一種從銀杏外種皮中聯(lián)合提取銀杏酸、黃酮和萜內(nèi)酯、以及多糖的工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)、生物、化工領(lǐng)域，具體涉及一種從銀杏外種皮中聯(lián)合提取銀杏酸、黃酮和萜內(nèi)酯、以及多糖的工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]銀杏是我國重要的醫(yī)用和經(jīng)濟(jì)型樹種。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，銀杏葉、銀杏果、銀杏外種皮中都含有黃酮、萜內(nèi)酯、銀杏酸、多糖等多種具有生物活性的成分。其中，銀杏黃酮和萜內(nèi)酯具有清除自由基和擴(kuò)張血管、拮抗PF(血小板因子)的作用，銀杏多糖具有降低血糖、延緩衰老、提高免疫力的作用，銀杏酸具有抗腫瘤、抗微生物的作用但同時又有較強(qiáng)的胚胎毒性和細(xì)胞毒性。
[0003]銀杏葉由于黃酮和萜內(nèi)酯含量較高(3.6%)，銀杏酸含量較低(0.25% )，目前其黃酮和萜內(nèi)酯提取物(EGB)已成為重要的治療心腦血管疾病的藥物，但各國藥典均對EGB中銀杏酸的含量進(jìn)行了限定。如，美國與德國對于EGB中銀杏酸含量限定均< 5ppm，中國對于EGB中銀杏酸含量限定均<10ppm。
[0004]銀杏外種皮是銀杏果剝離果核后剩余的部分，其黃酮類活性成分含量較低(1.3%?2.7%)，銀杏酸的含量較高(5.4%)，一直沒有得到有效的利用。據(jù)統(tǒng)計每年全國在銀杏種植區(qū)，有近10萬噸銀杏白果上剝離下的銀杏外種皮被直接廢棄。廢棄的銀杏外種皮會腐爛揮發(fā)出腥臭刺激的氣味，造成環(huán)境污染、生物死亡，據(jù)初步估算這些廢棄的銀杏外種皮中含有1300?2770t的黃酮，5900t的銀杏酸，6580t的多糖。目前研究較多的是黃酮和萜內(nèi)酯、銀杏酸、或多糖的單獨(dú)提取方法，成本高、效率低，不能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，目的在于提供一種從銀杏外種皮中聯(lián)合提取銀杏酸、黃酮和萜內(nèi)酯、以及多糖的工藝。
[0006]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]—種從銀杏外種皮中聯(lián)合提取銀杏酸、黃酮和萜內(nèi)酯、以及多糖的工藝，包括如下步驟:
[0008](1)將干燥的銀杏外種皮粉粹過篩，然后加入非極性溶劑，在攪拌條件下，利用非極性溶劑進(jìn)行多次萃取以脫除銀杏外種皮中的銀杏酸，分離并收集每次萃取的萃取相，直到銀杏外種皮中銀杏酸含量<0.01wt%(10mg/kg)時結(jié)束萃取，合并多次萃取收集的萃取相并蒸干萃取劑后，得到銀杏酸粗提物，同時得到銀杏外種皮一次殘渣;采用硅膠柱純化銀杏酸粗提物，隨后經(jīng)濃縮干燥后得到純度大于97wt%的固體銀杏酸；
[0009](2)將步驟(1)得到的銀杏外種皮一次殘渣干燥后，向其中加入醇水混合物進(jìn)行多次浸提，分離并收集每次浸提的浸提液，直至銀杏外種皮一次殘渣中黃酮和萜內(nèi)酯的含量<0.2wt%時結(jié)束浸提，合并多次浸提收集的浸提液得到黃酮和萜內(nèi)酯粗提物，同時得到銀杏外種皮二次殘渣；采用大孔樹脂純化黃酮和萜內(nèi)酯粗提物，隨后經(jīng)濃縮得到黃酮224wt%、蔽內(nèi)酯2 6wt%、銀杏酸含量<0.01wt%的黃酮和蔽內(nèi)酯提取物；
