專利名稱：制備(3-三氟甲磺?；?-n-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2基氨基)-苯基]-苯甲酰胺的 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從4-甲基-2-硝基-苯胺(式(II))起始，經(jīng)中間體(3-三氟甲磺 ?；?-N44-甲基-3-硝基苯基]-苯甲酰胺(式(III))、(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨 基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(IV))和(3-三氟甲磺?；?-N-[3-胍基-4-甲基苯 基]-苯甲酰胺(式(V))制備(3-三氟甲磺酰基)-N-W-甲基-3-(4-吡啶-3基-嘧啶-2 基氨基)-苯基]-苯甲酰胺(式(I))的方法。本發(fā)明還涉及制備這些中間體的方法。式 (I)化合物為如下所示，其也稱為AN-024
式-1開發(fā)代碼AN-02背景技術：
在于2007年10月4日公布的US 2007/0232633的實施例13以及許多其他國 家的對應申請(PCT/IN 2005/000243)中描述了式(I)的(3-三氟甲磺酰基)-N-甲 基-3-(4-吡啶-3基-嘧啶-2基氨基)_苯基]-苯甲酰胺的制備及其應用尤其是作為抗 腫瘤劑的應用。鑒于(3-三氟甲磺?；?-N<4-甲基-3-(4-吡啶-3基-嘧啶-2基氨基)_苯 基]-苯甲酰胺(式(I))作為抗腫瘤劑對社會和保健產(chǎn)業(yè)的有用性，開發(fā)了一種式(I)化 合物的制備方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及中間體的制備和使用所述中間體制備式(I)的(3-三氟甲磺酰 基)-N44-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺的方法。式⑴ 的(3-三氟甲磺?；?-N- [4-甲基-3- (4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲 酰胺是一種抗增殖(例如抗腫瘤)齊U。因此，本發(fā)明提供了一種制備式(I)化合物的方法，所述方法包括(如下面的路線 圖1所示)(a)提供(3-三氟甲磺?；?苯甲酰氯(式(VI))或通過常規(guī)方法制備該化合物；(b)在氯烴(chlorohydrocarbon)溶劑中于約30°C到約40°C通過加入堿的水 溶液使4-甲基-2-硝基-苯胺(式(II))與式(XI)化合物縮合，獲得(3-三氟甲磺酰 基)-N-W-甲基-3-硝基苯基]-苯甲酰胺(式(III))；(c)在約0到約5°C下用氯化亞錫/濃鹽酸將式(III)化合物還原約3到約4小 時，獲得(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(IV))；(d)在正丁醇溶劑中在約90到約95°C下使式(IV)化合物與氨腈溶液發(fā)生縮合反 應，獲得(3-三氟甲磺?；?-N-[3-胍基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(V))；(e)在回流溫度下在堿的存在下使式(V)化合物與式(VII)化合物縮合，獲得式 ⑴化合物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種制備式(III)化合物的方法，所述方法包 括(a)提供(3-三氟甲磺?；?苯甲酰氯(式(VI))；或通過常規(guī)方法制備該化合 物；(b)在氯烴溶劑中于約30°C到約40°C通過加入堿的水溶液使4-甲基-2-硝基 苯胺(式(II))與式(VI)化合物縮合，獲得(3-三氟甲磺?；?-N-W-甲基-3-硝基苯 基]-苯甲酰胺(式(III))。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種制備(3-三氟甲磺酰基)-N_[3-氨 基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(IV))的方法，所述方法包括a)提供(3-三氟甲磺?；?苯甲酰氯(式(VI))；或通過常規(guī)方法制備該化合物；b)在氯烴溶劑中于約30°C到約40°C通過加入堿的水溶液使4-甲基-2-硝基-苯 胺(式(II))與式(VI)化合物縮合，獲得(3-三氟甲磺酰基)-N44-甲基-3-硝基苯 基]-苯甲酰胺(式(III))；c)在約0到約5°C下用氯化亞錫/濃鹽酸將式(III)化合物還原約3到約4小時， 獲得(3-三氟甲磺?