白介素-1偶聯(lián)物在糖尿病治療中的用途的制作方法

文檔序號：1175902閱讀：323來源：國知局

專利名稱：白介素-1偶聯(lián)物在糖尿病治療中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學、公共衛(wèi)生、免疫學、分子生物學和病毒學領域。本發(fā)明提供用于治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的組合物、藥物組合物和疫苗。本發(fā)明的組合物、藥物組合物和疫苗包含核心顆粒和抗原，其中所述抗原包含白介素-l(IL-l)分子。當對動物、優(yōu)選地對人施用時，所述組合物、藥物組合物和疫苗誘導有效的免疫應答，特別是抗體應答，其中典型且優(yōu)選地，所述抗體應答針對IL-1。因此，本發(fā)明提供了通過針對 IL-1的主動免疫來治療、改善或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的方法。相關技術2型糖尿病是以存在由缺陷的胰島素分泌、胰島素作用或這兩者的組合引起的高血糖癥為特征的慢性代謝紊亂。盡管2型糖尿病中胰腺0細胞失敗的機理尚未完全闡明，但是已經確定涉及應激和炎癥途徑。反復血糖漂移(glucose excursion)、血脂異常和脂肪細胞因子引起的代謝應激可以在胰腺中誘導炎癥應答，其特征為局部細胞因子分泌、胰島免疫細胞浸潤、0細胞凋亡、淀粉樣蛋白沉著和纖維化。IL-10作為主要的細胞因子，它調節(jié)胰島趨化因子產生并且導致胰島素產生減弱和0細胞死亡。已經證明通過施用重組 IL-1受體拮抗劑或中和性單克隆抗體阻斷IL-1信號途徑可以改善2型糖尿病動物模型中的血糖控制(Sauter等人，2008，Osborn等人，2008)。而且，用重組人IL-1受體拮抗劑(阿那白滯素)治療2型糖尿病患者導致糖化血紅蛋白水平(長期血糖過多的可靠指標)降低和3細胞功能改善(Larsen等人，2007)。

發(fā)明內容
我們發(fā)現，本發(fā)明的分別包含至少一種IL-1分子、優(yōu)選IL-1突變蛋白的組合物和疫苗不僅能夠誘導針對IL-1的免疫應答，特別是抗體應答，而且能夠在體內中和IL-1的促炎活性。另外，我們還驚訝地發(fā)現，使用本發(fā)明組合物的主動免疫在小鼠糖尿病模型中導致飲食誘導的糖尿病表型的改善(參見Surwit等人，BIABETES, Vol. 37，1988，1163-1167)。這一發(fā)現是用不同的IL-1分子作出的，包括IL-1 a分子(參見實施例9)以及IL-1日分子(參見實施例12和13)。因此，一方面，本發(fā)明提供一種用于治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的組合物，其中所述組合物包含(a)具有至少一個第一附著位點的核心顆粒，其中所述核心顆粒是病毒樣顆粒(VLP)或病毒顆粒，優(yōu)選為病毒樣顆粒；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原，其中所述至少一種抗原包含IL-1分子或由IL-1分子組成或是 IL-1分子，該IL-1分子優(yōu)選地選自IL-1蛋白、IL-1成熟片段、IL-1肽和IL-1突變蛋白，其中(a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接，優(yōu)選地共價連接。在另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，其包含(a)具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原包含IL-1分子或由IL-1分子組成或是IL-1分子，并且其中(a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接。在一個優(yōu)選實施方案中，所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原包含或優(yōu)選地由(i)IL-l分子和(ii)接頭組成。在進一步優(yōu)選的實施方案中，其中所述第一附著位點與所述第二附著位點通過至少一個共價鍵連接，其中優(yōu)選地所述至少一個共價鍵是非肽鍵。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原包含或者優(yōu)選地由以下部分組成(i)IL_10分子，其中所述IL-10分子是SEQ ID NO 165 或SEQ ID N0:136，優(yōu)選SEQ IDNO :136 ；和(ii)接頭，其中所述接頭包含所述第二附著位點，并且其中優(yōu)選地所述接頭包含或者優(yōu)選地由GGC(SEQ ID NO 178)或GGCG(SEQ ID NO 188)組成，優(yōu)選地包含或者由GGCG(SEQ IDNO 188)組成；其中進一步優(yōu)選地，所述接頭通過肽鍵共價結合到所述IL-1 0分子的C末端。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原由以下部分組成(i)IL_l a分子，其中所述IL-la分子是SEQ ID N0:203或SEQ ID NO :210，優(yōu)選SEQ ID NO 203 ；和(ii)接頭，其中所述接頭包含所述第二附著位點，并且其中優(yōu)選地所述接頭包含或者優(yōu)選地由GGC(SEQ ID NO 178)或GGCG (SEQ ID NO 188)組成，優(yōu)選地包含或者由GGCG(SEQ ID NO 188)組成；其中進一步優(yōu)選地，所述接頭通過肽鍵共價結合到所述IL-la分子的C末端上。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，其中優(yōu)選地所述RNA噬菌體是噬菌體Q 3。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第二附著位點中僅有一個與所述第一附著位點通過至少一個非肽共價鍵連接，形成單一且均勻類型的所述抗原與所述病毒樣顆粒的結合，其中與所述第一附著位點連接的所述僅一個第二附著位點是巰基，并且其中所述抗原和所述病毒樣顆粒通過所述連接相互作用，形成有序且重復的抗原陣列。另一方面，本發(fā)明提供用于治療糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的疫苗，所述疫苗包含或者由本發(fā)明的組合物組成，優(yōu)選為有效量。另一方面，本發(fā)明提供用于治療糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的藥物組合物，所述藥物組合物包含(a)本發(fā)明的組合物或本發(fā)明的疫苗；和(b)藥學可接受的載體。另一方面，本發(fā)明提供一種治療糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的方法，所述方法包括給動物，優(yōu)選地給人施用免疫有效量的本發(fā)明的組合物、本發(fā)明的疫苗、和/或本發(fā)明的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的組合物、本發(fā)明的疫苗和/或本發(fā)明的藥物組合物在制備用于治療動物、優(yōu)選人的糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的藥物中的用途。發(fā)明詳述除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員的通常理解具有相同的含義。佐劑本文使用的術語“佐劑”是指免疫應答的非特異性刺激物或使宿主內產生貯庫(depot)的物質，當分別與疫苗或藥物組合物組合時，可以提供更加增強的免疫應答。優(yōu)選的佐劑包括完全和不完全弗氏佐劑，含鋁佐劑，優(yōu)選氫氧化鋁，最優(yōu)選明礬，和修飾的胞壁酰二肽。進一步優(yōu)選的佐劑有礦物質凝膠例如氫氧化鋁，表面活性物質例如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多元醇、聚陰離子、肽、油乳膠、匙孔賊血藍蛋白、二硝基酚，和人用佐劑例如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌。這些佐劑也是本領域已知的?？梢院捅景l(fā)明的組合物一起施用的其他佐劑包括但不限于單磷酰脂質免疫調節(jié)劑、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、 CRL1005、鋁鹽(明礬)、]\^-59、011-174、011-197、011-294、和病毒體佐劑技術。所述佐劑也可以包含上述物質的混合物。VLP通常被描述為佐劑。然而，在本申請上下文中使用的術語 “佐劑”是指不是用于本發(fā)明組合物的VLP的佐劑，而是涉及另外一種不同的成分?？乖疚乃玫男g語“抗原，，是指如果被MHC分子呈遞，則能夠被抗體或T細胞受體(TCR)結合的分子。本文所用的術語“抗原”也包括T細胞表位?？乖€能夠被免疫系統(tǒng)識別，以及/或者能夠誘導體液免疫應答和/或細胞免疫應答，導致B和/或T淋巴細胞的活化。然而，至少在某些情況下，這可能需要抗原含有Th細胞表位或者連接于Th細胞表位上，并且在佐劑中提供。一個抗原可能具有一個或多個表位(B和T表位)。上面提到的特異性反應的意思是，抗原優(yōu)選地一般以高選擇性方式與其相應的抗體或TCR反應，而不與可能由其它抗原誘導的其它許多抗體或TCR反應。本文所用的抗原也可以是幾種不同抗原的混合物。本文所用的術語“抗原”優(yōu)選地是指IL-1分子、IL-1蛋白、IL-1成熟片段、 IL-1片段、IL-1肽和IL-1突變蛋白，最優(yōu)選地“抗原”是指IL-1突變蛋白。如果沒有另外說明，本文所用的術語“抗原”不指病毒顆?；虿《緲宇w粒。表位術語表位是指多肽的連續(xù)或不連續(xù)的部分，它可被抗體或在MHC分子環(huán)境內被T細胞受體免疫特異性地結合。免疫特異性結合不包括非特異性結合，但是不一定排除交叉反應性。表位在對于該表位獨特的空間構象中一般包含5-10個氨基酸。特異性結合(抗體/抗原)在本申請中，如果抗體與抗原以lOT或更高、優(yōu)選 K^M—1或更高、更優(yōu)選lCfM—1或更高、最優(yōu)選lCAf1或更高的結合親和力(Ka)結合，則被定義為特異性結合?？贵w的親和力可以由本領域技術人員容易地測定(例如，通過Scatchard 分析、ELISA或Biacore分析)。特異性結合(IL-1/IL-1受體)受體和受體配體之間的相互作用可以用本領域公知的生物物理方法來表征，所述方法包括，例如，ELISA或Biacore分析。當IL-1與IL-1 受體的結合親和力(Ka)至少為105M_i，優(yōu)選至少lCfM—1，更優(yōu)選至少lO、—1，再更優(yōu)選至少 lOl1，最優(yōu)選至少lCAf1時，認為所述IL-1分子能夠特異性結合所述IL-1受體；其中優(yōu)選地所述IL-1受體是來自小鼠或人、最優(yōu)選地來自人的IL-1受體。進一步優(yōu)選地，所述IL-1 受體包含序列SEQ ID NO 166至SEQ ID NO 169中的任一種或者更優(yōu)選地由該序列組成，最優(yōu)選地所述IL-1受體包含序列SEQ ID NO 166和SEQ ID NO 167中的任一種或者更優(yōu) 選地由該序列組成。聯(lián)接的(associated)本文所用的術語“聯(lián)接的”或“聯(lián)接”是指所有可能的方式，優(yōu)選化學相互作用，通過這種方式，兩個分子連接在一起?；瘜W相互作用包括共價和非共價的相互作用。非共價相互作用的典型例子是離子相互作用、疏水相互作用或氫鍵，而共價相互作用例如基于共價鍵如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷鍵、碳-硫鍵如硫醚或酰亞胺鍵。第一附著位點本文所用的短語“第一附著位點”是指VLP(優(yōu)選RNA噬菌體的 VLP)中天然存在的或者人工添加到VLP(優(yōu)選RNA噬菌體的VLP)中的元件，第二附著位點可與之連接。第一附著位點可以是蛋白質、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)、或化學反應性基團如氨基、羧基、巰基、羥基、胍基、組氨?；蚱浣M合。作為第一附著位點的化學反應性基團的一個優(yōu)選的實施方案是氨基酸(優(yōu)選賴氨酸)的氨基。在一個優(yōu) 選的實施方案中，所述第一附著位點是賴氨酸殘基的氨基，其中優(yōu)選地所述賴氨酸殘基是所述VLP自然存在的賴氨酸殘基，優(yōu)選為RNA噬菌體的所述VLP自然存在的賴氨酸殘基。第一附著位點一般位于VLP(優(yōu)選RNA噬菌體的VLP，最優(yōu)選RNA噬菌體Q0的VLP)的表面上，優(yōu)選位于其外表面上。多個第一附著位點典型且優(yōu)選地以重復構型存在于病毒樣顆粒(優(yōu) 選RNA噬菌體的VLP，最優(yōu)選RNA噬菌體Q 0的VLP)的表面上，優(yōu)選外表面上。在一個優(yōu) 選的實施方案中，第一附著位點與VLP通過至少一個共價鍵、優(yōu)選通過至少一個肽鍵聯(lián)接。在進一步優(yōu)選的實施方案中，第一附著位點自然存在于VLP中?；蛘?，在一個優(yōu)選的實施方案中，第一附著位點被人工添加到VLP上。在一個優(yōu)選的實施方案中，第一附著位點與所述 VLP通過至少一個共價鍵、優(yōu)選通過至少一個肽鍵聯(lián)接，其中所述VLP是RNA噬菌體的VLP，優(yōu)選RNA噬菌體Q0的VLP。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第一附著位點是賴氨酸殘基的氨基，其中所述賴氨酸殘基是外殼蛋白的賴氨酸殘基，優(yōu)選RNA噬菌體的外殼蛋白的賴氨酸殘基，最優(yōu)選RNA噬菌體Q0的外殼蛋白的賴氨酸殘基。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第一附著位點是RNA噬菌體的外殼蛋白的賴氨酸殘基的氨基，其中優(yōu)選地所述外殼蛋白包含或優(yōu)選地由氨基酸序列SEQ ID N0:3組成。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第一附著位點是賴氨酸殘基，其中優(yōu)選地所述賴氨酸殘基是外殼蛋白的賴氨酸殘基，優(yōu)選RNA 噬菌體的外殼蛋白的賴氨酸殘基，最優(yōu)選RNA噬菌體Q0的外殼蛋白的賴氨酸殘基。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第一附著位點是RNA噬菌體Q0的外殼蛋白的賴氨酸殘基。第二附著位點本文使用的短語“第二附著位點”是指天然存在于或者人工添加到 IL-1分子上的元件，第一附著位點可以與之連接。IL-1分子的第二附著位點優(yōu)選地是蛋白質、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)、或化學反應性基團，例如氨基、羧基、巰基、羥基、胍基、組氨?；?、或其組合。作為第二附著位點的化學反應性基團的一個優(yōu) 選的實施方案是巰基。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第二附著位點是巰基，優(yōu)選半胱氨酸的巰基。本文使用的術語“具有至少一個第二附著位點的IL-1分子”因此是指包含IL-1 分子和至少一個第二附著位點的構建體。然而，特別是對于并非天然存在于IL-1分子內的第二附著位點，這種構建體一般且優(yōu)選地進一步含有“接頭”。在另一個實施方案中，第二附著位點與IL-1分子通過至少一個共價鍵，優(yōu)選地通過至少一個肽鏈聯(lián)接。在一個進一步的實施方案中，第二附著位點天然存在于IL-1分子內。在另外一個進一步優(yōu)選的實施方案中，第二附著位點被優(yōu)選地通過接頭人工添加到IL-1分子上，其中進一步優(yōu)選地所述接頭包含半胱氨酸或由半胱氨酸組成。非常優(yōu)選地，所述接頭與IL-1分子通過肽鍵融合。外殼蛋白術語“外殼蛋白”是指能夠摻入病毒衣殼或VLP內的病毒蛋白質，優(yōu)選病毒(優(yōu)選RNA噬菌體)的天然衣殼的亞單位。外殼蛋白也被稱為衣殼蛋白。連接的本文所用的術語“連接的”或“連接“是指所有可能的方式，優(yōu)選化學相互作用，通過這種方式，至少一個第一附著位點和至少一個第二附著位點連接在一起?；?學相互作用包括共價和非共價的相互作用。非共價相互作用的典型例子是離子相互作用、疏水相互作用或氫鍵，而共價相互作用例如基于共價鍵如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷鍵、碳-硫鍵如硫醚或酰亞胺鍵。在某些優(yōu)選實施方案中，第一附著位點和第二附著位點通過至少一個共價鍵連接，優(yōu)選通過至少一個非肽鍵連接，更優(yōu)選只通過非肽鍵連接。然而，本文所用的術語“連接”不僅指至少一個第一附著位點和至少一個第二附著位點的直接連接，而且可替代地并且優(yōu)選地，包括至少一個第一附著位點和至少一個第二附著位點通過中間分子的間接連接，典型且優(yōu)選地通過使用至少一個、優(yōu)選一個異雙功能交聯(lián)劑連接。因此，在優(yōu)選實施方案中，所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點通過至少一個，優(yōu)選地正好一個異雙功能交聯(lián)劑連接，其中優(yōu)選地，所述至少一個第一附著位點是賴氨酸殘基的氨基，其中進一步優(yōu)選地，所述第二附著位點是半胱氨酸殘基的巰基。在其它優(yōu)選實施方案中，第一附著位點和第二附著位點通過至少一個共價鍵連接，優(yōu)選通過至少一個肽鍵連接，更優(yōu)選只通過肽鍵連接。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，第一附著位點和第二附著位點只通過肽結合，優(yōu)選地通過基因融合，直接地或優(yōu)選地通過氨基酸接頭連接。在進一步優(yōu)選的實施方案中，第二附著位點只通過肽結合，優(yōu)選地通過基因融合，與所述第一附著位點的C末端連接。接頭本文所用的“接頭”將第二附著位點與IL-I分子聯(lián)接，或者已經包含第二附著位點、基本由、或者由第二附著位點組成。優(yōu)選地，本文所用的“接頭”已經包含第二附著位點，典型且優(yōu)選地_但不是必需地_為一個氨基酸殘基，優(yōu)選半胱氨酸殘基。在一個優(yōu)選實施方案中，所述接頭是氨基酸接頭。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述接頭僅由一個半胱氨酸殘基組成。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述接頭包含或僅由一個半胱氨酸殘基組成，并且所述第二附著位點是所述僅一個半胱氨酸殘基的巰基。可用于本發(fā)明的其他接頭有包含C1-C6烷基_、環(huán)烷基如環(huán)戊基或環(huán)己基、環(huán)烯基、芳基或雜芳基部分的分子。而且，優(yōu)選地包含C1-C6烷基_、環(huán)烷基-(C5，C6)、芳基-或雜芳基-部分和另外的氨基酸的接頭也可以用作本發(fā)明的接頭，并且包括在本發(fā)明的范圍內。接頭與IL-I分子優(yōu)選地通過至少一個共價鍵、更優(yōu)選地通過至少一個肽鍵聯(lián)接。在通過基因融合連接的情況中，接頭可以不存在，或者優(yōu)選地是氨基酸接頭，更優(yōu)選地是僅僅由氨基酸殘基組成的氨基酸接頭。非常優(yōu) 選的用于基因融合的接頭是柔性氨基酸接頭。在通過基因融合連接的情況中，接頭優(yōu)選地由1-20個、更優(yōu)選2-15個、更優(yōu)選2-10個、更優(yōu)選2-5個、最優(yōu)選3個氨基酸組成。非常優(yōu)選的用于基因融合的接頭包含GSG (SEQ ID NO 189)或者優(yōu)選地由GSG組成。氨基酸接頭術語“氨基酸接頭”是指包含至少一個氨基酸殘基的接頭。通常，術語“氨基酸接頭”并不意味著這種接頭僅由氨基酸殘基組成。然而，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述氨基酸接頭僅由氨基酸殘基組成。接頭的氨基酸殘基優(yōu)選地由本領域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸組成，其為全L型或全D型或混合物，最優(yōu)選全L型。本發(fā)明的接頭的進一步優(yōu)選的實施方案是包含巰基或半胱氨酸殘基的分子，這些分子因此也包括在本發(fā) 明中。有序且重復的抗原陣列本文所用的術語“有序且重復的抗原陣列”通常是指抗原的重復模式，或者其特征在于抗原相對于病毒樣顆粒的空間排列具有典型且優(yōu)選地高度均一性的結構。在本發(fā)明的一個實施方案中，這種重復模式可以是幾何模式。本發(fā)明的某些實施方案，例如與RNA噬菌體的VLP偶聯(lián)的抗原，是合適的有序且重復的抗原陣列的典型且優(yōu) 選的實例，而且其優(yōu)選地具有嚴格重復的類晶體抗原排列，優(yōu)選間隔1-30納米，優(yōu)選2-15 納米，更優(yōu)選2-10納米，更優(yōu)選2-8納米，進一步更優(yōu)選1. 6-7納米。IL-I分子本文使用的術語“IL-1分子”或簡寫“IL-1”是指任何多肽，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與選自SEQ ID N0:36至SEQ ID NO :116、SEQ ID N0:130至SEQ IDNO: 140和SEQ ID NO: 163至SEQ ID NO 165的任一種序列具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。本文使用的術語“IL-1分子”優(yōu)選地是指任何IL-I蛋白、IL-I片段、IL-I成熟片段、IL-I肽或IL-I突變蛋白，其包含一種多肽或者由該多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與選自SEQ ID N0:36至SEQ ID NO :116、SEQ ID NO 130 至 SEQ ID NO 140 和 SEQ ID NO 163 至 SEQ ID NO 165 的任一種序列具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100% 的序列同一性。本文使用的術語IL-I分子典型且優(yōu)選地還指任何動物種的IL-I蛋白的直向同源物。IL-I分子優(yōu)選地但不是必須地能夠與IL-I受體結合并且進一步優(yōu)選地具有生物活性。IL-I α分子本文使用的術語“IL-1 α分子”或簡寫“IL-1 α ”是指IL-1 α蛋白、 IL-Ia片段、IL-I α成熟片段、IL-Ia肽或IL_1 α突變蛋白，其包含一種多肽或者由該多肽組成，其中該多肽的氨基酸序列顯示與選自SEQ ID N0:36至48、SEQ ID NO 63, SEQ ID NO :65、SEQ ID NO 67 至 SEQ ID NO 88 和 SEQ ID NO 163 的任一種序列具有至少 80%、優(yōu) 選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。IL-Ia的一種特別優(yōu)選的實施方案是人IL-I a 119-271 (SEQ ID NO 63)。IL-I β分子本文使用的術語“IL-1 β分子”或簡寫“IL-1 β ”是指IL-1 β蛋白、 IL-I β片段、IL-I β成熟片段、IL-I β肽或IL-I β突變蛋白，其包含一種多肽或者由該多肽組成，其中該多肽的氨基酸序列顯示與選自SEQ ID Ν0:49至SEQ ID NO 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO 89 至 SEQ ID NO :116、SEQ ID NO 130 至 SEQ ID NO :140、 SEQ ID N0:164和SEQ ID NO :165的任一種序列具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。