專利名稱：生物類黃酮類或多酚化合物治療帕金森病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物類黃酮類或多酚類化合物的一種新用途，尤其涉及生 物類黃酮類或多酚類化合物在預(yù)防或治療帕金森病中的用途，屬于藥物化 學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
帕金森病(Parkinson' s Disease, PD)又名震顫麻痹，是一種常 見的中老年人神經(jīng)退行性疾病。PD的主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)致密部 (Substantia Nigral compacta, SNc )多巴胺(Dopamine, DA)能神經(jīng) 元的變性，當(dāng)神經(jīng)元變性到達(dá)一定閾值，開始出現(xiàn)癥狀，主要表現(xiàn)為靜止 性震顫、運(yùn)動遲緩和肌肉強(qiáng)直，此外還有步態(tài)、姿勢異常，認(rèn)知障礙等癥 狀。其發(fā)病原因與中腦黑質(zhì)紋狀體內(nèi)的多巴胺神經(jīng)元的變性丟失相關(guān)。目 前PD的確切發(fā)病機(jī)制還不明確，^旦已有多種學(xué)說，如氧化應(yīng)激學(xué)說、 環(huán)境毒素學(xué)說、遺傳因素學(xué)說等。其中，氧化應(yīng)激在帕金森病的發(fā)病機(jī)制 中具有重要作用。
臨床上對PD的治療可以分為藥物治療和手術(shù)治療，以藥物治療為 主。手術(shù)治療的應(yīng)用范圍較窄，以蒼白球毀損術(shù)為代表的毀損手術(shù)，由于 中、遠(yuǎn)期療效不佳，并有可能帶來不可預(yù)測的并發(fā)癥，如吞咽、語言和平衡 障礙，目前已經(jīng)基本淘汰。神經(jīng)干細(xì)胞移植目前還處于實(shí)驗(yàn)階段，腦深部 電極刺激(de印brain stimulation, DBS )是治療PD的最新進(jìn)展，但手 術(shù)后仍然要堅(jiān)持藥物治療；而藥物治療基本上以緩解癥狀為主，尤以左旋 多巴(L-DOPA)為最常用的治療藥物，但L-DOPA長期使用有許多嚴(yán)重副 作用，如"開-關(guān)"現(xiàn)象、運(yùn)動不能、精神障礙等，且僅為對癥治療，隨 著神經(jīng)元變性的發(fā)展其效能逐漸減小。盡管新的腺苷A2A受體拮抗劑在 PD治療中的應(yīng)用受到日益關(guān)注，但仍缺乏根治的藥物。因此，研發(fā)高效 低毒的新的治療PD的新藥顯得必須而緊迫。我國是資源豐富的中藥大國，近年來報(bào)道許多中藥及其有效成分均有 神經(jīng)保護(hù)作用，研究這些中藥及其有效成分，開發(fā)出能改善PD癥狀的新 藥將會有廣闊的應(yīng)用前景。
DJ-1基因最早由日本學(xué)者Nagakubo等在1997年發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，他們 發(fā)現(xiàn)，作為一個(gè)新的癌基因，DJ-1的基因產(chǎn)物能轉(zhuǎn)化小鼠NIH3T3細(xì)胞， 并與H-Ras具有協(xié)同轉(zhuǎn)化作用。之后，人們研究發(fā)現(xiàn)DJ-1基因突變與人 類常染色體隱性遺傳早發(fā)型帕金森病(Parkinson' s disease, PD)相 關(guān)，此外，DJ-1還具有抗氧化應(yīng)激、分子伴侶等功能，并與胂瘤、阿爾 茨海默病、亨挺頓病發(fā)生相關(guān)。
DJ-l基因定位于人類染色體lp36，有8個(gè)外顯子，長24kb。外顯 子1A和1B不編碼，在DJ-1 mRNA中^c可變剪切。外顯子2 ~ 7包含開》文 性閱讀框架(0RF)，編碼一個(gè)含189個(gè)氨基酸的蛋白，其分子量約為 20kD 。 DJ-1蛋白以同源二聚體的形式存在，屬于DJ-1/ThiJ/PfpI蛋白 超家族，在進(jìn)化中高度保守，其單體包含8個(gè)a-螺旋和ll個(gè)P-片層。 對小鼠的研究表明DJ-1蛋白廣泛分布在腦和脂肪組織之外的外周組織， 在腦中廣泛表達(dá)，并在海馬、小腦和嗅球中高表達(dá)。在大鼠腦中，DJ-1 在海馬、皮層、紋狀體中均有表達(dá)。小鼠中DJ-1主要分布在神經(jīng)元，在 膠質(zhì)細(xì)胞中分布很少，而在大鼠和人中，DJ-1主要存在于膠質(zhì)細(xì)胞中， 在神經(jīng)元中低表達(dá)或缺失。
目前家族性PD與DJ-1的關(guān)系已經(jīng)為眾多文獻(xiàn)所證明，即DJ-1基因 突變會引起早發(fā)性PD,患者腦內(nèi)DJ-1蛋白也會發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化或者在 細(xì)胞器內(nèi)發(fā)生位置上的遷移。而非家族性PD患者的DJ-1基因發(fā)生突變比 較罕見。這一點(diǎn)已經(jīng)為大家所公認(rèn)。因?yàn)镈J-1具有抗氧化應(yīng)激的作用， 而氧化應(yīng)激是引起PD的一個(gè)重要的誘因，因此這種作用可以被看作是機(jī) 體對PD進(jìn)程的一種自我保護(hù)的反應(yīng)；另一方面，在對早發(fā)性PD進(jìn)行的 DJ-1外顯子的篩查中，還在散發(fā)性PD患者發(fā)現(xiàn)了 DJ-1的多種雜合性突 變。此外，Masaaki Waragai等對來自散發(fā)性PD病人和非PD病人的腦脊 液(CSF)進(jìn)行定量免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，散發(fā)性PD病人CSF DJ-1水平顯 著高于非PD對照，而PD早期階段CSF DJ-1的上調(diào)更明顯。因此CSF DJ-1可能是散發(fā)性PD早期階段的生物標(biāo)記。進(jìn)一步研究表明，DJ-1與 PD的其他致病基因如a-synuclein和Parkin基因存在密切的關(guān)系。ct-synuclein和PD的發(fā)病相關(guān)，DJ-1不但能抑制其聚集，而且在PD病人Lewy小體的邊緣與其共定位。parkin介導(dǎo)的DJ-1蛋白穩(wěn)定性的改變可能 與PD發(fā)病有關(guān)。Goldberg等還報(bào)道了 DJ-1與02受體之間的關(guān)系，DJ-1 功能喪失可導(dǎo)致D2受體介導(dǎo)應(yīng)答的減弱。