；?-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(IV))。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種制備N-{2_(4-甲基哌嗪甲基)苯甲酰氨 基]-5-甲基}鹽酸胍(式(V))的方法，所述方法包括(a)提供(3-三氟甲磺酰基)苯甲酰氯(式(VI))；或通過常規(guī)方法制備該化合 物；(b)在氯烴溶劑中于約30°C到約40°C通過加入堿的水溶液使4-甲基_2_硝基 苯胺(式(II))與式(VI)化合物縮合，獲得(3-三氟甲磺酰基)-N-W-甲基-3-硝基苯 基]-苯甲酰胺(式(III))；
(c)在約0到約5°C下用氯化亞錫/濃鹽酸將式(III)化合物還原約3到約4小 時，獲得(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(IV))；(d)在正丁醇溶劑中在約90到約95°C下使式(IV)化合物與氨腈水溶液發(fā)生縮合 反應，獲得(3-三氟甲磺?；?-N-[3-胍基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(V))。


圖1.用多種濃度的ΑΝ024(1-10μ g/ml)處理K562細胞。收集細胞裂解產(chǎn)物并按 照標準方案進行蛋白質印跡分析。測定BCR-Abl、Crk和Stat5AY694Ai99的表達水平(實施例 1)。圖2.通過口服劑量的AN-OM和伊馬替尼(Imatinib)，植入了 K562的裸鼠中的脾 腫大的減輕(實施例幻。通過目視檢查測定脾腫大，測得對照小鼠表現(xiàn)出脾腫大，這表示 K562細胞局域化。ANOM處理的細胞未顯示任何脾腫大，而伊馬替尼處理的小鼠顯示了輕 微的脾腫大。圖3A和3B.在植入K5621uc人白血病細胞并用ANOM或伊馬替尼處理的裸鼠中 螢光素酶表達的下降(實施例4)。濃度為lmg/kg的ANOM未引起螢光素酶表達的下降，而 5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg的濃度導致了螢光素酶表達的下降。給予濃度為lmg/kg的伊 馬替尼未引起螢光素酶表達的下降，而10mg/kg和20mg/kg的濃度顯示出螢光素酶表達的 抑制。圖4A、4B和4C.這些圖示出了與圖3A和所示類似的研究結果，但使用的是對 照藥物達沙替尼(dasatinib)。圖4A(實施例6)是通過口服(or)給予達沙替尼，在植入 Baf3突變細胞(wt、T315I、M351T和E255K)的裸鼠中胚細胞計數(shù)下降的圖示。圖4B (實施 例6)是通過口服(or)給予伊馬替尼，在植入Baf3突變細胞(wt、T315I、M351T和E255K) 的裸鼠中胚細胞計數(shù)下降的圖示。圖4C(實施例6)是通過口服(or)給予AN-024，在植入 Baf3突變細胞(wt、T315I、M351T和E255K)的裸鼠中胚細胞計數(shù)下降的圖示。圖5A和5B.在進行和不進行放射的情況下，4910、5310和U87膠質瘤細胞以及 MDAMB231和觀71乳腺癌細胞在指定濃度的AN-024的存在下的體外基質膠(matrigel)侵 襲測定(實施例7)。圖5C.在進行和不進行放射的情況下，4910、5310和U87膠質瘤細胞以及 MDAMB231和觀71乳腺癌細胞在指定濃度的AN-OM的存在下的體外血管發(fā)生測定(實施例 7)。圖5D.在進行和不進行放射的情況下，4910、5310和U87膠質瘤細胞以及 MDAMB231和觀71乳腺癌細胞在指定濃度的AN-024的存在下的蛋白質印跡分析(實施例7)。圖6A.用AN024、AN019或伊馬替尼處理后的K562uc植入小鼠的螢光素酶表達。圖6B.在第58天用ANOM或AN019處理治愈的動物的數(shù)量。藥物處理在第42天 停止，停止藥物處理后動物繼續(xù)顯示出用ANOM和AN019處理后的療效(實施例8)。圖6C.在標明的日期從動物獲得的血涂片的胚細胞計數(shù)。藥物處理在第42天停 止。在停止藥物處理后AN024和AN019依然顯示出有效性。發(fā)現(xiàn)伊馬替尼無效(實施例8)。
圖7A.在進行和不進行放射(5Gy)的情況下，用TMZ、AN024或AN019處理后的裸 鼠中顱內腫瘤的半定量分析(實施例9)。圖7B.用AN-OM進行藥物處理但不進行放射處理后不顯示顱內腫瘤的裸鼠的圖 示(實施例9)。