IL-I β的一種特別優(yōu)選的實施方案是人 IL-I β 117-269 (SEQ ID NO :64)。IL-I蛋白本文使用的術語“IL-1蛋白”是指一種天然存在的蛋白質，其中所述天然存在的蛋白質的氨基酸序列顯示與SEQ ID Ν0:36至SEQ ID NO :62的任一種序列具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性；或者其中所述天然存在的蛋白質能夠與IL-I受體結合，優(yōu)選地具有生物活性。本文使用的術語“IL-1蛋白”優(yōu)選地是指一種天然存在的蛋白質，其中所述天然存在的蛋白質的氨基酸序列顯示與SEQ ID Ν0:36至SEQ IDNO :62的任一種序列具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性；并且其中所述天然存在的蛋白質能夠與IL-I受體結合，優(yōu)選地具有生物活性。典型且優(yōu)選地，本文使用的術語“IL-I蛋白”是指至少一種天然存在的蛋白質，其中所述蛋白質能夠與IL-I受體結合，并且具有生物活性，其中進一步地所述蛋白質包含一種多肽或由該多肽組成，所述多肽的氨基酸序列顯示與SEQ ID NO 36至SEQ ID NO 62的任一種序列具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。相應地，術語“ IL-I α蛋白”涉及包含一種多肽或者由該多肽組成的IL-I蛋白，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與SEQ ID NO 36至SEQ ID NO 48的任一種具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性，而術語“IL-1 β蛋白”涉及包含一種多肽或者由該多肽組成的IL-I蛋白，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與SEQ ID NO 49至SEQ ID NO 62 的任一種具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。IL-I片段本文使用的術語“ IL-I片段”涉及含有IL-I蛋白的連續(xù)序列段的多肽，其中所述多肽的長度為至少50個、優(yōu)選至少100個、最優(yōu)選至少150個氨基酸。典型且優(yōu) 選地，所述IL-I片段的長度最多為300個、更優(yōu)選最多250個、最優(yōu)選最多200個氨基酸。典型且優(yōu)選地，IL-I片段能夠與IL-I受體結合，進一步優(yōu)選地具有生物活性。相應地，術語“IL-la片段”和“IL-Ιβ片段”涉及如上定義的IL-I片段，其中所述IL-I蛋白分別是 IL-Ia蛋白或IL-I β蛋白。IL-I成熟片段本文使用的術語“ IL-I成熟片段”涉及IL-I片段，其中所述IL-I 片段是IL-I蛋白的天然存在的成熟產物。相應地，本文使用的術語“IL-I α成熟片段”和 "IL-I β成熟片段”涉及如上定義的IL-I成熟片段，其中所述IL-I蛋白分別是IL-I α蛋白或IL-I β蛋白。IL-Ia成熟片段的優(yōu)選實施方案是SEQ ID NO 63、SEQ ID NO :65和 SEQ ID N0:163。IL-1 β 成熟片段的優(yōu)選實施方案是 SEQ ID NO 64、SEQ ID NO 66、SEQ ID N0:130、SEQ ID N0:164 禾口 SEQ ID N0:165。優(yōu)選的IL-I α成熟片段包含選自下組的氨基酸序列或者優(yōu)選地由所述氨基酸序列組成(a)人 IL-I α 119-271 (SEQ ID NO 63) ； (b)小鼠 IL-1 α 117-270 (SEQ ID NO 65)； (c)小鼠 IL-I α 117-270 (SEQ ID NO 163)；禾口 (e)與 SEQ ID NO :63、SEQ ID NO 65 和 SEQ ID NO 163任一種至少80%、或優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、或最優(yōu)選至少99%相同
的氨基酸序列。優(yōu)選的IL-I β成熟片段包含選自下組的氨基酸序列或者優(yōu)選地由所述氨基酸序列組成(a)人 IL-I β 117-269 (SEQ ID NO 64) ； (b)人 IL-1 β 116-269 (SEQ ID NO 165)； (c)小鼠 IL-I β 119-269 (SEQ ID NO 66) ； (d)小鼠 IL-1 β 119-269 (SEQ ID NO : 164)；禾口 (e)與 SEQ ID NO 64,SEQ ID NO :66、SEQ ID N0:164 禾口 SEQ ID NO : 165 任一種至少 80%、或優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、或最優(yōu)選至少99%相同的氨基酸序列。IL-I肽本文使用的術語“IL-I肽”涉及一種含有天然存在的蛋白質的連續(xù)序列段的多肽，其中所述蛋白質能夠與IL-I受體結合，并且優(yōu)選地具有生物活性，其中所述多肽的長度為4-49個，優(yōu)選6至35個，最優(yōu)選10至25個氨基酸。IL-I肽可以，但是一般不能夠結合IL-I受體，典型地沒有生物活性。相應地，本文使用的術語“IL-I α肽”和“IL-Ιβ 肽”涉及如上定義的IL-I肽，其中所述天然存在的蛋白質分別是IL-I α蛋白或IL-I β蛋白。優(yōu)選的 IL-I 肽是 SEQ ID NO 82 至 SEQ ID NO 116。IL-I突變蛋白本文使用的術語“IL-1突變蛋白”包含由IL-I分子、優(yōu)選地由 IL-Ia或IL-I β蛋白、IL-Ia或IL-1 β片段、IL-Ia或IL-1 β成熟片段或IL-Ia或 IL-I β肽衍生的任何多肽，或者優(yōu)選地由所述多肽組成，其中優(yōu)選地所述多肽顯示比衍生出它的IL-I分子降低的生物活性。相應地，IL-Ia突變蛋白和IL-Ιβ突變蛋白是以上定義的IL-I突變蛋白，其中所述多肽分別衍生自IL-Ia分子或IL-Ιβ分子。非常優(yōu)選的 IL-I β突變蛋白是衍生自IL-I β成熟片段、優(yōu)選地衍生自人IL-li3117_269 (SEQ ID NO 64) 的IL-I β突變蛋白。非常優(yōu)選的IL-I α突變蛋白衍生自IL-Ia成熟片段、優(yōu)選地衍生自人 IL-I α 119_271 (SEQ ID NO 63)。在優(yōu)選的IL-I突變蛋白中，所述生物活性低于衍生出它的IL-I分子的生物活性的80 %，更優(yōu)選低于60 %，更優(yōu)選低于40 %，更優(yōu)選低于20 %，其中進一步優(yōu)選地所述生物活性是根據所述IL-I突變蛋白在人PBMC中誘導IL-6的能力來確定的，其中最優(yōu)選地所述生物活性基本如實施例8B所述確定。在優(yōu)選的IL-I β突變蛋白中，所述生物活性低于衍生出它的IL-I β分子的生物活性的80%，更優(yōu)選低于60%，更優(yōu)選低于40%，更優(yōu)選低于20%，其中優(yōu)選地所述IL-I β 分子是IL-I β成熟片段，優(yōu)選為人IL-li3117_269 (SEQ ID NO :64)，并且其中進一步優(yōu)選地所述生物活性是根據所述IL-I β突變蛋白在人PBMC中誘導IL-6的能力來確定的，其中最優(yōu) 選地所述生物活性基本如實施例8Β所述確定。在優(yōu)選的IL-I α突變蛋白中，所述生物活性低于衍生出它的IL_1 α分子的生物活性的80%，更優(yōu)選低于60%，更優(yōu)選低于40%，更優(yōu)選低于20%，其中優(yōu)選地所述IL-I α 分子是IL-I α成熟片段，優(yōu)選為人IL-la119_271(SEQ ID NO :63)，并且其中進一步優(yōu)選地所述生物活性是根據所述IL-I α突變蛋白在人PBMC中誘導IL-6的能力來確定的，其中最優(yōu) 選地所述生物活性基本如實施例11所述確定。進一步優(yōu)選的IL-I突變蛋白衍生自IL-I成熟片段，其中所述IL-I突變蛋白的生物活性低于衍生所述IL-I突變蛋白的IL-I成熟片段的生物活性的80%，更優(yōu)選低于 60 %，更優(yōu)選低于40 %，更優(yōu)選低于20 %。非常優(yōu)選的IL-I突變蛋白不顯示生物活性，其中優(yōu)選地所述生物活性基本如實施例8Β或11所述確定。進一步優(yōu)選地，但不是必須地，IL-I突變蛋白能夠特異性結合IL-I受體。包含優(yōu)選的IL-I突變蛋白作為唯一抗原的組合物誘導能夠特異性結合衍生所述 IL-I突變蛋白的IL-I分子的抗體效價，其中所述效價為使用包含衍生所述IL-I突變蛋白的IL-I分子作為唯一抗原的組合物獲得的效價的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少 60%，再更優(yōu)選至少80%，最優(yōu)選至少100%，其中優(yōu)選地所述效價基本如實施例9D所述確定。當引入動物時，包含優(yōu)選的IL-Ιβ突變蛋白作為唯一抗原的組合物誘導能夠特異性結合衍生所述IL-Ιβ突變蛋白的IL-Ιβ分子的抗體效價，其中優(yōu)選地所述IL-I β 分子為IL-I β成熟片段，最優(yōu)選為人IL-I β 117_269 (SEQ ID NO :64)，其中所述效價為使用包含衍生所述IL-I β突變蛋白的IL-I β分子、優(yōu)選所述IL-I β成熟片段、最優(yōu)選所述人IL-li3117_269 (SEQ ID NO 64)作為唯一抗原的組合物獲得的效價的至少20%，優(yōu)選至少 40 %，更優(yōu)選至少60 %，再更優(yōu)選至少80 %，最優(yōu)選至少100 %，其中進一步優(yōu)選地所述效價基本如實施例9D所述確定。當引入動物時，包含優(yōu)選的IL-Ia突變蛋白作為唯一抗原的組合物誘導能夠特異性結合衍生所述IL-I α突變蛋白的IL-Ia分子的抗體效價，其中優(yōu)選地所述IL-I α 分子為IL-Ia成熟片段，最優(yōu)選為人IL-I α 119_271 (SEQ ID NO :63)，其中所述效價為使用包含衍生所述IL-I α突變蛋白的IL-Ia分子、優(yōu)選所述IL-I α成熟片段、最優(yōu)選所述人IL-I α 119_271 (SEQ ID NO 63)作為唯一抗原的組合物獲得的效價的至少20%，優(yōu)選至少 40 %，更優(yōu)選至少60 %，再更優(yōu)選至少80 %，最優(yōu)選至少100 %，其中進一步優(yōu)選地所述效價基本如實施例9D所述確定。一種非常優(yōu)選的IL-I突變蛋白是這樣一種IL-I突變蛋白，其中所述生物活性為衍生它的IL-I分子的生物活性的不到80%，更優(yōu)選不到60%，更優(yōu)選不到40%，更優(yōu)選不到20%，其中進一步優(yōu)選地所述生物活性是根據所述IL-I突變蛋白在人PBMC中誘導IL-6的能力來確定的，其中最優(yōu)選地所述生物活性基本如實施例8B所述確定，并且其中另外，包含優(yōu)選的IL-I突變蛋白作為唯一抗原的組合物誘導能夠特異性結合衍生所述非常優(yōu)選的IL-I突變蛋白的IL-I分子的抗體效價，其中所述效價為使用包含衍生所述非常優(yōu)選的 IL-I突變蛋白的IL-I分子作為唯一抗原的組合物獲得的效價的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少60%，再更優(yōu)選至少80%，最優(yōu)選至少100%，其中優(yōu)選地所述效價基本如實施例9D所述確定。非常優(yōu)選的是衍生自以下的IL-I突變蛋白(i)IL_l蛋白，優(yōu)選來自SEQ ID NO 36至SEQ ID N0:62;或(ii)更優(yōu)選IL-1成熟片段，優(yōu)選來自SEQ ID N0:63至SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 130 禾口 SEQ ID NO: 163 至 SEQ ID NO: 165 中的任一種。在本發(fā)明上下文中有用的IL-I突變蛋白已經在以下文獻中描述=Kamogashira 等人(1988) J. Biochem. 104 :837_840 ；Gehrke 等人(1990) The Journal of Biological Chemistry 265 (11) :5922_5925 ;Conca 等人(1991)The Journal of Biological Chemistry 266(25) :16265_16268 ;Ju 等人(1991)PNAS 88 2658-2662 ；Auron 等人 (1992)Biochemistry 31 :6632_6638 ；Guinet 等人(1993)Eur. J. Biochem 211 :583_590 ； Camacho(1993)Biochemistry 32 8749-8757 ；Baumann (1993)Journal of Recepror Research 13(1-4) 245~262 ；Simon(1993)The Journal of Biological Chemistry 268(13) :9771-9779 ；和 Simoncsits (1994) Cytokine 6(2) :206_214，它們的公開內容通過參考引入本文。優(yōu)選的IL-I突變蛋白包含一種多肽或者優(yōu)選地由該多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列與IL-I蛋白、IL-I片段、IL-I成熟片段或IL-I肽的氨基酸序列有1至10個、優(yōu)選1至6個，更優(yōu)選1至5個，更優(yōu)選1至4個，更優(yōu)選1至3個，更優(yōu)選1至2個，最優(yōu) 選正好1個氨基酸殘基不同，其中優(yōu)選地所述氨基酸殘基(i)從所述多肽上刪除，(ii)插入所述多肽內，(iii)更換為另外一種氨基酸殘基，或者(iv) (i)至(iii)的任意組合。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述氨基酸殘基在一個連續(xù)序列段中。進一步優(yōu)選的IL-I突變蛋白包含一種多肽或者優(yōu)選地由該多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列與IL-I蛋白、IL-I 片段、或IL-I成熟片段(優(yōu)選IL-I成熟片段)的氨基酸序列有1至10個、優(yōu)選1至6個，更優(yōu)選1至5個，更優(yōu)選1至4個，更優(yōu)選1至3個，更優(yōu)選1至2個，最優(yōu)選正好1個氨基酸殘基不同，其中優(yōu)選地所述氨基酸殘基(i)從所述多肽上刪除，( )插入所述多肽內，
(iii)更換為另外一種氨基酸殘基，或者(iv)(i)至(iii)的任意組合。進一步優(yōu)選的IL-I突變蛋白包含一種多肽或者更優(yōu)選地由該多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列與選自SEQ ID N0:36至SEQ ID NO 48和SEQ ID NO 49至SEQ ID NO 62的氨基酸序列有1至10個、優(yōu)選1至6個，更優(yōu)選1至5個，更優(yōu)選1至4個，更優(yōu) 選1至3個，更優(yōu)選1至2個，最優(yōu)選正好1個氨基酸殘基不同，其中優(yōu)選地所述氨基酸殘基(i)從所述多肽上刪除，(ii)插入所述多肽內，(iii)更換為另外一種氨基酸殘基，或者
(iv)(i)至(iii)的任意組合。進一步優(yōu)選的IL-I突變蛋白包含一種多肽或者更優(yōu)選地由該多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列與選自以下序列的氨基酸序列有1至10個、優(yōu)選1 至6個，更優(yōu)選1至5個，更優(yōu)選1至4個，更優(yōu)選1至3個，更優(yōu)選1至2個，最優(yōu)選正好1 個氨基酸殘基不同(i)SEQ ID NO :63、SEQ ID NO 65和SEQ ID NO 163中的任一種，最優(yōu) 選 SEQ ID NO :63 ；或(ii)SEQ ID NO 64、SEQ ID NO 66、SEQ ID N0:130、SEQ ID NO 164和SEQ ID NO: 165中的任一種，最優(yōu)選SEQ ID NO :64，其中優(yōu)選地所述氨基酸殘基(i)從所述多肽上刪除，(ii)插入所述多肽內，(iii)更換為另外一種氨基酸殘基，或者(iv)(i) 至(iii)的任意組合。進一步優(yōu)選的IL-I突變蛋白是IL-I α突變蛋白，其中所述IL_1 α突變蛋白包含一種多肽或者更優(yōu)選地由該多肽組成，所述多肽的氨基酸序列與選自SEQ ID Ν0:36至SEQ ID NO 48的氨基酸序列有1至6個，優(yōu)選1至5個，更優(yōu)選1至4個，更優(yōu)選1至3個，更優(yōu) 選1至2個，最優(yōu)選正好1個氨基酸殘基不同，其中優(yōu)選地所述氨基酸殘基(i)從所述多肽上刪除，(ii)插入所述多肽內，(iii)更換為另外一種氨基酸殘基，或者(iv)⑴至(iii) 的任意組合。進一步優(yōu)選的IL-I α突變蛋白包含一種多肽或者優(yōu)選地由該多肽組成，所述多肽的氨基酸序列與選自SEQ ID NO 63,SEQ ID NO :65禾P SEQ ID NO :163，最優(yōu)選SEQ ID NO 63的氨基酸序列有1至6個，優(yōu)選1至5個，更優(yōu)選1至4個，更優(yōu)選1至3個，更優(yōu)選 1至2個，最優(yōu)選正好1個氨基酸殘基不同，其中優(yōu)選地所述氨基酸殘基(i)從所述多肽上刪除，( )插入所述多肽內，(iii)更換為另外一種氨基酸殘基，或者(iv) (i)至(iii)的任意組合。非常優(yōu)選的IL-Ia突變蛋白包含一種多肽或者優(yōu)選地由該多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO 63的氨基酸序列有1至10個、優(yōu)選1至6個，更優(yōu)選1至 5個，更優(yōu)選1至4個，更優(yōu)選1至3個，更優(yōu)選1至2個，最優(yōu)選正好1個氨基酸殘基不同，其中優(yōu)選地所述氨基酸殘基(i)從所述多肽上刪除，(ii)插入所述多肽內，(iii)更換為另外一種氨基酸殘基，或者(iv) (i)至(iii)的任意組合。再更優(yōu)選的IL-I α突變蛋白包含一種多肽或者優(yōu)選地由該多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列選自SEQ ID Ν0:210至 SEQ ID NO :218ο進一步優(yōu)選的IL-I突變蛋白是IL-I β突變蛋白，其中所述IL_1 β突變蛋白包含一種多肽或者更優(yōu)選地由該多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列與選自SEQ ID Ν0:49 至SEQ ID NO 62的氨基酸序列有1至6個，優(yōu)選1至5個，更優(yōu)選1至4個，更優(yōu)選1至3 個，更優(yōu)選1至2個，最優(yōu)選正好1個氨基酸殘基不同，其中優(yōu)選地所述氨基酸殘基(i)從所述多肽上刪除，(ii)插入所述多肽內，(iii)更換為另外一種氨基酸殘基，或者(iv)(i) 至(iii)的任意組合。進一步優(yōu)選的IL-I β突變蛋白包含一種多肽或者優(yōu)選地由該多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列與選自SEQ ID NO 64,SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 130、SEQ ID NO: 164和SEQ ID NO 165，最優(yōu)選SEQ ID NO :64的氨基酸序列有1至6個，優(yōu)選1至5 個，更優(yōu)選1至4個，更優(yōu)選1至3個，更優(yōu)選1至2個，最優(yōu)選正好1個氨基酸殘基不同，其中優(yōu)選地所述氨基酸殘基(i)從所述多肽上刪除，( )插入所述多肽內，(iii)更換為另外一種氨基酸殘基，或者(iv) (i)至(iii)的任意組合。非常優(yōu)選的IL-I β突變蛋白包含一種多肽或者優(yōu)選地由該多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID Ν0:64的氨基酸序列有1至10個，優(yōu)選1至6個，優(yōu)選1至5個，更優(yōu)選1至4個，更優(yōu)選1至3個，更優(yōu)選 1至2個，最優(yōu)選正好1個氨基酸殘基不同，其中優(yōu)選地所述氨基酸殘基(i)從所述多肽上刪除，( )插入所述多肽內，(iii)更換為另外一種氨基酸殘基，或者(iv) (i)至(iii)的任意組合。更優(yōu)選的IL-I β突變蛋白包含一種多肽或者優(yōu)選地由該多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列選自 SEQ ID NO 131 至 SEQ ID NO 140 和 SEQ ID NO 205 至 SEQ ID NO 209。