DJ-1的最重要的功能是抗氧化應(yīng)激功能，DJ-1蛋白是氫過氧化物反 應(yīng)蛋白，能參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低氧化應(yīng)激對機(jī)體的損傷。用siRM降 低神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)源DJ-1表達(dá)能增加氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞死亡。Taira等 也發(fā)現(xiàn)利用siRNA敲除DJ-l的SH-SY5Y細(xì)胞對過氧化氫(H202) 、 l-曱基-4-苯基吡啶離子(MPP+)和6-羥基多巴胺(6-0HDA)引起的細(xì)胞死亡更敏感。 相反，在大鼠多巴胺能N27細(xì)胞系和原代多巴胺能神經(jīng)元中，"達(dá)野生 型(WT) DJ-1能保護(hù)由H202、 6-0HDA和多巴胺(DA)引起的細(xì)胞死亡。 Nagakubo等研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞S期，DJ-1從細(xì)胞質(zhì)移位到細(xì)胞核，而氧化 應(yīng)激使之發(fā)生從細(xì)胞核向線粒體的移位，這可能與其抗氧化應(yīng)激、保護(hù)線 粒體損傷的功能相關(guān)。此外，氧化應(yīng)激能誘導(dǎo)DJ-1表達(dá)，并有研究發(fā) 現(xiàn)，發(fā)生氧化應(yīng)激后DJ-1蛋白的等電點(diǎn)降低，故推測DJ-1通過自身氧化 消除氧化應(yīng)激中的活性氧。在Tomoya Kinum等的研究中，將人的臍靜脈 內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)HA處理，DJ-1的三個(gè)半胱氨酸殘基(Cys)均被氧化為半胱 氨酸磺酸(Cys-S03H) (sulphonic acid)。其中，Cys-46和Cys-53僅 一小部分被氧化，但實(shí)驗(yàn)中任何濃度的HA均使Cys-106完全氧化。由此 說明Cys-106在三個(gè)半胱氨酸殘基中對氧化應(yīng)激最敏感，是DJ-1抗氧化 應(yīng)激時(shí)自身氧化的關(guān)4定氨基酸殘基。Wenbo Zhou的研究也證實(shí)當(dāng)DJ-1發(fā) 生氧化時(shí)，最先是Cys-106氧化為亞磺酸(sulfinic acid, 20 DJ-1)， 最后才是Cys-46和Cys-53的氧化。
DJ-1作為藥物耙點(diǎn)已經(jīng)在一些研究中得到了應(yīng)用。Masatoshi Inden 等發(fā)現(xiàn)將重組DJ-1蛋白給入左側(cè)黑質(zhì)注射6-0HDA的PD大鼠腦內(nèi)，能顯 著改善PD表型，包括運(yùn)動不能、黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡、紋狀體多巴 胺和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體水平的減少，并能減少由去氧麻黃堿、阿樸嗎啡和可卡 因造成的旋轉(zhuǎn)行為。Zhou等的研究發(fā)現(xiàn)DJ-1半胱氨酸106位氨基酸的過 氧化可以使DJ-1失活。而且在散發(fā)性的PD患者的血清中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有這類 氧化的DJ-1蛋白的存在。Shin Miyazaki等通過虛擬篩選的方法得到與 C106位氨基酸結(jié)合的化合物。這些化合物不僅能夠阻止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞以及原代神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，而且在SH-SY5Y 以及NIH3T3的DJ-1敲除的細(xì)胞系中表現(xiàn)出與DJ-1結(jié)合具有特異性。此 外，還能夠抑制R0S的產(chǎn)生并能防止氧化應(yīng)激引起的線粒體損傷和酪氨酸 羥化酶活性的降低。并在6-OHDA損傷的PD大鼠模型中，阻止黑質(zhì)多巴胺 能神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，恢復(fù)行為異常。這些化合物的可能作用機(jī)制是阻止 DJ-1的過氧化，從而保護(hù)了 DJ-1蛋白免于失活，正常發(fā)揮其功能。
