專利名稱：偶聯(lián)因子6抑制劑和活化劑及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及判斷血液中偶聯(lián)因子(CF6)濃度變化引起的疾病、PGI2過?；虿蛔愕募膊?，以及cPLA2作用的亢進或減弱的疾病的發(fā)病、進展而采用的診斷方法和診斷輔助制劑，以及針對該疾病的治療藥物。另外本發(fā)明還涉及到含有編碼CF6或其部分多肽的DNA的載體、利用該載體轉化的轉化體以及CF6或其部分多肽的有效的制造方法、與CF6特異反應的抗體和其制造方法、CF6的測定方法。
背景技術：
經(jīng)由花生四烯酸級聯(lián)反應產生的前列腺素(PG)、凝血噁烷(TX)和白三烯(LT)那樣的前列腺素類(激素)是維持生物體恒定性的必要的生理活性物質。作為前列腺素類(激素)一員的前列腺環(huán)素(PGI2)是在PGI2合成酶作用下由前列腺素H2(PGH2)生成的，而PGH2是在血管內皮細胞內經(jīng)環(huán)加氧酶、PGH2合成酶催化由花生四烯酸生成的。
已知該PGI2的藥理作用有如下幾個方面(1)PGI2與膜上的受體結合，通過使腺苷酸環(huán)化酶激活，生成cAMP，表現(xiàn)出血小板凝集抑制作用、血管擴張作用(中田等人著，藥局501365-1373、1999)，(2)PGI2在由血管內皮損傷引起的血栓形成中起著重要的作用(Murata、T.et al.Nature 388678-682、1997)，(3)PGI2是引起炎癥浮腫的主要的前列腺素類(激素)(Murata、T.etal.Nature 388678-682、1997)。
因此，確定PGI2的生物合成途徑和參與合成的酶(花生四烯酸級聯(lián)反應)，PGI2的生理活性作用能夠做到某種程度的判斷。然而有關疾病中抑制PGI2生成的機制還不清楚。
關于抑制PGI2的生成通過使用高血壓自然發(fā)病大鼠(SHR)的實驗表明，在SHR內存在內原性抑制PGI2生成的物質(Osanai、T.et al.Jpn.Circ.J.54、507-514、1990、Falardeau、P.et al.Prostaglandins、29、621-628、1985)。有關該內原性抑制PGI2生成的物質的研究雖然還不充分，但本發(fā)明人成功地從SHR的心臟中分離純化出了抑制SHR腸膜平滑肌細胞分泌PGI2的因子。而且確定了它的結構，闡明了該因子為CF6(以后記為rCF6)，是輸送H+的ATP合成酶的一個亞基(參考例1)。
哺乳類的輸送H+的ATP合成酶存在于線粒體內膜，至少由14個亞基組成。CF6是該酶的一個亞基，由76個氨基酸組成。CF6是以在N末端附加了含有線粒體移動序列的32個氨基酸的肽合成的(Higuchi、T.etal.Biochem.Biophys.Res.Commun.178 793-799、1991)。
到目前為止，本發(fā)明人確立了使通過因子Xa能夠切出rCF6的嵌合蛋白質以大腸桿菌為宿主表達，然后從嵌合蛋白質中切出rCF6，進行純化的方法(參考例2)。
另外本發(fā)明人弄清楚了由CF6引起的抑制PGI2生成的作用點是抑制PLA2(參考例3)、特別是抑制cPLA2(參考例4)(Osanai、T.et al.J.Biol.Chem.273、31778-31783、1998)。然而作為細胞內的肽CF6與疾病的關系完全不清楚，CF6在體內對血管內皮作用的狀態(tài)、即是否存在于血液中也不清楚。
關于cPLA2的功能已經(jīng)了解到(Bonventre JV、T.et al.Nature390622-625、1997)(1)cPLA2對作為花生四烯酸級聯(lián)反應的炎癥介體的前列腺素E2、白三烯B4、白三烯C4的產生是必需的，(2)缺失該酶的小鼠，中大腦動脈的瞬間結扎后的梗塞區(qū)域變小，腦的浮腫和神經(jīng)欠落也減少。從這些功能可以推測到抑制cPLA2的藥可以成為有效的炎癥治療藥和腦梗塞等的治療藥，但還沒有找到有效的治療藥、以及基于抑制CF6作用的抑制cPLA2的藥的篩選方法。
因此，關于花生四烯酸級聯(lián)反應中的PGI2的生物合成和生理作用、cPLA2的生理作用、以及PGI2和cPLA2與CF6的關系正逐漸被闡明。然而，與處于花生四烯酸級聯(lián)反應末端的稱之為PGI2因子和位于開頭的cPLA2因子有關的疾病的起因的闡明還沒有進展。
發(fā)明的公開本發(fā)明人已經(jīng)清楚了大鼠和人血液中存在CF6，CF6是由血管內皮細胞產生的。還弄清楚了PGI2不足引起的高血壓中，隨著血壓的上升，血中的rCF6濃度也隨著增加，在該狀態(tài)下，如果給予rCF6，血壓會上升，而在rCF6濃度高的高血壓狀態(tài)下，抗rCF6抗體表現(xiàn)出降壓作用。另外，獲得了在人急性心肌梗塞時，血中CF6濃度上升，在人患病時血中CF6濃度也有變化的資料，直至本發(fā)明完成。
本發(fā)明涉及鑒于上述那樣的實際狀況，通過調節(jié)CF6的血中濃度，對于血液中的CF6量的變化引起的疾病、PGI2的過?；虿蛔愕募膊?，以及cPLA2作用亢進或減弱的疾病的預防藥或治療藥，以及對于判斷這些疾病的發(fā)病、進展的診斷方法和診斷助劑。
就是說，本發(fā)明可以提供以象CF6、促進CF6分泌的物質以及CF6激動劑那樣的CF6活化劑為有效成分，或以象抑制CF6分泌的物質以及CF6拮抗劑那樣的CF6抑制劑為有效成分的治療藥，該藥可作為CF6濃度增加或減少，PGI2濃度增加或減少的疾病，或cPLA2作用亢進或減弱的疾病的預防藥或治療藥。另外還提供血中CF6濃度的測定方法以及CF6濃度增加或減少的疾病的診斷方法和診斷助劑。
另外本發(fā)明提供作為上述疾病的預防藥和治療藥的有效成分的促進CF6分泌的物質、抑制CF6分泌的物質、CF6的激動劑或CF6的拮抗劑。另外還提供用作血中CF6濃度的測定方法或診斷方法的試劑或診斷助劑的抗CF6抗體。另外本發(fā)明還涉及到含有編碼CF6的載體，利用該載體轉化的轉化體和象CF6那樣的肽的制造方法。本發(fā)明提供與CF6和CF6的部分多肽特異反應的抗體及其制造方法。
圖2是用腸激酶處理含有表達的rCF6的嵌合蛋白質的溶液的C18-HPLC的洗脫曲線。
圖3是粗純化rCF6的C18-HPLC的洗脫曲線。
圖4是用腸激酶處理含有表達的hCF6的嵌合蛋白質的溶液的C18-HPLC的洗脫曲線。
圖5是粗純化rCF6的C18-HPLC的洗脫曲線。
圖6是用由rCF6誘導的免疫抗原免疫兔子制備的抗血清，以及用能夠使抗體肽結合的瓊脂糖凝膠親和層析柱純化的抗體的電泳凝膠結果。
圖7是抗rCF6抗體對SHR(16周齡)血壓的影響圖。
圖8是表示抗rCF6抗體對大鼠(SHR、WKY、16周齡)血壓的影響圖。
圖9是表示抗rCF6抗體的提前注入對由緩激肽引起的大鼠(SHR16周齡)血壓下降的影響圖。


圖10是表示抗rCF6抗體的提前注入對由緩激肽引起的大鼠(SHR SWY、16周齡)血壓下降的影響圖。
圖11是表示rCF6對大鼠(SHR SWY、16周齡)血壓的影響圖。
圖12是表示用Sephadex G-25對SHR心臟的開水提取液進行分級的曲線圖。
圖13是將上述圖12的活性級分經(jīng)HPLC分離得到的曲線圖。
圖14是將上述圖13的活性級分經(jīng)HPLC分離得到的曲線圖。
圖15是表示由大鼠大動脈的cDA文庫構建含有N末端附加了因子Xa的識別序列的rCF6的蛋白質表達用的載體圖。
圖16是表示rCF6抑制PGI2生成的圖。
圖17是表示在緩激肽存在下rCF6抑制PGI2生成的圖。
圖18是表示rCF6對花生四烯酸從人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)游離的影響。
圖19是表示rCF6對緩激肽引起的花生四烯酸從HUVEC游離的影響。
圖20是表示各種PLA2抑制藥和rCF6對花生四烯酸從HUVEC游離的影響。
圖21是表示各種PLA2抑制藥和rCF6對緩激肽引起的花生四烯酸從HUVEC游離的影響。
圖22是表示rCF6對大鼠(SHR、WKY、16周齡)血壓的影響圖。
圖23是表示健康人和急性心肌梗塞患者血中的hCF6濃度的比較圖。
圖24是表示急性心肌梗塞患者血中hCF6濃度的變化圖。
圖25是表示HUVEC培養(yǎng)液中hCF6濃度的變化圖。