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“衍生自”在本發(fā)明的上下文中，“衍生自”另一氨基酸序列的氨基酸序列這一表述的意思是除了某些突變以外，所述氨基酸序列與衍生它的氨基酸序列基本上相同，其中所述突變選自⑴氨基酸更換，( )缺失，(iii)插入，和(iv)⑴至(iii)的任意組合，其中優(yōu)選地所述突變選自(i)氨基酸更換，和(ii)缺失。特別是，衍生自野生型氨基酸序列的突變的氨基酸序列優(yōu)選地與野生型氨基酸序列有1至10個，優(yōu)選1至6個，優(yōu)選1至5個，更優(yōu)選1至4個，更優(yōu)選1至3個，更優(yōu)選1至2個，最優(yōu)選正好1個氨基酸殘基不同，其中優(yōu) 選地所述氨基酸殘基(i)更換為另外一種氨基酸，( )從所述野生型氨基酸上刪除，(iii) 插入所述野生型序列內，和(iv) (i)至(iii)的任意組合，其中最優(yōu)選地所述氨基酸殘基 (i)更換為另外一種氨基酸，或(ii)從所述野生型氨基酸上刪除。一個以上氨基酸殘基的刪除優(yōu)選地作為所述野生型氨基酸序列的氨基酸殘基的連續(xù)序列段的缺失而發(fā)生。衍生自野生型氨基酸序列的突變的氨基酸序列優(yōu)選地具有與所述野生型氨基酸序列至少90 %、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，最優(yōu)選至少 99%的序列同一性。類似地，“衍生自IL-I分子的突變蛋白”這一表述是指一種突變蛋白，其中所述突變蛋白包含或優(yōu)選地由一種多肽組成，其中除了某些突變以外，所述多肽的氨基酸序列與衍生它的IL-I分子的氨基酸序列基本上相同，其中所述突變選自(i)氨基酸更換，(ii)缺失，(iii)插入，和(iv) (i)至(iii)的任意組合，其中優(yōu)選地所述突變選自(i)氨基酸更換，和(ii)缺失。特別是，衍生自IL-I分子的IL-I突變蛋白與所述IL-I分子有1至10 個，優(yōu)選1至6個，優(yōu)選1至5個，更優(yōu)選1至4個，更優(yōu)選1至3個，更優(yōu)選1至2個，最優(yōu) 選正好1個氨基酸殘基不同，其中優(yōu)選地所述氨基酸殘基(i)更換為另外一種氨基酸，( ) 從所述野生型氨基酸上刪除，(iii)插入所述野生型序列內，和(iv) (i)至(iii)的任意組合，其中最優(yōu)選地所述氨基酸殘基(i)更換為另外一種氨基酸，或(ii)從所述野生型氨基酸上刪除。一個以上氨基酸殘基的刪除優(yōu)選地作為衍生所述IL-I突變蛋白的IL-I分子的氨基酸殘基的連續(xù)序列段的缺失而發(fā)生。衍生自野生型氨基酸序列的突變蛋白優(yōu)選地具有與衍生所述IL-I突變蛋白的IL-I分子至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%，最優(yōu)選至少99%的序列同一性。氨基酸更換氨基酸更換這一表述是指氨基酸序列特定位點的氨基酸殘基被更換為任何其它氨基酸殘基。IL-I的促動效應/生物活性本文用于IL-I的術語“生物活性”或“生物活性的”是指IL-I分子在給動物全身施用后誘導IL-6產生的能力，優(yōu)選地如實施例 2E和實施例3E所述。IL-I分子的生物活性也指誘導胸腺細胞(Epps等人，Cytokine 9(3) 149-156 (1997) )、D10. G4. IT 輔助細胞(Orencole 和 Dinarello，Cytokine 1(1) 14-22(1989))增殖的能力，或誘導 MG64 或 HaCaT 細胞(Boraschi 等人，J. Immunol. 155 4719-4725(1995))或成纖維細胞(Dinarello 等人，Current Protocols in Immunology 6. 2. 1-6-2-7(2000))產生IL-6的能力，或者誘導EL-4胸腺瘤細胞產生IL-2 (Simon等人， J. Immunol. Methods 84(1-2) =85-94(1985))的能力，或者抑制人骨髓瘤細胞系A375生長的能力(Nakai 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 154 1189-1196 (1988))。非常優(yōu)選地，術語IL-I分子或IL-I突變蛋白的生物活性是指包含所述IL-I分子或所述IL-I突變蛋白的IL-I組合物在人PBMC中誘導IL-I的能力，其中優(yōu)選地所述IL-I分子或所述IL-I突變蛋白是所述IL-I組合物中的唯一抗原，并且其中最優(yōu)選地所述生物活性基本如實施例8B所述測定。包裝的本文所用的術語“包裝的”是指聚陰離子大分子或免疫刺激物相對于VLP 的狀態(tài)。本文所用的術語“包裝”包括結合，該結合可以是共價的，例如化學偶聯(lián)，也可以是非共價的，例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等。在優(yōu)選實施方案中，術語“包裝的” 是指VLP對聚陰離子大分子的包封或部分包封。因此，聚陰離子大分子或免疫刺激物可以被VLP包封，而不需要存在實際上的結合，特別是共價結合。在優(yōu)選的實施方案中，至少一個聚陰離子大分子或免疫刺激物被包裝在VLP內，最優(yōu)選地以非共價的方式包裝。向VLP 內，特別是向RNA噬菌體的VLP內包裝聚陰離子大分子如聚谷氨酸的方法在W02006/037787 中公開。尤其參考W02006/037787的實施例4。向VLP內包裝免疫刺激物，優(yōu)選免疫刺激性核酸，最優(yōu)選含非甲基化CpG的寡核苷酸的方法在W02003/024481A2中描述。在所述免疫刺激物是核酸，優(yōu)選為DNA，最優(yōu)選為含非甲基化CpG的寡核苷酸的情況中，術語包裝的含意是所述核酸對于核酸酶水解而言是不可及的，優(yōu)選地對于DNAse水解(例如DNAseI或 Benzonase)是不可及的，其中優(yōu)選地所述可及性如W02003/024481A2的實施例11-17所述測定。聚陰離子大分子如此處所用的術語“聚陰離子大分子”是指包含重復負電荷基團的高相對分子量的分子，其結構基本包括實際上或概念上來源于低相對分子量的分子的多個重復單位。如此處所用的術語“聚陰離子大分子”是指不能活化toll-樣受體的分子。因此術語“聚陰離子大分子”不包括Toll-樣受體配體，并且不包括能夠誘導和/或增強免疫應答的物質，如Toll-樣受體配體，能夠誘導和/或增強免疫應答的核酸，和脂多糖(LPS)。更優(yōu)選地，如此處所用的術語“聚陰離子大分子”是指不能誘導細胞因子產生的分子。優(yōu)選地，聚陰離子大分子是聚陰離子多肽或陰離子葡聚糖。在一個優(yōu)選實施方案中，所述聚陰離子大分子是聚陰離子多肽，其中優(yōu)選地所述聚陰離子多肽選自(a)聚谷氨酸；(b)聚天冬氨酸；(c)聚(GluAsp)；和(d) (a)-(c)的任何化學修飾?；瘜W修飾的例子包括但不限于糖基化、乙?；土姿峄?。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述聚陰離子大分子是陰離子葡聚糖，選自(a)硫酸葡聚糖；(b)羧甲基葡聚糖；(c)磺丙基葡聚糖；⑷磺酸甲酯葡聚糖；和 (e)磷酸葡聚糖。聚天冬氨酸如此處所用的術語“聚天冬氨酸”是指一種多肽，在組成所述多肽的氨基酸殘基總數中包含至少50 %，優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu) 選至少99%，更優(yōu)選100%的天冬氨酸殘基。所述多肽的天冬氨酸殘基是全L型或全D型或L-和D-天冬氨酸的混合物。最優(yōu)選地，所述多肽僅包含L-天冬氨酸殘基。聚谷氨酸如此處所用的術語“聚谷氨酸”是指一種多肽，在組成所述多肽的氨基酸殘基總數中包含至少50 %，優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少99%，最優(yōu)選100%的谷氨酸殘基。所述多肽的谷氨酸殘基是全L型、全D型或L-和 D-谷氨酸的混合物。最優(yōu)選地，所述多肽僅包含L-谷氨酸殘基。聚(GluAsp)如此處所用的術語“聚(GluAsp)”是指一種多肽，在組成所述多肽的氨基酸殘基總數中包含至少50 %，優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少90 %，或更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少99%，最優(yōu)選100%的谷氨酸殘基和天冬氨酸殘基。所述多肽的谷氨酸分子和天冬氨酸分子是全L型或全D型或其混合物。最優(yōu)選地，所述多肽僅包含L-谷氨酸殘基和 L-天冬氨酸殘基。
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多肽如此處所用的術語“多肽”是指由單體(氨基酸)通過酰胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接組成的分子。它是指氨基酸分子鏈，而不是指特定長度的產物。因此，多肽的定義內包括肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白質。該術語也包括多肽的翻譯后修飾，例如糖基化、
乙?；?、磷酸化等。多肽的氨基酸序列同一性可以使用諸如Bestfit程序等已知計算機程序常規(guī)確定。當使用Bestfit或其它任何序列比對程序、優(yōu)選使用Bestfit來確定一種特定序列與參照氨基酸序列是否例如95%相同時，將參數設置為使得在參照氨基酸序列的全長上計算同一性百分比，并且允許最多占參照序列中氨基酸殘基總數的5%的同源性缺口。上述測定多肽之間百分同一性的方法適用于本發(fā)明公開的所有蛋白質、多肽或其片段。重組VLP 本文使用的術語“重組VLP”是指通過包括至少一個重組DNA技術步驟的方法獲得的VLP。病毒顆粒本文使用的術語“病毒顆粒”是指病毒的形態(tài)學形式。在某些病毒類型中，它包含由蛋白質衣殼圍繞的基因組；另外一些具有額外的結構(例如被膜、尾等)。本文使用的病毒樣顆粒(VLP)是指非復制性或非傳染性的、優(yōu)選非復制性且非傳染性的病毒顆粒，或者是指非復制性或非傳染性的、優(yōu)選非復制性且非傳染性的類似于病毒顆粒、優(yōu)選病毒衣殼的結構。本文使用的術語“非復制性”是指不能復制VLP所含的基因組。本文使用的術語“非傳染性”是指不能進入宿主細胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的病毒樣顆粒是非復制性和/或非傳染性的，因為它缺乏全部或部分的病毒基因組或基因組功能。在一個實施方案中，病毒樣顆粒是其中病毒基因組已經被物理或化學滅活的病毒顆粒。典型且更優(yōu)選地，病毒樣顆粒缺少病毒基因組的全部或部分復制性和傳染性部分。本發(fā)明的病毒樣顆?？赡芎信c其基因組不同的核酸。本發(fā)明的病毒樣顆粒的一個典型且優(yōu)選的實施方案是病毒衣殼，如相應病毒、噬菌體、優(yōu)選RNA噬菌體的病毒衣殼。術語“病毒衣殼”或“衣殼” 是指由病毒蛋白質亞單位組成的大分子裝配體。典型地，有60、120、180、240、300、360個和 360個以上的病毒蛋白亞單位。典型且優(yōu)選地，這些亞單位的相互作用導致形成具有固有的重復組織的病毒衣殼或病毒衣殼樣結構，其中所述結構一般是球形或管狀。例如，RNA噬菌體或HBcAg的衣殼具有二十面體對稱的球形形式。本文使用的術語“衣殼樣結構”是指由病毒蛋白亞單位組成的大分子裝配體，其類似于上述定義的衣殼形態(tài)，但是不同于典型的對稱裝配體，同時保持足夠程度的順序和重復性。病毒顆粒和病毒樣顆粒的一個共同特征是其亞單位高度有序且重復的排列。RNA噬菌體的病毒樣顆粒本文使用的術語“RNA噬菌體的病毒樣顆?！笔侵赴?RNA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段、或者優(yōu)選地基本由其組成、或者由其組成的病毒樣顆粒。另外，RNA噬菌體的病毒樣顆粒類似于RNA噬菌體的結構。而且，RNA噬菌體的病毒樣顆粒是非復制性或非傳染性的。典型且優(yōu)選地，RNA噬菌體的病毒樣顆粒缺少至少一個編碼RNA噬菌體的復制機制的基因，優(yōu)選全部基因。進一步優(yōu)選地，RNA噬菌體的病毒樣顆粒缺少編碼負責病毒附著或進入宿主的一種或多種蛋白質的一種或多種基因。然而，該定義也包括上述基因仍然存在但是無活性的RNA噬菌體的病毒樣顆粒，這樣也可產生非復制性和/或非傳染性的RNA噬菌體的病毒樣顆粒。優(yōu)選的來源于RNA噬菌體的VLP表現為二十面體對稱，并且由180個亞單位(單體)組成。使RNA噬菌體的病毒樣顆粒成為非復制性和/或非傳染性的優(yōu)選方法是通過物理、化學滅活，如紫外線照射、甲醛處理，一般且優(yōu)選地是通過遺傳操作?！N或一個術語“一種”或“一個”在本申請中使用時，除非另外說明，是指“至少一種(個)”或“一種(個)或一種(個)以上”。糖尿病術語糖尿病是指任何類型的糖尿病。優(yōu)選地，糖尿病是指I型糖尿病和/ 或II型糖尿病。最優(yōu)選地，糖尿病是指II型糖尿病。此處所述的組合物能夠在動物或人中誘導或增強針對IL-I的免疫應答。已經驚奇地發(fā)現，在雄性C57BL/6小時中使用IL-I分子免疫，即使用IL-I α分子或使用IL-I β 分子或使用這兩者的組合免疫，導致飲食誘導的糖尿病表型明顯好轉。因此，本發(fā)明提供一種用于治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的組合物，其中所述組合物包含(a)具有至少一個第一附著位點的核心顆粒，其中所述核心顆粒是病毒樣顆粒(VLP)或病毒顆粒，優(yōu)選為病毒樣顆粒；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原，其中所述至少一種抗原包含IL-I分子或由IL-I分子組成，該IL-I分子優(yōu) 選地選自IL-I蛋白、IL-I成熟片段、IL-I肽和IL-I突變蛋白，其中(a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點共價連接。在一個優(yōu)選實施方案中，所述組合物包含(a)具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原包含IL-I分子，并且其中(a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原包含或優(yōu)選地由(i) IL-I分子和(ii)接頭組成，其中優(yōu)選地所述接頭包含或優(yōu)選地由所述第二附著位點組成。優(yōu)選地，所述IL-I分子連接到核心顆粒上，從而形成有序且重復的抗原-VLP陣列。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，至少20個，優(yōu)選至少30個，更優(yōu)選至少60個，更優(yōu)選至少120個，進一步更優(yōu)選至少180個IL-I分子連接到核心顆粒上?？梢赃x擇本領域公知的任何具有有序且重復的結構的病毒作為本發(fā)明的VLP或病毒顆粒。其外殼或衣殼蛋白能夠用于制備VLP的示例性的DNA或RNA病毒已經在WO 2004/009124的第25頁第10-21行，第26頁第11-28行，和第28頁第4行到第31頁第4 行公開。這些公開的內容通過參考并入本文。病毒顆?；虿《緲宇w?？梢詮牟《靖腥镜募毎囵B(yǎng)物中產生和純化。獲得的用于疫苗目的的病毒顆粒或病毒樣顆粒優(yōu)選地是非復制性或非傳染性的，更優(yōu)選地是非復制性且非傳染性的。紫外線照射、化學處理，如甲醛或氯仿處理，是本領域公知的滅活病毒的常用方法。在一個優(yōu)選實施方案中，核心顆粒是病毒顆粒，其中優(yōu)選地所述病毒顆粒是噬菌體，其中進一步優(yōu)選地所述噬菌體是RNA噬菌體，其中進一步優(yōu)選地所述RNA噬菌體是選自 Q β、fr、GA 或 AP205 的 RNA 噬菌體。在一個優(yōu)選實施方案中，核心顆粒是VLP。在進一步優(yōu)選的實施方案中，VLP是重組VLP。幾乎所有公知的病毒都已經被測序，并且可以容易地被公眾獲得。本領域技術人員能夠容易地確定編碼外殼蛋白的基因。通過在宿主中重組表達外殼蛋白制備VLP是本領域技術人員公知的常識。在一個優(yōu)選實施方案中，病毒樣顆粒包含或者由選自下組的病毒的重組蛋白、其突變體或片段組成(a) RNA噬菌體；(b)噬菌體；(c)乙型肝炎病毒，優(yōu)選其衣殼蛋白 (Ulrich 等人，Virus Res. 50 141-182 (1998))或其表面蛋白(W0 92/11291) ； (d)麻疹病毒(Warnes等人，Gene 160:173-178(1995)) ； (e)辛德畢斯病毒；(f)輪狀病毒(US 5，071,651 和 US 5,374,426) ； (g) 口蹄疫病毒(Twomey 等人，Vaccine 13:1603-1610， (1995)) ； (h)諾沃克病毒(Jiang, X.等人，Science 250 1580-1583 (1990) ；Matsui， S.M.等人，J.Clin. Invest. 87 1456-1461 (1991)) ； (i)甲病毒；(j)逆轉錄病毒，優(yōu)選其GAG蛋白(W096/30523) ； (k)逆轉錄轉座子Ty，優(yōu)選蛋白pi ； (1)人乳頭瘤病毒(W0 98/15631) ； (m)多瘤病毒，優(yōu)選BKV ； (η)煙草花葉病毒；和(ο)禽獸棚病毒。包含一種以上重組蛋白的VLP在本申請中通常被稱為嵌合VLP。在一個實施方案中，VLP是嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含或者由一種以上的重組蛋白、優(yōu)選兩種不同的重組蛋白、最優(yōu)選兩種不同的重組衣殼蛋白、其突變體或片段組成。本文使用的術語“重組蛋白的片段”或術語“外殼蛋白的片段”被定義為一種多肽，其長度分別為野生型重組蛋白或外殼蛋白長度的至少70%，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，并且優(yōu)選地保留形成VLP的能力。優(yōu)選地，該片段通過至少一個內部缺失、至少一個截短或至少一個其組合而獲得。進一步優(yōu)選地，所述片段通過最多5、4、 3或2個內部缺失、通過最多2個截短或通過正好一個它們的組合獲得。術語“重組蛋白的片段”或術語“外殼蛋白的片段”還包括與以上定義的“重組蛋白的片段”或“外殼蛋白的片段”分別具有至少80 %，優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %的氨基酸序列同一性并且優(yōu)選能夠裝配為病毒樣顆粒的多肽。術語“突變外殼蛋白”是指具有分別由野生型重組蛋白或外殼蛋白衍生的氨基酸序列的多肽，其中該衍生的氨基酸序列與野生型序列至少80%、優(yōu)選至少85%、90%、 95%、97%或99%相同，并且其中優(yōu)選地所述氨基酸序列保留裝配為VLP的能力。在一個優(yōu)選實施方案中，病毒樣顆粒是乙型肝炎病毒的病毒樣顆粒。乙型肝炎病毒樣顆粒的制備已經在WO 00/32227、W001/85208和WO 02/056905中公開，所有三篇文獻在此都引用以作參考。適合在本發(fā)明的實施中使用的HBcAg的其他變體在WO 01/056905 的第34-39頁已經公開。在本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案中，將賴氨酸殘基導入HBcAg多肽中，來介導IL-I分子與HBcAg的VLP的連接。在優(yōu)選的實施方案中，利用包含、或由SEQ ID NO 1的氨基酸1-144、或1-149、1-185組成的HBcAg制備本發(fā)明的VLP和組合物，其中該氨基酸被修飾使得第79和80位的氨基酸被替代為具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列(SEQ ID NO 170)的肽。這個修飾將SEQ ID NO 1改變?yōu)镾EQ ID NO :2。在進一步優(yōu)選的實施方案中，SEQ ID NO :2的第48和110位的半胱氨酸殘基，或其相應片段，優(yōu)選1-144或1-149，被突變?yōu)榻z氨酸。本發(fā)明進一步包括包含具有上述相應氨基酸改變的乙型肝炎核心蛋白突變體的組合物。本發(fā)明進一步包括分別包含HBcAg多肽的組合物和疫苗，該HBcAg多肽包含、或由與SEQID NO 21至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體的重組外殼蛋白、其突變體或片段，或者基本由其組成，或者由其組成。優(yōu)選地，該RNA噬菌體選自(a)噬菌體Q β ； (b)噬菌體R17 ； (c)噬菌體fr ； (d)噬菌體GA ； (e)噬菌體SP ； (f)噬菌體MS2 ； (g) 噬菌體Mll ； (h)噬菌體MXl ；⑴噬菌體NL95 ； (k)噬菌體f2 ； (1)噬菌體PP7 ；和(m)噬菌
19體PRRl ；禾口 (η)噬菌體ΑΡ205。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述病毒樣顆粒包含RNA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段，其中該外殼蛋白包含選自以下序列的氨基酸序列或優(yōu)選地由該序列組成(a) SEQ ID NO 3 ；涉及Q β CP ； (b) SEQ ID NO :3禾口 SEQ ID NO 4 的混合物(Q β Al 蛋白)； (c)SEQ ID NO :5(R17 衣殼蛋白)；(d) SEQ ID N0:6(fr 衣殼蛋白)；(e) SEQ ID N0:7(GA 衣殼蛋白)；(f) SEQ ID NO 8 (SP 衣殼蛋白)；(g) SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO 9 的混合物；(h) SEQ ID NO :10(MS2 衣殼蛋白)；⑴ SEQ ID NO :11 (Mil 衣殼蛋白)；(j)SEQ ID NO 12 (MXl 衣殼蛋白)；(k) SEQ ID NO :13(NL95 衣殼蛋白)；(I)SEQ ID NO 14 (f 2 衣殼蛋白)；(m) SEQ ID NO :15(PP7 衣殼蛋白)；禾口 (n) SEQ ID NO :21 (ΑΡ205 衣殼蛋白)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，VLP是嵌合VLP，包含RNA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段的一種以上的氨基酸序列，優(yōu)選兩種氨基酸序列，或者由該氨基酸序列組成。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，VLP包含RNA噬菌體的兩種不同的外殼蛋白，或者由所述外殼蛋白組成，其中所述兩種不同的外殼蛋白包含或優(yōu)選地由以下序列組成CP Q^ (SEQ ID NO 3)和 CP Q β Al (SEQ ID NO 4)的氨基酸序列；或CP SP (SEQ ID NO 8)和 CP SP Al (SEQ ID NO 9)的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體的重組外殼蛋白、其突變體或片段，或者基本由其組成，或者由其組成，其中優(yōu)選地所述RNA噬菌體選自噬菌體Q β、噬菌體fr、噬菌體AP205和噬菌體GA。在一個優(yōu)選實施方案中，VLP是RNA噬菌體Q β的VLP。Q β的衣殼或病毒樣顆粒顯示為二十面體噬菌體樣衣殼結構，直徑25nm，T = 3半對稱。該衣殼含有180個拷貝的外殼蛋白，這些外殼蛋白通過二硫鍵連接為共價五聚體和六聚體(Golmohammadi R.等人， Structure 4 :543_5554(1996))，使Qβ衣殼具有顯著的穩(wěn)定性。然而，由重組Q3外殼蛋白構成的衣殼或VLP可能含有不通過二硫鍵與衣殼內的其它亞單位連接的或不完全連接的亞單位。Q β的衣殼或VLP顯示對有機溶劑和變性劑有不同尋常的耐受性。我們驚奇地發(fā)現，高至30%的DMSO和乙腈濃度和高至IM的胍鹽濃度不影響衣殼的穩(wěn)定性。Qi3的衣殼或VLP的高穩(wěn)定性是一個有利的特征，特別是對于根據本發(fā)明免疫和接種哺乳動物和人的用途而言。進一步優(yōu)選的RNA噬菌體的病毒樣顆粒、特別是RNA噬菌體Q β和RNA噬菌體fr 的病毒樣顆粒，已經在W002/056905中公開，其公開內容通過參考并入本文。特別地，WO 02/056905的實施例18給出了關于制備RNA噬菌體Q β的VLP的詳細說明。在另一個優(yōu)選實施方案中，VLP是RNA噬菌體ΑΡ205的VLP。在本發(fā)明的實踐中也可以使用AP205VLP的能夠裝配的突變形式，包括氨基酸5位的脯氨酸被置換為蘇氨酸的 ΑΡ205外殼蛋白，或氨基酸14位的天酰胺被置換為天冬氨酸的ΑΡ205外殼蛋白，這產生本發(fā) 明的其他優(yōu)選的實施方案。WO 2004/007538，特別是在實施例1和實施例2中，描述了如何獲得包含ΑΡ205外殼蛋白的VLP，以及特別是其表達和純化。WO 2004/007538通過參考并入本文。AP205VLP具有高度免疫原性，能夠與抗原連接，典型且優(yōu)選地產生以重復方式展示定向的IL-I分子的疫苗構建體。在一個優(yōu)選實施方案中，VLP包含病毒(優(yōu)選RNA噬菌體)的突變外殼蛋白，或者基本由或由所述突變外殼蛋白組成，其中通過置換和/或通過刪除而除去至少一個賴氨酸