具體實施例方式制備本發(fā)明式(I)化合物的反應路線示于下面的路線圖1中。SO,CF,步驟2NHSO2CF3SO2CF3O^ INMe2步驟(YII)SO2CF3(I)路線囷1在路線圖1的反應的一個實施方案中，在步驟1中，堿可為氫氧化鈉或氫氧化鉀， 例如，氫氧化鉀。此反應可在氯烴例如二氯甲烷或氯仿例如氯仿中進行。溫度可為約30°C 到約40 0C ο在一個實施方案中，步驟2中的還原可通過使用6摩爾在濃鹽酸介質中的氯化亞 錫實現(xiàn)。在一個實施方案中，在步驟3中使用的溶劑可為正丁醇。在一個實施方案中，本發(fā)明的步驟4可在正丁醇的存在下使用氫氧化鈉進行。2007年3月5日提交的美國專利申請No. 11/714，565 (2007年10月4日公布， 美國專利申請公布號US 2007/0232633)和2005年7月19日提交的PCT申請No. PCT/IN 2005/00(^43(2006年3月16日公布，PCT公布號WO 2006/027795)的公開內容以引用的方 式全文納入本文中。下面給出的實施例描述了本發(fā)明的實施方案，提供所述實施例只是為了闡釋本發(fā) 明，因此他們不應被解釋為對本發(fā)明范圍的限制。實施例式I的本發(fā)明化合物(以開發(fā)代碼AN-OM標示)被發(fā)現(xiàn)顯示出有效的抗增殖(例 如抗腫瘤)活性。這種抗增殖活性優(yōu)于某些現(xiàn)有批準的此類藥物。開發(fā)代碼AN-019是指 發(fā)明人在別處描述的另一種同類化合物。將本發(fā)明化合物的生物有效性和活性與在本研究 中用作陽性對照的批準藥物如伊馬替尼甲磺酸鹽和達沙替尼進行了比較。在本研究中“伊 馬替尼甲磺酸鹽”縮寫為“伊馬替尼”t施例1在棺入了 k562細朐的裸鼠中AN-024的杭CML活t牛的確定(圖1)用AN-024講行的體外研究通過蛋白質印跡分析測定了用多種濃度的AN024(1、2. 5、5或10 μ g/ml)處理12 小時的K562細胞中BCR-Abl、Crk和磷酸Mat5AY694Ai99的表達水平。觀察到BCR-Abl、Crk 和磷酸Stat5AY694Ai99蛋白水平以劑量依賴的方式降低。蛋白質印跡分析用1、2. 5、5或10μ g/ml的ANOM處理K562細胞。12小時后，收集細胞，并在含有 Tris
、Triton-Xl 14 (1. 0% )、EDTA (IOmM)、抑肽酶和苯甲基磺酰氟的提取緩 沖液中制備全細胞裂解產(chǎn)物。通過12% SDS-PAGE在非還原條件下從這些樣品中分離10 μ g 蛋白并轉移到硝酸纖維素膜(Schleicher紹chuell，Keene, NH)上。按照標準方案用針對 BCR-Abl、Crk和磷酸Mat5AY694/699的抗體對所述膜檢測2小時。隨后將所述膜用PBS洗 滌三次以除去過量的一抗，根據(jù)需要，用合適的HRP綴合的二抗孵育，然后根據(jù)加強化學發(fā) 光方案(Amersham, ArlingtonHeights, IL)顯影。MTT細胞生長測定將K562細胞用多種濃度的AN0M(1、2. 5、5或10yg/ml)處理M小時，然后進行 MTT測定以測定所處理細胞的增殖指數(shù)。測定根據(jù)產(chǎn)商說明書(Chemicon Temecula,CA)按 照標準方案進行。在570nm下測量光密度并通過圖表表示。吸光度與存在的細胞數(shù)量成正 比，由此確定活細胞數(shù)量。AN024以劑量依賴的方式抑制BCR-Abl激酶活性。圖1示出了此試驗的結果。用多種濃度的ΑΝ024(1-10μβ/πι1)處理Κ562細胞。收 集細胞裂解產(chǎn)物并按照標準方案進行蛋白質印跡。測定BCR-Abl、Crk和Stat5AY694Ai99的表 達水平。實施例2對植入K562細胞的裸鼠注射AN024不表現(xiàn)脾腫大并且無Crk表達(圖 21通過腹膜內(ip)注射，用伊馬替尼或ANOM處理植入K562細胞的裸鼠。在觀察 到白血病生長百分指數(shù)(LGI)下降后處死小鼠并采集脾臟。通過目視檢查測定脾腫大，測得對照小鼠表現(xiàn)出脾腫大，這表示K562細胞局域化。ANOM處理的細胞未顯示任何脾腫大， 而伊馬替尼處理的小鼠顯示了輕微的脾腫大。這些結果示于圖2。針對Crk蛋白的存在情況對脾石蠟切片進行免疫檢測，發(fā)現(xiàn)Crk表達的強局域化， 并伴隨細胞密度增加，這表示對照小鼠中的K562局域化。用AN-OM處理的小鼠只顯示了基 礎水平的Crk表達，與陰性對照相當。