黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法，黑蟻原材料先經(jīng)二氯甲烷溶劑室溫冷浸提取后得到黑蟻濾渣，再將黑蟻濾渣采用質(zhì)量百分比為60?80%甲醇溶液室溫冷浸提取，提取后的甲醇濃縮液經(jīng)冷凍干燥處理得甲醇浸膏，然后甲醇浸膏先后經(jīng)過(guò)乙酸乙酯溶液、石油醚?乙酸乙酯混合溶液洗脫后，得到的餾分經(jīng)進(jìn)一步分離純化最終提取出2個(gè)化合物，即大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物。本發(fā)明采用70%的甲醇溶液浸漬提取，能夠使大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架的化合物高度富集后盡可能多的提取出來(lái)，并能有效分離得到單體化合物。
【專利說(shuō)明】
黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化 合物的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黑蟻(Polyrhachzs vzczna Roger)是節(jié)肢動(dòng)物門、昆蟲(chóng)綱、缺翅目、蟻科多刺蟻屬 的昆蟲(chóng)，是一種及其遠(yuǎn)古的社會(huì)性昆蟲(chóng)，是經(jīng)過(guò)國(guó)家衛(wèi)生部門批準(zhǔn)許可的唯一有作為藥用 及食用雙重價(jià)值的藥品，據(jù)文獻(xiàn)記載，黑蟻?zhàn)鳛橐环N常見(jiàn)的中藥具有補(bǔ)腎精，壯腎陽(yáng)，益精， 強(qiáng)腰膝的功效。臨床上主治腎虛勞損，腰膝酸痛，耳聾耳鳴，陽(yáng)痿，遺精，早泄，宮冷不孕，帶 下清稀等疾病。該研究的文獻(xiàn)相關(guān)報(bào)道有鄭巍等人從擬黑多刺蟻的三氯甲烷中分離純化得 到化合物谷甾醇、甘油、十八烷酸單甘油酯、、十八烷酸、十八碳烯酸（油酸）、十八碳烯酸 單甘油酯、棕櫚酸等化合物。中國(guó)科學(xué)院昆明植物所程永現(xiàn)研究員通過(guò)對(duì)食用黑蟻的研究， 先后從其90%乙醇提取物中分離純化出了 13個(gè)含氮非肽化合物和6個(gè)新的多巴胺衍生物。進(jìn) 而主要研究了這些化合物作為R0CK1/2抑制劑、神經(jīng)干細(xì)胞增殖刺激劑、免疫抑制劑和抗炎 作用的功能等方面的研究，為黑蟻在中醫(yī)藥的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法，該方法 是在活性指導(dǎo)下的有效分離，本發(fā)明采用70%的甲醇溶液浸漬提取，能夠使大環(huán)內(nèi)酯倍半萜 骨架的化合物高度富集后盡可能多的提取出來(lái)，并能有效分離得到單體化合物。
[0004] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法，黑 蟻原材料先經(jīng)二氯甲烷溶劑室溫冷浸提取后得到黑蟻濾渣，再將黑蟻濾渣采用質(zhì)量百分比 為60-80%甲醇溶液室溫冷浸提取，提取后的甲醇濃縮液經(jīng)冷凍干燥處理得甲醇浸膏，然后 甲醇浸膏先后經(jīng)過(guò)乙酸乙酯溶液、石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脫后，得到的餾分經(jīng)進(jìn)一步 分離純化最終提取出2個(gè)化合物，即大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物。
[0005] 作為本發(fā)明一種黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法的進(jìn)一步優(yōu)化，所 述方法包括以下步驟： 步驟一、取黑蟻原材料，清洗干凈后放入45_50°C烘箱中鼓風(fēng)干燥至恒重，粉碎，得到黑 蟻粉末，備用； 步驟二、將步驟一得到的黑蟻粉末用其重量5-10倍的二氯甲烷溶劑室溫冷浸，48-50h 后過(guò)濾，將黑蟻殘?jiān)鼮V出后再次加入黑蟻殘?jiān)亓?