20殘基，從而修飾了該突變外殼蛋白。在另一個優(yōu)選實施方案中，VLP包含病毒(優(yōu)選RNA噬菌體)的突變外殼蛋白，或者基本由或由所述突變外殼蛋白組成，其中通過置換和/或通過插入而添加至少一個賴氨酸殘基，從而修飾了該突變外殼蛋白。至少一個賴氨酸殘基的刪除、置換或添加可以改變偶聯(lián)程度，即VLP(優(yōu)選RNA噬菌體的VLP)的每個亞單位上IL-I 分子的量，特別是，用來滿足和適應疫苗的要求。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物和疫苗具有0. 5到4. 0的抗原密度。本文使用的術語“抗原密度”是指VLP (優(yōu)選RNA噬菌體)的VLP的每個亞單位上(優(yōu)選每個外殼蛋白上)連接的IL-I分子的平均數。因此，該值可以計算為在本發(fā)明的組合物或疫苗中VLP (優(yōu)選RNA噬菌體的VLP)的所有亞單位上的平均數。Q^外殼蛋白的VLP或衣殼在其表面上展示數量確定的賴氨酸殘基，具有確定的拓撲學，3個賴氨酸殘基指向衣殼內部，并與RNA相互作用，其它4個賴氨酸殘基暴露于衣殼外部。優(yōu)選地，至少一個第一附著位點是賴氨酸殘基，指向或位于VLP的外部。在進一步優(yōu) 選的實施方案中，所述第一附著位點是SEQ ID NO :3的賴氨酸殘基的氨基。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第一附著位點是SEQ ID NO 3的位點2、13、16、46、60、63和67任一個賴氨酸殘基的氨基。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第一附著位點是外殼蛋白，優(yōu)選SEQ ID NO 3的任一個賴氨酸殘基的氨基，它們暴露于衣殼的外部。其暴露的賴氨酸殘基被精氨酸取代的Qβ突變體可以用于本發(fā)明。這樣，在本發(fā) 明另一個優(yōu)選的實施方案中，該病毒樣顆粒包含下列物質，基本上由下列物質組成，或由下列物質組成突變Q3外殼蛋白。優(yōu)選地，這些突變外殼蛋白包含選自以下序列的氨基酸序列，或由該氨基酸序列組成；(a) Q β-240 (SEQ ID NO 16 ；SEQ ID NO :3 的 Lysl3_Arg)，(b) Q β -243 (SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO :3 的 Asn 10-Lys)，(c) Q β -250 (SEQ ID NO: 18，SEQ ID NO :3 的 Lys2-Arg) ； (d) Q β-251 (SEQ ID NO :19，SEQ ID NO :3 的 Lysl6_Arg)；禾口 (e) Q3-259(SEQID NO 20, SEQ ID NO :3 的 Lys2_Arg、Lys 16-Arg)。上述突變外殼蛋白、突變Q0外殼蛋白VLP和衣殼的構建、表達和純化在W002/056905中有描述。特別參考上述申請的實施例18。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，病毒樣顆粒包含Qi3的突變外殼蛋白、或其片段和相應的Al蛋白，或者基本由其組成，或者由其組成。在進一步優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含具有氨基酸序列SEQ ID NO 16、17、18、19或20的突變外殼蛋白和相應的Al 蛋白，或者基本由其組成，或者由其組成。其它一些RNA噬菌體外殼蛋白在細菌宿主中表達后也顯示自裝配(Kastelein， RA.等人，Gene 23 :245_254 (1983)，Kozlovskaya, TM.等人，Dokl. Akad. Nauk SSSR 287 452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology 170 238-242 (1989), Priano, C.等人， J. Mol. Biol. 249 :283-297 (1995))。特別是已經公開了 GA(Ni，CZ，等人，Protein Sci. 5 2485-2493 (1996)，Tars，K 等人，J. Mol. Biol. 271 :759_773 (1997))和 fr (Pushko P.等人， Prot. Eng. 6 883-891 (1993), Liljas, L 等人· J Mol. Biol. 244 :279_290，(1994))的生物學和生化性質。幾種RNA噬菌體的晶體結構已經確定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4 543-554 (1996))。利用這些信息，能夠確定表面暴露的殘基，從而能夠修飾RNA噬菌體的外殼蛋白，以便能夠通過插入或置換插入一個或多個反應性氨基酸殘基。來源于RNA噬菌體的VLP的另一個優(yōu)點是它們在細菌中的高表達產量，這允許以可承受的成本產生大量的
21物質。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物包含至少一種抗原，優(yōu)選1至4種，更優(yōu) 選1至3種，更優(yōu)選1-2種，最優(yōu)選正好1種抗原，其中所述抗原包含或優(yōu)選地由以下分子組成IL-1分子，優(yōu)選IL-I蛋白、IL-I片段、IL-I成熟片段、IL-I肽或IL-I突變蛋白，其中所述IL-I分子優(yōu)選地含有一種多肽或更優(yōu)選地由該多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與 SEQ ID N0:36 至 SEQ ID N0:116、SEQ ID N0:130 至 SEQ ID N0:140 和 SEQ ID NO 163至SEQ ID NO 165中任一種具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu) 選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述抗原包含來源于選自下組的生物的IL-I分子或由這些IL-I分子組成(a)人；(b)靈長類動物；(c)嚙齒類動物；(d)馬；(e)羊；(f)貓； (g)牛；(h)豬；⑴兔；(j)狗；(k)小鼠；和(1)大鼠。最優(yōu)選地，所述IL-I分子來源于人類。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，IL-I分子是人IL-I分子。進一步優(yōu)選地，所述IL-I分子包含一種多肽，或者優(yōu)選由該多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與選自SEQ ID NO 36,SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO 64 的任一種序列、SEQ ID NO :67_110 的任一種序列、SEQ ID NO 130-140的任一種序列和SEQ ID NO 165具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I分子來源于大鼠或小鼠，優(yōu)選小鼠，其中所述IL-I分子優(yōu)選地包含一種多肽，或者更優(yōu)選地由該多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與 SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO :65、 SEQ ID NO :66 的任一種序列、SEQ ID NO 111-116 的任一種序列、SEQ ID NO 163, SEQ ID NO 164具有至少80 %、優(yōu)選至少90 %、更優(yōu)選至少95 %、更優(yōu)選至少99 %、最優(yōu)選100 %的序列同一性。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I分子是IL-I α分子，優(yōu)選IL-Ia蛋白、 IL-Ia片段、IL-Ia成熟片段、IL-Ia肽或IL_1 α突變蛋白，其中所述IL_1 α分子優(yōu)選地包含一種多肽，或者更優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與選自 SEQ ID N0:36 至 48、SEQ ID NO 63、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO :67 至 88 禾口 SEQ ID NO: 165 的任一種序列具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選 100%的序列同一性。IL-Ia分子的特別優(yōu)選的實施方案是人IL-I α分子，優(yōu)選人IL-Ia 蛋白、人IL-I α片段或人IL-I α成熟片段，其中所述IL_1 α分子優(yōu)選地包含一種多肽或者更優(yōu)選由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與SEQ ID N0:36、SEQ ID NO 63和SEQ ID NO 163中的任一種、最優(yōu)選與SEQ ID NO :63具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I分子是IL-I β分子，優(yōu)選IL-Ιβ蛋白、 IL-I β片段、IL-I β成熟片段、IL-I β肽或IL-I β突變蛋白，其中所述IL-I β分子優(yōu)選地包含一種多肽，或者更優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與選自SEQ ID NO 49 至 62、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO 89 至 116、SEQ ID NO 130 至 SEQ ID NO 140,SEQ ID Ν0:164禾口 SEQ ID NO :165中的任一種序列具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。IL-I β分子的特別優(yōu)選的實施方案是人IL-I β分子，優(yōu)選人IL-I β蛋白、人IL-I β片段或人IL-I β成熟片段，其中所述IL-Ιβ分子優(yōu)選地包含一種多肽，或者更優(yōu)選由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與SEQ ID NO 49,SEQ ID NO 64、SEQ ID N0:130至SEQ ID NO 140 和SEQ ID NO 165中的任一種，最優(yōu)選地與SEQ ID NO 64具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I分子是IL-I蛋白、IL-I片段或優(yōu)選IL-I 成熟片段，其中所述IL-I蛋白、IL-I片段或IL-I成熟片段優(yōu)選地能夠與IL-I受體結合，更優(yōu)選地另外也具有生物活性。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I分子是IL-I蛋白，其中所述IL-I蛋白優(yōu) 選地包含一種多肽，或者更優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與SEQ ID N0:36至SEQ ID NO :62中的任一種具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I蛋白是IL-I α蛋白，其中所述IL-Ia蛋白優(yōu)選地包含一種多肽，或者更優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與選自SEQ ID NO 36至SEQ ID NO 48的任一種序列具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu) 選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。最優(yōu)選地，所述IL-I α蛋白是人IL-Ia蛋白，其中所述人IL-Ia蛋白優(yōu)選地包含一種多肽，或者更優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與SEQ ID NO :36具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu) 選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I蛋白是IL-I β蛋白，其中所述IL-I β蛋白優(yōu)選地包含一種多肽，或者更優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與選自SEQ ID NO 49至SEQ ID NO 62的任一種序列具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu) 選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。最優(yōu)選地，所述IL-I β蛋白是人IL-Ιβ蛋白，其中所述人IL-Ιβ蛋白優(yōu)選地包含一種多肽，或者更優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與SEQ ID NO :49具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu) 選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I分子是IL-I片段，優(yōu)選IL-I成熟片段，其中所述IL-I片段或所述IL-I成熟片段優(yōu)選地來源于小鼠或人類，最優(yōu)選地來源于人類。優(yōu) 選地，所述IL-I片段或所述IL-I成熟片段含有一種多肽或者更優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與SEQ ID Ν0:63至SEQ ID NO 66、SEQ ID Ν0:130和SEQ ID NO: 163至SEQ ID NO 165中的任一種具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I成熟片段是IL-I α成熟片段，其中所述 IL-Ia成熟片段優(yōu)選地具有生物活性，并且其中進一步，所述IL-I α成熟片段優(yōu)選地含有一種多肽或者更優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與SEQ ID N0:63 或SEQ ID NO :65任一種，最優(yōu)選地與SEQ ID NO :63具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I成熟片段是IL-I β成熟片段，其中所述 IL-I β成熟片段優(yōu)選地具有生物活性，并且其中進一步所述IL-I β成熟片段優(yōu)選地含有一種多肽或者更優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與SEQ ID NO64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO 130 中的任一種，最優(yōu)選地與 SEQ ID NO 64 具有至少 80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的序列同一性。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I分子是IL-I肽，其中所述IL-I肽來源于小鼠、大鼠或人類，最優(yōu)選地來源于人類。優(yōu)選地，所述IL-I肽優(yōu)選地含有一種多肽或者更優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列顯示與SEQ ID N0:67至SEQ ID NO 116中的任一種具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選 100%的序列同一性。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I分子是IL-I突變蛋白，其中優(yōu)選地所述 IL-I突變蛋白包含降低的生物活性或更優(yōu)選地沒有生物活性，并且其中進一步優(yōu)選地所述 IL-I突變蛋白能夠結合IL-I受體。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I突變蛋白包含一種多肽或優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列與IL-I成熟片段的氨基酸序列有1至3個，更優(yōu)選1-2個，最優(yōu)選正好1個氨基酸殘基不同。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I突變蛋白包含至少一個、優(yōu)選一個衍生自野生型氨基酸序列的突變的氨基酸序列，其中所述野生型氨基酸序列是選自下組的IL-I β 氨基酸序列(I)SEQ ID NO 64 的位點 3-11 ； (2) SEQ ID NO 64 的位點 46-56 ； (3) SEQ ID NO 64的位點88-109 ；和(4) SEQ ID NO 64的位點143-153 ；或者其中所述野生型氨基酸序列是選自下組的IL-I α氨基酸序列(5) SEQ ID NO 63的位點9-20 ； (6) SEQ ID NO 63 的位點 52-62 ； (7) SEQ ID NO 63 的位點 94-113 ；和(8) SEQ ID NO 63 的位點 143-153 ；并且其中所述至少一個突變的氨基酸序列的特征是與所述衍生它的野生型氨基酸序列相比，在1-4個位點，優(yōu)選地在1、2或3個位點，更優(yōu)選地在1或2個位點有氨基酸更換；或者其中所述至少一個突變的氨基酸序列的特征是所述衍生它的野生型氨基酸序列缺失1-4個連續(xù)氨基酸。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I突變蛋白包含最多一個衍生自所述 IL-I β氨基酸序列(1)_(4)中每一個的突變的氨基酸序列；或者其中所述IL-I突變蛋白包含最多一個衍生自所述IL-I α氨基酸序列(5)-(8)中每一個的突變的氨基酸序列。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I突變蛋白包含所述至少一個突變氨基酸序列中的正好一個，其中優(yōu)選地所述正好一個突變氨基酸序列衍生自野生型氨基酸序列，其中所述野生型氨基酸序列是SEQ ID NO 64的位點143-153或SEQ ID NO 63的位點 143-153。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個突變的氨基酸序列的特征在于所述衍生它的野生型氨基酸序列缺失1-3個，優(yōu)選1-2個連續(xù)氨基酸。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個突變的氨基酸序列的特征在于所述衍生它的野生型氨基酸序列缺失正好一個氨基酸。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個突變的氨基酸序列衍生自野生型氨基酸序列，其中所述野生型氨基酸序列是SEQ ID NO 64的位點143-153或SEQ ID NO 63的位點143-153。最優(yōu)選地，所述至少一個突變的氨基酸序列衍生自SEQ ID NO :64的位點 143-153。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個突變的氨基酸序列衍生自野生型氨基酸序列，其中所述野生型氨基酸序列是SEQ ID NO 64的位點46-56或SEQ ID NO 63的位點52-62，其中優(yōu)選地所述至少一個突變的氨基酸序列的特征在于所述衍生它的野生型氨基酸序列缺失1-4個，優(yōu)選2-3個連續(xù)氨基酸。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I 突變蛋白包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO 137 或 SEQ ID NO :138 ο在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個突變的氨基酸序列衍生自野生型氨基酸序列，其中所述野生型氨基酸序列是SEQ ID NO :64的位點88-109或SEQ ID NO :63的位點94-113，其中所述至少一個突變的氨基酸序列的特征在于所述衍生它的野生型氨基酸序列缺失1-4個，優(yōu)選1-3個，更優(yōu)選1-2個連續(xù)氨基酸。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個突變的氨基酸序列的特征在于與所述衍生它的野生型氨基酸序列相比，在1或2個位點，優(yōu)選地在正好一個位點存在氨基酸更換。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述野生型氨基酸序列是SEQ ID NO :64的位點 143-153或SEQ ID NO 63的位點143-153，并且所述至少一個突變的氨基酸序列的特征在于與所述衍生它的野生型氨基酸序列相比，在1或2個位點，優(yōu)選地在正好一個位點存在氨基酸更換，其中進一步優(yōu)選地，所述正好一個位點是SEQ ID NO :64的位點145或SEQ ID NO 63的位點145，其中再進一步優(yōu)選地，所述氨基酸更換是天冬氨酸(D)更換為選自賴氨酸(K)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、天冬酰胺(N)和精氨酸(R)的氨基酸。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述氨基酸更換是天冬氨酸(D)更換為賴氨酸 ⑷。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述野生型氨基酸序列是SEQ ID NO :64的位點 143-153或SEQ ID NO 63的位點143-153，并且所述至少一個突變的氨基酸序列的特征在于與所述野生型氨基酸序列相比，在正好一個位點存在氨基酸更換，其中進一步優(yōu)選地，所述正好一個位點是SEQ ID NO 64的位點146或SEQ ID NO 63的位點146，其中再進一步優(yōu)選地，所述氨基酸更換是苯丙氨酸(F)更換為選自天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)和絲氨酰 ⑶的氨基酸。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I突變蛋白是IL-I β突變蛋白，優(yōu)選為人 IL-I β突變蛋白，最優(yōu)選為選自SEQ ID NO: 131至SEQ ID NO 140的人IL-1 β突變蛋白，最優(yōu)選地，所述IL-I突變蛋白是SEQ ID Ν0:136。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I突變蛋白是IL-I β突變蛋白，其中優(yōu)選地所述IL-I β突變蛋白包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO 64的氨基酸序列有1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2個氨基酸殘基不同。最優(yōu)選地，所述氨基酸序列與SEQ ID NO :64的氨基酸序列有正好1個氨基酸殘基不同。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I β突變蛋白包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 131至SEQ ID NO: 140和SEQ ID N0:205至SEQ ID NO :209，其中最優(yōu)選地所述IL-I β突變蛋白包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列是SEQ ID Ν0:136。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I分子，優(yōu)選地所述IL-I β突變蛋白，包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 136組成。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I突變蛋白是IL-I α突變蛋白，其中優(yōu)選地