用伊馬替尼處理的小鼠顯示出Crk表達的局域化表 達區(qū)域，表明K562細胞在脾中。對照小鼠也出現(xiàn)顯示Crk表達的隨機皮下腫瘤，表明K562 細胞的存在。根據(jù)這些結果，可明顯看出ANOM處理導致裸鼠中LGI的消退。伊馬替尼處理的小 鼠也表現(xiàn)出LGI的顯著下降，但是落后于AN-OM處理的小鼠。ANOM和伊馬替尼處理的小 鼠都未表現(xiàn)出不正常的生理、表型或行為異常。對照小鼠顯示出隨機皮下腫瘤的存在，伴隨 足趾的損失、皮膚下的淡紅色斑點以及腹部的輕微腫大。根據(jù)這些結果，可明顯看出AN-OM 具有作為治療白血病的治療性藥物的希望。^MM 3 #用Baf3伊馬替原杭t牛小鼠CML細胞,系講行的體內研究為測定ANO19和ANOM的體內抗白血病活性，將Baf 3小鼠白血病細胞(Wt、T3151、 M351T和E225K)經(jīng)腹膜內途徑植入裸鼠，植入后15天通過經(jīng)口管飼或腹膜內注射伊馬替尼 (10mg/kg)、AN019(20mg/kg)和AN024 (20mg/kg)處理小鼠。每6天經(jīng)尾靜脈或經(jīng)股靜脈獲 得血涂片，對胚細胞進行計數(shù)并通過圖表示出。42 天后，用伊馬替尼(10mg/kg)、AN019Q0mg/kg)或 ANOMQOmg/kg)處理的植入 Baf3fft的小鼠的血涂片與正常對照的相似。用伊馬替尼(10mg/kg)、AN019(20mg/kg)或ANOMQOmg/kg)處理的植入 Baf3T315I的小鼠的血涂片顯示，AN024和AN019處理的小鼠中的胚細胞計數(shù)顯著下降。 通過口服劑量的伊馬替尼處理的小鼠未顯示出胚細胞計數(shù)的下降，與未處理的對照和植入 Baf3M351T的小鼠相似。植入Baf3E255K的小鼠的表現(xiàn)也與植入Baf3M351T和Baf3T315I的小鼠的相似。用伊馬替尼、ANO19和ANOM處理(口服和腹膜內注射)植入Baf3突變細胞Wt、 E255K、T315I和M351T的裸鼠。簡言之，在植入后15天，通過經(jīng)口管飼或腹膜內注射伊馬 替尼(10mg/kg)、AN019(20mg/kg)或AN024(20mg/kg)處理小鼠。每日監(jiān)測腹部腫脹和活性 降低，每6天經(jīng)尾靜脈或股靜脈獲得血涂片并按照標準方案進行H&E染色。植入后42天， 處死小鼠并采集脾臟。測定脾腫大，并將其與血涂片胚細胞計數(shù)相關聯(lián)。MM胚細胞計數(shù)的顯微鏡測定每6天從植入Baf3細胞的小鼠的尾靜脈或股靜脈采血直至第42天。在植入后 第15天，如前文所述用伊馬替尼、AN019和ANOM( 口服和腹膜內注射)處理小鼠。觀察到 在植入Baf3Wt的小鼠中，胚細胞計數(shù)在所有處理條件下都不斷減少。Baf3M351T、T315I和 E22^(對伊馬替尼處理的反應不佳?？诜榴R替尼在植入Baf3M351T、T315I和E225K的小 鼠中無顯著效果?？偟膩碇v，ANOM和AN019的腹膜內處理在減少所有植入Baf3的小鼠中 的胚細胞計數(shù)方面明顯更好。在植入Baf3Wt的小鼠中的AN019處理導致白血病胚細胞的完全消退，與未處理的 正常對照的水平相當。腹膜內處理優(yōu)于口服處理。在第42天，在植入Baf3M351T、T315I和E225K的小鼠中的AN019處理顯示出胚細胞計數(shù)的顯著下降，并且與腹膜內處理的小鼠在 植入后第12天的水平相當；腹膜內處理的小鼠顯示出比口服處理的小鼠更大程度的胚細 胞的消退。在第42天，在植入Baf3M351T、T315I和E225K的小鼠中的ANOM處理顯示出胚 細胞計數(shù)的顯著下降，并且優(yōu)于AN019處理；腹膜內處理的小鼠顯示出比口服處理的小鼠 更大程度的胚細胞的消退。實施例4.棺入K562 ιΗ常/Luc人白血病細胞的棵鼠對低劑量AN024、ANO19和伊 馬替尼的反應(圖3A和3B)AN024、AN019和伊馬替尼的口服給藥
權利要求
1.一種式I的化合物式(I)(開發(fā)代碼AN-024)
2. 一種治療增殖疾病的方法，包括給予需要治療增殖疾病的受試者下式的抗增殖化合式(I)(開發(fā)代碼AN-024)
3.一種化合物，其為(3-三氟甲磺酰基)-N-W-甲基-3-硝基苯基]-苯甲酰胺。
4.一種制備(3-三氟甲磺?；?-N-[4-甲基-3-硝基苯基]-苯甲酰胺的方法，所述方 法包括提供式VI化合物(3-三氟甲磺?；?苯甲酰氯；在氯烴溶劑中于約30°C到約40°C通過加入堿的水溶液使4-甲基-2-硝基苯胺與式 (VI)化合物縮合，獲得(3-三氟甲磺?；?-N-W-甲基-3-硝基苯基]-苯甲酰胺。