發(fā)明實施方式在本發(fā)明中，用作上述的預防藥和治療藥的有效成分，或者用作血中CF6濃度的測定方法或血中CF6濃度變化引起的疾病的診斷方法的試劑或診斷助劑的大鼠和人CF6通過用腸激酶作為切出酶可以更有效地制造(與以前的方法(參考例2)相比)。腸激酶是識別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列(序列3)，切斷其末端肽鍵的酶。為了獲得CF6，通過基因重組技術的常規(guī)方法可以得到在腸激酶識別序列的N末端含有保護肽，C末端含有CF6或其部分肽的嵌合蛋白質，通過腸激酶可以切出CF6。作為嵌合蛋白質可以使用例如由大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端139個氨基酸組成的肽(第76和122位的半胱氨酸取代為絲氨酸序列4)的C末端通過腸激酶的識別序列結合CF6后構成的肽。該嵌合蛋白由于在大腸桿菌中以不溶性級分大量蓄積，所以可以有效地表達、純化。不溶的嵌合蛋白可溶解于尿素，然后用腸激酶作用，可以從嵌合蛋白中切出CF6。CF6可以經(jīng)裝有C18柱的HPLC純化。表達載體的制作、宿主的轉化對于本領域普通技術人員來說利用常規(guī)方法都可以進行(Maniatis等人編寫的“分子克隆實驗指南”(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989))。(部分多肽)本發(fā)明所謂的部分多肽是指由具有抑制由人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)生成PGI2作用的CF6的一部分構成的多肽。包括對構成CF6一部分的多肽缺失、附加以及取代一個乃至數(shù)個氨基酸的，以及經(jīng)缺失、附加和取代聯(lián)合作用被修飾的具有抑制由HUVEC生成PGI2作用的多肽。(CF6抗體的制造)在本發(fā)明中，用作上述的預防藥或治療藥的有效成分，或者用作血中CF6濃度的測定方法或診斷方法的試劑或診斷助劑的針對CF6的免疫特異的抗體可以通過以下操作獲得用CF6或其片段或其類似物，或表達它們的細胞作為免疫原，利用通常的實驗方法使動物，最好是人以外的動物致敏，就獲得抗CF6抗體。制備單克隆抗體時，可以利用提供的通過連續(xù)的細胞系培養(yǎng)產生抗體的雜交瘤法(Kohler、G.et al.Nature、256495-497、1975)。采用產生單鏈抗體的技術(美國專利第4946778號)可以產生抗CF6的單鏈抗體。另外使用具有產生人抗體系統(tǒng)的轉基因鼠(Green LL.et al.Nat Genet、7、13-21、1994)可以使人型抗體表達。在本發(fā)明的詳細說明中給出了制作多克隆抗體的例子(實施例2)合成在來自rCF6或hCF6的大約20個氨基酸構成的片段的N末端附加上半胱氨酸的肽，通過N末端的半胱氨酸與鑰孔血藍素結合，然后以此作為抗原免疫兔子，可制造多克隆抗體。(CF6濃度的測定方法)另外本發(fā)明通過利用上述抗體，能夠建立通過RIA法或ELISA法測定樣品中CF6的方法(放射免疫分析北川p79-88、酶免疫分析p88-99、新生化實驗講座12、分子免疫學III、抗原、抗體、補體、日本生化學會編輯1992)。作為該例子在本發(fā)明書實施例2中給出了通過樣品中的抗原抑制125I標記的抗原和抗體反應進行定量的拮抗抑制系統(tǒng)(RIA法)。(促進CF6分泌物質或抑制CF6分泌物質的篩選方法)本發(fā)明通過使用上述CF6濃度的測定方法，可以得到促進CF6分泌物質或抑制CF6分泌物質。具體來說，在分泌CF6的細胞，例如HUVEC培養(yǎng)液中，添加被檢測物質，利用抗CF6抗體測定體系，例如上述的RIA法測定培養(yǎng)液中分泌的CF6量，可以獲得使CF6量增加的促進CF6分泌的物質或使CF6量減少的抑制CF6分泌的物質(實施例7)。分泌CF6的細胞有望使用成為疾病起因的細胞。(CF6激動劑或CF6拮抗劑的篩選方法)本發(fā)明獲得了用于找到CF6激動劑或CF6拮抗劑的篩選方法。
具體來說，在PGI2生成量被CF6抑制的細胞，例如在HUVEC或大鼠腸動脈的平滑肌細胞培養(yǎng)液中一起添加被檢驗物質和CF6，測定培養(yǎng)液中分泌的PGI2的穩(wěn)定代謝物6-酮-PGF1α量，可以得到使6-酮-PGF1α量增加的CF6拮抗劑或使6-酮-PGF1α量減少的激動劑。而在有標記的花生四烯酸存在下，將被檢驗物質和CF6一起加到HUVEC培養(yǎng)液中，測定培養(yǎng)基中游離的花生四烯酸，也可以發(fā)現(xiàn)拮抗劑或激動劑。PGI2生成細胞或花生四烯酸游離有望使用成為疾病起因的細胞。(CF6結合受體的鑒定方法)本發(fā)明提供了CF6結合受體的鑒定方法。使用CF6，通過該領域內已知的標準的受體結合法可以鑒定CF6結合受體。這些方法包含配體結合和交聯(lián)分析，但不限于這些方法。在這些方法中，CF6被放射性標記(例如，125I標記)、化學修飾(例如，生物素化)或融合入適于檢測或純化的肽序列、與HUVEC等細胞的膜級分一起溫育。而被標記的CF6在用結合分析來鑒定與CF6的受體競爭性結合的CF6的激動劑和拮抗劑的方法中也可以利用。進行這樣分析的標準方法在該領域內都是眾所周知的。(疾病例子)在本發(fā)明中所謂的CF6過剩的疾病是指血中的CF6作用亢進的疾病，對于生物體來說是不希望的狀態(tài)，但也未必是血中CF6濃度與健康人相比高的疾病，例如，PGI2不足引起的疾病或cPLA2作用減弱引起的疾病。例如血小板凝集亢進引起的疾病或由于抑制血管擴張引起的伴隨著末梢循環(huán)障礙的疾病、心肌梗塞、心絞痛、心功能不全、肺高血壓、高血壓癥、腦血管障礙、閉塞性動脈硬化癥、動脈硬化、高脂血癥、糖尿病、支氣管病、胃潰瘍、妊娠子癇、溶血性尿毒癥綜合癥、血栓性血小板減少性紫斑病。
在本發(fā)明中所謂的CF6不足的疾病是指血中的CF6作用低下的疾病，對于生物體來說是不希望的狀態(tài)，但也未必是血中的CF6濃度與健康人相比低的疾病，例如，PGI2過剩引起的疾病或cPLA2作用亢進引起的疾病。其病例有腦梗塞、急性胰腺炎、哮喘、ARDS、包含慢性關節(jié)風濕病在內的炎癥。(提供治療藥)本發(fā)明可以提供象上述血中CF6量過?；虿蛔隳菢影Y狀的治療藥。
CF6活性過剩時，例如通過給予抑制CF6對配體、底物、受體、酶等作用的有效量的拮抗劑、或抑制CF6分泌的物質，可以降低CF6活性。這些拮抗劑和抑制CF6分泌的物質可以通過上述的篩選方法獲得。
另外為了治療CF6不足的異常的病癥，通過給促進CF6對配體、底物、受體、酶等作用的有效量的激動劑，或促進CF6分泌的物質，可以增強CF6活性。這些激動劑和促進CF6分泌的物質可以通過上述的篩選方法獲得。(制劑的制造方法)將用本發(fā)明的篩選方法得到的促進CF6分泌的物質、抑制CF6分泌的物質、CF6激動劑或CF6拮抗劑作為藥物組合物使用時，可以按照常規(guī)手段實施。例如，根據(jù)需要，可以作成加了包衣的片劑、膠囊、顆粒劑、細粒劑等固形劑，或溶解于或懸浮于水或水以外的藥學上容許的溶液中作成的針劑、滴眼劑或滴鼻劑，或作成所謂的軟膏、外敷軟膏的外用劑使用。
這些制劑通過使用通常用的添加劑按照常規(guī)操作都可以制造。制造片劑、膠囊、顆粒劑、細粒劑等口服用的固形劑時，作為添加劑，例如，可以使用(1)乳糖、淀粉或結晶纖維素等賦形劑，(2)羥丙基纖維素或聚乙烯基吡咯烷酮那樣的黏合劑，(3)淀粉、交聯(lián)羧甲醚纖維素鈉那樣的崩解劑，(4)聚乙烯二醇或檸檬酸三乙酯那樣的增塑劑，(5)硬脂酸鎂和滑石那樣的潤滑劑，(6)羥丙基甲基纖維素、Eudragit包衣基劑，(7)白糖或甘露糖醇那樣的矯味劑以及矯臭劑、著色劑等。
另外，制造針劑、滴眼劑或滴鼻劑時，作為添加劑可以使用(1)氯化鈉、D-甘露糖醇、D-山梨糖醇等張化劑，(2)鹽酸、檸檬酸等pH調整劑，(3)檸檬酸鈉、醋酸鈉、硼酸鈉等緩沖劑，(4)鹽酸普魯卡因等無痛化劑以及穩(wěn)定劑和表面活性劑。另外考慮有效成分的穩(wěn)定性等，可以選擇作成用時溶解或用時懸浮后使用的制劑或溶劑。
為了制造稱之為軟膏、外敷軟膏等外用劑，可以添加(1)液體石蠟、凡士林、親水軟膏等基劑(2)吐溫80、黃蓍膠等乳化劑，(3)苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸丙酯等保存劑，(4)鹽酸普魯卡因等無痛化劑以及穩(wěn)定劑和表面活性劑。