25所述IL-I α突變蛋白包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO 63的氨基酸序列有1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2個氨基酸殘基不同。最優(yōu)選地，所述氨基酸序列與SEQ ID NO :63的氨基酸序列有正好1個氨基酸殘基不同。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I α突變蛋白包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列選自SEQ ID Ν0:210至SEQ ID NO :218，其中最優(yōu)選地所述IL-I α 突變蛋白包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列是SEQ ID Ν0:210。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I分子，優(yōu)選地所述IL-I α突變蛋白，包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 210組成。進一步公開了一種制備本發(fā)明的組合物的方法，包括(a)提供具有至少一個第一附著位點的VLP ； (b)提供具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原，其中所述抗原包含或者由以下組成IL-1分子，優(yōu)選IL-I蛋白、IL-I片段，優(yōu)選IL-I成熟片段、IL-I肽或 IL-I突變蛋白；和(c)將所述VLP與所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原相組合，產生所述組合物，其中所述至少一種抗原和所述VLP通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接。在一個優(yōu)選實施方案中，提供具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原，包括所述IL-I分子、所述IL-I蛋白、所述IL-I片段、優(yōu)選IL-I成熟片段、所述IL-I肽或所述IL-I突變蛋白，是通過表達，優(yōu)選地通過在細菌系統(tǒng)中，優(yōu)選地在大腸桿菌中表達而實現的。為了有利于純化過程，通常添加純化標簽，如His標簽、Myc標簽、Fc標簽或HA標簽。在另一方法中，特別可以化學合成具有不長于50個氨基酸的IL-I 肽或IL-I突變蛋白。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，具有至少一個第一附著位點的VLP與具有至少一個第二附著位點的抗原通過至少一個肽鍵連接。編碼IL-I分子(優(yōu)選IL-I突變蛋白) 的基因符合讀框地連接到編碼VLP外殼蛋白的基因的內部或優(yōu)選連接到其N末端或C末端。也可以通過將IL-I分子的序列插入部分外殼蛋白序列已經缺失的突變外殼蛋白中實現融合。這些構建體進一步被稱為截短突變體。截短突變體可以具有外殼蛋白的部分序列的N末端或C末端或者內部缺失。例如，對于特異性VLP HBcAg，氨基酸79-80被替換為外源表位。該融合蛋白優(yōu)選保留了在表達后裝配為VLP的能力，這可以通過電鏡檢查?？杉尤雮纫戆被釟埢鶃碓黾油鈿さ鞍缀屯庠幢砦恢g的距離。甘氨酸和絲氨酸殘基是用于側翼序列的特別有利的氨基酸。這種側翼序列提供額外的柔性，可減少外源序列融合進入VLP亞單位序列時可能的去穩(wěn)定效應，并且可減少外源表位的存在對裝配的干擾。在另外一些實施方案中，至少一種IL-I分子，優(yōu)選IL-I突變蛋白，能夠與大量其它病毒外殼蛋白融合，例如，與Q0的Al蛋白的截短形式的C末端融合(K0Zl0VSka，T.M.，等人，Intervirology 39 :9_15 (1996))，或者插入CP延伸的位點72和73之間。作為另一個實例，IL-I分子可以插入fr CP的氨基酸2和3之間，產生IL-l-fr CP融合蛋白(Pushko P.等人，Prot. Eng. 6 :883_891 (1993))。此外，IL-1也可以與RNA噬菌體MS-2的外殼蛋白的N末端突出β-發(fā)夾融合(W092/13081)。此外，IL-I也可以與乳頭瘤病毒的衣殼蛋白融合，優(yōu)選與1型牛乳頭瘤病毒(BPV-I)的主要衣殼蛋白Ll融合(ChaCkerian，B.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 2373-2378 (1999), WO 00/23955)。將 BPV-1L1 的氨基酸 130-136 置換為IL-I也是本發(fā)明的實施方案。將IL-I分子與病毒的外殼蛋白、或與其突變體或片
26段融合的實施方案已經在WO 2004/009124的第62頁第20行至第68頁第17行公開，在此引入作為參考。US 5，698，424描述了一種能夠形成衣殼的修飾的噬菌體MS-2外殼蛋白，其中通過向N端發(fā)夾區(qū)中插入半胱氨酸殘基，以及通過將位于N端發(fā)夾區(qū)外部的每一個半胱氨酸殘基置換為非半胱氨酸氨基酸殘基，修飾了該外殼蛋白。插入的半胱氨酸然后可以直接連接到欲呈遞的期望的分子種類如表位或抗原性蛋白質上。然而我們注意到，衣殼中存在暴露的游離半胱氨酸殘基可導致衣殼通過形成二硫鍵而寡聚化。而且，衣殼和抗原性蛋白質之間通過二硫鍵的連接是不穩(wěn)定的，特別是對于含有巰基部分的分子不穩(wěn)定，而且，在血清中例如比硫醚連接的穩(wěn)定性差(Martin FJ.和 Papahadjopoulos D. (1982)Irreversible Coupling of Immunoglobulin fragments to Preformed Vesicles. J. Biol. Chem. 257 :286_288)。因此，在本發(fā)明的另一個非常優(yōu)選的實施方案中，VLP與包含或由IL-I分子組成的至少一種抗原的聯(lián)接或連接不包括二硫鍵。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個第二附著位點包含，或優(yōu)選地是巰基。而且，在本發(fā)明一個非常優(yōu)選的實施方案中，VLP與至少一種抗原的聯(lián)接或連接不包括硫-硫鍵。進一步優(yōu)選地，至少一個第二附著位點包含或者優(yōu)選地是巰基。在另一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個第一附著位點不是或不包含巰基。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個第一附著位點不是或者不包含半胱氨酸的巰基。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個第一附著位點包含氨基，并且所述第二附著位點包含巰基。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第一附著位點是氨基，并且所述第二附著位點是巰基。在再進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第一附著位點是賴氨酸殘基的氨基，并且所述第二附著位點是半胱氨酸殘基的巰基。在進一步優(yōu)選的實施方案中，僅一個所述第二附著位點與所述第一附著位點通過至少一個非肽共價鍵連接，形成單一且均勻類型的所述抗原與所述核心顆粒(優(yōu)選與所述病毒樣顆粒)的結合，其中與所述第一附著位點連接的所述僅一個第二附著位點是巰基，并且其中所述抗原與所述核心顆粒(優(yōu)選與所述病毒樣顆粒)通過所述連接相互作用，形成有序且重復的抗原陣列，并且其中進一步優(yōu)選地，所述第一附著位點是賴氨酸殘基的氨基。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述病毒樣顆粒包含病毒(優(yōu)選RNA噬菌體)的重組外殼蛋白、其突變體或片段，基本上由其組成，或者由其組成，其中所述至少一種抗原與所述重組外殼蛋白、其突變體或片段的N-或C-末端融合。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述病毒樣顆粒包含RNA噬菌體的重組外殼蛋白、其突變體或片段，或者基本由其組成，或者由其組成，其中優(yōu)選地，所述RNA噬菌體選自 (a)噬菌體AP205;(b)噬菌體fr;和(c)噬菌體GA ；并且其中所述至少一種抗原與所述重組外殼蛋白、其突變體或片段的N-或C-末端融合，優(yōu)選地與C-末端融合，并且其中進一步優(yōu)選地，所述至少一種抗原包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列是 SEQ ID N0:136 或 SEQ ID NO :210，優(yōu)選為 SEQ ID NO 136。在進一步優(yōu)選的實施方案中，IL-I分子，優(yōu)選IL-I蛋白，更優(yōu)選IL-I成熟片段，更優(yōu)選包含氨基酸序列SEQ ID NO 63至SEQ ID NO :66、最優(yōu)選SEQ ID NO 63或SEQ ID NO :64、或者由上述序列組成的IL-I成熟片段，與RNA噬菌體AP205的外殼蛋白、其突變體或片段的N-或C-末端融合、優(yōu)選與其C-末端融合。在非常優(yōu)選的實施方案中，所述病毒樣顆粒包含、基本由或由噬菌體AP205的重組外殼蛋白、其突變體或片段組成，其中所述至少一種抗原與所述重組外殼蛋白、其突變體或片段的C-末端融合，并且其中所述至少一種抗原包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO 136或SEQ ID NO :210，優(yōu)選為SEQ ID NO :136。含有RNA噬菌體AP205的外殼蛋白與抗原的融合蛋白的VLP在W02006/032674A1 中總體公開，在此引用作為參考。在進一步優(yōu)選的實施方案中，融合蛋白進一步包含接頭，其中所述接頭與AP205的外殼蛋白、其突變體或片段和IL-I分子融合。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I分子與AP205的所述外殼蛋白、其突變體或片段通過所述接頭融合。已經發(fā)現，IL-I分子，特別是包含至少100個、最多300個氨基酸、典型且優(yōu)選地大約140-160個氨基酸、最優(yōu)選大約155個氨基酸的IL-I蛋白和IL-I片段，可以與噬菌體的外殼蛋白融合，優(yōu)選地與AP205的外殼蛋白融合，同時保持該外殼蛋白自裝配為VLP的能力。鑒于IL-I蛋白、IL-I片段和IL-I成熟片段的大尺寸，以及由于空間原因，構建了產生包含與IL-I分子融合的AP205外殼蛋白以及野生型外殼蛋白亞單位的嵌合VLP的表達系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，終止密碼子的抑制產生了 AP205-IL-1外殼蛋白融合，而正確終止產生野生型AP205外殼蛋白。兩種蛋白質在細胞中同時產生，并裝配為嵌合VLP。這種系統(tǒng) 的優(yōu)點是可以展示大蛋白質，而不干擾VLP的裝配。由于AP205-IL-1融合蛋白引入嵌合 VLP中的水平依賴于阻抑水平，AP205-IL-1在已經包含過量表達抑制t_RNA的質粒的大腸桿菌細胞中表達。對于乳白阻抑，使用質粒PISM3001 (Smiley，B. K.，Minion, F. C. (1993) Enhanced readthrough of opal (UGA) stop codons and production of Mycoplasma pneumoniae Pl epitopes in Escherichia coli. Gene 134，33-40)，其編碼識別乳白終止密碼子的阻抑型t-RNA并引入Trp。應用質粒pISM579可以增加琥珀終止的阻抑，pISM579 過量表達識別琥珀終止密碼子并引入Trp的阻抑型t-RNA。質粒pISM579如下產生用限制性內切核酸酶EcoRI從pISM3001上切下trpT176基因，并將其替換為含有琥珀t-RNA阻抑基因的來自質粒PMY579 (Michael Yarus惠贈)的EcoRI片段。該t-RNA阻抑基因是trpT175 的突變體(Raftery LA.等人(1984) J. Bacteriol. 158 :849_859)，與 trpT 在三個位點上不同G33，A24和T35。在具有琥珀阻抑(supE或glnV)的大腸桿菌株如大腸桿菌JM109中表達AP205-白介素-Ia融合蛋白，除了在琥珀終止密碼子處引入Trp的AP205-IL-1融合蛋白以外，還可以產生一定比例的在琥珀終止密碼子處引入Gln而不是Trp的AP205-IL-1 融合蛋白。在終止密碼子處翻譯的氨基酸身份因此可依賴于過量表達的阻抑型t-RNA和菌株表型的組合。如Miller JH等人((1983) J. Mol. Biol. 164 :59_71)所述和本領域中公知的，阻抑效率是依賴于環(huán)境的。特別是，位于終止密碼子3’的密碼子和位于終止密碼子3’ 的第一個堿基特別重要。例如，后接嘌呤堿的終止密碼子通常被很好地阻抑。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述VLP是嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含至少一個、優(yōu)選一個第一多肽和至少一個、優(yōu)選一個第二多肽，或優(yōu)選地由上述多肽組成，其中所述第一多肽是重組衣殼蛋白、其突變體或片段；并且其中所述第二多肽是優(yōu)選所述第一多肽的重組衣殼蛋白、其突變體或片段與IL-I分子的基因融合產物。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第一多肽是噬菌體AP205的重組衣殼蛋白或其突變體或片段。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第一多肽選自SEQ ID N0:21、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO :23。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述第一多肽是SEQ ID N0:21。包含抗原的噬菌體AP205的嵌合VLP 在TO2006/032674A1中總體公開，特別是在所述公開文本的第107段。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第二多肽是優(yōu)選所述第一多肽的重組衣殼蛋白、其突變體或片段與IL-I分子的基因融合產物，其中所述IL-I分子與所述重組衣殼蛋白、其突變體或片段的C-末端融合，優(yōu)選地通過氨基酸接頭融合。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述IL-I分子包含100-300 個氨基酸、典型且優(yōu)選地大約140-160個氨基酸、最優(yōu)選地大約155個氨基酸，或者優(yōu)選地由上述氨基酸組成。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述嵌合VLP中所述第一多肽與所述第二多肽的摩爾比為10 1至5 1，優(yōu)選8 1至6 1，最優(yōu)選大約7 1。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物含有或者基本由具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒組成，該病毒樣顆粒與具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原通過至少一個共價鍵連接，優(yōu)選地該共價鍵是非肽鍵。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，第一附著位點包含或優(yōu)選地是氨基，優(yōu)選賴氨酸殘基的氨基。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，第二附著位點包含，或者優(yōu)選地是巰基，優(yōu)選半胱氨酸的巰基。在本發(fā)明的一個非常優(yōu)選的實施方案中，至少一個第一附著位點是氨基，優(yōu)選賴氨酸殘基的氨基，并且至少一個第二附著位點是巰基，優(yōu)選半胱氨酸殘基的巰基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，通過化學交聯(lián)，一般且優(yōu)選地通過使用異雙功能交聯(lián)劑，將抗原與VLP連接。在優(yōu)選的實施方案中，所述異雙功能交聯(lián)劑含有能夠與 VLP的優(yōu)選的第一附著位點(優(yōu)選氨基，更優(yōu)選賴氨酸殘基的氨基)反應的官能團，和能夠與IL-I分子固有的或人工添加的優(yōu)選的第二附著位點(即巰基，優(yōu)選半胱氨酸殘基的巰基)反應的另一個官能團，任選地該另一個官能團也可通過還原用于反應。有幾種異雙功能交聯(lián)劑在本領域公知。包括優(yōu)選的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA 和其它例如可從 Pierce Chemical Company獲得的、具有一個氨基反應性官能團和一個巰基反應性官能團的交聯(lián) 劑。上述交聯(lián)劑均導致在與氨基反應后形成酰胺鍵和與巰基反應后形成硫醚鍵。最優(yōu)選地，所述異雙功能交聯(lián)劑是琥珀酰亞胺基-6-[ β-馬來酰亞胺基丙酰胺基]己酸酯(SMPH)。適用于實施本發(fā)明的另一類交聯(lián)劑的特征在于偶聯(lián)時在IL-I分子與VLP之間引入二硫鍵。屬于這一類的優(yōu)選交聯(lián)劑包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP (Pierce)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物還包含接頭。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述具有所述至少一個第二附著位點的至少一種抗原進一步包含接頭，其中所述接頭包含所述第二附著位點，并且其中所述接頭與所述抗原通過一個肽鍵連接，并且其中優(yōu)選地所述接頭是半胱氨酸。根據本發(fā)明的公開內容，通過連接優(yōu)選包含適合作為第二附著位點的至少一個氨基酸殘基的接頭，實現向IL-I分子上構建第二附著位點。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，接頭通過至少一個共價鍵、優(yōu)選通過至少一個、通常一個肽鍵與 IL-I分子連接。優(yōu)選地，接頭包含或者由第二附著位點組成。在進一步優(yōu)選的實施方案中，接頭包含巰基，優(yōu)選半胱氨酸殘基的巰基。在另一個優(yōu)選的實施方案中，氨基酸接頭是半胱氨酸殘基。
接頭的選擇取決于IL-I分子的性質，取決于其生化性質，如pi、電荷分布和糖基化。柔性的氨基酸接頭通常是有利的。在本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案中，接頭由氨基酸組成，其中進一步優(yōu)選地，接頭由最多25個，優(yōu)選最多20個，更優(yōu)選最多15個氨基酸組成。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，氨基酸接頭含有1-10個氨基酸。接頭的優(yōu)選實施方案選自(a)CGG(SEQ ID NO 171) ；(b)N_端 γ 1 接頭，優(yōu)選CGDKTHTSPP(SEQ ID NO 172)； (c) N-端 γ 3 接頭，優(yōu)選 CGGPKPSTPPGSSGGAP (SEQ ID NO 173) ； (d) Ig 鉸鏈區(qū)；(e) N-端甘氨酸接頭，優(yōu)選 GCGGGG (SEQ ID NO 174) ； (f) (G) kC (G) n，其中 η = 0-12，k = 0-5 (SEQ ID NO 175) ;(g) N-端甘氨酸-絲氨酸接頭，優(yōu)選(GGGGS) η，η = 1-3 (SEQ ID N0:176)，具有另外一個半胱氨酸；(h) (G) kC(G)m⑶ l(GGGGS)n，其中 η = 0-3, k = 0-5, m = 0-10, 1 = 0-2 (SEQ ID NO 177) ； (i)GGC(SEQ ID NO 178) ； (k)GGC-NH2(SEQ ID NO 179) ； (I)C端 γ 1 接頭，優(yōu)選 DKTHTSPPCG(SEQ ID NO 180) ； (m)C_端 γ 3 接頭，優(yōu)選PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQ ID NO: 181) ； (η) C-端甘氨酸接頭，優(yōu)選 GGGGCG (SEQ ID NO: 182) ； (ο) (G) nC (G) k，其中 η = 0-12，k = 0-5 (SEQ ID NO: 183) ； (p) C-端甘氨酸-絲氨酸接頭，優(yōu)選(SGGGG) n，η = 1-3 (SEQ ID NO : 184)，具有另外一個半胱氨酸；(q) (G)m(S) 1 (GGGGS) η (G)0C (G) k，其中 η = 0-3, k = 0-5，m = 0-10，1 = 0-2，ο = 0-8 (SEQ ID NO: 185)。在進一步優(yōu)選的實施方案中，接頭添加到IL-I分子的N末端。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，接連體添加到IL-I分子的 C末端。本發(fā)明優(yōu)選的接頭是進一步含有半胱氨酸殘基作為第二附著位點的甘氨酸接頭 (G) n，如N-末端甘氨酸接頭(GCGGGG，SEQ IDNO 174)和C-末端甘氨酸接頭(GGGGCG，SEQ ID NO 182)。進一步優(yōu)選的實施方案是C-末端甘氨酸-賴氨酸接頭(GGKKGC，SEQ ID NO 186) 和N-末端甘氨酸-賴氨酸接頭(CGKKGG，SEQ ID NO 187)，位于肽的C-末端的GGCG(SEQ ID NO 188)和GGC(SEQ ID NO :179，“ NH2"代表酰胺化)接頭，或位于其N-末端的CGG(SEQ ID N0:171)。甘氨酸殘基通常插入大氨基酸與作為第二附著位點的半胱氨酸之間，以避免偶聯(lián)反應中較大氨基酸的潛在的空間位阻。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述接頭進一步包含His-標簽。一種非常優(yōu)選的接頭包含或者優(yōu)選地由LEHHHHHHGGC(SEQ ID NO 201)或 LEHHHHHHGGCG (SEQ ID NO :219)組成，優(yōu)選地接頭由 LEHHHHHHGGCG(SEQ ID NO 219)組成。根據上述優(yōu)選方法利用異雙功能交聯(lián)劑連接具有至少一個第二附著位點的抗原與VLP，使得IL-I分子以定向方式與VLP偶聯(lián)。連接具有至少一個第二附著位點的抗原和 VLP的其它方法包括使用碳二亞胺EDC和NHS交聯(lián)IL-I分子和VLP的方法。IL-I分子也可以首先通過例如與SATA、SATP或亞氨硫醇(iminothiolane)反應而硫醇化。必要時，在脫保護之后，具有至少一個第二附著位點的抗原可以和VLP如下所述偶聯(lián)。在分離過量的硫醇化試劑之后，具有至少一個第二附著位點的抗原與預先用含有半胱氨酸反應性部分的異雙功能交聯(lián)劑活化的VLP反應，該活化的VLP展示至少一個或幾個對半胱氨酸殘基具有反應性的官能團，如上所述的硫醇化的具有至少一個第二附著位點的抗原能夠與該官能團反應。任選地，在反應混合物中含有少量的還原劑。另外一些方法使用同型雙功能交聯(lián)劑，如戊二醛、DSG、BM[PE0]4、BS3 (Pierce)或含有對VLP的胺基或羧基有反應性的官能團的其它已知同型雙功能交聯(lián)劑，將具有至少一個第二附著位點的抗原與VLP連接。在本發(fā)明的其他實施方案中，組合物包含或者基本由通過化學相互作用與具有至少一個第二附著位點的抗原連接的病毒樣顆粒組成，其中這些相互作用的至少一種不是共