-10倍的二氯甲烷重復(fù)提取，過(guò)濾，分別 收集濾液和濾渣，濾渣經(jīng)過(guò)干燥，得到黑蟻濾渣粉，備用； 步驟三、將步驟二得到的黑蟻濾渣粉放置通風(fēng)處風(fēng)干，加入質(zhì)量百分比為60-80 %的甲 醇溶液室溫冷浸提取48-50h后過(guò)濾，收集濾液，濾出的黑蟻渣粉再次加入質(zhì)量百分比為60-80 %甲醇溶液室溫冷浸提取，重復(fù)上述操作若干次，合并濾液，減壓下除去溶劑后得到黑蟻 60-80 %甲醇濃縮液;然后將濃縮液置于-10-20°C冰箱中冷凍至結(jié)冰狀，取出再放置于冷凍 干燥儀中，調(diào)至-40°C下冷凍干燥處理，得到黑蟻的60-80%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置 于-80°C冰箱中，備用； 步驟四、將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解后，采用柱色譜法進(jìn)行分離，先 用乙酸乙酯洗脫后，再將洗脫得到的餾分用石油醚-乙酸乙酯混合液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫得 到的餾分經(jīng)進(jìn)一步純化得到化合物1和化合物2,即大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物，結(jié)構(gòu)式如 下：
化合物2。
[0006] 作為本發(fā)明一種黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法的進(jìn)一步優(yōu)化，步 驟四所述的分離提純的具體步驟為:將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解后，用 硅膠拌樣后，利用濕法上柱，進(jìn)行柱色譜分離;取100-200目硅膠裝入色譜柱中，上樣，用7-10倍柱體積的乙酸乙酯洗脫，收集乙酸乙酯餾分，合并濃縮后得到乙酸乙酯提取浸膏，備 用； 取上述黑蟻的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶劑充分溶解，加入硅膠充分拌樣干燥， 進(jìn)行柱色譜分離，取200-300目硅膠裝入色譜柱中，上樣，然后分別用石油醚-乙酸乙酯溶液 進(jìn)行梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯洗脫液的梯度比例依次為10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分別收集餾分，TLC檢測(cè)合并相同餾分，得到不同餾分段共8個(gè)組分； 取梯度比例為8:2的石油醚-乙酸乙酯餾分段，進(jìn)一步通過(guò)S印hadex LH-20凝膠色譜進(jìn) 行純化，收集合并餾分，經(jīng)過(guò)TLC分析，分別得到化合物1和化合物2。
[0007] 作為本發(fā)明一種黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法的進(jìn)一步優(yōu)化，梯 度比例為8:2的石油醚-乙酸乙酯餾分段進(jìn)行5叩1^(1^1^-20凝膠色譜純化過(guò)程中，流動(dòng)相 采用摩爾比例為1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脫，流速為〇.3ml/min。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有下述優(yōu)點(diǎn)及有益效果： 本發(fā)明提供的黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法是基于對(duì)孳生昆蟲(chóng)黑蟻 的抵抗多種致病性微生物的侵害或抗菌性能的研究，通過(guò)該方法提取得到2個(gè)大環(huán)內(nèi)酯倍 半萜化合物，這兩種化合物經(jīng)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，具有良好的抗金黃色葡萄球菌，枯草桿菌， 大腸桿菌，綠膿桿菌的廣譜抗菌活性。為進(jìn)一步提升黑蟻的藥用價(jià)值提供了新的科學(xué)依據(jù)， 并具有重要的理論價(jià)值和開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
[0009] 本發(fā)明提供的方法是在活性指導(dǎo)下的有效分離，尤其適合天然微量化合物的追蹤 獲取，本發(fā)明采用70%的甲醇溶液浸漬提取，能夠使大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架的化合物高度富集 后盡可能多的提取出來(lái)，并能有效分離得到單體化合物。本發(fā)明已經(jīng)分離的大環(huán)內(nèi)酯倍半 萜骨架的化合物具有廣譜抗菌生物活性。