制備的針劑以適合各種劑型的形式包裝。例如可以采用瓶包裝、分包、PTP包裝、安培瓶、管式瓶的包裝形式。這樣制作的制劑可以給藥于例如哺乳動物(大鼠、兔子、山羊、豬、牛、貓、狗、猴、人等)。給藥量因適應癥、癥狀或給藥途徑等而有所差異，但一般來說對于成年人(60kg)，每天0.01mg～300mg，優(yōu)選大約0.1mg～100mg。對于其它動物，可以按照每60kg給藥量換算后給藥。(診斷方法)另外本發(fā)明通過測定采集的血樣中的CF6濃度，可以提供CF6濃度增加或減少引起的疾病的診斷方法。CF6的濃度如上所述可以通過使用抗體的RIA法或ELISA法測定。(CF6基因或mRNA)根據(jù)本發(fā)明可以使用CF6基因或mRNA作為對CF6的過少表達、過剩表達、局部存在的變化、或由于這些變化引起的疾病的診斷藥或診斷助劑。
CF6基因中存在變異的個體可以通過各種方法在DNA水平上檢測。供診斷用的核酸可以從檢測對象的細胞、例如血液、尿、唾液、組織活檢或解剖材料獲得。基因組DNA可以直接使用，或在分析前經(jīng)PCR或其它的擴增方法擴增后再用。mRNA或cDNA也可以采用同樣的方法來使用。通過與正?；蛐捅容^，擴增產物大小的變化可以檢測出缺失和插入。點突變可以通過使擴增的DNA與含有DNA堿基序列的CF6DNA雜化來鑒定。完全配對的序列經(jīng)RNase消化，或者由于融解溫度的不同，可以與誤配對的雙螺旋區(qū)別開。DNA序列的差異可以通過與變性物質一起或單獨電泳時的DNA片段在凝膠中的遷移率的變化，或通過直接確定DNA序列來檢測。序列在特異位置的變化通過核酸酶保護分析、例如通過Rnase和S1保護或化學裂解法也可以搞清楚?；蛘撸瑯嫿ê蠧F6堿基序列或其片段的寡核苷酸探針的陣列(array)，例如可以進行遺傳變異效果的篩選。陣列法是眾所周知的方法，適用的范圍很廣，利用該方法可以研究包括基因表達、遺傳連鎖和遺傳變化在內的分子生物學中的種種問題。
實施例以下通過實施例具體地說明本發(fā)明，但這是本發(fā)明的實施方式的例子，本發(fā)明并不限定于這些例子。而實施例中的術語、縮略號等只要沒有特別說明，都是來自在該技術領域中通常使用的術語。本發(fā)明作為材料使用的質粒、大腸桿菌以及各個實施例中通用的基本實驗操作是作為參考給出的。另外為了確認、說明成為本發(fā)明的基礎的以前的技術以及本發(fā)明的附帶技術給出了參考例。
質粒pG97S4DhCT[G]是通過大腸桿菌乳糖操縱子的啟動子能夠表達嵌合蛋白的質粒，該嵌合蛋白是通過β-半乳糖苷酶的N末端到第97號氨基酸序列構成的肽(序列5中第76位的半胱氨酸被絲氨酸取代，而第40、41、71和75位谷氨酸被取代為天冬氨酸，稱之為βGal-97S4D)中Glu-Phe-Glu序列結合了hCT[G](降血鈣素的第32位的氨基酸的C末端附加了甘氨酸的肽)形成的嵌合蛋白質。通過這樣的質粒轉化的轉化株可以通過四環(huán)素耐藥性選擇。如果將讀碼框合并使編碼目的肽的DNA區(qū)以EcoRI-SalI DNA片段導入的話，可以表達與βGal-97S4D構成的嵌合蛋白質。另外含有該質粒的大腸桿菌W3110株命名為EscherichiacoliSBM33，保藏于工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所，保藏號為微工研寄第3503號(FERMBP-3503)，于1991年8月8日保藏。
質粒pGP#19RI是將編碼pG97S4DhCT[G]的βGal-97S4D/hCT[G]嵌合蛋白的基因取代為編碼βGal-139S(序列4)/hProPTH嵌合蛋白的基因的質粒。如果將讀碼框合并使編碼目的肽的DNA區(qū)以EcoRI-SalI DNA片段導入的話，可以表達與βGal-139S構成的嵌合蛋白質。在編碼質粒pGP#19(特開平9-296000；圖4)的保護肽βGal-139S和hProPTH的結合部分的DNA部分中插入EcoRI部位，可以作成質粒pGP#19RI。
質粒pCRII可以以與通過使用TaqDNA聚合酶的PCR法擴增的DNA片段能夠直接連接的形式從Invitrogen(公司)購入。由質粒pCRII轉化的轉化株可以通過氨卞青霉素耐藥性選擇。
(大腸桿菌與培養(yǎng)基)大腸桿菌JM109株從東洋紡(株)購入，用于質粒的制備和嵌合蛋白質的表達。培養(yǎng)基中使用了LB培養(yǎng)基(0.5％(w/v)酵母提取液)、1％(w/v)胰蛋白胨、0.5％(w/v)NaCl、SB培養(yǎng)基(2％(w/v)酵母提取液、1％(w/v)胰蛋白胨、0.5％(v/v)甘油、1.2％(w/v)K2HPO4、0.3％(w/v)KH2PO4)。
(基本實驗操作)在實施例中沒有具體給出時，實驗操作按照以下方法進行。DNA堿基序列通過雙脫氧法/DNA序列儀373(Applied Biosystems Inc.)確定。用限制性內切酶切DNA使用購入單位指定的3～10倍量的酶，酶切反應一小時。質粒構造的解析使用0.5～1μg DNA于20μL反應液中進行，而DNA的制備是使用3～10μg DNA于50～100μL的反應液中進行。反應溫度、反應緩沖液等條件按照購入單位的指定條件。得到的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，解析或制備。
瓊脂糖凝膠電泳樣品通過在反應液中加入含有1/5容量的色素液(0.25％(w/v)溴[代苯]酚藍的15％(w/v)Ficoll水溶液)制備的。瓊脂糖凝膠電泳中使用了TAE緩沖液(10mMTris、20mMEDTA·Na、pH6.8)。在質粒結構解析、以及DNA片段制備中使用Mupid-2(CosmoBio(株))于100伏特下進行了1小時電泳。凝膠在溴乙啶水溶液(0.5μg/ml)中染色20分鐘后，通過紫外線照射檢測DNA帶。瓊脂糖濃度與分級的DNA片段的大小相對應，使用1.0、1.5、2.0％(w/v)。瓊脂糖凝膠中的DNA使用SUPREC-01(寶酒造(株))從凝膠中提取。DNA溶液用酚處理后，進行乙醇沉淀。連接反應使用0.05～1μg的DNA片段，利用TAKARA連接試劑盒(寶酒造(株))進行。
大腸桿菌的轉化法用氯化鈣法進行(JM109株用的是購買的感受態(tài)細胞)，轉化株通過耐藥性(氨卞青霉素或四環(huán)素)選擇。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)按照Laemmli方法進行(Laemmli et al.Nature227、680-685、1970)。即，在樣品中加入1/4容量的4×SDS樣品緩沖液(375mMTris鹽酸(pH6.8)、30％(v/v)甘油、7％(w/v)SDS、15％(v/v)2-巰基乙醇、0.1％(w/v)溴酚藍)，于95℃加熱5分鐘。將10μL樣品加到SDS-聚丙烯酰胺凝膠(55mm×85mm×1mm)或Tefco(株))上，電流20mA，電泳80分鐘。電泳后，用染色液(10％(v/v)醋酸、40％(v/v)甲醇、0.25％(w/v)考馬斯亮藍R250)對凝膠進行染色。利用裝有C18柱的HPLC進行肽的解析和純化，使用連接YMC-ODS-A302(d4.6mm×150mm)柱、YMC-ODS-A323((d10mm×250mm)株(以上為YMC(株)))、InertsilODS-2 C18(d4.6mm×250mm)(GL科學(株))柱的HPLC(島津制作所(株)LC10A)，用A液(0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)、B液(0.092％(v/v)TFA/80％(v/v)乙腈、或0.092％(v/v)TFA/60％(v/v)乙腈)的濃度梯度展開(流速為1mL/分或2.5mL/分)，計算于210nm吸光度測定的峰的面積。
DNA低聚物用Greiner Japan或Lifetech Oriental(株)合成。
PGI2生成抑制活性通過測定從取自SHR腸膜動脈的平滑肌細胞或人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)分泌到上清的PGI2的穩(wěn)定代謝物(6-酮-PGF1α)進行評價。即取自SHR腸膜動脈的平滑肌細胞在含有10％(v/v)胎牛血清的Dulbecco改進Eagle培養(yǎng)基(DMEM)進行繼代培養(yǎng)，一直培養(yǎng)到匯合那樣的狀態(tài)。HUVEC在含有2％(v/v)胎牛血清、10ng/ml EGF、5ng/ml bFGF、1μg/ml氫皮質酮、10μg/ml肝素的合成培養(yǎng)基(HuMediaKurabo(株))中增殖。將SHR腸膜動脈的平滑肌細胞或HUVEC在添加了測定樣品的DMEM培養(yǎng)基中溫育30分鐘，測定培養(yǎng)期間分泌到上清的6-酮-PGF1α量。