30價鍵。VLP與具有至少一個第二附著位點的抗原的連接可以通過將VLP生物素化并且將 IL-I分子表達為鏈霉抗生物素_融合蛋白而實現。一個或幾個抗原分子，即IL-I分子，可以附著到優(yōu)選RNA噬菌體外殼蛋白的VLP 的一個亞單位上，優(yōu)選通過RNA噬菌體外殼蛋白VLP的暴露的賴氨酸殘基附著，如果空間上允許的話。RNA噬菌體的VLP(特別是Qβ外殼蛋白VLP)的特定特征因此是每個亞單位能夠偶聯(lián)幾個抗原。這允許產生密集的抗原陣列。在本發(fā)明的非常優(yōu)選的實施方案中，具有至少一個第二附著位點的抗原通過添加到IL-I分子N末端或C末端上的半胱氨酸或IL-I分子內的天然半胱氨酸殘基與RNA噬菌體的VLP的外殼蛋白(特別是Qi3的外殼蛋白)的賴氨酸殘基連接。如上所述，4個賴氨酸殘基暴露于Qβ外殼蛋白的VLP的表面。典型地，這些殘基通過與交聯(lián)劑分子反應而衍生化。當不是所有的暴露賴氨酸殘基都能與抗原偶聯(lián)時，在衍生化步驟后，已與交聯(lián)劑反應的賴氨酸殘基就留下來，交聯(lián)劑分子附著到ε_氨基上。這就使對VLP的溶解性和穩(wěn)定性可能不利的一種或幾種正電荷消失。通過例如在下文所述的 Q^外殼蛋白突變體中那樣用精氨酸取代某些賴氨酸殘基，我們避免了正電荷的過度消失，因為精氨酸殘基并不能與優(yōu)選的交聯(lián)劑反應。此外，用精氨酸取代賴氨酸殘基會產生更確定的抗原陣列，因為只有較少的位點可與抗原反應。因此，在下列的Qi3外殼蛋白突變體中，用精氨酸取代暴露的賴氨酸殘基: Q^ -240(Lysl3-Arg ；SEQ ID NO 16), Q β-250 (Lys2-Arg, Lysl3-Arg, SEQ ID NO 18), Q^ -259(Lys2-Arg, Lysl6-Arg ；SEQ ID NO :20)，禾口 Q β-251 (Lysl6_Arg ;SEQ ID NO: 19)。在一個進一步的實施方案中，我們公開了具有另外一個賴氨酸殘基的Qi3突變外殼蛋白 Q β-243 (Asn IO-Lys ；SEQ ID NO :17)，它適合獲得較高密度的抗原陣列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，RNA噬菌體的VLP由宿主重組產生，并且其中所述VLP基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述組合物還包含至少一種與VLP結合、優(yōu)選包裝或包封于VLP內部的聚陰離子大分子。在進一步優(yōu)選的實施方案中，聚陰離子大分子是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述組合物進一步包含至少一種與VLP結合、優(yōu)選包裝或包封于VLP內部的免疫刺激物。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述免疫刺激物是核酸，優(yōu)選DNA，最優(yōu)選含非甲基化CpG的寡核苷酸?；静缓拗鱎NA、優(yōu)選宿主核酸本文所用的術語“基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸”是指VLP所含的宿主RNA、優(yōu)選宿主核酸的量，該量典型且優(yōu)選地為每mg VLP不到 30 μ g，優(yōu)選不到20 μ g，更優(yōu)選不到10 μ g，甚至更優(yōu)選不到8 μ g，甚至更優(yōu)選不到6 μ g，甚至更優(yōu)選不到4 μ g，最優(yōu)選不到2 μ g。在上述內容中使用的宿主是指在其中重組產生VLP 的宿主。測定RNA(優(yōu)選核酸)的量的常規(guī)方法是本領域技術人員公知的。根據本發(fā)明測定RNA (優(yōu)選核酸)的量的典型且優(yōu)選的方法在W02006/037787A2的實施例17中描述。對于含有Q0以外的VLP的本發(fā)明的組合物，測定RNA(優(yōu)選核酸)的量典型且優(yōu)選地使用相同、相似或類似的條件。最終需要的條件的改變是本領域技術人員的常識。確定的量的數值應當典型且優(yōu)選地被理解為包括指定數值士 10%、優(yōu)選士5%偏差的數值。宿主RNA、優(yōu)選宿主核酸本文使用的術語“宿主RNA、優(yōu)選宿主核酸”或術語“具有二級結構的宿主RNA、優(yōu)選宿主核酸”是指最初由宿主合成的RNA或優(yōu)選核酸。然而，RNA、優(yōu)選核酸在典型且優(yōu)選地通過本發(fā)明的方法減少或去除RNA、優(yōu)選核酸的量的過程中可能經受化學和/或物理學改變，例如，RNA、優(yōu)選核酸的大小可能被縮短，或者其二級結構可能改變。但是，甚至這種得到的RNA或核酸仍然被認為是宿主RNA，或宿主核酸。2004年10月5日同一申請人提交的美國臨時申請中公開了確定VLP包含的RNA 的量以及減少VLP包含的RNA的量的方法，因此整個申請引入本文作為參考。減少或消除宿主RNA、優(yōu)選宿主核酸的量，最小化或者減少了不希望的T細胞應答，如炎性T細胞應答和細胞毒性T細胞應答，和其他不希望的副作用，如發(fā)熱，而同時保持特異性針對IL-I的強抗體應答。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明的組合物和本發(fā)明的 RNA-噬菌體的VLP的方法，其中所述VLP由宿主重組產生，并且其中所述VLP基本不含宿主RNA，優(yōu)選不含宿主核酸，該方法包括以下步驟a)由宿主重組產生具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌體的外殼蛋白、其變體或片段；b) 將所述病毒樣顆粒解裝配為所述RNA-噬菌體的所述外殼蛋白、其變體或片段；c)純化所述外殼蛋白、其變體或片段；d)將所述純化的所述RNA-噬菌體的外殼蛋白、其變體或片段重裝配為病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆?；静缓拗鱎NA，優(yōu)選不含宿主核酸；和e)連接至少一種具有至少一個第二附著位點的本發(fā)明的抗原與步驟d)獲得的所述VLP。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述純化的外殼蛋白、其變體或片段的重裝配在至少一種聚陰離子大分子的存在下實現。在一個方面，本發(fā)明提供用于治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的疫苗，所述疫苗包含本發(fā)明的組合物，優(yōu)選為有效量。因此，本發(fā)明提供用于治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的疫苗，所述疫苗包含優(yōu)選為有效量的一種組合物，所述組合物包含(a)具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原包含IL-I分子或由IL-I分子組成，其中 (a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接。本發(fā)明的組合物的有效量是能夠在被治療的受試者中，優(yōu)選地在人體中誘導免疫應答的量，優(yōu)選地導致治療或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的效果。在一個優(yōu)選實施方案中，所述疫苗包含(i)第一組合物，優(yōu)選為有效量，其中所述第一組合物是本發(fā)明的組合物，其中所述第一組合物中包含的IL-I分子是IL-I β分子，優(yōu)選為SEQ ID NO :136或SEQ ID NO 165 ；和(ii)第二組合物，優(yōu)選為有效量，其中所述第二組合物是本發(fā)明的組合物，其中所述第二組合物中包含的IL-I分子是IL-I α分子，優(yōu)選為 SEQ ID NO 203 或 SEQ ID NO :210。在一個優(yōu)選實施方案中，在疫苗所含的組合物中與VLP連接的IL-I分子可以來源于動物，優(yōu)選地來源于哺乳動物或人類。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的IL-I來源于人、牛、狗、貓、小鼠、大鼠、豬或馬。在一個優(yōu)選實施方案中，該疫苗進一步包含至少一種佐劑。本發(fā)明的一個有利的特征是組合物的高免疫原性，甚至在不含佐劑時依然如此。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，疫苗組合物不含佐劑。而且，不含佐劑使得不希望的炎性T 細胞應答的發(fā)生減至最少，炎性T細胞應答是針對自身抗原接種中的一個安全性問題。因此，優(yōu)選地給患者施用本發(fā)明的疫苗而不需在施用該疫苗之前、同時或之后給同一患者施用至少一種佐劑。然而，當施用佐劑時，至少一種佐劑的施用可以在施用本發(fā)明的組合物或疫苗之前、同時或之后進行。當給個體施用本發(fā)明的組合物和/或疫苗時，它可以是含有鹽、緩沖液、佐劑或其他改善偶聯(lián)物效果所需的物質的形式。適合在制備疫苗或藥物組合物中使用的材料的例子在許多資料中提供，包括 REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed, Mack Publishing Co, (1990))。其中包括無菌水溶液(例如生理鹽水)或非水溶液和懸液。非水溶劑的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、和注射用有機酯如油酸乙酯。可以利用載體或封閉敷料提高皮膚通透性并促進抗原吸收。如果接受個體(優(yōu)選人)能夠耐受本發(fā)明的疫苗的施用，則認為本發(fā)明的疫苗是 “藥學可接受的”。進而，本發(fā)明的疫苗以“治療有效量”(即產生希望的生理學效果的量) 施用。免疫應答的性質或類型不是本申請公開內容的限制因素。并非意在通過以下機制的解釋來限制本發(fā)明，本發(fā)明的疫苗可以誘導可與IL-I結合的抗體，從而降低了它的濃度和 /或干擾它的生理學或病理學功能。因此本發(fā)明提供用于治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的藥物組合物，所述藥物組合物包含(1) 一種組合物，該組合物包含(a)具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原包含IL-I分子或由IL-I分子組成，并且其中(a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接；和(2)藥學可接受的載體。本發(fā)明進一步提供用于治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的藥物組合物，所述藥物組合物包含(1) 一種疫苗，所述疫苗包含一種組合物，該組合物包含(a)具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原包含IL-I分子或由IL-I分子組成，并且其中(a)和(b) 通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接；和(2)藥學可接受的載體。本發(fā)明進一步提供治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的方法，所述方法包括給動物，優(yōu)選地給人施用本發(fā)明的組合物、疫苗或藥物組合物。本發(fā)明進一步提供治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的方法，所述方法包括給動物，優(yōu)選地給人施用(i)第一組合物，優(yōu)選為有效量，其中所述第一組合物是本發(fā)明的組合物，其中所述第一組合物中包含的IL-I分子是IL-I β分子，優(yōu)選為SEQ ID Ν0:136或SEQ ID NO 165 ；和 ( )第二組合物，優(yōu)選為有效量，其中所述第二組合物是本發(fā)明的組合物，其中所述第二組合物中包含的IL-I分子是IL-I α分子，優(yōu)選為SEQ ID NO 203或SEQ ID NO :210。因此，本發(fā)明提供治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的方法，所述方法包括給動物，優(yōu)選地給人施用組合物，所述組合物包含(a)具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原包含IL-I分子或由IL-I分子組成，并且其中(a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接。本發(fā)明進一步提供治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的方法，所述方
33法包括給動物，優(yōu)選地給人施用疫苗，所述疫苗包含一種組合物，該組合物包含(a)具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原包含IL-I分子或由IL-I分子組成，并且其中(a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接。本發(fā)明進一步提供治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的方法，所述方法包括給動物，優(yōu)選地給人施用藥物組合物，所述藥物組合物包含(1) 一種組合物，該組合物包含(a)具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原包含IL-I分子或由IL-I分子組成，并且其中(a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接；和(2) 藥學可接受的載體。本發(fā)明進一步提供治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的方法，所述方法包括給動物，優(yōu)選地給人施用藥物組合物，所述藥物組合物包含(1) 一種疫苗，所述疫苗包含一種組合物，該組合物包含(a)具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒(VLP)；和 (b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原包含IL-I分子或由IL-I分子組成，并且其中(a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接；和(2)藥學可接受的載體。關于本發(fā)明的方法，所述組合物、所述疫苗和/或所述藥物組合物以免疫有效量給所述動物，優(yōu)選地給所述人施用。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述動物是哺乳動物，優(yōu)選地選自貓、綿羊、豬、馬、牛、狗、大鼠、小鼠，最優(yōu)選為人。在一個實施方案中，所述組合物、疫苗和/或藥物組合物通過注射、輸注、吸入、口服或其他適當的物理方法來給所述動物，優(yōu)選地給所述人施用。在優(yōu)選的實施方案中，所述組合物、疫苗和/或藥物組合物通過肌肉內、靜脈內、經粘膜、經皮、鼻內、腹膜內、皮下或直接進入淋巴結給所述動物，優(yōu)選地給所述人施用。本發(fā)明的另一方面是此處所述的組合物、疫苗和/或藥物組合物在治療、改善和/ 或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病中的用途。更詳細地說，本發(fā)明提供一種組合物在治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的藥物中的用途，所述組合物包含(a)具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原包含IL-I分子或由IL-I分子組成，并且其中(a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接。本發(fā)明的另一方面是此處所述的組合物、疫苗和/或藥物組合物在制備用于治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的藥物中的用途。更詳細地說，本發(fā)明提供一種組合物在制備用于治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的藥物中的用途，所述組合物包含(a)具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原包含IL-I分子或由IL-I分子組成，并且其中(a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接。應當理解，此處所述的所有技術特征和實施方案，特別是對于本發(fā)明的組合物所述的那些，可以單獨地或以任何可能的組合應用于本發(fā)明的所有方面，特別是應用于疫苗、藥物組合物、方法和用途。在上下文中，明確強調所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原的以下實施方案是特別優(yōu)選的。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原包含或者優(yōu)選地由以下組成(i) IL-I β分子，其中所述IL-Ιβ分子選自SEQ ID Ν0:165和 SEQ ID Ν0:131-140中的任一個；和(ii)接頭，其中所述接頭包含所述第二附著位點，并且其中優(yōu)選地所述接頭包含或者優(yōu)選地由GGC (SEQ ID NO 178)或GGCG(SEQ ID NO 188)組成。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原由以下組成(i) IL-I β分子，其中所述IL-I β分子是SEQ ID NO: 165或SEQ ID NO: 136，優(yōu) 選SEQ ID NO 136 ；和(ii)接頭，其中所述接頭包含所述第二附著位點，并且其中所述接頭包含或者優(yōu)選地由GGC (SEQ ID NO 178)或GGCG (SEQ ID NO 188)組成，優(yōu)選地包含或者由 GGCG(SEQ ID NO: 188)組成。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原由以下組成(i) IL-I β分子，其中所述IL-I β分子是SEQ ID NO: 165或SEQ ID N0:136，優(yōu) 選SEQ ID N0:136;和(ii)接頭，其中所述接頭包含所述第二附著位點，并且其中所述接頭通過肽鍵共價結合到所述IL-I β分子的C末端，并且其中所述接頭包含或者優(yōu)選地由 GGC(SEQ ID NO 178)或 GGCG(SEQ ID NO 188)組成，優(yōu)選地包含或者由 GGCG(SEQ ID N0: 188)組成。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原由以下組成(i) IL-I β分子，其中所述IL-I β分子是SEQ ID Ν0:165或SEQ ID N0:136，優(yōu) 選為SEQ ID NO 136 ；和(ii)接頭，其中所述接頭包含所述第二附著位點，并且其中所述接頭通過肽鍵共價結合到所述IL-I β分子的C末端，并且其中所述接頭由LEHHHHHHGGCG(SEQ ID NO 219)組成。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原是 SEQ ID NOs 220-223 中的任一個，優(yōu)選為 SEQ ID NO 220。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原包含或優(yōu)選地由以下部分組成(i) IL-I α分子，其中所述IL-la分子選自SEQ ID Ν0 203-218;和(ii)接頭，其中所述接頭包含所述第二附著位點，并且其中優(yōu)選地所述接頭包含或者優(yōu)選地由 GGC(SEQ ID NO 178)或 GGCG(SEQ ID NO 188)組成。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原由以下部分組成(i) IL-I α分子，其中所述IL-I α分子是SEQ ID Ν0:203或SEQ ID NO :210，優(yōu)選為SEQ ID NO 203 ；和(ii)接頭，其中所述接頭包含所述第二附著位點，并且其中所述接頭包含或者優(yōu)選地由GGC(SEQ ID NO 178)或GGCG(SEQ ID NO 188)組成，優(yōu)選地包含或者由 GGCG (SEQ ID NO 188)組成。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原由以下組成(i) IL-I α分子，其中所述IL-I α分子是SEQ ID NO 203或SEQ ID Ν0:210，優(yōu) 選為SEQ ID Ν0:203;和(ii)接頭，其中所述接頭包含所述第二附著位點，并且其中所述接頭通過肽鍵共價結合到所述IL-I α分子的C末端，并且其中所述接頭包含或者優(yōu)選地由 GGC(SEQ ID NO 178)或 GGCG(SEQ ID NO 188)組成，優(yōu)選地包含或者由 GGCG(SEQ ID N0: 188)組成。
35
在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原是 SEQ ID NOs 224 或 225 中的任一個，優(yōu)選為 SEQ ID NO 224。
實施例實施例1U ILl α 117_270 和 IL-1 β 119_269 的克隆、表達和純化使用寡核苷酸IL 1 α 1(5，-ATATATGCTAGCCCCTTACACCTACCAGAGTGATTTG-3，；SEQ ID NO :24)和 IL 1 α 2(5’-ATATATCTCGAGTGATATCTGGAAGTCTGTCATA GAG-3' ； SEQ ID NO: 25)，通過PCR從TNF α -活化的鼠巨噬細胞cDNA文庫中擴增編碼鼠IL-I α的氨基酸 117-270的核苷酸序列。使用相同的cDNA文庫，用寡核苷酸IL 1 β 1 (5，-ATATATGCTAGCCC CCATTAGACAGCTGCACTACAGG-3' ;SEQ ID NO 26)和 ILl β 2 (5，-ATATATCTCGAGGGAAGACACAGA TTCCATGGTGAAG-3' ;SEQ ID NO 27)擴增編碼鼠IL-1 β前體的氨基酸119-269的核苷酸序列。兩條DNA片段用NheI和XhoI消化，并且克隆到表達載體pModECl (SEQ ID NO 29)內。載體pModECl(SEQ ID NO :29)是 pET22b (+) (Novagen Inc.)的衍生物，分兩步構建。第一步，將pET22b(+)的NdeI和XhoI位點之間的原始序列替換為退火的oligos 引物 MCS-1F(5’-TATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTA AACGGCGGCCGCAT-3 ‘ ； SEQ ID NO 30) 和引物 MCS-1R(5，-TCGAATGCGGCCGCCGTTTAAACCCTCGAGCGCTAGCCGGATCCA-3’ ；SEQ ID N0: 31)(在15mM TrisHCl pH 8緩沖液中退火)，由此改變pET22b (+)的多克隆位點。得到的質粒被命名為pModOO，在其多克隆位點中具有Ndel，BamHI、NheI, XhoI, PmeI和NotI 限制酶切位點。退火 oligos 對 Bamhis6-EK-Nhe-F(5’ -GATCCACACCACCACCACCACCACGG TTCTGGTGA CGACGATGACAAAGCGCTAGCCC-3’ ；SEQ ID NO 32)和 Bamhis6_EKNhe-R(5’ -T CGAGGGCTAGCGCTTTGTCATCGTCGTCACCAGAACCGTGGT GGTGGTGGTGGTGTG-3，；SEQ ID NO: 33)和退火 oligo 對 IF-C-甘氨酸-接頭(5，-TCGAGGGTGGTGGTGGTGGTTGCGGTTAATAAGTT TAAACGC-3，；SEQ ID NO 34)和 oligolR-C-甘氨酸-接頭(5，-GGCCGCGTTTAAACTTATTA ACCGCAACCACCACCACCACCC-3' ;SEQ ID NO 35) 一起連接到 BamHI-NotI 消化的 pModOO 質粒內，獲得pModECl，其編碼N-末端六組氨酸標簽，腸激酶酶切位點和含有一個半胱氨酸殘基的C-末端甘氨酸接頭。上述片段向pModECl內的克隆分別產生質粒pModECl-His-EK-mlLl α 117_27(1和 pModECl-His-EK-mILl β 119_269。這些質粒分別編碼由N-末端His-標簽、腸激酶酶切位點、成熟鼠IL-I α或IL-I β和含C-末端半胱氨酸的接頭(GGGGGCG，SEQ ID NO 28)組成的融合蛋白。對于表達，含有質粒的大腸桿菌BL21細胞在37 °C生長至600nm處OD為1. O，然后加入ImM濃度的異丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷誘導。細菌在37°C下生長4小時，離心收獲，重懸浮在80ml裂解緩沖液(IOmM Na2HPO4, 30mM NaCl,pH 7.0)中。然后超聲處理破碎細胞，在室溫下與64μ1 2Μ MgCljP ΙΟμΙ Benzonase孵育30分鐘消化細胞DNA和RNA。離心除去細胞碎片(SS34轉頭，20000rpm, 4°C，60min)，將澄清的裂解液加到Ni2+-NTA瓊脂糖柱 (Qiagen,Hilden,Germany)上。用洗滌緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mM Imidazol， pH 8.0)充分洗滌后，用洗脫緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,200mM Imidazol, pH 8.0) 洗脫蛋白質。純化的蛋白質用PBS pH 7. 2透析，在液氮中驟凍，并且貯存在-80°C直到進一步使用。
