油混水封片。結(jié)果判斷：脂肪呈紅色，胞核呈藍(lán)色。

所有實(shí)施例中對(duì)照組與藥物處理組之間的差異用student’s t‐test來(lái)分析。

試驗(yàn)結(jié)果：相比空白對(duì)照，Tschimgine處理的db/db小鼠在第六次用藥后血糖就明顯低于對(duì)照組(圖1)。Tschimgine處理的小鼠血清中甘油三酯(圖2)、自由脂肪酸(圖3)和總膽固醇(圖4)水平明顯低于對(duì)照組。表明Tschimgine能有效治療糖尿病小鼠的病癥。

非酒精性脂肪肝是一種無(wú)過(guò)量飲酒史，由各種原因引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性和脂質(zhì)蓄積為主要特征的臨床病理綜合征，被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟的一種病理表現(xiàn)。肝臟組織切片HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組中肝臟細(xì)胞出現(xiàn)明顯的脂肪空泡，而Tschimgine處理的小鼠肝臟細(xì)胞中無(wú)明顯脂肪泡形成(圖6)。油紅O為脂溶性染料,在脂肪內(nèi)能高度溶解,可特異性的使組織內(nèi)甘油三酯等中性脂肪著色。在日常病理診斷和科研工作中,顯示組織內(nèi)的脂肪常采用油紅O進(jìn)行染色。為了進(jìn)一步證明肝臟切片HE染色的圖片中的空泡就是甘油三酯等中性脂肪的聚集，我們又用油紅染色對(duì)肝臟切片進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，對(duì)照組的肝臟切片中顯示有眾多大滴的油脂顆粒，而Tschimgine處理的小鼠肝臟切片中的油滴顆粒顯著小于對(duì)照組，脂肪含量顯著少于對(duì)照組(圖7)，該結(jié)果與HE染色的結(jié)果一致，表明Tschimgine對(duì)脂肪肝有良好的療效。

結(jié)論：Tschimgine在治療糖尿病、非酒精性脂肪肝、肥胖癥、高血糖、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥等代謝性疾病方面具有良好療效。

血液中血糖水平和血甘油三酯的水平過(guò)高，是心血管疾病的警戒指標(biāo)，這些指標(biāo)水平過(guò)高反映出機(jī)體患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)極高。因此本實(shí)施例中Tschimgine處理能顯著下調(diào)血糖和血甘油三酯水平，表明Tschimgine在心血管疾病中具有治療作用。

有研究表明，高總膽固醇與頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病變程度成正相關(guān)。因此，本實(shí)施例中Tschimgine處理小鼠能有效降低血清總膽固醇水平，表明Tschimgine對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的具有療效。

實(shí)施例二：Tschimgine在治療腎臟疾病中的作用

試驗(yàn)方法：腎臟為排泄尿素的主要器官，尿素從腎小球?yàn)V過(guò)后在各段小管均可重吸收，腎小管內(nèi)尿流速越快，重吸收就越少。當(dāng)腎功能損害時(shí)，腎小球?yàn)V過(guò)率下降，濾過(guò)率下降到正常的50％以下時(shí)，血尿素氮的濃度迅速升高。各種腎實(shí)質(zhì)性病變，如腎小球腎炎、間質(zhì)性 腎炎、急慢性腎功能衰竭、腎內(nèi)占位性和破壞性病變均可使血尿素氮增高。因此，血尿素氮是腎功能主要指標(biāo)之一。血尿素氮升高也可作為尿毒癥診斷指標(biāo)之一。

慢性腎臟疾病是糖尿病的并發(fā)癥之一。本實(shí)施例用實(shí)施例一中處理的db/db小鼠血清，用南京建成科技有限公司的尿素氮(BUN)測(cè)試盒(脲酶法)按說(shuō)明書測(cè)血清中尿素氮的水平。

試驗(yàn)結(jié)果：相比空白對(duì)照組，Tschimgine處理的小鼠血尿素氮的水平顯著下調(diào)(圖5)，表明Tschimgine對(duì)腎臟功能的維護(hù)和腎病的治療效果。