在用75mg/kg氯胺酮和15mg/kg鹽酸甲苯噻嗪麻醉的大鼠的大動脈直接插入導管，直接通過血液測定血壓。即將用含有20U/ml肝素的生理鹽水充滿的2根聚乙烯導管插入左頸動脈和左大腿靜脈，將插入左頸動脈的導管連接到與多功能記錄儀連動的壓力檢測器(Carrier AmplofierAP-601G；日本光電(株))上。樣品用200μL的生理鹽水溶解后由大靜脈給藥。
各種儀器、試劑等的使用方法參照各自附帶的使用說明書。另外有關基因操作的基本操作參考Maniatis等人編寫的“分子克隆實驗指南”(ColdSpring Harbor Laboratory Press1989)。[實施例1]利用嵌合蛋白表達法制備CF6-1
以下給出了使用腸激酶作為切出酶從嵌合蛋白切出CF6的制造方法的具體例子。(rCF6和hCF6 cDNA的制備)rCF6 cDNA是通過以大鼠肝臟cDNA(快速克隆cDNA文庫、克隆技術(株))為模板，rCF6-01(序列6)和rCF6-02(序列7)為引物的PCR法得到的。即在耐熱性DNA聚合酶中使用KOD(東洋紡(株))，對由大鼠肝臟cDNA文庫1μL、10×反應緩沖液5μL、2mMdNTP混合液7.5μL、rCF6-01 0.5μL和rCF6-02 0.5μL、滅菌水35μL構成的反應液進行30循環(huán)的反應，每循環(huán)為96℃30秒，56℃1分鐘，74℃40秒，可以得到rCF6cDNA。同樣hCF6 cDNA通過以人腎臟cDNA(快速克隆cDNA文庫、克隆技術(株))為模板，hCF6-01(序列8)和hCF6-02(序列9)為引物的PCR法得到。反應條件按照大鼠的實驗進行。序列6 5’-ATGACTGTTCAGAGGATCTTCAG-3’序列7 5’-GTCGACTCAGGACTGGGGTTTGTCGAG-3’序列8 5’-ATGATTCTTCAGAGGCTCTTCAG-3’序列9 5’-GTCGACTCAGGCCTGGGGTTTTTCGATG-3’得到的rCF6和hCF6 cDNA經(jīng)1.5％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳后，用SUPREC-01(寶酒造(株))回收，作為制作通過腸激酶可切出rCF6或hCF6的嵌合蛋白基因的模板。(附加了腸激酶識別序列的rCF6和hCF6 cDNA的制備)為了制作利用腸激酶可切出rCF6或hCF6的嵌合蛋白基因，合成了在編碼rCF6或hCF6的N末端的基因的5’端帶有編碼Asp-Asp-Asp-Asp-Lys基因序列和限制性內切酶Eco RI識別序列的DNA聚合物(rCF6E；序列10和hCF6E；序列11)。序列105′-GAATTCGACGATGACGATAAGAATAAGGAACTTGATCCTGTACAG-3′序列115′-GAATTCGACGATGACGATAAGAATAAGGAACTTGATCCTATACAGA-3′序列10的DNA序列通過以rCF6 cDNA為模板，rCF6E(序列10)和rCF6-02(序列7)為引物的PCR法導入的。在PCR的耐熱性DNA聚合酶中使用了Taq DNA聚合酶(Phamacia)。即rCF6 cDNA 1μL、10×反應緩沖液5μL、1.25mMdNTP混合液8μL、rCF6-010.5μL、rCF6-020.5μL、滅菌水25μL構成的反應液進行8次循環(huán)的反應，每次循環(huán)為96℃1分鐘，60℃ 1分鐘，74℃30秒，可以得到5’端帶有腸激酶識別序列和限制性內切酶Eco RI識別序列的rCF6 cDNA。擴增的DNA片段在pCRII進行克隆(pCRrCF6EK)，確認堿基序列。同樣序列11的DNA序列可以通過以hCF6 cDNA為模板，hCF6E(序列11)和hCF6-02(序列9)為引物的PCR法導入。反應條件按照大鼠實驗進行。擴增的DNA片段在pCRII進行克隆(pCRhCF6EK)，確認堿基序列。(嵌合蛋白表達載體的構建)用限制性內切酶Eco RI和Sal I切pCRrCF6EK和pCRhCF6EK，得到由0.3kb構成的Eco RI-Sal I DNA片段rCF6EK和hCF6EK。這些DNA片段帶有編碼含有N末端附加了Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的腸激酶識別序列的rCF6或hCF6蛋白質的DNA堿基序列，其上游有限制性內切酶Eco RI位點，而下游有限制性內切酶Sal I位點。質粒pGP#19 RI用限制性內切酶Eco RI和Sal I切后，可制備含有載體部分的大約3.5kb DNA片段。將該片段與rCF6EK或hCF6EK連接，可分別得到pG139SrCF6EK和pG139ShCF6EK(圖1)。(嵌合蛋白表達和純化)用pG139SrCF6EK或pG139ShCF6EK轉化大腸桿菌JM109菌株，得到JM109[pG139SrCF6EK]和JM109[pG139ShCF6EK]。JM109[pG139SrCF6EK]和JM109[pG139ShCF6EK]用3L發(fā)酵罐于含有10μg/mL四環(huán)素的SB培養(yǎng)基中37℃下進行通氣攪拌培養(yǎng)。8小時后，添加IPTG使之終濃度達到1mM，再培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)液3L于6000rpm、4℃條件下離心10分鐘(20PR-52D；日立制作所(株))，回收菌體。將該菌體懸浮于含有0.5％(w/v)TritonX-100的Tris鹽酸(pH7.0)、1mMEDTA中，通過超聲波破碎菌體后，于6000rpm、4℃條件下離心15分鐘(20PR-52D；日立制作所(株))，在沉淀級分中以包涵體形式回收嵌合蛋白。再反復進行3次沉淀級分的溶解、離心操作，可得到粗純化的嵌合蛋白。hCF6嵌合蛋白也同樣制備。(從嵌合蛋白中切出hCF6和rCF6并純化)從嵌合蛋白中切出hCF6和rCF6的方法中有使用因子Xa作為切出酶的方法(參考例2)。然而在該方法中，為了將嵌合蛋白變成可溶性后再使因子Xa作用，需要2M以上的尿素。這樣的尿素濃度使因子Xa的活性下降到1/10。因此需要嵌合蛋白的1/60那樣的大量的因子Xa。另外尿素存在下的因子Xa的底物特異性降低，從嵌合蛋白切出rCF6的效率也大約降低到8％。
通過使用腸激酶作為切出酶改善了CF6的切出效率。首先，將粗純化的rCF6嵌合蛋白4mg溶解于10M尿素溶液1.75mL中，通過離心除去不溶物。向上清中添加10×EK緩沖液(200mM Tris鹽酸(pH8.0)、500mMNaCl、20mMCaCl2)0.5mL、30U(大約3.4μg，約相當于底物的1200分之一的量)的腸激酶(Stratagene(株))，用蒸餾水將總體積調到5mL。22℃反應過夜后，將反應液加到SepPak18(Waters(株))，使肽吸附。吸附的肽用含有0.1％(v/v)TFA的80％(v/v)的乙腈溶液洗脫。洗脫液冷凍干燥后，溶解于0.1％(v/v)TFA，將溶解后的1/10量通過連有YMC-ODS-A-323(d4.6mm×150mm)柱的HPLC分離，加樣后大約14.2分鐘洗脫出的峰作為rCF6級分收集(圖2)。同樣的操作重復10次，收集該洗脫級分作為粗純化rCF6。
粗純化rCF6級分冷凍干燥后溶解于0.1％TFA，通過連有YMC-ODS-A-323的HPLC純化(圖3、％B40-43/18分；流速2.5ml/分)。將大約14.2分鐘洗脫出的峰收集后冷凍干燥，作為rCF6標準品。通過質量分析儀MALDI-TOFMS(VoyagerElite；日本Perseptive(株))分析，rCF6標準品是單一峰，分子量大致與理論值一致，另外通過使用氨基酸序列分析儀(PPSQ-10；島津制作所(株))分析，N末端10個氨基酸與rCF6的一樣，通過這些事實可以確認rCF6的結構。
象rCF6那樣從嵌合蛋白中切出并純化hCF6。hCF6在最初的HPLC中大約在18.0分鐘洗脫出來(圖4)。再次層析大約在10.5分鐘洗脫出來(圖5，洗脫梯度為％B45-48/18分鐘)。其結構象rCF6那樣確認。