生物類黃酮(bioflavonoids)亦稱維生素P ，常與維生素C伴存，在 自然界分布廣泛，屬植物次級代謝產(chǎn)物，是一組在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上不同的多 酚化合物，黃烷是其核心骨架，因多呈黃色而稱生物類黃酮。近年來報(bào)道類 黃酮及其某些衍生物具有廣泛的藥理學(xué)特性，包括抗炎、抗誘變、抗腫瘤 形成與生長等活性。迄今為止，尚沒有生物類黃酮類化合物具有治療帕金 森病藥理活性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生物類黃酮類或多酚化合物具有與 DJ-1蛋白相互作用的活性，在此基礎(chǔ)上，又進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)生物類黃酮類或多酚化合物均具有抗氧化應(yīng)激，防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的 PC12細(xì)J包或原代神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)l包內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species, R0S)的產(chǎn)生以及提高酪氨酸羥化酶的活性等特性，上述實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明，生物類黃酮類或多酚化合物具有確切的預(yù)防或治療帕金森病的藥 理活性。本發(fā)明人對大量的生物類黃酮類或多酚化合物進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)下述的7種生物類黃酮類或多酚化合物相比于其它的生物類黃酮類化合 物，具有更為確切或顯著的抗帕金森病的藥理活性
山柰酚-3氧蕓香糖苷(Kaempferol 3-0~ 0+rutinoside )(代號 為hhw-14)、脫水紅花黃色素B ( Anhydrosafflor yellow B)(代號為 hhw-16 ) 、 6-羥基山柰酚-3， 6-二氧葡萄糖苷(6-Hydroxykaempfero1 3, 6-W+Clucoside)(代號為hhw-19 ) ; (2S)-4， ， 5-二羥基-6， 7-二氧葡萄糖二氫黃酮苷((2S)-4， ， 5-dihydroxy1-6， 7-di+/3-/>■ glucopyranssyl f lavanone )(代號為 hhw-21 ) 、 ,丁 (Quercetin 3-0~ )3-D~rutinoside )(代號為hhw-29 )、槲皮素(quercetin)、香草 醛(代號為3# )、異香草醛(代號為5#)。
當(dāng)然，生物類黃酮類或多酚化合物的酸加成的鹽，這些鹽包括在本發(fā) 明之中。
生物類黃酮類或多酚化合物的酸加成鹽優(yōu)選為藥學(xué)上可接受的，與適 當(dāng)?shù)乃?例如鹽酸、醋酸、硫酸)形成無毒的鹽，除了藥物上可接受的鹽 以外，其它的鹽也包括在本發(fā)明之中。
上述化合物的結(jié)構(gòu)式為下式所示
7<formula>formula see original document page 8</formula>
上述各化合物均可以通過商業(yè)途徑購買得到，也可按照現(xiàn)有的文獻(xiàn) 所公開的方法制備得到。
本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問題是提供一種預(yù)防或治療帕金森病 的藥物組合物，該藥物組合物由有效量的生物類黃酮類或多酚化合物或其 可藥用的鹽與藥學(xué)上可接受的載體配合而成，也即是說，將藥學(xué)上可接受 用量的生物類黃酮類或多酚化合物與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑配合 后，按本領(lǐng)域常規(guī)的制劑方法將其制備成任意一種適宜的藥物組合物。將有效量的生物類黃酮類化合物與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑配合后，按 本領(lǐng)域常規(guī)的制劑方法將其制備成任意一種適宜的藥物組合物。通常該組 合物適合于口服給藥和注射給藥，也適合其他的給藥方法。該組合物可以 是片劑、膠嚢劑、粉劑、顆粒劑、錠劑、栓劑，或口服液等液體制劑形 式。根據(jù)不同的給藥方法，本發(fā)明藥物組合物可以含有0. 1%-99%重量，
優(yōu)選10-60%重量的生物類黃酮類或多酚化合物。


圖l hhw-14、 hhw-16、 hhw-19、 hhw-21和hhw-29的分離流程圖;
圖2 3并化合物和DJ-1蛋白的相互作用試驗(yàn)結(jié)果；
圖3 hhw-14化合物和DJ-1蛋白的相互作用試驗(yàn)結(jié)果；
圖4 hhw-16化合物和DJ-1蛋白的相互作用試驗(yàn)結(jié)果；
圖5 hhw-19化合物和DJ-l蛋白的相互作用試驗(yàn)結(jié)果；
圖6 hhw-21化合物和DJ-l蛋白的相互作用試驗(yàn)結(jié)果；
圖7槲皮素(quercetin)和DJ-1蛋白的相互作用試驗(yàn)結(jié)果；
圖8 5#化合物和DJ-1蛋白的相互作用試驗(yàn)結(jié)果； 圖9 hhw-29化合物和DJ-1蛋白的相互作用試驗(yàn)結(jié)果； 圖103#、 5#、 hhw-14、 hhw-16、 hhw-19 、 hhw-21和槲皮素 (quercetin)和DJ-1蛋白的相互作用試-驗(yàn)結(jié)果；
圖11 3#、 5#、 hhw-14 、 hhw-16 、 hhw-19 、 hhw-21和槲皮素
(quercetin)對氧化應(yīng)激i秀導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的作用試-驗(yàn)結(jié)果；