結(jié)論：Tschimgine在出現(xiàn)血尿素氮水平升高的各種腎實(shí)質(zhì)性病變，如腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、急慢性腎功能衰竭、腎內(nèi)占位性和破壞性病變，以及尿毒癥等腎臟疾病中具有療效。

實(shí)施例三：Tschimgine的肝臟保護(hù)和修復(fù)功能試驗(yàn)。

試驗(yàn)方法：過(guò)量服用APAP致小鼠急性藥物性肝損傷模型是研究保肝藥物常用的模型之一，APAP是通過(guò)活性氧或活性氮引起藥物性肝損傷的典型代表物。APAP過(guò)量使用會(huì)引起肝臟活性氧增多，過(guò)量消耗體內(nèi)還原態(tài)物質(zhì)如GSH導(dǎo)致體內(nèi)GSH水平下降，谷草轉(zhuǎn)氨酶AST、谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和乳酸脫氫酶LDH等活性上升，導(dǎo)致肝臟組織炎癥或壞死。本實(shí)施例即采用該模型檢測(cè)Tschimgine對(duì)APAP誘導(dǎo)形成肝損傷的保護(hù)和修復(fù)功能。

用8周齡的C57B6/J野生型小鼠，在廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)別動(dòng)物房，用常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。Tschimgine用DMSO高濃度溶解，再用40％HBC(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin)配置成工作濃度，使DMSO濃度為10％，并且使腹腔注射100μl Tschimgine溶液最終工作濃度分別為10mg/kg和40mg/kg(藥物/小鼠體重)?？瞻讓?duì)照組直接用等量的DMSO稀釋在40％HBC溶液。每天上午9點(diǎn)注射，每日一次，注射5天后，在第五天下午3點(diǎn)給小鼠注射500mg/kg用PBS新鮮溶解配制的APAP。24h后處死小鼠，取部分肝臟組織用多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色。部分肝臟組織液氮凍存，Trizol試劑提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用天根生化科技有限公司的RealMasterMix(SYBR Green I)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)肝臟組織中相關(guān)基因的表達(dá)。心臟取血，制備血清，用于檢測(cè)血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶AST、谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和乳酸脫氫酶LDH活性。

試驗(yàn)結(jié)果：肝臟切片HE染色結(jié)果如圖8，空白對(duì)照組病理切片可見(jiàn)肝小葉內(nèi)細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，呈空泡狀和壞死灶，小葉內(nèi)和匯管區(qū)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞渾濁，核固縮或已溶解破碎，肝細(xì)胞索模糊。與空白對(duì)照組明顯嚴(yán)重的肝損傷相比，注射了Tschimgine的小鼠肝臟形態(tài)顯示基本正常。使用了Tschimgine的小鼠血清中AST和ALT活性(如圖9)和LDH活性(圖10)顯著低于空白對(duì)照組中APAP引起的高活性。肝臟組織中與肝損傷相關(guān)的基因表達(dá)水平結(jié)果也表明，Tschimgine能上調(diào)與外源毒性物質(zhì)代謝密切相關(guān)的功能基因GCLM、GSTa3、 GPX1和UGT1a1的表達(dá)水平(如圖11)，表明Tschimgine能通過(guò)外源性藥物代謝相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控從而調(diào)節(jié)保護(hù)和修復(fù)肝臟功能。

結(jié)論：Tschimgine在肝損傷方面具有很好的保護(hù)和修復(fù)功能。

實(shí)施例四：Tschimgine在炎癥方面的治療作用。

試驗(yàn)方法：炎癥因子是在炎癥過(guò)程中由細(xì)胞產(chǎn)生和分泌參與炎癥反應(yīng)的物質(zhì)，是反應(yīng)炎癥的標(biāo)志物。本實(shí)施例利用實(shí)施例三中處理的APAP誘導(dǎo)肝臟炎癥的C57B6/J野生型小鼠，取小鼠肝臟組織，用Trizol試劑提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用天根生化科技有限公司的RealMasterMix(SYBR Green I)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)肝臟組織中炎癥因子的表達(dá)水平。