【具體實(shí)施方式】
[0010] -種黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法，包括以下步驟： 步驟一、取黑蟻原材料，清洗干凈后放入45-50°C烘箱中鼓風(fēng)干燥至恒重，粉碎，得到黑 蟻粉末，備用； 步驟二、將步驟一得到的黑蟻粉末用其重量5-10倍的二氯甲烷溶劑室溫冷浸，48-50h 后過(guò)濾，將黑蟻殘?jiān)鼮V出后再次加入黑蟻殘?jiān)亓?-10倍的二氯甲烷重復(fù)提取，過(guò)濾，分別 收集濾液和濾渣，濾渣經(jīng)過(guò)干燥，得到黑蟻濾渣粉，備用； 步驟三、將步驟二得到的黑蟻濾渣粉放置通風(fēng)處風(fēng)干，加入質(zhì)量百分比為60-80 %的甲 醇溶液室溫冷浸提取48-50h后過(guò)濾，收集濾液，濾出的黑蟻渣粉再次加入質(zhì)量百分比為60-80 %甲醇溶液室溫冷浸提取，重復(fù)上述操作若干次，合并濾液，減壓下除去溶劑后得到黑蟻 60-80 %甲醇濃縮液;然后將濃縮液置于-10-20°C冰箱中冷凍至結(jié)冰狀，取出再放置于冷凍 干燥儀中，調(diào)至-40°C下冷凍干燥處理，得到黑蟻的60-80%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置 于-80°C冰箱中，備用； 步驟四、將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解后，用硅膠拌樣后，利用濕法上 柱，進(jìn)行柱色譜分離;取100-200目硅膠裝入色譜柱中，上樣，用7-10倍柱體積的乙酸乙酯洗 脫，收集乙酸乙酯餾分，合并濃縮后得到乙酸乙酯提取浸膏，備用； 取上述黑蟻的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶劑充分溶解，加入硅膠充分拌樣干燥， 進(jìn)行柱色譜分離，取200-300目硅膠裝入色譜柱中，上樣，然后分別用石油醚-乙酸乙酯溶液 進(jìn)行梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯洗脫液的梯度比例依次為10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分別收集餾分，TLC檢測(cè)合并相同餾分，得到不同餾分段共8個(gè)組分； 取梯度比例為8:2的石油醚-乙酸乙酯餾分段，進(jìn)一步通過(guò)S印hadex LH-20凝膠色譜進(jìn) 行純化，流動(dòng)相采用摩爾比例為1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脫，流速為〇.3ml/min，收集合 并餾分，經(jīng)過(guò)TLC分析，分別得到化合物1和化合物2，即大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物，結(jié)構(gòu)式 如下：
化合物2。
[0011] 這兩個(gè)大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架的化合物是全新的倍半萜化合物，經(jīng)過(guò)波譜數(shù)據(jù)分析 和理化鑒定推斷他們的結(jié)構(gòu)式如下，并被命名為： (1)化合物1，黑蟻素 A-l(/Wj^acAzSic/e U)，化學(xué)名稱為:4，10，15_三甲基，1，3_ 二甲酰氨基，8-0-(2~甲基，3^甲氧基）丙烯酯基，11-(1-甲基，（6,7)驥十五環(huán)(5.10-二烯） 戊內(nèi)酯-12化合物內(nèi)酯化合物。
[0012] (2)化合物2,黑蟻素為，化學(xué)名稱為：21_四甲基，1-(9)-環(huán)內(nèi)酰胺基，3α-甲酰氨基，7-0-(27-甲基，3。甲氧基）丙烯酯基，13-(17，18_二甲基）異 丙基，21-甲基，雙環(huán)[3,5，0]，癸烷驥環(huán)(5.6)戊內(nèi)酯-14化合物。