圖12 3#、 5#、 hhw-14 、 hhw-16 、 hhw-19 、 hhw-21和槲皮素 (quercetin )防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的原代神經(jīng)細(xì)胞的凋亡試驗(yàn)結(jié)果；
圖13 3#、 5#、 hhw-14 、 hhw-16 、 hhw-19 、 hhw-21和槲皮素 (quercetin )對細(xì)月包內(nèi)活性氧水平的影響試—瞼；
圖14 3#、 5#、 hhw-14 、 hhw-16 、 hhw-19 、 hhw-21和槲皮素 (quercetin)對酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH )的活性影響 試驗(yàn)；
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會 隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍 構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和 范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改 和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例l 山柰酚-3氧蕓香糖苷、脫水紅花黃色素B、 6-羥基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖苷、(2S)-4， ，5-二羥基-6，7-二氧葡萄糖二氫黃酮苷和蘆 丁的制備
1、 試劑與藥品
常規(guī)提取分離用乙醇、曱醇等均為分析純試劑，制備用甲醇為色鐠 純試劑，北京化工廠生產(chǎn)，乙腈為Fisher試劑(Fisher Scientific, Fairlawn， NJ )。去離子水由純凈水經(jīng)Millipore Simplicity純水系統(tǒng) 制備。
大孔樹脂(AB-B)購自天津南開大學(xué)；層析柱用凝膠Sephadex LH-20 (25-100 pm)為Amersham Biosciences/>司產(chǎn)品，北京分公司分裝； 0DS反相柱填料(50 [jm)為Merk公司生產(chǎn)。
2、 藥材
紅花為菊科植物紅花CarWa/nus L.的干燥花瓣，購自
中國藥材7>司，產(chǎn)地為新疆，由北京大學(xué)藥學(xué)院果德安教授鑒定。
3、 提取與分離取紅花藥材560 g,加水14倍浸泡過夜，60。C溫浸兩次，每次2小 時(shí)，合并兩次提取液，減壓濃縮至一定體積約4升左右，將水提物溶液減 壓抽濾，澄清溶液上大孔樹脂，以水-乙醇梯度洗脫。水洗脫部分為糖及 大分子蛋白質(zhì)等物質(zhì)，棄去。HPLC檢測收集10。/。(6 g)、 30°/。(22 g)、 50°/。(24 g)、 70%(2. 4g)、 95%(0. 8 g)乙醇洗脫部分，分別減壓濃縮至一定 體積后，至于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，得干燥粉末，置干燥器中，避光陰 涼處貯藏備用。取50%乙醇部分上Sephadex LH-20柱，水-曱醇梯度洗 脫，HPLC檢測收集合并各流份，半制備液相進(jìn)一步純化，得到hhw-14(12 mg)、 hhw-16(130 mg) 、 hhw-19(39 mg) 、 hhw-21 (27. 6 mg) 、 hhw-29 (3 mg)。具體分離過程見圖1。
4、結(jié)構(gòu)鑒定
(1)山柰酚-3氧蕓香糖苷(Kaempferol 3-0~戶-IHrut inos ide ) (hhw-14)的鑒定
白色^f分末，可溶于曱醇、乙腈。分子式為C27H30O15。 ESI-MS(m/z): 593([M-H]陽)。H1-NMR(500固z,DMSO-4)S:6.19(lH, d，/=2.0Hz，H-6)， 6.40(1H, d, ^^2.0Hz，H-8), 6.87(2H, d, J:9.0Hz，H-3',5'), 7.97(2H, d, ^9.0Hz,H-2，,6，),顯示為苯環(huán)的AABB系統(tǒng)。10.09(1H, s， 4'-OH), 10.80(1H， s, 7-0H), 12.55(1H， s, 5隱OH); 3-O-Glc, 5.25(1H, d, J=8.0Hz,H-r)， 3.67(1H, bd, /=10.0Hz,H-6a), rhamnosyl moiety, 4.35(1H, d, /=2.0Hz,H-1)， 0.97(3H, s, CH3), 3.00-3.69為糖上的氬信號。13C-NMR(125 MHz， DMSO-^) S:156.4(C-2)， 133.2(C-3), 177.3(C-4), 161.1(C-5)， 98.6(C-6), 164.0(C-7)， 93.6(C-8)， 156.7(C-9), 103.9(C-10)， 120.8(C-1，), 130.7(C-2，,6,)， 115.0(C隱3，，5')， 159.7(C-4，)； 3-O-Glc, 101.3(C-1), 74.1(C-2), 76.3(C-3), 69.9(C-4)， 75.7(C-5), 66.8(C-6); rhamnosyl moiety, 100.7(C-1), 70.3(C-2), 70.5(C-3)， 71.8(C-4)， 68.1(C-5), 17.5(C畫6)。以上H據(jù)與文獻(xiàn)(Kazuma， Kohei;Takahashi, Takashi;Sato,Katsura， et al.Quinochalcones and flavonoids from fresh florets in different cultivars of Carthamus tinctorius L. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2000， 64(8): 1588-99 )報(bào)道的基本一致，故此化合物鑒定為山 柰酚-3氧蕓香糖苷。