試驗(yàn)結(jié)果：相比空白對(duì)照組，腹腔注射了Tschimgine的小鼠肝臟組織中iNOS、TGFβ、TNFα、COX2、IL-1β、IFNγ、MIP-1a等多種炎癥因子的基因表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組(圖12)，表明Tschimgine可以抑制炎癥反應(yīng)。

結(jié)論：Tschimgine在炎癥治療方面具有療效，包括化學(xué)性因素引起的炎癥。

實(shí)施例五：Tschimgine抑制由LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

試驗(yàn)方法：炎癥是動(dòng)物常見(jiàn)且重要的基本病理過(guò)程,任何能夠引起組織損傷的因素均可導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharides，簡(jiǎn)稱LPS)是革蘭陰性細(xì)菌致病的主要因素，它能引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)。利用LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞或機(jī)體炎癥反應(yīng)，常被用于基因或者藥物在炎癥中的作用及機(jī)理研究。

本實(shí)施例利用從C57B6/J野生型小鼠中提取的原代肝細(xì)胞，將細(xì)胞按5×10⁵個(gè)/孔，分在6孔板，高糖DMEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)培養(yǎng)過(guò)夜后其中兩組細(xì)胞換上含20μM的Tschimgine(用DMSO溶解)的新鮮培養(yǎng)基(藥物組)，另兩組細(xì)胞用含藥物處理組等體積的DMSO的新鮮培養(yǎng)基作為對(duì)照(對(duì)照組)，處理18h后，在藥物組中的一組加入20μg/ml的LPS(藥物-誘導(dǎo)組)，另一組中加入等體積的DMSO為對(duì)照(藥物-非誘導(dǎo)組)；在對(duì)照組中的一組加入20μg/ml的LPS(對(duì)照-誘導(dǎo)組)，另一組中加入等體積的DMSO為對(duì)照(對(duì)照-非誘導(dǎo)組)。加入LPS處理6h后收細(xì)胞，用Omega公司的總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用天根生化科技有限公司的RealMasterMix(SYBR Green I)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)水平。

試驗(yàn)結(jié)果：從附圖13～19可以看出，相比非誘導(dǎo)組，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞中各炎癥因子的表達(dá)顯著上升，表明LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)已經(jīng)產(chǎn)生。在有Tschimgine處理過(guò)的誘導(dǎo)組細(xì)胞中，包括MIP-1a、iNOS、TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-6和CD36等多種炎癥因子的表達(dá)水平 被明顯下調(diào)，表明Tschimgine能有效降低細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的水平，減緩炎癥癥狀。

結(jié)論：Tschimgine在炎癥治療方面具有療效，包括細(xì)菌性炎癥。

實(shí)施例六:Tschimgine對(duì)肝硬化的功效。

試驗(yàn)方法：脂肪肝是肝臟中過(guò)多積累脂肪導(dǎo)致的一種肝病。過(guò)多脂肪長(zhǎng)期積蓄于肝臟，將影響肝臟血液和氧的供應(yīng)及肝臟自身代謝，會(huì)逐漸造成大量肝臟細(xì)胞腫脹、炎癥浸潤(rùn)及變性壞死，一旦有纖維增生及假小葉形成，就會(huì)成為肝硬化，大大增加患肝癌的危險(xiǎn)。肝硬化患者肝臟組織中各種膠原含量都有增加，Ⅰ型膠原纖維增多，參與結(jié)締組織的形成。隨著肝硬化程度的發(fā)展惡化，Ⅰ型膠原沉積越來(lái)越多，Ⅰ型膠原與其它類型膠原的比率越來(lái)越大。因此本實(shí)施例通過(guò)Masson氏染色法和天狼星紅染色法鑒定Tschimgine處理是否能減輕肝臟有脂肪過(guò)量積累的小鼠肝臟組織中膠原沉積的癥狀，并通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)膠原蛋白的表達(dá)水平。