[0013] 化合物波譜數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)推斷： 化合物1，黑蟻素 A-U/WjrAacAzsic/e d-乃淡黃色固體粉末。[a]D20 = -69.8°。高分 辨質(zhì)譜測(cè)定分子量顯示HRESI-MS m/z [M+H]+ 463.2395 (calc. 463.2399)，可推測(cè)該化 合物的分子式為C24H34N2〇7。紅外圖譜展示有酯基吸收峰在1736，1260cm-l;酰胺基吸收信號(hào) 1663,1432和660 cm-1 ;C=C雙鍵吸收特征峰3052,1601和1493cm-l，建議該化合物分子結(jié)構(gòu) 中可能含有上述官能團(tuán)?；衔?的1HNMR (400MHz，CDC13)，核磁共振氫譜顯示在芳區(qū)有 2個(gè)雙鍵質(zhì)子信號(hào)分別在δΗ 7.23(m，1H)和8.09(s，1H)，說(shuō)明化合物中含有雙鍵;另外還 有兩個(gè)活潑財(cái)言號(hào)在3!18.00和8.11。在1!1~1?的含氧區(qū)有1個(gè)甲氧基信號(hào)在6!14.46((1(1， 3H)和在δΗ4.46和4.51處分別有一個(gè)質(zhì)子信號(hào)，揭示化合物中還有兩個(gè)含氧質(zhì)子或連接在 氮上的質(zhì)子;在化合物的飽和信號(hào)區(qū)含有7個(gè)質(zhì)子信號(hào)在δΗ 2.23~1.20,在δΗ 0.98~0.91 是含有6個(gè)甲基的18個(gè)質(zhì)子信號(hào)。在化合物的13C NMR (100MHz，CDC13)核磁共振圖譜中顯 示有24個(gè)碳信號(hào)，其中羰基信號(hào)6〇175.5，174.3，167.2和163.8分別顯示有2個(gè)酯基和和 2個(gè)酰胺基的存在，這與紅外圖譜信號(hào)的分析一致。DEPT分析顯示有2個(gè)亞甲基信號(hào)分別在δ c 41.9和26.1;7個(gè)次甲基信號(hào)163·6，129·5,74·0 X 2,57·4,50·1，48·3;5個(gè)季碳信號(hào)δ c 163·6，130·3，129·7 X 2和 127.9;6個(gè)甲基信號(hào)在23.3,21.8，19.6，17.9，16.1和 11.9。經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[1，2'3]和理化性質(zhì)分析，初步判斷該化合物為大環(huán)內(nèi)酯類的新化合物。 分析化合物1的1 Η- 1Η COSY及HSQC相關(guān)圖譜證明了該骨架結(jié)構(gòu)應(yīng)有的3個(gè)結(jié)構(gòu)片段:C-2-C- 3-C-4-C-5、C-6-C-7-C-8-C-9和C-4 ' -C-2 ' -C-3 ' c^HMBC譜中，H-4 ' 與C-3 '（163 · 6)，甲氧 基Η與C-3'的相關(guān)信號(hào)表明C-3'直接和1個(gè)甲氧基相連;在HMBC譜中，還可以觀測(cè)到Η-3與C-19 0(；167.2)和(：-14(3(；16.1)相關(guān)，揭示(：-3連有1個(gè)酰胺基；甲基!1-15與(：-1(3( ； 127.9)相關(guān)和酰胺活潑氫與〇1(3(；127.9)和(：-1〇0(；13〇.3)相關(guān)信號(hào)證實(shí)(：-1連接1個(gè)甲 酰胺基。圓8(：譜另外揭示的!1-8分別與(：-12 0(；175.5)和(：-1'0(；174.3)信號(hào)相關(guān)，表明 有兩個(gè)酯鍵的存在。綜上分析，可推段該化合物為4，10，15-三甲基，1，3-二甲酰氨基，8-0-(2~甲基，3^甲氧基)丙烯酯基，11-(1-甲基，（6,7)驥十五環(huán)(5.10-二烯)戊內(nèi)酯-12化合物 內(nèi)酯化合物。該化合物未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，因此為1個(gè)新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，命名為黑蟻素 Α-1 (Polyrhachzside k_Y)。
[0014] 表1:化合物1的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)歸屬
[1] ff. Hexz, P. s. Kalyanaraman and G. Rama Krishnan. J. Org. Chem. 42.2265.
[2] ff. Herz and .R. P. Sharma. J. Org. Chem. 41.1015(1976).