實施例2A.小鼠IL-I β 119-269與Qi3病毒樣顆粒的偶聯(lián)在PBS pH 7. 2中含有1. 3mg/ml實施例1獲得的純化的鼠IL-1 β 119_269蛋白(SEQ ID NO 66)的溶液在室溫下與等摩爾量的TCEP孵育60分鐘，以還原C-末端半胱氨酸殘基。然后6ml 2mg/ml Q^衣殼蛋白在PBS pH 7. 2中的溶液在室溫下與131 μ 1 SMPH 溶液(65mM，在DMSO中)反應60分鐘。反應溶液在4°C下用3升20mM HEPES, 150mM NaCl pH 7. 2透析24小時，其中更換三次透析液。75 μ 1衍生化并透析的QP溶液與117 μ 1 H2O 和308 μ 1純化并預還原的小鼠IL-li3119_269蛋白混合，并且在15°C下孵育過夜，用于化學交聯(lián)。使用分子量截斷值為300，OOODa的纖維素酯膜，通過相對于PBS正切流動過濾除去未偶聯(lián)的蛋白質。偶聯(lián)的產物在還原條件下的12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分析。

圖1中顯示考馬斯染色的凝膠?？梢妿讞l相對于Q0衣殼單體分子量升高的帶，清楚地證明了小鼠 IL-13 119-269蛋白與Q3衣殼的成功交聯(lián)。B.使用與Qβ衣殼偶聯(lián)的小鼠IL-I β 119_269蛋白(Qi3 -mIL-1 β 119_269)免疫小鼠對5只balb/c雌性小鼠用Qβ-mIL-lβ119_269(SEQ ID No 66)進行免疫。將 50 μ g 總蛋白質用PBS稀釋到200 μ 1，并在第0天、第21天皮下注射(100 μ 1在腹部兩側)。在第0天、第21天和第35天，對小鼠眶后取血，使用小鼠IL-I β 119_269特異性的ELISA分析血清。C. ELISA使用濃度為1 μ g/ml的小鼠IL-I β 119_269蛋白包被ELISA板。封閉該板，然后與第 0天、第21天、第35天的小鼠血清的連續(xù)稀釋液一起孵育。使用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測結合的抗體。以在450nm處產生半數最大光密度的那些稀釋度的平均值來計算小鼠血清的抗體效價?？剐∈驣L-I β 119_269的平均效價是第21天1 22262，第35天1 309276。這表明使用與小鼠仏-10119_269蛋白偶聯(lián)的03免疫能夠克服免疫耐受，并產生特異性識別 IL-I β 119_269的高效價抗體。D. IL-I β的體外中和然后測試Qi3 -mIL-1 β 119_269 (SEQ ID No 66)免疫小鼠的血清抑制小鼠IL-1 β蛋白與其受體結合的能力。因而使用濃度為ι μ g/ml的重組mIL-1受體I_hFc融合蛋白包被 ELISA板，并與免疫小鼠的血清的連續(xù)稀釋液共孵育，所述小鼠已用與Qi3衣殼偶聯(lián)的小鼠 IL-I β 119_269免疫或者用與0日衣殼偶聯(lián)的小鼠IL-I α 117_27。與lOOng/ml的小鼠IL-1 β 119_269 免疫。使用生物素化的抗小鼠IL-I β抗體與辣根過氧化酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白來檢測IL-I β 119_269與固定化的mIL-1受體I-hFc融合蛋白的結合。所有的針對鼠IL-I β 119_269 免疫的小鼠的血清在濃度為> 0. 4%時完全抑制小鼠IL-I β 119_269與其受體的結合，而針對小鼠IL-I α 117_270免疫的小鼠的血清甚至在最高使用濃度(3. 3% )時都沒有顯示任何抑制效果。這些數據表明用偶聯(lián)到Q0衣殼上的小鼠IL-I β 119_269免疫能夠產生能夠特異性地中和小鼠IL-I β 119_269與其受體相互作用的抗體。E.IL-Ιβ的體內中和然后研究了通過用00-!1111^10119_269免疫而產生的抗體的體內中和能力。因而在第0天、第14天用Qi3 -mIL-1 β 119_269對4只balb/c雌性小鼠免疫兩次，同時單獨用Q β衣殼對4只小鼠免疫。在第21天對所有小鼠靜脈注射Iyg游離IL-I β 119_269。作為注射的IL-I β 119_269的炎癥活性的讀數，在注射3小時后分析血清樣本中促炎細胞因子IL-6濃度的相對增加。Q0免疫的小鼠顯示出血清IL-6濃度平均增加1.01 士0.61ng/ml，而用 Q^-mIL-l β 119_269免疫的小鼠則顯示出平均增加只有0. 11 士0. 30ng/ml (ρ = 0. 004)。作為對照，在第28天對所有小鼠注射1 μ g mIL-1 α。注射3小時后，僅用Q0載體免疫的小鼠顯示出血清IL-6濃度平均增加40. 24士8. 06ng/ml，而用Q^-mIL-l β 119_269免疫的小鼠則顯示出增加57. 98士29. 92ng/ml (ρ = 0. 30)。這些數據表明用Q^-mIL-l β 119_269免疫產生的抗體能夠特異性地、有效地中和IL-Ia的促炎癥反應活性。實施例3Α.小鼠IL-I α 117_270與Q β病毒樣顆粒的偶聯(lián)在PBS ρΗ 7. 2中含有1. 8mg/ml實施例1獲得的純化的鼠IL-1 α 117_270蛋白(SEQ ID NO 65)的溶液在室溫下與等摩爾量的TCEP孵育60分鐘，以還原C-末端半胱氨酸殘基。然后6ml 2mg/ml Q^衣殼蛋白在PBS ρΗ 7. 2中的溶液在室溫下與131 μ 1 SMPH 溶液(65mM，在DMSO中)反應60分鐘。反應溶液在4°C下用3升20mM HEPES, 150mM NaCl ρΗ 7. 2透析24小時，其中更換三次透析液。75 μ 1衍生化并透析的Q β溶液與192 μ 1 H2O 和233 μ 1純化并預還原的小鼠IL-I α 117_27(|蛋白混合，并且在15°C下孵育過夜，用于化學交聯(lián)。使用分子量截斷值為300，OOODa的纖維素酯膜，通過相對于PBS正切流動過濾除去未偶聯(lián)的蛋白質。偶聯(lián)的產物在還原條件下的12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分析。圖2中顯示考馬斯染色的凝膠。可見幾條相對于Q0衣殼單體分子量升高的帶，清楚地證明了小鼠 IL-I α 117_270蛋白與Qβ衣殼的成功交聯(lián)。B.使用與Qβ衣殼偶聯(lián)的小鼠IL-I α 117_270蛋白(Qi3 -mIL_l α 117_270)免疫小鼠對5只balb/c雌性小鼠用Q β -mIL_l α 117_270進行免疫。將50 μ g總蛋白質用PBS 稀釋到200 μ 1，并在第0天、第21天對小鼠皮下注射(100 μ 1在腹部兩側)。在第0天、第 21天和第35天，對小鼠眶后取血，使用小鼠IL-I α 117_270特異性的ELISA分析血清。C. ELISA使用濃度為1 μ g/ml的小鼠IL-I α 117_270蛋白包被ELISA板。封閉該板，然后與第 0天、第21天、第35天的小鼠血清的連續(xù)稀釋液一起孵育。使用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測結合的抗體。以在450nm產生半數最大光密度的那些稀釋度的平均值來計算小鼠血清的抗體效價。抗小鼠仏-10117_27(1的平均效價是第21天1 9252，第35天1 736912。這表明使用與小鼠仏-1(!117_27(|蛋白偶聯(lián)的03免疫能夠克服免疫耐受，并產生特異性識別 IL-I α 117_270的高效價抗體。D. IL-I α的體外中和然后測試Qi3 -mIL-1 α 117_270免疫小鼠的血清抑制小鼠IL-I α 117_27(1蛋白與其受體結合的能力。因而使用濃度為ι μ g/ml的重組mIL-1受體I_hFc融合蛋白包被ELISA板，并與免疫小鼠的血清的連續(xù)稀釋液共孵育，所述小鼠已用與Q0衣殼偶聯(lián)的小鼠IL-I α 117_270 免疫或者用與Q β衣殼偶聯(lián)的小鼠IL-I β 119_269與5ng/ml的小鼠IL-I α 117_27(1免疫。使用生物素化的抗小鼠IL-I α抗體與辣根過氧化酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白來檢測IL-I α 117_270 與固定化的mIL-1受體I-hFc融合蛋白的結合。所有的針對鼠IL-I α 117_27(1免疫的小鼠的血
38清在濃度為彡0. 4%時完全抑制小鼠IL-I α 117_27(1與其受體的結合，而針對小鼠IL-I β 119_269 免疫的小鼠的血清甚至在最高使用濃度(3.3%)時都沒有顯示明顯的抑制效果。這些數據表明用偶聯(lián)到Q0衣殼上的小鼠仏-1(1117_27(|免疫能夠產生能夠特異性地中和小鼠 IL-I α 117_270與其受體相互作用的抗體。Ε. IL-I α的體內中和然后研究了通過用^^-!!！仏-丨 …㈣免疫而產生的抗體的體內中和能力。因而在第0天、第14天用Qi3 -mIL-1 α 117_270對4只balb/c雌性小鼠免疫兩次，同時單獨用Q β 衣殼對4只小鼠免疫。在第21天對所有小鼠靜脈注射Iyg游離IL-I α 117_27(|。作為注射的IL-I α 117_270的炎癥活性的讀數，在注射3小時后分析血清樣本中促炎細胞因子IL-6濃度的相對增加。Q0免疫的小鼠顯示出血清IL-6濃度平均增加8. 16士2. 33ng/ml，而用 Q^-mIL-l α 117_270免疫的小鼠則顯示出平均增加只有0. 15士0. 27ng/ml (ρ = 0. 0005)。作為對照，在第28天對所有小鼠注射lygmIL-li3。注射3小時后，僅用Qi3載體免疫的小鼠顯示出血清IL-6濃度平均增加9. 52士7. 33ng/ml，而用-mIL-1 α 117_270免疫的小鼠則顯示出增加21.46±27.36ng/ml(p = 0.43)。這些數據表明用Q β-mlL-l α 117_27(1免疫產生的抗體能夠特異性地、有效地中和IL-Ia的促炎活性。實施例4Q β -mlL-I α 117_270 禾口 Q β -mlL-I β 119_269 免疫與ICineret 治療在類風濕性關節(jié)炎小鼠模型中的比較Kineret (Anakinra，Amgen)是一種重組的人IL-I受體拮抗劑，被批準用來治療人類類風濕性關節(jié)炎。為了達到臨床效果，必須每天通過皮下注射使用相對高的劑量 (IOOmg)。用膠原誘導的關節(jié)炎模型來比較Q β -mIL-1 α 117_27(1、Q β -mIL-l β 119_269免疫與每日應用不同劑量Kineret 的有效性。對dba/i雄性小鼠用50μ g Q^-miL-i α 117_27Q(n = 8)、Q β -mlL-I β 119_269 (η = 8)或者單獨Q β (η = 32) 3次(第0天、第14天和第28天)皮下免疫，然后在第42天皮內注射200 μ g與完全弗氏佐劑混合的牛11型膠原。從第42天起，用 Q^-mIL-l α 117_270與-mIL_l β 119_269免疫的小鼠與一組Qβ免疫的小鼠(η = 8)每日接受腹膜內注射200μ1 PBS，而另外三組Qi3免疫的小鼠每日接受腹膜內注射37. 5yg(n = 8)、375 μ g(n = 8)或者 3. 75mg(n = 8) Kineret 。每只小鼠每日注射 37. 5 μ gKineret 大致相當于1.5mg/kg的劑量，這在推薦的對于人類有效的劑量范圍內(IOOmg)。所有的小鼠在第63天加強注射200 μ g與不完全弗氏佐劑混合的牛II型膠原，并每日檢查關節(jié)炎癥狀的發(fā)展。第二次膠原注射4周后，Q^免疫的對照小鼠顯示出3.75的平均累積臨床評分(如W02008/037504A1的實施例2F定義的)，而-mIL-1 α 117_270和 Q β -mIL-1 β 119_269免疫的小鼠分別顯示出僅為0. 81和1. 44的平均評分(見表1)。用 37. 5 μ g或者375 μ g Kineret 治療的小鼠分別達到了 2. 44和2. 63的平均評分，而用 3.75mgKineret 治療的小鼠基本保持無癥狀，達到了僅為ο. 19的最高評分。定期測量所有動物的后踝關節(jié)厚度，作為炎癥反應的附加讀數。第二次膠原注射 4周后，Qi3免疫的對照小鼠顯示出后踝關節(jié)厚度平均增加16%，而Qi3-mIL-la117_27(1免疫的小鼠顯示出增加2%，03-11111^-13119_269免疫的小鼠顯示出增加6%。用37. 5yg或者 375μ gKineret 治療的小鼠分別顯示出13%和ιο%的平均增加，而用3.75mgKineret 治療的小鼠則顯示出后踝關節(jié)厚度完全沒有增加?？傊?，我們驚奇地發(fā)現三次注射Qi3 -mIL-1 α 117_270或者Qi3 -mIL_l β 119_269要比每日以與人類相當的劑量或者甚至十倍于人類的劑量注射Kineret 更好地保護小鼠免于關節(jié)炎癥狀的發(fā)展。只有應用loo倍于人類的劑量的Kineret 時才顯示出對應于 Q^-mIL-l α 117_270或者Qi3 -mIL_l β 119_269免疫接種的增強的有益效應。表1 膠原誘導的關節(jié)炎模型中的臨床疾病癥狀
治療第91天的平均臨床評分第63-91天的后踝關節(jié)厚度平均增加(％)3x Qp皮下+ PBS腹膜內(200 μ /天)3.75163x QP-mIL-lan7.270 皮下 +PBS 腹膜內 (200 μ /天)0.8123χ Qp-mIL-Ιβι 19-269 皮下 +PBS 腹膜內 (200 μ /天)1.4463x Qp皮下 + Kineret 腹膜內(37.5 天)2.44133x Qp皮下 + Kineret 腹膜內(375 pg/天)2.63103x QP皮下 + Kineret 腹膜內(3.75 mg/天)0.190實施例5Α.與小鼠 IL-I α 117_270 基因融合的 ΑΡ205 外殼蛋白(AP205_mIL_l α 117_270)所組成的病毒樣顆粒的克隆、表達和純化考慮到IL-I α的大體積與空間原因，構建產生所謂的嵌合顆粒的表達體系，該嵌合顆粒包含與IL-Ici融合的ΑΡ205衣蛋白和野生型外殼蛋白亞單元。在這一體系中，終止密碼子的阻抑產生AP205-IL-1 α外殼蛋白融合物，而正確的終止產生野生型ΑΡ205外殼蛋白。兩種蛋白質在細胞中同時產生，并裝配為嵌合病毒樣顆粒。制備兩個編碼被阻抑型密碼子TAG(琥珀，pAP590)或者TGA(乳白，pAP592)終止的AP205外殼蛋白基因的中間質粒PAP590和pAP592。將一個編碼三肽Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO 189)的接頭序列添加到外殼蛋白基因的下游和閱讀框中。在Gly-Ser-Gly氨基酸接頭的C末端和AP205外殼蛋白的C末端添加Kpn2I和HindIII位點，用于克隆編碼外源氨基酸序列的序列。產生的構建體是AP590(SEQ ID NO 117) :AP205 外殼蛋白基因-琥珀密碼子-GSG(Kpn2I_HindIII)； AP592 (SEQ ID NO 118) :AP205 外殼蛋白基因-乳白密碼子-GSG(Kpn2I_HindIII)。為了構建質粒 pAP590，用 NcoI 和 HindIII 消化由寡核苷酸 pi. 44(5，-NNCCATGGCAAATAAGCCAATGC AACCG-3，；SEQ ID NO 119)和 pINC_36(5，-GTAAGCTTAGATGCATTATCCGGATCCCTAAGCAGTAGTA TCAGACGATACG-3' ;SEQ ID NO : 120)獲得的PCR片段，并將其克隆到已經用相同的限制性內切酶消化的pQbl85載體中。pQbl85是一個由pGEM載體衍生的載體。此載體中克隆基因的表達受trp啟動子的控制(Kozlovska, Τ. Μ.等人，Gene 137:133-37(1993))。同樣地，通過克隆 Ncol/Hindlll 消化的由寡核苷酸 pi. 44 和 pINC-40 (5，-GTAAGCTTAGATGCATTATCCGG ATCCTCAAGCAGTAGTA TCAGACGATACG-3，；SEQ ID NO 121)獲得的 PCR 片段到同樣的載體內，構建質粒PAP592。使用將Kpn2I和HindIII限制性位點分別添加到5’和3’末端的引物pINC_34(5 ‘-GGTCCGGAGCGCTAGCCCCTTACAC-3 ‘ ；SEQ ID NO 122)和 pINC-35 (5，_GTAAGCTTATGCATTATGA
40TATCTGGAAGTCTGTCATAGA-3，；SEQ ID NO 123)，從質粒 pModECl-His-EK-mlLl α 117_27(| (見實施例1)中PCR擴增編碼鼠IL-I α的氨基酸117-270的序列。獲得的DNA片段用Κρη2Ι和 HindIII消化，并分別克隆到ρΑΡ590載體和ρΑΡ592載體中，分別產生出質粒ρΑΡ594(琥珀阻抑)和ΡΑΡ596 (乳白阻抑)質粒。為了表達在其表面上展示鼠IL-Ia的嵌合ΑΡ205 VLP，分別用ρΑΡ594質粒或者 ΡΑΡ596質粒轉化包含pISM 579質?；蛘遬ISM 3001質粒的大腸桿菌JM109細胞。通過使用限制性核酸內切酶EcoRI從pISM3001上切除trpT176基因，并用來自pMY579質粒(Michael Yarus贈予)的包含琥珀t-RNA抑制基因的EcoRI片段置換它，產生質粒pISM579。此t-RNA 阻抑基因是 trpT175 的突變體(Raftery LA.等人(1984) J. Bacteriol. 158 :849_859)，在 G33、A24和T35這3個位點不同于trpT175。在包含20 μ g/ml氨芐青霉素和10 μ g/ml卡那霉素的5毫升LB液體培養(yǎng)基中接種單一菌落，并在37°C下靜置培養(yǎng)16-24小時。制備的接種物用包含20 μ g/ml氨芐青霉素和10 μ g/ml卡那霉素的M9培養(yǎng)基稀釋50倍，并在 37°C下在搖床中過夜培養(yǎng)。通過離心分離收獲細胞。在裂解緩沖液(20mMTris_HCl、5mM EDTA、150mM NaCl、ρΗ7· 8、0· 吐溫 20)中通過超聲處理來裂解細胞(lg，用質粒PAP594轉化，包含pISM579)。通過離心分離來清除裂解液，用裂解緩沖液來清洗細胞碎片。將合并的上清液加樣到瓊脂糖凝膠CL-4B柱上，用 TEN緩沖液(20mM Tris_HCl，5mM EDTA, 150mM NaCl, pH 7.8)洗脫。通過瓊脂糖凝膠電泳 (1 % TAE，溴化乙啶染色凝膠和UV檢測)證實在清除的裂解液和清洗的上清液中存在衣殼。通過SDS-PAGE或者310nm處的光散射UV光譜分析來檢測從柱上洗脫的兩個峰。將包含衣殼的第二個峰的級分集中并加樣到瓊脂糖凝膠CL-6B柱上。集中CL-6B柱的峰級分，并用離心過濾單元(Amicon Ultra 15MWC0 30000,Millipore)來濃縮。通過新一輪的CL-4B柱的凝膠過濾來進一步純化蛋白質，并集中產生的峰級分，如上所述用離心過濾單元來濃縮。將緩沖液更換為IOmM Hepes, pH 7. 5，并添加甘油到50%的最終濃度。基本上按照以上描述的純化pAP594的步驟，從質粒pAP596中純化AP205_ mIL-la117_2TO，在經過最后的CL-4B柱后，增加另外一個蔗糖梯度純化步驟。蛋白質在用以下蔗糖溶液制備的梯度上分層9ml36%，3ml 30%,6ml 25%,8ml 20%,6ml 15%,6ml 10%和3ml 5%蔗糖。通過紫外光譜鑒定級分，集中的含有衣殼的級分如上所述用離心過濾單元來濃縮，緩沖液更換為IOmM Hepes, pH 7.5。最后添加甘油到50%的最終濃度。B.使用 AP205_mIL_l α 117_27。免疫小鼠4只balb/c雌性小鼠用AP205_mIL_l α 117_270免疫。將25 μ g總蛋白用PBS稀釋到200 μ 1，并在第0天、第14天和第28天對小鼠皮下注射(100 μ 1在腹部兩側)。在第0 天、第14天、第28天和第35天對小鼠眶后取血，使用鼠IL-I α 117_270-特異性ELISA來分析血清。C. ELISA使用濃度為1 μ g/ml的小鼠IL-I α 117_27。蛋白包被ELISA板。封閉板，然后與第14 天、第28天和第35天的小鼠血清的連續(xù)稀釋液一起孵育。使用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測結合的抗體。以在450nm處產生半數最大光密度的那些稀釋度的平均值來計算小鼠血清的抗體效價。抗小鼠IL-I Ci117,的平均效價是第14天1 4412，第28天1 27955，第35天1 34824。這表明使用AP205_mIL_l α 117_270免疫能夠克服免疫耐受，并產生特異