(2) 脫水紅花黃色素B ( Anhydrosafflor yellow B) (hhw-16)的鑒定
黃色粉末，可溶于水、曱醇、乙醇、乙腈。分子式為C48H52026。 ESI-MS(m/z): 1043([M誦H]-)。 13C-NMR(125 MHz，pyridine-d5/methanol-《(v/v,95:5))S:197.2(C-l), 196.4(C-1，)， 103.8(C-2)， 114.6(C-2，)， 189.2(C-3)， 188.0(C-3，)， 85.4(C-4)， 87.2(C-4，)， 184.4(C-5), 173.8(C畫5'), 107.2(C-6), 109.3(C-6，)， 182.5(C-7), 181.2(C-7，)， 122.9(C-8), 119.3(C-8，)， 140.2(C-9), 144.3(C-9,), 129.0(C-10), 128.2(C-10，)， 131.0(C-11，15), 131.7(C-11,,15，)， 116.7(C-12，14), 116.9(C-12，,14，)， 160.3(C-13)， 161.4(C-13，)， 4-C-Glc, 86.0(C-l，)， 70.9(C-2，)， 79.8(C-3，)， 70.6(C-4，)， 80.4(C-5，)， 60.7(C-6,), 4,-C-Glc, 87.3(C-1，)， 69.1(C-2，)， 79.5(C-3，)， 71.5(C-4，)， 82.2(C-5，)， 62.7(C-6，)， 2,2,-C-Glc， 38.3(C-1"), 95.0(C-2，，)， 72.4(C-3"), 72.8(C-4"), 73.1(C-5"), 65.0(C-6")。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Kazuma, Kohei;Takahashi, Takashi;Sato, Katsura， et al.Quinochalcones and flavonoids from fresh florets in different cultivars of Carthamus tinctorius L. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2000， 64(8): 1588-99)報(bào)道的基本一致，故此化合物鑒定為脫水紅花黃色素B。
(3) 6-雍基山柰酚-3, 6-二氧葡萄糖苷(6-Hydroxykaempferol 3， 6-0"jS"0"glucoside) (hhw-19)的鑒定
淺黃色粉末，可溶于甲醇、乙醇、乙腈及水。分子式為C27H3()017。 ESI-MS(m/z): 625([M-H]-)。 H、NMR(500MHz，DMSO-拳6.55(lH， s, H-8),
126.87(2H， d, /=9.0Hz， H-3，,5，)， 8.03(2H, d, J二8.5Hz, H-2，,6，),顯示為苯環(huán)的 AABB系統(tǒng)。10.14(1H， s， 4，-OH), 12.76(1H, s, 5-OH); 3-O-Glc, 5.14(1H, d, /=7.5Hz， H-1); 6-O-Glc, 4.77(1H， d, J二7.5Hz, H-1), 3.04-3.64為沖唐上的氫信 號。13C-NMR(125 MHz， DMSO-d6) S:157.2(C畫2), 132.8(C-3), 177.7(C-4), 152.0(C隱5)， 128.2(C-6), 156.4(C-7)， 93.9(C-8), 152.3(C-9)， 105.9(C-10)， 120.9(C-r), 130.8(C-2,，6,)， 115.0(C-3，，5，)， 159.9(C畫4，)； 3-6>-Glc， 100.8(C-1)， 74.2(C-2)， 76.4(C-3), 69.9(C-4), 77.4(C-5)， 60.8(C-6); 6-O-Glc, 104.3(C-1), 73.8(C-2), 76.1(C-3)， 69.5(C-4), 77.2(C-5), 60.7(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) (Kazuma, Kohei;Takahashi， Takashi;Sato， Katsura， et al.Quinochalcones and flavonoids from fresh florets in different cultivars of Carthamus tinctorius L. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2000, 64(8): 1588-99 ) l艮道的基 本一致，故此化合物鑒定為6-羥基山柰酚-3, 6-二氧葡萄糖苷。
(4) (2S)-4， ，5-二羥基-6,7-二氧葡萄糖二氫黃酮苷((2S)-4， ， 5-dihydroxyl—6, 7—di_0~ —i)~glucopyranssyl flavanone) (hhw—21)的 鑒定