5.一種化合物，其為(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺。
6.一種制備(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺的方法，所述方 法包括提供式VI化合物(3-三氟甲磺?；?苯甲酰氯；在氯烴溶劑中于約30°C到約40°C通過加入堿的水溶液使4-甲基-2-硝基苯胺與式 (IV)化合物縮合，獲得式111化合物(3-三氟甲磺酰基)-N- [4-甲基-3-硝基苯基]-苯甲 酰胺；在約0到約5°C下用氯化亞錫/濃鹽酸將式(III)化合物還原約3到約4小時，獲得 (3-三氟甲磺?；?-N- [3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺。
7.一種化合物，其為(3-三氟甲磺?；?-N-[3-胍基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺。
8.一種制備(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-胍基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺的方法，所述方 法包括提供式VI化合物(3-三氟甲磺酰基)苯甲酰氯；在氯烴溶劑中于約30°C到約40°C通過加入堿的水溶液使4-甲基-2-硝基苯胺與式 (IV)化合物縮合，獲得式III化合物(3-三氟甲磺?；?-N-[4-甲基-3-硝基苯基]-苯甲酰胺；在約0到約5°C下用氯化亞錫/濃鹽酸將式(III)化合物還原約3到約4小時，獲得式 (IV)化合物(3-三氟甲磺?；?-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺；在正丁醇溶劑中在約90°C到約95°C下使式(IV)化合物與氨腈水溶液發(fā)生縮合反應， 獲得(3-三氟甲磺酰基)-N- [3-胍基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺。
9. 一種制備式I化合物的方法式(I)(開發(fā)代碼AN-024) 所述方法包括提供式VI化合物(3-三氟甲磺?；?苯甲酰氯；在氯烴溶劑中于約30°C到約40°C通過加入堿的水溶液使4-甲基-2-硝基苯胺與式 (IV)化合物縮合，獲得式III化合物(3-三氟甲磺酰基)-N-[4-甲基-3-硝基苯基]-苯甲 酰胺；在約0到約5°C下用氯化亞錫/濃鹽酸將式(III)化合物還原約3到約4小時，獲得式 IV化合物(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺；在正丁醇溶劑中在約90°C到約95°C下使式IV化合物與氨腈水溶液發(fā)生縮合反應，獲 得式V化合物(3-三氟甲磺?；?-N- [3-胍基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺；在回流溫度下在堿的存在下使式(V)化合物與3- 二甲基氨基-1-吡啶-3-基-丙烯 酮縮合，獲得式(I)化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從4-甲基-2-硝基苯胺(式II)起始，經(jīng)中間體(3-三氟甲磺?；?-N-[4-甲基-3-硝基苯基]-苯甲酰胺(式(III))、(3-三氟甲磺?；?-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(IV))和(3-三氟甲磺?；?-N-[3-胍基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(V))制備(3-三氟甲磺?；?-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3基-嘧啶-2基氨基)-苯基]-苯甲酰胺(式(I))的方法。本發(fā)明還涉及制備這些中間體的方法。式(I)化合物也稱為AN-024。
文檔編號A61P35/00GK102046617SQ200980107583
公開日2011年5月4日 申請日期2009年3月2日 優(yōu)先權日2008年3月4日
發(fā)明者A·K·肯佩拉, S·拉沙康達, 布疆加·勞·阿迪巴特拉卡利薩蒂亞, 納納潘尼·委卡拉籌德利 申請人:納科法爾馬有限公司