方法一：

Masson氏染色法師用于顯示組織中纖維的染色方法之一，是膠原纖維染色權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。Masson氏染色方法是根據(jù)不同組織和細(xì)胞的空隙和大小不同，因而組織的滲透性不同，其中膠原纖維相對(duì)來(lái)說(shuō)結(jié)構(gòu)疏松，滲透性高，能讓苯胺藍(lán)(藍(lán)色)這種大分子的染料進(jìn)入著色，而組織中紅細(xì)胞、肌纖維部分的空隙較小，因而苯胺藍(lán)不能進(jìn)入著色。該方法能區(qū)分組織中膠原纖維的存在和積累程度。廣泛用于結(jié)締組織、肌肉組織和膠原蛋白的研究等。本染色方法操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。

本實(shí)施例采用南京建成科技有限公司的快速M(fèi)asson染液試劑盒(貨號(hào)D026)，按照該試劑盒說(shuō)明書，對(duì)實(shí)施例一中處理的小鼠肝臟進(jìn)行Masson染色，染色結(jié)果為：膠原纖維呈藍(lán)色，胞漿、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，胞核藍(lán)紫色。

方法二：

已知膠原有四型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)區(qū)分并定量這四種膠原纖維，對(duì)于研究病變的發(fā)生機(jī)理和演變過(guò)程有一定的意義。利用膠原蛋白聚合及其纏繞螺旋排列不同的特點(diǎn)，使用天狼星紅苦(Sirius Red)味酸染色法，在偏振光顯微鏡下，可以根據(jù)雙折光性和著色的不同，分別顯示出四型膠原纖維。

具體方法如下：

飽和苦味酸配置：加入純凈水進(jìn)苦味酸粉末中,自行溶解兩日，仍然有沉淀的話即為飽和溶液。天狼星紅飽和苦昧酸：0.1g Sirius Red，溶于100ml飽和苦味酸溶液。

染色步驟：中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。蘇木素染1min，蒸餾水 洗3次。天狼星紅飽和苦昧酸濃染15-30min，無(wú)水乙醇直接分化與脫水。二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

染色結(jié)果：染色封固后的切片，須及時(shí)用偏光顯微鏡進(jìn)行觀察和照相已保持鮮艷的色彩。在偏光顯微鏡下可以觀察到四種類型的膠原纖維。l型膠原纖維：緊密排列，顯示很強(qiáng)的雙折光性，呈黃色或紅色的纖維。ll型膠原纖維：顯示弱的雙折光，呈多種色彩的疏松網(wǎng)狀分布。皿型膠原纖維：顯示弱的雙折光，呈綠色的細(xì)纖維。lV型膠原纖維：顯示弱的雙折光的基膜，呈淡黃色。

本實(shí)施例又采用天狼星紅染色方法對(duì)對(duì)實(shí)施例一中處理的小鼠肝臟組織中的膠原纖維進(jìn)行了染色檢測(cè)。

方法三：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：將實(shí)施例一中小鼠部分肝臟組織液氮凍存，Trizol試劑提取肝臟組織RNA，Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用天根生化科技有限公司的RealMasterMix(SYBR Green I)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，Bio-rad公司的CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。檢測(cè)肝臟組織中膠原蛋白相關(guān)基因的表達(dá)。

試驗(yàn)結(jié)果：如圖20所示，在Masson染色結(jié)果中可以看出，對(duì)照組的肝臟切片中，可以看到明顯的著色藍(lán)色的膠原蛋白沉積，Tschimgine處理的小鼠肝臟切片中則無(wú)明顯的膠原沉積藍(lán)色表現(xiàn)。在天狼星紅染色結(jié)果與Masson染色結(jié)果一致(如圖21)，對(duì)照組的肝臟切片中可以看到明顯的紅色的膠原纖維，而Tschimgine處理的小鼠肝臟切片中則無(wú)明顯的膠原沉積紅色。熒光定量PCR結(jié)果顯示(如圖22)，肝纖維化的標(biāo)志基因α1(I)collagen、α2(I)collagen、α-SMA和MMP2基因在Tschimgine處理的小鼠肝臟中的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。

結(jié)論：結(jié)合前面所述實(shí)施例中結(jié)果，Tschimgine能減緩肝臟細(xì)胞和組織的炎癥反應(yīng)，能減少肝臟組織脂肪積累，能有效消除肝臟中膠原的積累，因而Tschimgine能預(yù)防和治療肝硬化疾病。