淺黃色粉末，可溶于曱醇、乙醇、乙腈及水。分子式為C27H32016。 ESI-MS(m/z): 61 l([M-H])。 hLnMR(500MHz，DMSO-早6.35(1H, s, H-8), 6.79(2H, d, /=9.0Hz, H-3，,5'), 7.31(2H, d,聲9.0Hz, H-2，，6，),顯示為苯環(huán)的 AABB系統(tǒng)。5.47(1H, d,聲9.0Hz， H-2), 9.56(1H， s，4，-OH), 11.95(1H， s,5-OH); 6-CM31c， 4.53(1H, d，聲7.0Hz, H-l); 7-CM31c, 4.91(1H， d， 《/=7.5Hz, H-1),3.07-3.68為糖上的氪信號。13C-NMR(125 MHz, DMSO-4) 5: 78.7(C畫2), 42.3(C-3)， 197.5(C國4), 154.6(C誦5), 126.9(C-6)， 158.1(C-7), 94.8(C隱8), 158.5(C-9)， 103.4(C-10), 128.6(C誦r), 128.4(C國2,，6，),115.0(C-3，,5，)； 6-0畫Glc, 103.7 (C-1), 73.3(C畫2), 75.7(C畫3)， 69.8(C陽4), 77.1(C-5), 60.6(C畫6); 7-0畫Glc,跳7(C畫1),74.0(C-2)， 76.2(C-3), 69.8(C-4)， 77.1(C畫5), 60.6(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(J Asian Nat Prod Res. Two new compounds from Carthamus tinctorius.Zhou YZ， Chen H, Qiao L, Xu N, Cao JQ， Pei YH. 2008 May-Jun;10(5-6):429隱33.)報(bào)道 的基本一致，故此化合物鑒定為(2S)-4， ，5-二羥基-6, 7-二氧葡萄糖二 氫黃酮苷。
(5) ,丁 (Quercetin 3-0~ 0 -Z)~rut inos ide ) (hhw-29)的鑒定
淺黃色粉末，可溶于甲醇、乙腈。分子式為C27H3()016。 ESI-MS(m/z): 609([M-H])。 rf-NMR(500MHz，DMS0O5: 6.16(1H， d, W.O, H-6), 6.35(1H, d, /=2.0, H-8), 7.61(1H, d， /=2.0， H-2'), 7.57(1H, dd,8.5, H-6，),顯示為苯環(huán)的AABB系統(tǒng)；3-(9-Glc, 5.05(1H, d,J^7.0, H-l)， 3.75(1H, bd, J=l 1.0， H-6a), rhamnosyl moiety, 4.46(1H, s, l-H), 3.57(1H, m， 2-H), 3.48(1H, dd, /=3.0， 9.0, 3-H), 1.06(3H, d,J二6.0, -CH3), 3.19-3.76為糖上的氬 信號。13C-NMR(125固z， MeOH-力)S: 158.2(C-2), 135.6(C-3), 179.5(C-4)， 163.0(05)， 100.0(C-6), 166.0(C-7), 94.9(C-8), 159.4(C-9), 105.7(C-10), 123.2(C-1，)， 117.7(C-2，)， 145.9(C-3，)， 149.8(C-4，)， 116.1(C隱5'), 123.6(C-6，)； 3畫OGlc, 104.7(C-1), 75.7(C-2), 78.2(C-3), 71.4(C-4), 77.3(C-5)， 68.6(C-6); rhamnosyl moiety, 102.4(C-1), 72.1(C-2)， 72.3(C-3), 73.9(C-41)， 69.7(C-5), 17.9(C畫6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Kazuma, Kohei;Takahashi， Takashi;Sato， Katsura, et al.Quinochalcones and flavonoids from fresh florets in different cultivars of Carthamus tinctorius L. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2000， 64(8): 1588-99)凈艮道的基本一致，故此化合物鑒定為蘆 丁。
試驗(yàn)例1 生物類黃酮類化合物和DJ-1蛋白的相互作用試驗(yàn)(QCM)一、試驗(yàn)材料
1、供試化合物山柰酚-3氧蕓香糖苷(Kaempferol 3-0~戶-rutinoside)(代號為hhw-14 )、脫水紅花黃色素B ( Anhydrosaff lor yellow B)(代號為hhw-16 ) 、 6-羥基山柰酚-3， 6-二氧葡萄糖苷(6-Hydroxykaempferol 3， 6_di-6>~ -Z>~glucoside )(代號為 hhw-19 ); (2S)-4， ，5-二羥基-6，7-二氧葡萄糖二氫黃酮苷((2S)-4， ， 5-dihydroxy1-6， 7_di_0~戶_D~glucopyranssyl flavanone )(代號為hhw-21)、蘆丁 (Quercetin 3-0~ ;9-ZKrutinoside )(代號為hhw-29 )、槲 皮素(quercetin)、香草醛(代號為3# )、異香草醛(代號為5# )。
山柰酚-3氧蕓香糖苷、脫水紅花黃色素B、 6-羥基山柰酚-3，6-二氧 葡萄糖苷、(2S)-4， ，5-二鞋基-6,7-二氧葡萄糖二氫黃酮苷和蘆丁按照實(shí) 施例l的方法制備得到；槲皮素(quercetin)、香草醛和異香草趁購自 北京化學(xué)試劑廠，規(guī)格為分析純；
2、其它化合物氯仿；H202/H2S04(mol/raol = 1/3)，DMS0.