從400mg的嵌合蛋白可分別得到大約210μg hCF6和290μg rCF6，切出效率大約分別為15％和20％，與用因子Xa作切出酶相比(回收率8％)，提高了2～2.5倍。[實施例2]大鼠血中CF6的測定(兔抗大鼠CF6抗體(抗rCF6抗體)的制作)由在rCF6(序列2)的C末端的19個氨基酸的N末端附加了半胱氨酸的共計20個氨基酸構成的肽(CFPTFNFEDPKFEVLDKPQSC-rCF6(58-76)序列12)通過Fmoc固相法合成，經(jīng)使用C18柱的HPLC純化。通過合成肽的N末端的半胱氨酸結合于鑰孔血藍素(KLH)，制作免疫用抗原。
用兩只新西蘭白種兔，初次將用完全佐劑(CFA)乳化的抗原在兔子背部皮下4個地方免疫后，在2周、6周、8周后用不完全佐劑(IFA)乳化的抗原進行同樣的免疫。采集動物的全血，得到抗血清?？寡宓目贵w效價通過將抗原固定化的ELISA測定。免疫前的兔子血清的抗體效價在50以下，免疫的兔子的血清的抗體效價分別是59，600和81，400。將抗血清加到結合了6mg抗原肽的瓊脂糖凝膠親和柱(6ml)上，洗凈后，用低pH洗脫，純化抗體(圖6)。純化的抗體濃縮后，對含有0.1％(w/v)NaN3的PBS溶液透析后，使用之前保存在-80℃下。(rCF6濃度測定方法的建立)rCF6(序列2)的C末端19個氨基酸的N末端附加了酪氨酸的共計20氨基酸的肽(YFPTFNFEDPKFEVLDKPQSY-rCF6(58-76)(序列13))通過Fmoc固相法合成，經(jīng)使用C18柱的HPLC純化。Y-rCF6(58-76)的放射性碘標記(125I標記)利用乳酸過氧化物酶法進行，125I標記的Y-rCF6(58-76)經(jīng)使用C18柱的HPLC純化后，添加最終濃度為0.1％(w/v)的牛血清白蛋白，使用之前保存在-80℃下。
使用通過樣品中的抗原抑制125I標記的抗原和抗體的反應進行定量的拮抗抑制體系作為反應體系。即將含有0.25～32ng的rCF6的樣品100μL和rCF6抗體(稀釋2500倍)100μL混合，反應12小時后，向反應液中添加125I標記的Y-rCF6(58-76)100μL，再反應過夜。然后添加用含有200μg/mL的兔IgG 100μL和10％(w/v)聚乙二醇6000的RIA緩沖液稀釋60倍的羊抗兔IgG血清(日本抗體研究所)1mL，放置1小時。經(jīng)3000rpm、30分鐘離心后，除去上清，用γ計數(shù)器測定125I。所有的反應都是在4℃下進行。結果在0.25～16ng/μL的范圍，觀察到沉淀中放射活性與用量的依賴關系。于是建立了樣品中rCF6濃度的測定方法。(大鼠血液中rCF6的測定)使用上述的測定方法，測定4周齡的雄性高血壓自然發(fā)病大鼠(SHR)和正常血壓大鼠(WKY)、以及16周齡的SHR和WKY的血液中rCF6。
每組都是5只大鼠，用含有1/10用量的1％(w/v)EDTA·2Na溶液的注射器采血。得到的血液經(jīng)冷卻離心，提取血漿。血漿在測定之前一直保存在-80℃下。在該血漿0.8ml中添加2N鹽酸0.2ml后，于4℃下放置10分鐘。然后于4℃、10000rpm條件下離心30分鐘，其上清加到SepPakC18柱，用0.1％(v/v)TFA 5ml洗3次。用含有0.1％(v/v)TFA的60％(v/v)乙腈溶液2ml洗脫柱子，于真空條件下除去溶劑，溶解于0.2～0.4ml的RIA緩沖液中，作成RIA用樣品。供使用前面制備的抗rCF6抗體的上述測定方法用。
各組大鼠血漿中的rCF6的測定結果表明無論哪一組中血漿中的rCF6都在200pg/mL以上。4周齡的SHR和WKY的血漿中rCF6濃度沒有差別，如都是16周齡，SHR的血漿中的rCF6濃度顯示出明顯的增加，比WKY的濃度高(p＜0.05)(表1)。
因此表明在大鼠血液中存在rCF6。而在PGI2不足的自然高血壓模型(SHR)中能夠確認血中rCF6濃度隨著周齡增加即高血壓的發(fā)病而增加。即起因于PGI2不足的高血壓的發(fā)病和rCF6的血液濃度之間存在相關性。
表1血漿中rCF6濃度(pg/ml)

平均(利用HPLC制備RIA用樣品中與抗rCF6抗體反應的級分的分子)抗rCF6抗體是以rCF6的第58位到76位的片段作為抗原制備的。因此，在用上述RIA體系評價的CF6量中也包含含有來自rCF6 C末端片段的肽的量。用HPLC對RIA樣品進行分級，研究各個級分與抗rCF6抗體的反應性。
使RIA樣品吸附在SepPak18上，用含有0.1％(v/v)TFA的60％(v/v)的乙腈溶液洗脫。洗脫出的樣品冷凍干燥后，溶解于0.1％(v/v)TFA，用連有InertsilODS-2C18(d4.6mm×250mm)柱(GL科學(株))的HPLC分離、分級(用含有0.1％(v/v)TFA的20％(v/v)的乙腈溶液洗5分鐘以上，用20-60％乙腈直線梯度/30分洗脫)。可以確認在使用抗rCF6抗體的上述測定體系中抗體反應性在90％以上的級分在與rCF6同一級分中洗脫出來。
即表明血液中的抗rCF6抗體反應性分子的90％以上不是含有來自rCF6C末端片段的肽，而是rCF6。[實施例3]兔抗hCF6抗體(抗hCF6抗體)的制作和hCF6測定體系的建立在免疫用抗原中使用由在hCF6(序列6)的N末端10～27個氨基酸的N端附加了半胱氨酸的共計19個氨基酸構成的肽和KLH的結合物，象[實施例2]那樣操作，得到針對hCF6的抗血清。免疫后得到的兔血清的抗體效價分別為123,000和121,300?？筯CF6抗體象[實施例2]那樣純化。hCF6的測定體系除了使用hCF6作為標準品以外，與rCF6測定體系一樣制作在125I標記的肽中含有由hCF6(序列2)的N末端10～27氨基酸構成的肽(LFVDKIREYKSKRQTSGGhCF6(10-27)；序列15)。[實施例4]抗hCF6抗體對大鼠血壓的影響(抗rCF6抗體對大鼠血壓的影響)將16周齡的SHR和WKY麻醉后，由大腿靜脈注入抗hCF6抗體(0.3、1.0、3.0μg/kg)，直接通過來自頸動脈的血測定動脈血壓。結果發(fā)現(xiàn)，對于SHR，由于注入抗hCF6抗體使得平均動脈血壓下降，其下降程度依賴于抗體的用量(圖7和圖8)。而對于WKY，注入抗hCF6抗體并沒有引起有意義的血壓變動(圖8)。另外注入非特異的兔抗體(IgG10μg/kg)，對SHR和WKY的動脈血壓都沒有影響。(抗hCF6抗體前注入對緩激肽引起的大鼠血壓降低的影響)研究抗hCF6抗體對緩激肽引起的大鼠血壓降低的影響。將16周齡的SHR和同周齡的WKY麻醉后，由大腿靜脈累積注入緩激肽(0.3、1.0、3.0μg/kg)，直接通過來自頸動脈的血測定動脈血壓。然后由大腿靜脈注入抗hCF6抗體(3.0μg/kg)后，同樣注入緩激肽，觀察血壓反應。
結果表明注入緩激肽引起SHR和WKY血壓降低都依賴于緩激肽用量(圖9-1和圖10)。而就SHR來說，注入抗hCF6抗體可使緩激肽引起的血壓下降進一步增強(圖9-2和圖10)，但對WKY來說，沒有影響(圖10)。
因此抗hCF6抗體只是在rCF6濃度上升的高血壓狀態(tài)下表現(xiàn)出降壓作用，表明CF6的抑制對由血液中CF6過剩引起的疾病的癥狀的改善是有效的。[實施例5]rCF6注入對大鼠血壓的影響研究rCF6對大鼠血壓的影響。將15周齡的SHR或WKY麻醉后，由大腿靜脈注入rCF6(0.3、1.0、3.0μg/kg)，直接通過來自頸動脈的血測定動脈血壓。SHR和WKY由于rCF6注入引起的平均動脈壓上升都依賴于用量，但其對SHR的作用比WKY更顯著(圖11、圖22)。
在血中CF6濃度高的SHR中能看到CF6的效果顯著，表明SHR處于對CF6的作用更易感性的狀態(tài)。
如果與實施例4中的抗rCF6抗體引起SHR血壓的下降作用的結果相加，CF6拮抗劑和CF6分泌抑制藥有可能成為血液中CF6過剩狀態(tài)的疾病中的某些高血壓根治的治療藥。即，表明抑制血中CF6濃度作為血中CF6濃度異常的疾病的治療方法是有效的。[實施例6]正常人和急性心肌梗塞患者的血漿中的hCF6用含有1/10用量的1％(w/v)EDTA·2Na溶液的注射器從健康人(6名)和急性心肌梗塞患者(18名)的靜脈采血。急性心肌梗塞患者都是冠狀動脈形成術(PTCA)的成功例子，分別在發(fā)病日、2、3、5、7、14天采血。得到的血液經(jīng)冷卻離心，提取血漿。血漿在測定之前一直保存在-80℃下。