[3] 龔運(yùn)淮天然有機(jī)化合物的13C匪R核磁共振化學(xué)位移，云南科技出版社，1986， P76. 化合物2,黑蟻素 U?)淡黃色粉末，[a]D2()= +75.6°。高分辨質(zhì)譜 測(cè)定分子量顯示HRESI-MS m/z [M+H]+ 463.2394(calc. 463.2399)，可推測(cè)該化合物的 分子式為C24H34N2〇 7。核磁共振圖譜顯示化合物2和化合物1非常相似，可推斷化合物1是同類 大環(huán)內(nèi)酯化合物的結(jié)構(gòu)。在化合物2的1H匪R(400MHz，CDC13)圖譜中，發(fā)現(xiàn)化合物2相比 上述化合物明顯缺少一組芳?xì)?，建議化合物2分子中只有一個(gè)雙鍵結(jié)構(gòu)?；衔?的13C NMR (100MHz，⑶C13)及結(jié)合它的DEPT譜數(shù)據(jù)也不同于上述化合物，碳譜中有21條線代表了化 合物中的24個(gè)碳信號(hào)，其中季碳信號(hào)62.2 X 2,和130.4在碳圖譜中未出峰而僅顯示在 DEPT圖譜中。其他包括2個(gè)羰基碳信號(hào)在175.4和174.3,兩個(gè)酰胺基信號(hào)分別在 167.2和163.6,2個(gè)季碳信號(hào)在130.4和54.7;11個(gè)次甲基信號(hào)分別在163.5，62.2 X 2,54.7，50.7，49.3，48.3，41.9，38.5，31.8，25.6;兩個(gè)亞甲基信號(hào)是在41.9和 26.0; 5個(gè)甲基信號(hào)分別在δο 23.3,21.8,17.9,16.1和11.9另有1個(gè)甲氧基碳信號(hào)在 56.7。以上所述的波譜學(xué)特征結(jié)合其1Η-1Η COSY和HSQC譜證實(shí)該化合物具有典型的似化合 物1的大環(huán)飽和內(nèi)酯的骨架結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步化合物2的結(jié)構(gòu)根據(jù)2D NMR被推斷為含有飽和庚環(huán) 骨架的大環(huán)內(nèi)酯化合物。在化合物2的HMBC譜中，相關(guān)信號(hào)交叉在H-1/C-11，H-8/C-ll和H-8/C-1表明了內(nèi)酰胺環(huán)與飽和庚烷的存在，相關(guān)信號(hào)交叉在H-4/C-21，H-5/C-10和H-2/C-3、 C-4證明了3-酰胺基環(huán)戊燒的結(jié)構(gòu)存在，相關(guān)彳目號(hào)交叉在H-13/C-14、C_7和H_3'/C-l '，揭不 了分子中環(huán)庚烷的7-取代結(jié)構(gòu)和5,6連接的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的推斷。經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[4]，可推斷該 化合物為大環(huán)內(nèi)酯類的另一個(gè)新化合物，化學(xué)名稱為:21-四甲基，1-(9)-環(huán)內(nèi)酰胺基，3α-甲酰氨基，7-0-(27-甲基，甲氧基）丙烯酯基，13-(17,18-二甲基）異丙基，21-甲基，雙 環(huán)[3，5，0]，癸烷驥環(huán)(5.6)戊內(nèi)酯-14化合物。命名為黑蟻素 A-2(/?辦rAadzsic/e d-2)。
[0015] 表2:化合物2的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)歸屬
[4] ff. Hexz, P. S. Kalyanaraman and G. Rama Krishnan. J. Org. Chem. 1977， 42,2265. 抗菌活性試驗(yàn)： 本實(shí)驗(yàn)得到的大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架的化合物的抗菌活性實(shí)驗(yàn)的抑菌圈的大小及最小 抑菌濃度MI C值的大小如下表所示： 表3:黑蟻素 A(Poi/rAacAzsic/e d-2)最小抑菌濃度(MIC)值的測(cè)定
從表3的最小抑菌濃度MIC值測(cè)定結(jié)果可知，Polyrhachzside A-1抗枯草菌的最小抑菌 濃度MIC為156此/11^、抗金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度MIC為78狀/11^、抗大腸桿菌的最 小抑菌濃度MIC為78yg/mL、抗綠膿桿菌的最小抑菌濃度MIC為156yg/mL。
[0016] 表4:黑蟻素 A-2(Polyrhachzside A-2)。最小抑菌濃度(MIC)值的測(cè)定