二、試^驗(yàn)方法
1、 用H202/H2S04(mol/mol = 1/3)作為洗滌劑洗滌石英芯片，洗滌后 用蒸餾水沖洗，吹打干凈。
2 、固定化合物將4ul的luM供試化合物樣本溶于適量氯仿中，直 到氯仿完全揮發(fā)。
3、 取8mlPBS置于樣品池中，固定石英芯片，4吏之浸入樣品池中。
4 、啟動計(jì)算機(jī)，然后調(diào)整相關(guān)參數(shù)。
5 、待基線平穩(wěn)后，取lmg/ml的蛋白溶液8ul，加入樣品池，標(biāo)記， 記錄lh的曲線。
6 、根據(jù)得到的曲線，判斷化合物是否與DJ-1蛋白有相互作用。 三、試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)結(jié)果見圖2-圖10。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，除了異香草醛外，其 余的供試化合物均表現(xiàn)出與DJ-1蛋白的較強(qiáng)的相互作用的活性。
15試驗(yàn)例2 生物類黃酮類化合物影響氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用試驗(yàn) 一、試驗(yàn)材料
1、供試化合物山柰酚-3氧蕓香糖苦(Kaempferol 3_0~ 0 -P~ ruti謂ide)(代號為hhw-14 )、脫水紅花黃色素B ( Anhydrosaff lor yellow B)(代號為hhw-16 ) 、 6-羥基山柰酚-3， 6-二氧葡萄糖苷(6-Hydroxykaempferol 3， 6-di-0~ 0 ~D~glucoside )(代號為 hhw-19 ); (2S)-4， ，5-二羥基-6，7-二氧葡萄糖二氫黃酮苷((2S)-4， ， 5-dihydroxyl-6， 7-di_0~ j0-D-glucopyranssyl flavanone)(代號為hhw_ 21)、槲皮素、香草醛(代號為3# )、異香草醛(代號為5#)。
2、 細(xì)胞才朱
PC12細(xì)胞(鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)，北海道大學(xué)分子生物實(shí)驗(yàn) 室提供
3、 其它試劑
可高壓滅菌的RPMI1640干粉(Invitrogen公司)，小牛血清 (Gibco) , EDTA, H202
二、試驗(yàn)方法
PC12細(xì)胞分為以下各組(1)空白對照組除了培養(yǎng)基外，不加任 何藥物；(2)模型組培養(yǎng)液中加入25Q iamol . L—力202,處理0. 5 h; (3)給藥組用luM供試化合物預(yù)處理24h后加入25G jamol . L—1 H202，處理0. 5 h。
將細(xì)胞以l x 10Vwell的密度鋪入96孔板，每組樣本設(shè)5個(gè)平行孔，每 孔加入100jaL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜后加入化合物賻育24h后，加入HA ,使 其終濃度為250uM，處理O. 5小時(shí)后每孔加入10ul的CCK-8培養(yǎng)4小時(shí)。使用 酶標(biāo)儀在450nm波長測量吸光度值，未接受11202處理的空白對照組的吸光度200810240461.0 值設(shè)為100%,計(jì)算過氧化氫處理后的細(xì)胞存活率。統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性差異 *p < 0. 05, **p < 0. 01。
三、試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)結(jié)果見圖ll。試驗(yàn)結(jié)果表明，同模型組相比，除hhw21外，其余 的供試化合物均具有明顯的抗氧化應(yīng)激作用，有顯著性差異。
試驗(yàn)例3 生物類黃酮類化合物防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的原代神經(jīng)細(xì)胞凋亡的 試驗(yàn)
一、試驗(yàn)材料
1、供試化合物山柰酚-3氧蕓香糖苷(Kaempferol 3-0~ ^ rutinoside)(代號為hhw-14 )、脫水紅花黃色素B ( Anhydrosaff lor yellow B)(代號為hhw-16 ) 、 6-羥基山柰酚-3， 6-二氧葡萄糖苷(6-Hydroxykaempferol 3, 6_di-0~ )0 _i)~glucoside )(代號為 hhw_19 ); (2S)-4， ，5-二羥基-6，7-二氧葡萄糖二氬黃酮苦((2S)-4， ， 5-dihydroxy1-6, 7-di-0" -Z)"glucopyranssyl flavanone )(代號為 hhw-n)、槲皮素、香草醛(代號為3# )、異香草醛(代號為5#)。
2、 實(shí)—驗(yàn)動物孕17日的wistar大鼠，日本北海道大學(xué)動物部提供
3、 其它試劑 DMEM (Invitrogen公司)，胎牛血清(FBS， Gibco);多聚賴氨酸購自sigma/>司，0. 25%胰酶，B-27。
二、試驗(yàn)方法
(1) 培養(yǎng)板的處理96孔培養(yǎng)板，每孔加入50ug/ml的多聚賴氨 酸，孵育過夜，以PBS液和培養(yǎng)基浸洗后放培養(yǎng)箱待用。
(2) 將受孕17日的大鼠脫頸推致死，置75%酒精泡2 — 3秒鐘，再用 碘酒消毒腹部，麻醉后無菌條件下取出胎鼠，剝除胎膜放入裝有冷D-Hanks液的無菌皿中。皿下墊水袋。取腦，在解剖顯微鏡下剔除腦膜和血 管，分離出紋狀體。用D-Hanks洗2次，剪碎組織成約0. 5 mm . 0.5