hCF6測定用樣品用以下方法從血漿中制備。即在該血漿0.8ml中添加2N鹽酸0.2ml后，于4℃下放置10分鐘。然后于4℃、10000rpm條件下離心30分鐘，其上清加到SepPakC18柱，用0.1％(v/v)TFA 5ml洗3次。用含有0.1％(v/v)TFA的60％(v/v)乙腈溶液2ml洗脫柱子，于真空條件下除去溶劑，溶解于0.2～0.4ml的RIA緩沖液中，作成RIA用樣品。
hCF6濃度的測定以重組hCF6作為標準，使用抗hCF6抗體用與[實施例3]的rCF6測定方法同樣的方法進行。
在健康人的血漿中，檢測出的CF6濃度為15.2＋0.5ng/ml(平均濃度＋標準誤差)，可以確認作為線粒體內膜蛋白質的CF6不僅在大鼠，而且在人的血液中也存在(圖23)。而急性心肌梗塞患者血漿中CF6濃度的峰值是在發(fā)病日或第2天出現(xiàn)，其血漿中CF6濃度高達22.1＋1.3ng/ml(圖23)。發(fā)病日或第2天的血漿中CF6濃度分別是20.2＋1.4ng/ml和17.7＋1.5ng/ml，與第14天的13.7＋0.7ng/ml相比，表現(xiàn)出有意義的高值(圖24；Fisher的PLSDp＜0.001和p＝0.01)。第7天和第14天的血漿中CF6濃度分別是13.7＋0.6ng/ml和13.7＋0.7ng/ml，低到健康人的水平以下。
由于急性心肌梗塞患者表現(xiàn)出血漿中CF6濃度上升，所以對于急性心肌梗塞等伴隨CF6濃度的變化的疾病，CF6濃度的測定作為診斷方法是有用的。[實施例7]CF6向HUVEC培養(yǎng)上清液中的釋放用不含胎牛血清的199培養(yǎng)基培養(yǎng)(直徑10cm，培替培養(yǎng)皿)匯合態(tài)的HUVEC，分別于24小時、48小時、72小時后取上清樣(各點n＝4)，測定hCF6量。用實施例6記載的方法處理培養(yǎng)上清，測定hCF6濃度。培養(yǎng)上清中的CF6濃度隨時間培養(yǎng)延長而增加，很明顯從HUVEC釋放出hCF6(圖25)。
因此，將候補物質添加到本實驗的HUVEC培養(yǎng)液中，通過使用將分泌到培養(yǎng)液中的CF6量與對照比較的方法可以得到促進CF6分泌的物質或抑制CF6分泌的物質。[參考例1]前列腺環(huán)素生成抑制因子的鑒定前列腺環(huán)素生成抑制因子通過以下給出的方法鑒定為CF6。以醋酸為萃取液從187只SHR(16～20周齡)的心臟(152g、于沸水中放置10分鐘)提取肽。提取物經(jīng)Sephadex G-25(1.5×30cm)分級(流速3ml/分；圖12)，每一級分0.5ml。活性級分(19-21)用接有InertsilODS-2 C18(d4.6mm×250mm)(GL科學(株))的HPLC分離、純化(用含有0.1％(v/v)TFA的20％(v/v)乙腈溶液洗5分鐘后，用20-60％(v/v)乙腈的直線梯度/分洗脫、流速為1mL/分，圖13)。通過測定從取自SHR腸膜動脈的平滑肌細胞分泌到上清的6-酮-PGF1α，進行活性評價。純化的肽(圖14)通過使用氨基酸序列分析儀(PPSQ-10；島津制作所(株))分析，確定從N末端開始的39個氨基酸序列(NKELDPVQKLFLDKIREYKAKRLASGGPVDTGPEYQQEV；序列2中的1～39氨基酸；序列16)，用連有YMC-ODS-A302(d4.6mm×150mm)的HPLC純化AsnN分解后的片段，確定了DRELFKLKQMYGKGEM(序列2中的40～55氨基酸；序列17)、DKFPTFNFE(序列2中的56～64氨基酸；序列18)、DPKFEVL(序列2中的65～71氨基酸；序列19)、DKPQS(序列2中的72～76氨基酸；序列20)序列。這些序列與作為大鼠質子輸送性的ATP合成酶的亞基的rCF6(序列2)序列完全一致。[參考例2]利用嵌合蛋白表達法進行CF6的制備-2以下給出了使用因子Xa作為從嵌合蛋白切出rCF6的酶制造rCF6(序列2)的方法。
(rCF6 DNA的制備)
通過PCR可以得到含有編碼在N末端附加了因子Xa識別序列的Ile GluGly Lys序列(序列21)的rCF6蛋白質的DNA片段。作為模板使用在100℃下處理1分鐘的大鼠大動脈cDNA文庫(克隆技術(株))，作為引物使用CF03(序列22)和CF04(序列23)。
DNA片段在pCRII克隆(pCRIIrCF6Xa)后，確定堿基序列，確認其結構。序列225’-GATCGAGGGACGTAATAAGGAACTTGATCCT-3’序列235’-GTCGACTTAGGACTGGGGTTTGTCGA-3’(表達載體的構建)用限制性內切酶Eco RI和Sal I切pCRIIrCF6Xa，得到由0.3kb構成的Eco RI-Sal I DNA片段。該DNA片段含有編碼在rCF6的N末端附加了Glu-Phe-Gly-Leu-Ile-Glu-Gly-Lys序列(序列24)的蛋白質的DNA堿基序列，其上游有限制性內切酶Eco RI位點，而下游有限制性內切酶Sal I位點。而Glu-Phe-Gly-Leu-Ile-Glu-Gly-Lys序列是在來自質粒pCRII DNA的Glu-Phe-Gly-Leu序列的C末端結合了因子Xa識別序列Ile-Glu-Gly-Lys后形成的序列。質粒pG97S4DhCT[G]用限制性內切酶EcoRI和Sal I切后，可制備含有載體部分的大約3.5kb DNA片段。將該片段與由0.3kb構成的Eco RI-Sal I DNA片段連接，可得到pG97SDrCH6Xa(圖15)。(rCF6嵌合蛋白表達和純化)使用pG97SDrCH6Xa轉化大腸桿菌JM109菌株，得到JM109[pG97SDrCH6Xa]。將JM109[pG97SDrCH6Xa]接種于含有10μg/mL四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)6小時。將最終濁度(OD660nm)達到0.1那樣的培養(yǎng)液接種于含有10μg/mL四環(huán)素和5mM IPTG的SB培養(yǎng)基中于37℃下培養(yǎng)16小時。
培養(yǎng)液于6000rpm、4℃條件下離心10分鐘(20PR-52D；日立制作所(株))，回收菌體。將該菌體懸浮于含有1mMEDTA·Na的Tris鹽酸(pH8.0)中，用弗氏(細胞)壓碎器破碎菌體(10,000psi；2次)。
菌體破碎液于8000rpm、4℃條件下離心20分鐘(05PR-22D；日立制作所(株))，將沉淀懸浮于含有0.5％(w/w)TritonX-100的20mM Tris鹽酸(pH8.0)30ml，于3000rpm、4℃條件下離心15分鐘，回收沉淀。對該操作重復4次，作為粗純化嵌合蛋白。(從嵌合蛋白中切出hCF6和rCF6并純化)從嵌合蛋白中切出rCF6，在3mg/ml粗純化嵌合蛋白濃度中使用50μg/mL因子Xa，于含有2M尿素的50mM Tris鹽酸(pH8.0)、100mMNaCl、1mMCaCl2溶液中，于37℃下反應4小時。反應液吸附于SepPak18柱后，用0.1％(v/v)三氟乙酸洗，用含有0.1％(v/v)三氟乙酸的80％(v/v)的乙腈溶液洗脫，回收肽。洗脫液冷凍干燥后，溶解于0.1％(v/v)TFA，rCF6通過連有YMC-ODS-A-302柱的HPLC純化(％B35-50/30分；14.5分洗脫出)。RCF6的結構象實施例1那樣確認。
但是，由于從本方法中的嵌合蛋白切出rCF6的切出效率大約低至8％，實施體內實驗等需要大量的CF6，所以需要更有效的CF6的制造方法。[參考例3]CF6對前列腺環(huán)素生成的抑制將HUVEC在含有參考例2制備的1、10、100nM的rCF6的DMEM中于37℃下培養(yǎng)30分鐘，研究CF6對PGI2生成的抑制作用。PGI2的生成是以分泌到培養(yǎng)基中的PGI2的穩(wěn)定代謝物6-酮-PGF1α量為指標的。結果表明，CF6抑制PGI2生成依賴于其用量(圖16)。在有1μM緩激肽存在下也進行了同樣的實驗，了解到CF6抑制由于緩激肽引起的PGI2生成上升依賴于CF6用量(圖17)。
另外雖然10nM的CF6抑制2μg/ml的伊屋諾霉素引起的PGI2生成量的上升，但不能抑制從細胞外添加的10ng/ml的花生四烯酸和10ng/mlPGH2引起的PGI2生成量的上升。
PGI2是以磷脂為起始物質合成的。即通過PLA2從磷脂切出的花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧激酶作用轉換為PGH2，再經(jīng)PGI2合成酶轉換合成的。伊屋諾霉素使該反應中的PLA2活化，即促進從磷脂中切出花生四烯酸。