[0010](3)將步驟(2)得到的銀杏外種皮二次殘渣干燥后，向其中加入水進(jìn)行多次水提，合并多次水提分離得到的水提液得到銀杏多糖粗提液，同時得到銀杏外種皮三次殘渣，所述銀杏外種皮三次殘渣無毒無臭無污染，可直接廢棄;采用Sevage法除去銀杏多糖粗提液中的蛋白質(zhì)，再通過重結(jié)晶純化得到純度大于98wt%的銀杏多糖。
[0011]上述方案中，步驟(1)所述非極性溶劑為石油醚、C5-C1Q間的烷烴、C5-C1Q間的烯烴、C5-C1Q間的環(huán)烷烴和氯仿中的一種或幾種。
[0012]上述方案中，步驟(1)所述萃取的方式為攪拌回流萃取、砂磨萃取、球磨破壁萃取、或超聲輔助萃取。
[0013]上述方案中，步驟(1)所述每次萃取的萃取時間為0.2?2h，固液質(zhì)量比為1:5?1:8。
[0014]上述方案中，步驟(2)所述醇水混合物為甲醇水溶液或乙醇水溶液。
[0015]上述方案中，步驟(2)所述浸提的方式為攪拌浸提、回流浸提、砂磨浸提、球磨浸提、或超聲輔助浸提。
[0016]上述方案中，步驟(2)所述每次浸提的浸提時間為0.2?2h，固液質(zhì)量比為1:5?1:
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[0017]上述方案中，步驟(3)所述水提的方式為攪拌水提、回流水提、砂磨水提、球磨水提、或超聲輔助水提。
[0018]上述方案中，步驟(3)每次水提的水提時間為0.2?2h，固液質(zhì)量比為1:5?1:7。
[0019]本發(fā)明的有益效果如下:本發(fā)明通過一條工藝路線，將銀杏外種皮中的銀杏酸、黃酮和萜內(nèi)酯以及多糖分別提取獲得提取物，充分利用了銀杏外種皮這一資源;本發(fā)明通過聯(lián)合提取的工藝，與單獨(dú)提取某一種活性成分相比，合并了去除銀杏酸的步驟、簡化了對與這些成分單獨(dú)提取的操作步驟、降低了提取的成本，為利用銀杏外種皮資源、保護(hù)環(huán)境以及工業(yè)化應(yīng)用建立基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明所述工藝的流程圖。
【具體實施方式】
[0021]為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施例。
[0022]實施例1
[0023]—種從銀杏外種皮中聯(lián)合提取銀杏酸、黃酮和萜內(nèi)酯、以及多糖的工藝，包括如下步驟:
[0024](1)取干燥的銀杏外種皮，經(jīng)粉碎后過60目篩，以石油醚為萃取溶劑，固液質(zhì)量比為1:5，采用球磨-溶劑萃取的方式萃取40min，萃取5次后，檢測出銀杏外種皮中銀杏酸的含量為0.007wt %，結(jié)束萃取，合并三次萃取的萃取相，將萃取溶劑蒸干后，得到銀杏酸粗提物，剩余為銀杏外種皮一次殘渣;將銀杏酸粗提物用石油醚復(fù)溶(lg銀杏酸粗提物用10ml石油醚復(fù)溶)，上樣于已處理的硅膠柱(硅膠100g，徑高比1:15，內(nèi)徑為30mm，濕法裝柱)，銀杏酸粗提物經(jīng)硅膠柱層析分離，以石油醚(95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60% )、異丙醇(4%、9%、14%、19%、24%、29%、34%、39% )、乙酸(1 % )的混合溶液為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集銀杏酸含量高的三個流份，將三個流份合并后濃縮和真空干燥，得到透亮黃棕色的固體銀杏酸產(chǎn)品，經(jīng)HPLC檢測，銀杏酸的純度為97.5wt %。