從表4的最小抑菌濃度MIC值測(cè)定結(jié)果可知，Polyrhachzside A-2抗枯草桿菌的最小抑 菌濃度MIC為78狀/11^、抗金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度MIC為78狀/11^、抗大腸桿菌的最 小抑菌濃度MIC為78yg/mL、抗綠膿桿菌的最小抑菌濃度MIC為78yg/mL。
[0017] 為使本發(fā)明的內(nèi)容更明顯易懂，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0018] 實(shí)施例1: 一種黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法，包括以下步驟： 步驟一、取黑蟻原材料1.5kg，清洗表面泥漬及除去存放處理用無(wú)機(jī)鹽，清洗干凈后放 入45°C烘箱中鼓風(fēng)干燥至恒重，粉碎，得到黑蟻粉末，備用； 步驟二、將步驟一得到的黑蟻粉末用其重量5倍的二氯甲烷溶劑室溫冷浸，48h后過(guò)濾， 將黑蟻殘?jiān)鼮V出后再次加入黑蟻殘?jiān)亓?倍的二氯甲烷重復(fù)提取，過(guò)濾，分別收集濾液和 濾渣，濾渣經(jīng)過(guò)干燥，得到黑蟻濾渣粉，備用； 步驟三、將步驟二得到的黑蟻濾渣粉放置通風(fēng)處風(fēng)干，加入質(zhì)量百分比為60 %的甲醇 溶液室溫冷浸提取48h后過(guò)濾，收集濾液，濾出的黑蟻渣粉再次加入質(zhì)量百分比為60 %甲醇 溶液室溫冷浸提取，重復(fù)上述操作若干次，直至濾液中全部為質(zhì)量百分比為60 %甲醇溶液， 合并濾液，減壓下除去溶劑后得到黑蟻60 %甲醇濃縮液;然后將濃縮液置于-10°C冰箱中冷 凍至結(jié)冰狀，取出再放置于冷凍干燥儀中，調(diào)至-40°C下冷凍干燥處理，得到黑蟻的60%甲醇 浸膏，甲醇浸膏密封后放置于_80°C冰箱中，備用； 步驟四、將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解后，用硅膠拌樣后，利用濕法上 柱，進(jìn)行柱色譜分離;取100-200目硅膠裝入色譜柱中，上樣，用7倍柱體積的乙酸乙酯洗脫， 收集乙酸乙酯餾分，合并濃縮后得到乙酸乙酯提取浸膏，備用； 取上述黑蟻的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶劑充分溶解，加入硅膠充分拌樣干燥， 進(jìn)行柱色譜分離，取200-300目硅膠裝入色譜柱中，上樣，然后分別用石油醚-乙酸乙酯溶液 進(jìn)行梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯洗脫液的梯度比例依次為10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分別收集餾分，TLC檢測(cè)合并相同餾分，得到不同餾分段共8個(gè)組分； 取梯度比例為8:2的石油醚-乙酸乙酯餾分段，進(jìn)一步通過(guò)S印hadex LH-20凝膠色譜進(jìn) 行純化，流動(dòng)相采用摩爾比例為1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脫，流速為〇.3ml/min，收集合 并餾分，經(jīng)過(guò)TLC分析，分別得到化合物1和化合物2，即大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物。
[0019] 實(shí)施例2: 一種黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法，包括以下步驟： 步驟一、取黑蟻原材料2.5kg，清洗表面泥漬及除去存放處理用無(wú)機(jī)鹽，清洗干凈后放 入50°C烘箱中鼓風(fēng)干燥至恒重，粉碎，得到黑蟻粉末，備用； 步驟二、將步驟一得到的黑蟻粉末用其重量7倍的二氯甲烷溶劑室溫冷浸，49h后過(guò)濾， 將黑蟻殘?jiān)鼮V出后再次加入黑蟻殘?jiān)亓?