因此，從CF6的作用不抑制從花生四烯酸或從花生四烯酸級聯(lián)反應下游產物的PGH2生成PGI2，而是抑制由于PLA2活化造成的PGI2生成的現(xiàn)象表明CF6的PGI2生成抑制作用是PLA2作用的抑制。[參考例4]CF6抑制花生四烯酸游離的作用從參考例3可看出CF6抑制PGI2生成的作用是來自于對PLA2的抑制。使花生四烯酸從脂肪酸釋放的PLA2根據(jù)結構和化學上的性質大致分為Ca2+依賴性細胞質型PLA2(cPLA2)、Ca2+依賴性分泌型PLA2(sPLA2)、Ca2+非依賴性PLA2(iPLA2)三種。使用各種抑制劑對CF6抑制哪種PLA2進行了研究。
在有[3H]標記的花生四烯酸存在下對HUVEC培養(yǎng)24小時后，將培養(yǎng)基換成DMEM，在有1、10、100nM的CF6存在下于37℃下培養(yǎng)30分鐘，研究培養(yǎng)液中游離的[3H]標記的花生四烯酸。結果表明CF6抑制[3H]標記的花生四烯酸游離依賴于其用量(圖18)。另外在有1μM的緩激肽存在下進行同樣的實驗，了解到CF6抑制緩激肽引起[3H]標記的花生四烯酸釋放的促進作用依賴于其用量(圖19)。
另外，研究了在1μM的緩激肽存在或不存在下cPLA2抑制劑(40μMAACOCF3；花生四烯酸3氟甲基酮)、sPLA2抑制劑(1μM OPC；油酰羥乙基磷酰膽堿)、或iPLA2抑制劑(1μM BEL；溴烯醇膽堿)抑制從HUVEC釋放花生四烯酸的作用。結果表明，在HUVEC的實驗中只有cPLA2抑制劑抑制花生四烯酸釋放，即參與從HUVEC釋放花生四烯酸的PLA2是cPLA2(圖20、21)。
cPLA2對含有花生四烯酸的磷脂表現(xiàn)出很高的特異性，通過μM級的Ca2+濃度可有選擇地使花生四烯酸釋放。從cPLA2過剩表達鼠和cPLA2缺失鼠的實驗表明cPLA2不僅在起始階段的花生四烯酸的代謝中，而且在炎癥反應中重要的花生四烯酸的后續(xù)階段的代謝中也是很重要的，人們期待cPLA2的抑制表現(xiàn)出很強的炎癥反應(Uozumi N.、et al 390618-622、1997)。
本發(fā)明可以提供CF6特異的抗體，與該因子有關的病癥的診斷方法。另外本發(fā)明提供由于CF6活性抑制而不能使正常血壓下降的高血壓等疾病的治療方法。另外基于本發(fā)明的診斷方法，本發(fā)明也提供血液中的CF6增加或減少病癥的治療方法。
<110>SUNTORY LIMITED<120>偶聯(lián)因子6的抑制劑和激活劑和抗原<130>YCT-515<140>PCT/JP00/5210<141>2000-08-03<150>JPA264687/99<151>1999-09-17<160>24<210>1<211>76<212>PRT<213>Human<400>1Asn Lys Glu Leu Asp Pro Ile Gln Lys Leu15 10Phe Val Asp Lys Ile Arg Glu Tyr Lys Ser15 20Lys Arg Gln Thr Ser Gly Gly Pro Val Asp25 30Ala Ser Ser Glu Tyr Gln Gln Glu Leu Glu35 40Arg Glu Leu Phe Lys Leu Lys Gln Met Phe45 50Gly Asn Ala Asp Met Asn Thr Phe Pro Thr
55 60Phe Lys Phe Glu Asp Pro Lys Phe Glu Val65 70Leu Glu Lys Pro Gln Ala75<210>2<211>76<212>PRT<213>Rat<400>2Asn Lys Glu Leu Asp Pro Val Gln Lys Leu15 10Phe Leu Asp Lys Ile Arg Glu Tyr Lys Ala15 20Lys Arg Leu Ala Ser Gly Gly Pro Val Asp25 30Thr Gly Pro Glu Tyr Gln Gln Glu Val Asp35 40Arg Glu Leu Phe Lys Leu Lys Gln Met Tyr45 50Gly Lys Gly Glu Met Asp Lys Phe Pro Thr55 60Phe Asn Phe Glu Asp Pro Lys Phe Glu Val65 70Leu Asp Lys Pro Gln Ser75<210>3<211>5<212>PRT<213>Unknown<220><221><222><223>腸激酶識別部位<400>3Asp Asp Asp Asp Lys<210>4<211>139<212>PRT<213>E.coli<400>4Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp1 510 15Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro20 25 30Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser35 40 45Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro50 55 60Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Glu Ser Asp Leu Pro Glu65 70 75 80Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr Asp85 90 95Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro
100 105 110Phe Val Pro Thr Glu Asn Pro Thr Gly Ser Tyr Ser Leu Thr Phe Asn115 120 125Val Asp Glu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Gln Thr130 135<210>5<211>97<212>PRT<213>E.coli<400>5Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp1 5 10 15Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro20 25 30Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser35 40 45Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro50 55 60Ala Pro Glu Ala Val Pro Asp Ser Leu Leu Asp Ser Asp Leu Pro Glu65 70 75 80Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr Asp85 90 95Ala<210>6<211>23<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>PCR方法中用的引物<400>6atgactgttc agaggatctt cag<210>7<211>27<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>PCR方法中用的引物<400>7gtcgactcag gactggggtt tgtcgag<210>8<211>23<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>PCR方法中用的引物<400>8atgattcttc agaggctctt cag<210>9<211>28<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>PCR方法中用的引物<400>9gtcgactcag gcctggggtt tttcgatg<210>10<211>45<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>編碼腸激酶識別部位和Eco