[0025](2)將銀杏外種皮一次殘渣置于70°C烘箱干燥24h，以80Vt% (體積百分比)乙醇溶液為萃取劑，固液質(zhì)量比為1:5，采用攪拌-溶劑萃取的方式浸提60min，浸提2次后，檢測出黃酮和萜內(nèi)酯在銀杏外種皮中的含量< 0.2wt %，結(jié)束浸提，合并2次浸提的提取液，濃縮5倍后即為黃酮和萜內(nèi)酯粗提物，剩余為銀杏外種皮二次殘渣;將黃酮和萜內(nèi)酯粗提物靜置6h后過濾，調(diào)節(jié)濾液pH到6，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀后真空干燥，再用乙醇復(fù)溶(濃度為2mg/mL)，上AB-8大孔樹脂柱，先以4BV水淋洗，再換20Vt%的乙醇溶液沖洗，最后用70Vt%乙醇洗脫黃酮和萜內(nèi)酯，洗脫液蒸發(fā)濃縮3倍后即為黃酮和萜內(nèi)酯提取物，經(jīng)測定，其中黃酮的含量為25.2wt %，萜內(nèi)酯的含量為6.3wt%,銀杏酸含量為5.2ppm。
[0026](3)將銀杏外種皮二次殘渣置于真空干燥箱70°C烘24h，以90°C水為提取溶劑，固液質(zhì)量比為1:5，以回流-溶劑萃取方式萃取120min，合并兩次水提的濾液，經(jīng)測定，銀杏多糖的粗提取率為72.7wt%，將濾液濃縮到原體積的1/5，再加4倍體積的乙醇于5°C下靜置24h，抽濾，用乙醇洗滌；回收固體并真空干燥，得到銀杏多糖粗產(chǎn)品，經(jīng)測定，其純度為34wt% ;將上述所得銀杏多糖粗產(chǎn)品用水復(fù)溶，采用1/4溶液體積的正丁醇:氯仿=1:3混合溶劑(Sevage法)萃取3次除去蛋白質(zhì)，再用加入4倍體積的乙醇重結(jié)晶，得到純度為98.2wt%、銀杏酸含量為1.8ppm的銀杏多糖。
[0027]實施例2
[0028]—種從銀杏外種皮中聯(lián)合提取銀杏酸、黃酮和萜內(nèi)酯、以及多糖的工藝，包括如下步驟:
[0029](1)取干燥的銀杏外種皮，經(jīng)粉碎后過60目篩，以正己烷為萃取溶劑，固液質(zhì)量比為1:5，采用砂磨-溶劑萃取的方式萃取lOOmin，萃取5次后，檢測出銀杏外種皮中銀杏酸的含量為0.006wt %，結(jié)束萃取，合并三次萃取的萃取相，將萃取溶劑蒸干后，得到銀杏酸粗提物，剩余為銀杏外種皮一次殘渣;將銀杏酸粗提物用石油醚復(fù)溶(lg銀杏酸粗提物用10ml石油醚復(fù)溶)，上樣于已處理的硅膠柱(硅膠100g，徑高比1:15，內(nèi)徑為30mm，濕法裝柱)，銀杏酸粗提物經(jīng)硅膠柱層析分離，以石油醚(95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60% )、異丙醇(4%、9%、14%、19%、24%、29%、34%、39% )、乙酸(1 % )的混合溶液為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集銀杏酸含量高的三個流份，將三個流份合并后濃縮和真空干燥，得到透亮黃棕色的固體銀杏酚酸純化產(chǎn)品，經(jīng)HPLC檢測，銀杏酸的純度為98.2wt %。
[0030](2)將銀杏外種皮一次殘渣置于70°C烘箱干燥24h，以80Vt% (體積百分比)甲醇溶液為萃取劑，固液質(zhì)量比為1:6，采用球磨-溶劑萃取的方式浸提40min，浸提2次后，檢測出黃酮和萜內(nèi)酯在銀杏外種皮中的含量< 0.