倍的二氯甲烷重復(fù)提取，過(guò)濾，分別收集濾液和 濾渣，濾渣經(jīng)過(guò)干燥，得到黑蟻濾渣粉，備用； 步驟三、將步驟二得到的黑蟻濾渣粉放置通風(fēng)處風(fēng)干，加入質(zhì)量百分比為70 %的甲醇 溶液室溫冷浸提取49h后過(guò)濾，收集濾液，濾出的黑蟻渣粉再次加入質(zhì)量百分比為70 %甲醇 溶液室溫冷浸提取，重復(fù)上述操作若干次，直至濾液中全部為質(zhì)量百分比為70 %甲醇溶液， 合并濾液，減壓下除去溶劑后得到黑蟻70 %甲醇濃縮液;然后將濃縮液置于_15°C冰箱中冷 凍至結(jié)冰狀，取出再放置于冷凍干燥儀中，調(diào)至-40°C下冷凍干燥處理，得到黑蟻的7%甲醇 浸膏，甲醇浸膏密封后放置于_80°C冰箱中，備用； 步驟四、將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解后，用硅膠拌樣后，利用濕法上 柱，進(jìn)行柱色譜分離；取100-200目硅膠裝入色譜柱中，上樣，用10倍柱體積的乙酸乙酯洗 脫，收集乙酸乙酯餾分，合并濃縮后得到乙酸乙酯提取浸膏，備用； 取上述黑蟻的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶劑充分溶解，加入硅膠充分拌樣干燥， 進(jìn)行柱色譜分離，取200-300目硅膠裝入色譜柱中，上樣，然后分別用石油醚-乙酸乙酯溶液 進(jìn)行梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯洗脫液的梯度比例依次為10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分別收集餾分，TLC檢測(cè)合并相同餾分，得到不同餾分段共8個(gè)組分； 取梯度比例為8:2的石油醚-乙酸乙酯餾分段，進(jìn)一步通過(guò)S印hadex LH-20凝膠色譜進(jìn) 行純化，流動(dòng)相采用摩爾比例為1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脫，流速為〇.3ml/min，收集合 并餾分，經(jīng)過(guò)TLC分析，分別得到化合物1和化合物2，即大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物。
[0020] 實(shí)施例3: 一種黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法，包括以下步驟： 步驟一、取黑蟻原材料3kg，清洗表面泥漬及除去存放處理用無(wú)機(jī)鹽，清洗干凈后放入 50°C烘箱中鼓風(fēng)干燥至恒重，粉碎，得到黑蟻粉末，備用； 步驟二、將步驟一得到的黑蟻粉末用其重量10倍的二氯甲烷溶劑室溫冷浸，50h后過(guò) 濾，將黑蟻殘?jiān)鼮V出后再次加入黑蟻殘?jiān)亓?0倍的二氯甲烷重復(fù)提取，過(guò)濾，分別收集濾 液和濾渣，濾渣經(jīng)過(guò)干燥，得到黑蟻濾渣粉，備用； 步驟三、將步驟二得到的黑蟻濾渣粉放置通風(fēng)處風(fēng)干，加入質(zhì)量百分比為80 %的甲醇 溶液室溫冷浸提取50h后過(guò)濾，收集濾液，濾出的黑蟻渣粉再次加入質(zhì)量百分比為80 %甲醇 溶液室溫冷浸提取，重復(fù)上述操作若干次，直至濾液中全部為質(zhì)量百分比為80 %甲醇溶液， 合并濾液，減壓下除去溶劑后得到黑蟻80 %甲醇濃縮液;然后將濃縮液置于-20°C冰箱中冷 凍至結(jié)冰狀，取出再放置于冷凍干燥儀中，調(diào)至-40°C下冷凍干燥處理，得到黑蟻的80%甲醇 浸膏，甲醇浸膏密封后放置于_80°C冰箱中，備用； 步驟四、將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解后，用硅膠拌樣后，利用濕法上 柱，進(jìn)行柱色譜分離；取100-200目硅膠裝入色譜柱中，上樣，用10倍柱體積的乙酸乙酯洗 脫，收集乙酸乙酯餾分，合并濃縮后得到乙酸乙酯提取浸膏，備用； 取上述黑蟻的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶劑充分溶解，加入硅膠充分拌樣干燥， 進(jìn)行柱色譜分離，取200-300目硅膠裝入色譜柱中，上樣，然后分別用石油醚-乙酸乙酯溶液 進(jìn)行梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯洗脫液的梯度比例依次為10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分別收集餾分，TLC檢測(cè)合并相同餾分，得到不同餾分段共8個(gè)組分； 取梯度比例為8:2的石油醚-乙酸乙酯餾分段，進(jìn)一步通過(guò)S印hadex LH-20凝膠色譜進(jìn) 行純化，流動(dòng)相采用摩爾比例為1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脫，流速為〇.3ml/min，收集合 并餾分，經(jīng)過(guò)TLC分析，分別得到化合物1和化合物2，即大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法，其特征在于：黑蟻原材料先經(jīng)二氯 甲烷溶劑室溫冷浸提取后得到黑蟻濾渣，再將黑蟻濾渣采用質(zhì)量百分比為60-80 %甲醇溶 液室溫冷浸提取，提取后的甲醇濃縮液經(jīng)冷凍干燥處理得甲醇浸膏，然后甲醇浸膏先后經(jīng) 過(guò)乙酸乙酯溶液、石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脫后，得到的餾分經(jīng)進(jìn)一步分離純化最終提 取出2個(gè)化合物，即大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物。