41性識別IL-I α 117_270的高效價抗體。D. IL-I α的體外中和檢測AP205_mIL_l α 117_270免疫小鼠的血清抑制鼠IL-1 α蛋白與其受體結合的能力。因而使用濃度為ι μ g/ml的重組mIL-1受體I_hFc融合蛋白包被ELISA板，并與來自單獨用AP205_mIL-l α 117_270或者單獨用ΑΡ205與100ng/ml的小鼠IL-1 α 117_270 一起免疫的小鼠的血清的連續(xù)稀釋液共孵育。使用生物素化的抗小鼠IL-I α抗體與辣根過氧化酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素來檢測IL-I α 117_270與固定化的mIL-1受體I_hFc融合蛋白的結合。所有的AP205_mIL_l α 117_27(1免疫的小鼠的血清在濃度為彡3. 3%時完全抑制小鼠IL-1 α 117_270 與其受體結合，而ΑΡ205免疫的小鼠血清在任何濃度都沒顯示明顯的抑制效果。這些數據表明用AP205_mIL_l α 117_270免疫能夠產生能夠特異性地中和小鼠IL-I α 117_270與其受體相互作用的抗體。Ε. IL-I α的體內中和然后研究通過AP205_mIL-la117_27Q免疫而產生的抗體的體內中和能力。因而在第O天、第14天和第28天用AP205_mIL-l a 117_270對4只balb/c雌性小鼠免疫3次，同時有4只小鼠單獨用AP205免疫。在第42天對所有小鼠靜脈注射1 μ g游離的鼠IL_1117_27(I。作為注射的IL-I α 117_270的炎癥活性的讀數，在注射前和注射3小時后取樣，并分析血清樣本中促炎細胞因子IL-6濃度的相對增加。ΑΡ205免疫的小鼠顯示出血清IL-6濃度平均增加12. 92士3. 95ng/ml，而用AP205_mIL_l α 117_270免疫的小鼠則顯示出平均增加只有 0. 06 士0. 05ng/ml (ρ < 0. 01)。這些數據表明用AP205_mIL_l α 117_270免疫產生的抗體能夠特異性地、有效地中和IL-I α的促炎活性。實施例6Α.與小鼠 IL-I β 119_269 基因融合的 ΑΡ205 外殼蛋白(AP205_mIL_l β 119_269)所組成的病毒樣顆粒的克隆和表達基本上按照實施例5中所述的對AP205_mIL_l α 117_270的操作來對與小鼠 IL-I β 119_269基因融合的ΑΡ205外殼蛋白所組成的病毒樣顆粒進行克隆、表達和純化。使用弓丨物 pINC-75(5，-GATCCGGAGGTGGTGTCCCCATTAGACAGCT-3’，SEQ ID NO 192)和 ρINC -77(5’ -GTAAGCTTAGGAAGACACAGATTCCAT-3’，SEQ ID NO :193)，從編碼鼠 IL-1 β 的質粒 pModECl-His-EK-mILl β 119_269 中擴增鼠 IL-I β 序列。這對引物擴增帶有 5，Κρη2Ι 和 3，Hind III位點的鼠IL-Ιβ基因，并且另外編碼在鼠IL-I β的N端的Gly-Gly氨基酸序列。將獲得的鼠IL-Ιβ片段用Κρη2Ι和HindIII消化，并克隆到載體ρΑΡ590(琥珀阻抑)的相同限制性位點，產生質粒ΡΑΡ630。用質粒ρΑΡ630轉化包含質粒pISM579并提供琥珀阻抑的大腸桿菌JM109。在包含20 μ g/ml氨芐青霉素和10 μ g/ml卡那霉素的5ml LB液體培養(yǎng)基中接種單一菌落，并在37°C下靜置培養(yǎng)16-24小時。制備的接種物用包含20 μ g/ml氨芐青霉素和10 μ g/ml卡那霉素的M9培養(yǎng)基稀釋50倍，并在37°C下在搖床中過夜培養(yǎng)。通過離心分離收獲細胞。B.與人 IL-I β 119_269 基因融合的 ΑΡ205 外殼蛋白(AP205_hIL_l β 119_269)所組成的病毒樣顆粒的克隆和表達使用引物pINC-74(5，-GA TCC GGA GGT GGT GCC CCT GTA CGA TCA CTG AAC TG-3，，SEQ ID NO 194)和 pINC-76(5，-GTATGCATTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAAGTC-3,SEQID NO 195)，從編碼人IL-I β的質粒pET42T_hIL_l β 116_269上擴增人IL-1 β序列，分別引 Λ 5，Κρη2Ι和3，Mphll03I位點。將獲得的人IL-I β片段用Κρη2Ι和Mphll03I消化，并克隆到載體PAP590 (琥珀阻抑)的相同限制性位點，產生質粒pAP649。用質粒pAP649轉化包含有質粒PlSM 579 (提供琥珀阻抑)的大腸桿菌JM109。在包含20 μ g/ml氨芐青霉素和 10 μ g/ml卡那霉素的5ml LB液體培養(yǎng)基中接種單一菌落，并在37°C下靜置培養(yǎng)16-24小時。制備的接種物用包含20 μ g/ml氨芐青霉素和10 μ g/ml卡那霉素的M9培養(yǎng)基稀釋50 倍，并在37°C下在搖床中過夜培養(yǎng)。通過離心分離收獲細胞。
C.使用 AP205_mIL_l β 119_269 免疫小鼠4只C3H/HeJ雌性小鼠用AP205_mIL_l β 119_269進行免疫。將25 μ g總蛋白用PBS 稀釋到200 μ 1，并在第0天、第14天和第28天對小鼠皮下注射(100 μ 1在腹部兩側)。在第0天、第14天、第28天和第35天對小鼠眶后取血，使用IL-I β 119_269特異性ELISA來分析血清。D. ELISA使用濃度為1 μ g/ml的小鼠IL-I β 119_269蛋白包被ELISA板。封閉該板，然后與第 0天、第14天、第28天和第35天的小鼠血清的連續(xù)稀釋液一起孵育。使用酶標記的抗小鼠 IgG抗體檢測結合的抗體。以在450nm處產生半數最大光密度的那些稀釋度的平均值來計算鼠血清的抗體效價。平均抗小鼠IL-I β 119_269效價在第14天為1 19000，在第28天為 1 58200，在第35天為1 104700。這表明使用AP205_mIL_l β 119_269免疫能夠克服免疫耐受，并產生特異性識別小鼠IL-I β 119_269的高效價抗體。Ε. IL-I β的體外中和然后測試AP205_mIL_l β 119_269免疫小鼠的血清抑制小鼠IL-1 β蛋白與其受體結合的能力。因而使用濃度為lyg/ml的重組mIL-1受體I-hFc融合蛋白包被ELISA板，與來自單獨用AP205_mIL-l β 119_269或者單獨用ΑΡ205與100ng/ml小鼠IL-1 β 119_269 —起免疫的小鼠的血清的連續(xù)稀釋液共孵育。使用生物素化的抗小鼠IL-I β抗體與辣根過氧化酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素來檢測IL-I β 119_269與固定化的mIL-1受體I-hFc融合蛋白的結合。所有的來自用AP205_mIL-l β 119_269免疫的小鼠的血清強烈抑制小鼠IL-1 β 119_269與其受體的結合，而來自單獨用ΑΡ205免疫的小鼠的血清則沒有顯示任何抑制效果。這些數據表明用 AP205_mIL-l β 119_269免疫能夠產生能夠是和小鼠IL-I β 119_269與其受體相互作用的抗體。F. IL-I β的體內中和然后研究通過AP205_mIL_l β 119_269免疫而產生的抗體的體內中和能力。因而在第 O天、第14天和第28天用AP205_mIL-l β 119_269對4只C3H/HeJ雌性小鼠免疫三次，同時有 4只小鼠單獨用AP205免疫。在第42天對所有小鼠靜脈注射1 μ g游離的鼠IL-I β 119_269。作為注射的IL-I β 119_269的炎癥活性的讀數，在注射前和注射3小時后取樣，并分析血清樣本中促炎細胞因子IL-6濃度的相對增加。ΑΡ205免疫的小鼠顯示出血清IL-6濃度增加0. 28ng/ml，而用AP205_mIL_l β 119_269免疫的小鼠顯示根本沒有增加。這些數據表明用 AP205_mIL-l β 119_269免疫產生的抗體能夠特異性地、有效地中和IL-I β的促炎活性。H.用 AP205_hIL_l β 116_269 對小鼠的免疫用AP205_hIL_l β 116_269免疫4只C3H/HeJ雌性小鼠。25 μ g總蛋白質在PBS中稀釋為200μ 1，并在第0、14、28天皮下注射(腹部兩側100 μ I).小鼠在第O、14、28、35天眼眶后放血，并使用人AP205_hIL-l β 116_269特異性ELISA分析血清。I. ELISAELISA平板用濃度為lyg/ml的人IL_li3116_269蛋白包被。封閉平板，然后與系列稀釋的來自第0、14、28、35天的小鼠血清一起孵育。用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測結合的抗體。作為導致450nm下半數最大光密度的稀釋度的平均值計算小鼠血清的抗體效價。平均抗人IL-I β 116_269效價在第14天為1 39600，第28天為1 58300，第35天為 1 65600。這證明T AP205_hIL-l β 116_269在小鼠中誘導高效價的hIL-Ι β 116_269特異性抗體。實施例7Α.人IL-I β 116_269的克隆、表達和純化以人類肝組織的cDNA文庫為模板，使用寡核苷酸HIL-1 (5，-ATATATGATATCCCTGTA CGATCACTGMCTGCACG-3' ;SEQ ID NO 124)和HIL-2 (5，_ATATATCTCGAGGGMGACACAAATTGCATG GTGAAG-3，;SEQ ID NO 125)，通過PCR擴增編碼人 IL-1 β (hIL_l β 116_269)的氨基酸 116-269 的核苷酸序列，將擴增的核苷酸序列用XhoI和EcoRV消化，并克隆到表達載體ρΕΤ42Τ(+) 中。通過用新的接頭序列置換pET_42a(+) (Novagen)的T7啟動子和T7終止子之間的整個區(qū)域分兩個步驟來構建質粒PET-42T(+)，這促進將目標蛋白質表達為與包含His-標簽的C末端標簽(SEQ ID NO :190)和含有半胱氨酸的接頭的融合蛋白。第一步，用限制性內切酶NdeI和AvrII消化質粒pET_42a(+)，釋放一個位于T7啟動子和T7終止子之間的958bp的由1個GST標簽、S標簽、2個His標簽和多克隆位點組成的片段。分離包含pET-42a(+)載體主鏈的4792bp的殘留片段，并將其連接到退火的互補寡核苷酸42_1 (5 ‘ -TATGGATATCGAATTCAAGCTTCTGCAGCTGCTCGAGTAATTGATTAC-3 ‘ ；SEQ ID NO: 126)禾口 42-2(5 ‘ -CTAGGTAATCAATTACTCGA GCAGCTGCAGAAGCTTGAATTCGATATCCA-3 ‘ ；SEQ ID NO: 127)上，產生質粒pET-42S(+)。第二步，將質粒pET_42S (+)通過用限制性內切酶XhoI和 AvrII消化而線性化，并連接到互補的退火寡核苷酸42T-1 (5 ‘ -TCGAGCACCACCACCACCACCA CGGTGGTTGCTAATAATAATTGATTAATAC-3' ； SEQ ID NO :128)和42T-2(5' -CTAGGTATTAATCAAT TATTATTAGCAACCACCGTGGTGGTGGTGGTGGTGC-3' ；SEQ ID NO 129)上，產生質粒pET_42T (+)。將上面提到的hIL-Ι β 116_269片段克隆到ρΕΤ_42Τ(+)中，產生了質粒 pET42T-hIL-li3116_269。此質粒編碼相當于成熟的人IL-I β、1個His標簽和1個C-末端包含半胱氨酸的接頭(GGC，SEQ ID NO 178)的融合蛋白。因此，該融合蛋白由在C-末端融合到SEQ ID NO 165上的SEQ ID NO 190組成。位于人IL-I β的117位點的原始丙氨酸殘基在此融合蛋白中轉變?yōu)楫惲涟彼??；旧习凑諏嵤├?所述的對于鼠mIL-1 β 119_269蛋白的操作進行人IL-I β 116_269蛋白的表達與純化。B.人IL-I β 116_269突變蛋白的克隆、表達和純化通過對質粒pET42T-hIL_l β 116_269的定向誘變，構建10個不同的突變型人 IL-Iβ 116_269融合蛋白表達載體。為實現此目標，按照使用說明來使用Quik-Change 定向誘變試劑盒(Stratagene)。這些突變型IL-1 β 119_269蛋白的表達載體連同用于其構建的寡核苷酸對列于表2中。按照實施例1所述進行不同的人IL-I β 116_269突變蛋白的表達與純化。
表2 =IL-I突變蛋白、表達載體和用于其構建的寡核苷酸的概括
表達載體突變蛋白序列 (無純化標簽)寡核苷酸對PET42T-hIL-lpn6.269 (R4D)hIL-Ιβ丨丨6.269(R4D) (SEQ-ID NO: 131)R4D-1 (5'-C ATATGG ATA TCCCTGTAGA CTCACTGAAC TGCACGCTC-3'; SEQ-ID NO: 143); R4D-2 (5'-GAGCGTGCAG TTCAGTGAGT CTACAGGGAT ATCCATATG-3'; SEQ-ID NO: 144)pET42T-hIL-ipu6.269 (L6A)hIL-lpn6-269(L6A) (SEQ-ID NO: 132)L6A-1 (S'-GATATCCCTG TACGATCAGC TAACTGCACG CTCCGGGAC-3'; SEQ-ID NO: 145); L6A-2 (5'-GTCCCGGAGC GTGCAGTTAG CTGATCGTAG AGGGATATC-3'; SEO-ID NO: 146)pET42T-hIL-ip,,6.269 (T9G)hIL-ipn<s.269(T9G) (SEQ-ID NO: 133)T9G-1 (5'-GTACGATCAC TGAACTGCGG TCTCCGGGAC TCACAGC-3'; SEQ-ID NO: 147) T9G-2 (5'-GCTGTGAGTC CCGGAGACCG CAGTTCAGTG ATCGTAC-3'; SEQ-ID NO: 148)pET42T-hIL-lpn6.269 (RllG)hIL-iPn6-269 (RllG) (SEQ-ID NO: 134)Rl IG-I (5'-GAACTGCACG CTCGGGGACT CACAGC-3'; SEQ-ID NO: 149) Rl 1G-2 (5'-GCTGTGAGTC CCCGAGCGTG CAGTTC-3，； SEQ-ID NO: 150)
4權利要求
一種用于治療糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的組合物，所述組合物包含(a)具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原；其中所述至少一種抗原包含IL 1分子，并且其中(a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接，并且其中優(yōu)選地所述IL 1分子選自(a)IL 1突變蛋白；(b)IL 1蛋白；(c)IL 1成熟片段；(d)IL 1片段；和(e)IL 1肽。
2.權利要求1的組合物，其中所述IL-I分子是IL-Iβ分子，該IL-I β分子包含或者優(yōu)選地由選自下組的氨基酸序列組成(a)人IL-I β 117-269 (SEQ ID NO 64)；(b)人IL-I β 116-269(SEQ ID NO 165)；(c)小鼠IL-I β 119-269s(SEQ ID NO 164)；禾口(d)與SEQ ID NO :64、SEQ ID NO 165 或 SEQ ID NO 164 中的任一個至少 80%、或者優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、或者最優(yōu)選至少99%相同的氨基酸序列。
3.權利要求1或2中任一項的組合物，其中所述IL-I分子是IL-Ιβ突變蛋白，其中優(yōu)選地所述IL-I β突變蛋白包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO :64的氨基酸序列有1-4個氨基酸殘基不同，并且其中進一步優(yōu)選地所述 IL-I β突變蛋白包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列選自SEQ ID Ν0:131 至 SEQ ID Ν0:140 和 SEQ ID NO 205 至 SEQ ID NO :209，并且其中再進一步優(yōu)選地所述IL-I β突變蛋白包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO :136。
4.權利要求1-3中任一項的組合物，其中所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原包含或者優(yōu)選地由以下部分組成(i) IL-I β分子，其中所述IL-I β分子是SEQ ID NO: 165或SEQ ID NO: 136，優(yōu)選為 SEQ ID NO 136 ；禾口( )接頭，其中所述接頭包含所述第二附著位點，并且其中所述接頭包含或者優(yōu)選地由 GGC(SEQ ID NO 178)或 GGCG(SEQ ID NO 188)組成，優(yōu)選地包含或者由 GGCG(SEQ ID NO 188)組成；其中優(yōu)選地，所述接頭通過肽鍵共價結合到所述IL-I β分子的C末端。
5.權利要求1-4中任一項的組合物，其中所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原是SEQ ID NO :220-223中的任一個，并且其中優(yōu)選地所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原是SEQ ID NO :220ο
6.權利要求1的組合物，其中所述IL-I分子是IL-Iα分子，該IL-I α分子包含或者優(yōu)選地由選自下組的氨基酸序列組成(a)人IL-I α 119-271 (SEQ ID NO 63)；(b)人IL-I α 119-271(SEQ ID NO 203)；(c)小鼠IL-I α 117-270 (SEQ ID NO 163)；禾口(d)與SEQ ID NO :63、SEQ ID NO 163 或 SEQ ID NO 203 中的任一個至少 80%、或者優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、或者最優(yōu)選至少99%相同的氨基酸序列。
7.權利要求1或6中任一項的組合物，其中所述IL-I分子是IL-Ia突變蛋白，其中優(yōu)選地所述IL-I α突變蛋白包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO :63的氨基酸序列有1-4個氨基酸殘基不同，并且其中進一步優(yōu)選地所述 IL-Ia突變蛋白包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列選自SEQ ID Ν0:210至SEQ ID NO :218，并且其中再進一步優(yōu)選地所述IL-I α突變蛋白包含或者優(yōu)選地由一種多肽組成，其中所述多肽的氨基酸序列是SEQ ID Ν0:210。
8.權利要求1、6或7中任一項的組合物，其中所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原由以下部分組成(i)IL-l α分子，其中所述IL-I α分子是SEQ ID NO 203或SEQ ID Ν0:210，優(yōu)選為 SEQ ID NO 203 ；和( )接頭，其中所述接頭包含所述第二附著位點，并且其中所述接頭包含或者優(yōu)選地由 GGC(SEQ ID NO 178)或 GGCG(SEQ ID NO 188)組成，優(yōu)選地包含或者由 GGCG(SEQ ID NO 188)組成；其中優(yōu)選地，所述接頭通過肽鍵共價結合到所述IL-I α分子的C末端上。
9.權利要求1、6、7或8中任一項的組合物，其中所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原是SEQ ID NO 224或225中的任一個，并且其中優(yōu)選地所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原是SEQ ID Ν0:224。
10.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，其中優(yōu)選地所述RNA噬菌體選自(a)噬菌體Qβ ；(b)噬菌體AP205；(c)噬菌體fr；和(d)噬菌體GA；并且其中進一步優(yōu)選地所述RNA噬菌體是噬菌體Q β。
11.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含、基本上由、或者由 RNA噬菌體的重組外殼蛋白、其突變體或片段組成，其中優(yōu)選地所述RNA噬菌體選自(a)噬菌體Qβ ；(b)噬菌體AP205；(c)噬菌體fr；和(d)噬菌體GA；并且其中進一步優(yōu)選地所述重組外殼蛋白包含或者優(yōu)選地由SEQ ID N0:3組成。
12.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述第一附著位點通過至少一個共價鍵連接到所述第二附著位點上，其中優(yōu)選地所述至少一個共價鍵是非肽鍵。
13.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述第一附著位點包含或者優(yōu)選地是氨基，優(yōu)選賴氨酸的氨基。
14.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述第二附著位點包含或者優(yōu)選地是巰基，優(yōu)選半胱氨酸的巰基。
15.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述第一附著位點是氨基，并且其中所述第二附著位點是巰基；并且其中優(yōu)選地所述第一附著位點是賴氨酸的氨基，并且所述第二附著位點是半胱氨酸的巰基。
16.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述第一附著位點不是巰基，或者其中所述病毒樣顆粒與所述至少一種抗原的所述連接不包含二硫鍵。
17.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述第二附著位點中只有一個與所述第一附著位點通過至少一個非肽共價鍵連接，產生單一且均勻類型的所述抗原與所述病毒樣顆粒的結合，其中與所述第一附著位點連接的所述只一個第二附著位點是巰基，并且其中所述抗原和所述病毒樣顆粒通過所述連接相互作用，形成有序且重復的抗原陣列。
18.權利要求1-11中任一項的組合物，其中所述第一附著位點通過至少一個共價鍵連接到所述第二附著位點上，其中所述共價鍵是肽鍵；并且其中優(yōu)選地所述病毒樣顆粒包含、基本上由、或者由RNA噬菌體的重組外殼蛋白、其突變體或片段組成，并且其中所述至少一種抗原與所述重組外殼蛋白、其突變體或片段的N末端或C末端融合。
19.權利要求18的組合物，其中所述RNA噬菌體選自(a)噬菌體AP205；(b)噬菌體fr；和(c)噬菌體GA；并且其中優(yōu)選地所述RNA噬菌體是噬菌體AP205。
20.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原進一步包含接頭，其中所述接頭包含所述第二附著位點，并且其中所述接頭與所述抗原通過一個肽鍵結合。
21.用于治療糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的疫苗，所述疫苗包含前述權利要求中任一項的組合物或者由該組合物組成，優(yōu)選為有效量。
22.權利要求21的疫苗，包含(i)第一組合物，優(yōu)選為有效量，其中所述第一組合物是權利要求1-20中任一項的組合物，并且其中所述第一組合物中包含的IL-I分子是IL-I β 分子，優(yōu)選為SEQ IDNO 136或SEQ ID NO 165 ；和(ii)第二組合物，優(yōu)選為有效量，其中所述第二組合物是權利要求1-20中任一項的組合物，并且其中所述第二組合物中包含的 IL-I 分子是 IL-I α 分子，優(yōu)選為 SEQ ID NO 203 或 SEQ ID NO 210。
23.權利要求21或22中任一項的疫苗，其中所述疫苗不含佐劑。
24.一種用于治療糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的藥物組合物，所述藥物組合物包含(a)權利要求1-20中任一項的組合物或權利要求21-23中任一項的疫苗；和(b)藥學可接受的載體。
25.一種治療糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的方法，所述方法包括給動物，優(yōu)選地給人施用免疫有效量的權利要求1-20中任一項的組合物、權利要求21-23中任一項的疫苗、和/或權利要求24的藥物組合物。
26.權利要求1-20中任一項的組合物、權利要求21-23中任一項的疫苗和/或權利要求24的藥物組合物在制備用于治療動物、優(yōu)選人的糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療、改善和/或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的組合物、藥物組合物和疫苗。本發(fā)明的組合物、藥物組合物和疫苗包含核心顆粒和抗原，其中所述抗原包含白介素-1(IL-1)分子。當對動物、優(yōu)選地對人施用時，所述組合物、藥物組合物和疫苗誘導有效的免疫應答，特別是抗體應答，其中典型且優(yōu)選地，所述抗體應答針對IL-1。因此，本發(fā)明提供了通過針對IL-1的主動免疫來治療、改善或預防糖尿病、優(yōu)選II型糖尿病的方法。
文檔編號A61P3/10GK101959526SQ200980107503
公開日2011年1月26日申請日期2009年3月5日優(yōu)先權日2008年3月5日
發(fā)明者G·斯波恩, M·巴赫曼申請人:賽托斯生物技術公司

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