RI識別部位的基因<400>10gaattcgacg atgacgataa gaataaggaa cttgatcctg tacag<210>11<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>編碼腸激酶識別部位和Eco RI識別部位的基因<400>11gaattcgacg atgacgataa gaataaggaa cttgatccta tacaga<210>12<211>20<212>PRT<213>rat<400>12Cys Phe Pro Thr Phe Asn Phe Glu Asp Pro Lys Phe Glu Val Leu1 5 10 15Asp Lys Pro Gln Ser20<210>12<211>20<212>PRT<213>rat<400>12Cys Phe Pro Thr Phe Asn Phe Glu Asp Pro Lys Phe Glu Val Leu1 5 10 15Asp Lys Pro Gln Ser20<210>13<211>20<212>PRT<213>rat<400>13Tyr Phe Pro Thr Phe Asn Phe Glu Asp Pro Lys Phe Glu Val Leu1 5 10 15Asp Lys Pro Gln Ser20<210>14<211>19<212>PRT<213>human<400>14Cys Leu Phe Val Asp Lys Ile Arg Glu Tyr Lys Ser Lys Arg Gln1 5 10 15Thr Ser Gly Gly<210>15<211>18<212>PRT<213>human<400>15Leu Phe Val Asp Lys Ile Arg Glu Tyr Lys Ser Lys Arg Gln Thr1 5 10 15Ser Gly Gly<210>16<211>39<212>PRT<213>rat<400>16Asn Lys Glu Leu Asp Pro Val Gln Lys Leu Phe Leu Asp Lys Ile1 5 10 15Arg Glu Tyr Lys Ala Lys Arg Leu Ala Ser Gly Gly Pro Val Asp20 25 30Thr Gly Pro Glu Tyr Gln Gln Glu Val35<210>17<211>16<212>PRT<213>rat<400>17Asp Arg Glu Leu Phe Lys Leu Lys Gln Met Tyr Gly Lys Gly Glu1 5 10 15Met<210>18<211> 9<212>PRT<213>rat<400>18Asp Lys Phe Pro Thr Phe Asn Phe Glu1 5<210>19<211> 7<212>PRT<213>rat<400> 19Asp Pro Lys Phe Glu Val Leu1 5<210>20<211>5<212>PRT<213>rat<400>20Asp Lys Pro Gln Ser1 5<210>21<211>4<212>PRT<213>人工合成序列<220><221><222><223>因子Xa識別部位<400>21Ile Glu Gly Lys<210>22<211>31<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>PCR方法中用的引物<400>22gatcgagggacgtaataaggaacttgatcct<210>23<211>26<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>PCR方法中用的引物<400>23gtcgacttaggactggggtttgtcga<210>24<211>8<212>PRT<213>人工合成序列<220><221><222><223>含有肽的因子Xa識別部位<400>24Glu Phe Gly Leu Ile Glu Gly Lys1 權利要求
1.血液中的CF6過剩疾病的預防或治療藥，以偶聯(lián)因子6(CF6)抑制劑為有效成分。
2.權利要求1記載的預防或治療藥，其中CF6抑制劑是抑制CF6分泌的物質或CF6拮抗劑。
3.權利要求1或2記載的預防或治療藥，其中血液中的CF6過剩的疾病是心肌梗塞、心絞痛、心功能不全、肺高血壓、高血壓癥、腦血管障礙、閉塞性動脈硬化癥、動脈硬化、高脂血癥、糖尿病、支氣管病、胃潰瘍、妊娠子癇、溶血性尿毒癥綜合癥、血栓性血小板減少性紫斑病。
4.血液中的CF6不足的疾病的預防或治療藥，以CF6活化劑為有效成分。
5.權利要求4記載的預防或治療藥，其中CF6活化劑是促進CF6分泌的物質或CF6激動劑。
6.權利要求4或5記載的預防或治療藥，其中血液中CF6不足的疾病是腦梗塞、急性胰腺炎、哮喘、ARDS、包含慢性關節(jié)風濕病在內的炎癥性疾病。
7.PGI2不足的疾病和/或Ca2+依賴性細胞質型PLA2(cPLA2)作用減弱的疾病的預防或治療藥，以CF6抑制劑為有效成分。
8.權利要求7記載的預防或治療藥，其中CF6抑制劑是抑制CF6分泌的物質或CF6拮抗劑。
9.權利要求7或8記載的預防或治療藥，其中PGI2不足的疾病和/或Ca2+依賴性細胞質型PLA2(cPLA2)作用減弱的疾病是心肌梗塞、心絞痛、心功能不全、肺高血壓、高血壓癥、腦血管障礙、閉塞性動脈硬化癥、動脈硬化、高脂血癥、糖尿病、支氣管病、胃潰瘍、妊娠子癇、溶血性尿毒癥綜合癥、血栓性血小板減少性紫斑病。
10.PGI2過剩的疾病和/或cPLA2作用亢進的疾病的預防或治療藥，以CF6活化劑或CF6為有效成分。
11.權利要求10記載的預防或治療藥，其中CF6活化劑是促進CF6分泌的物質或CF6激動劑。
12.權利要求10或11記載的預防或治療藥，其中PGI2過剩的疾病和/或cPLA2作用亢進的疾病是腦梗塞、急性胰腺炎、哮喘、ARDS、包含慢性關節(jié)風濕病在內的炎癥性疾病。
13.血液中CF6濃度增加或減少的疾病的診斷方法，其特征是測定采集的血樣中的CF6濃度。
14.由血液中CF6濃度增加或減少的疾病的診斷方法中使用的抗CF6抗體組成的診斷助劑，其特征是測定采集血樣中的CF6濃度。
15.權利要求14記載的診斷助劑，抗CF6抗體是以人CF6(序列1)或大鼠CF6(序列2)的全部或一部分作為抗原制作的。
16.利用基因重組技術制造CF6或其部分多肽的方法，包括培養(yǎng)用含有編碼嵌合蛋白的DNA的載體轉化的宿主，所說的嵌合蛋白中的編碼所說的CF6或其部分多肽的多核苷酸序列通過編碼N末端上腸激酶識別部位的多核苷酸序列與保護肽連接；然后用腸激酶處理上述得到的嵌合蛋白，得到CF6或其部分多肽。
17.血液中CF6濃度增加或減少疾病的患病容易程度的診斷方法，包括確定該患者基因組中的CF6基因區(qū)內基因序列有無變異。
18.權利要求17記載的方法，其中，血液中CF6濃度增加或減少的疾病是與PGI2的不足或過剩有關的疾病。
19.權利要求17記載的方法，其中，血液中CF6濃度增加或減少的疾病是與cPLA2作用亢進或減弱有關的疾病。
20.權利要求13記載的診斷方法，其中，血液中CF6濃度增加或減少的疾病是急性心肌梗塞。
全文摘要
提供作為存在于線粒體內的輸送質子的ATP合成酶的亞基的偶聯(lián)因子6有無在血液中存在以及其濃度的測定方法。另外闡明了血液中的偶聯(lián)因子6濃度和疾病的關系,以及偶聯(lián)因子6作用的抑制與疾病治療效果的關系,提供該疾病的診斷、治療技術。本發(fā)明提供含有編碼偶聯(lián)因子6或其片段的DNA的載體、用該載體轉化的轉化體以及偶聯(lián)因子6和其片段的制造方法。另外,本發(fā)明提供對偶聯(lián)因子6特異反應的抗體和其制造方法,以及偶聯(lián)因子6的測定方法。另外,本發(fā)明提供有關疾病的發(fā)病、進展和血液中的偶聯(lián)因子6量之間關系的見解,以及顯示由于抑制偶聯(lián)因子6而使癥狀改善的效果,血液中的偶聯(lián)因子6量或前列腺環(huán)素生成/cPLA2抑制活性變化引起的各種疾病的診斷和治療手段。
文檔編號A61P11/00GK1327389SQ00801939
公開日2001年12月19日 申請日期2000年8月3日 優(yōu)先權日1999年9月17日
發(fā)明者長內智宏, 孫田浩二 申請人:三得利株式會社