2. 如權(quán)利要求1所述的黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法，其特征在于:包 括以下步驟： 步驟一、取黑蟻原材料，清洗干凈后放入45-50Γ烘箱中鼓風(fēng)干燥至恒重，粉碎，得到黑 蟻粉末，備用； 步驟二、將步驟一得到的黑蟻粉末用其重量5-10倍的二氯甲烷溶劑室溫冷浸，48-50h 后過(guò)濾，將黑蟻殘?jiān)鼮V出后再次加入黑蟻殘?jiān)亓?-10倍的二氯甲烷重復(fù)提取，過(guò)濾，分別 收集濾液和濾渣，濾渣經(jīng)過(guò)干燥，得到黑蟻濾渣粉，備用； 步驟三、將步驟二得到的黑蟻濾渣粉放置通風(fēng)處風(fēng)干，加入質(zhì)量百分比為60-80 %的甲 醇溶液室溫冷浸提取48-50h后過(guò)濾，收集濾液，濾出的黑蟻渣粉再次加入質(zhì)量百分比為60-80 %甲醇溶液室溫冷浸提取，重復(fù)上述操作若干次，合并濾液，減壓下除去溶劑后得到黑蟻 60-80 %甲醇濃縮液;然后將濃縮液置于-10-20°C冰箱中冷凍至結(jié)冰狀，取出再放置于冷凍 干燥儀中，調(diào)至-40°C下冷凍干燥處理，得到黑蟻的60-80%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置 于-80°C冰箱中，備用； 步驟四、將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解后，采用柱色譜法進(jìn)行分離，先 用乙酸乙酯洗脫后，再將洗脫得到的餾分用石油醚-乙酸乙酯混合液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫得 到的餾分經(jīng)進(jìn)一步純化得到化合物1和化合物2,即大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物，結(jié)構(gòu)式如 下：化合物1; 化合物2。3. 如權(quán)利要求2所述的一種黑蟻中大環(huán)內(nèi)酯倍半萜骨架化合物的提取方法，其特征在 于:步驟四所述的分離提純的具體步驟為:將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解 后，用硅膠拌樣后，利用濕法上柱，進(jìn)行柱色譜分離;取100-200目硅膠裝入色譜柱中，上樣， 用7-10倍柱體積的乙酸乙酯洗脫，收集乙酸乙酯餾分，合并濃縮后得到乙酸乙酯提取浸膏， 備用； 取上述黑蟻的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶劑充分溶解，加入硅膠充分拌樣干燥， 進(jìn)行柱色譜分離，取200-300目硅膠裝入色譜柱中，上樣，然后分別用石油醚-乙酸乙酯溶液 進(jìn)行梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯洗脫液的梯度比例依次為10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分別收集餾分，TLC檢測(cè)合并相同餾分，得到不同餾分段共8個(gè)組分； 取梯度比例為8:2的石油醚-乙酸乙酯餾分段，進(jìn)一步通過(guò)Sephadex LH-20凝膠色譜進(jìn) 行純化，收集合并餾分，經(jīng)過(guò)TLC分析，分別得到化合物1和化合物2。4. 如權(quán)利要求3所述的一種黑蟻中含氮化合物的提取方法，其特征在于:梯度比例為8: 2的石油醚-乙酸乙酯餾分段進(jìn)行Sephadex LH-20凝膠色譜純化過(guò)程中，流動(dòng)相采用摩爾比 例為1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脫，流速為〇.3ml/min。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK106008428SQ201610346184
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月24日
【發(fā)明人】尹衛(wèi)平, 李海迪, 高嘉嶼, 劉坤, 劉華清
【申請(qǐng)人】河南科技大學(xué)