17mm .0.5 mm大小，吸出組織轉(zhuǎn)移到另一支裝有DMEM/Bbs的離心管內(nèi)。 吹打數(shù)次，靜置后取上清，吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟。最后仍 殘留的小組織塊棄去。所得上清吹打數(shù)次混勻，取樣進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞 密度成10000/well種入96孔板，放入含5°/。C02的孵箱培養(yǎng)。次日后， 全量換DMEM和2。/。B-27的無血清培養(yǎng)液。以后每隔3天進(jìn)行換液。第七 日加入luM供試化合物與大鼠角質(zhì)層神經(jīng)元細(xì)胞共孵育24h后，150uM過 氧化氫處理3h, MTT法測定細(xì)胞的存活率。顯著性差異*p < 0.05, **p < 0. 01。
三、試-驗(yàn)結(jié)果
試-險(xiǎn)結(jié)果見圖12。試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物3#， 5#， hhwl9， hhwl4， hhwl6和quercetin均能顯著防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的原^^神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。
試驗(yàn)例4 生物類黃酮類化合物抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species, ROS )的活小生^式馬全
一、 試驗(yàn)材料
1、供試化合物山柰酚-3氧蕓香糖苷(Kaempferol 3-0~ ;9-i>~ rutinoside)(代號為hhw-14 )、脫水紅花黃色素B ( Anhydrosaf f lor yellow B)(代號為hhw-16 ) 、 6-羥基山柰酚-3， 6-二氧葡萄糖苷(6-Hydroxykaempferol 3， 6-;6 _i)~glucoside )(代號為 hhw-19 ); (2S)-4， ，5-二羥基-6，7-二氧葡萄糖二氫黃酮苷((2S)-4， ， 5-dihydroxy1-6， 7-di-0" )0-/)"glucopyranssyl flavanone)(代號為 hhw-21)、槲皮素、香草醛(代號為3#)、異香草醛(代號為5#)。
2、 細(xì)月包PC12細(xì)月包；
3、 其它試劑DCFH—DA (sigma) , DAPI (sigma)
二、 試-驗(yàn)方法將細(xì)胞以2 x 105的密度鋪入6孔板，培養(yǎng)24小時(shí)后，與luM供試化 合物孵育10min后加入H202 ，使其終濃度為0. 1 mM,處理3小時(shí)后棄去 培養(yǎng)基，用PBS洗滌兩次后加入終濃度為5 jimol/L的DCFH-DA共同孵育 30分鐘。吸去DCFH-DA后細(xì)胞再用PBS洗滌兩次，DAPI染色后，在激光 掃描共聚焦顯纟鼓鏡下觀察。
三、試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)結(jié)果見圖13,試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組，ROS水平明顯升高，而經(jīng) 化合物處理后的細(xì)胞，R0S水平基本與未處理的陰性對照組相近，幾乎完 全終止了 R0S的產(chǎn)生。
試一險(xiǎn)例5 生物類黃酮類化合物影響酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH )活性的試一瞼
一、試驗(yàn)材料
1、供試化合物山柰酚-3氧蕓香糖苷(Kaempferol 3-0~ ^ -rutinoside)(代號為hhw-14 )、脫水紅花黃色素B ( Anhydrosaf f lor yellow B)(代號為hhw-16 ) 、 6-羥基山柰酚-3， 6-二氧葡萄糖苷(6-Hydroxykaempferol 3， 6_cfi-0~ ~0~glucoside )(代號為 hhw-19 ); (2S)-4， ，5-二羥基-6，7-二氧葡萄糖二氫黃酮苷((2S)-4， ， 5-dihydroxy1-6， 7-di-0~ ]9-Z)-glucopyranssyl flavanone)(代號為 hhw-21)、槲皮素、香草^ (代號為3# )、異香草醛(代號為5#)。
2、細(xì)胞PC12細(xì)胞；
二、試-驗(yàn)方法
PC12細(xì)胞以2 x 105的密度鋪入6孔板，次日與luM供試化合物孵育 24h后加入HA，使其終濃度為O. 15 mM，處理3小時(shí)后棄去培養(yǎng)基，37 o C與 100 mM L-tyrosine和500uM /Hiyciroxybeiizylhydrozine共同
19孵育12h后，棄去培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，懸浮于O. 2ml的0. 1N的高氯酸 中，超聲；12000rpm 4度離心15min,上清液100ul進(jìn)樣。以未經(jīng)過氧化 氫處理組的峰面積/蛋白濃度作為100%。
HPLC柱^f吏用4.6 * 150 mm COSMOSIL (Nakalai, Kyoto, Japan); 流速0. 8ml/min, 流動相50 mM potassium phosphate, 0. 1 mM EDTA， 0. 2 mM heptane sulfonic acid, and 10% methanol, pH 2.6。
三、試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)結(jié)果見圖14。試驗(yàn)結(jié)果表明，同模型組相比，經(jīng)供試化合物處 置后的PC12細(xì)胞，其酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, )活性顯 著增加。
權(quán)利要求
1、生物類黃酮類或多酚類化合物或其可藥用的鹽在制備治療帕金森病的藥物中的用途。
2、 按照權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的生物類黃酮類 或多酚類化合物選自山柰酚-3氧蕓香糖苷、脫水紅花黃色素B、 6-羥基山 柰酚-3，6-二氧葡萄糖香、(2S)-4， ，5-二鞋基-6，7-二氧葡萄糖二氫黃酮 苷、,丁、槲皮素、香草醛或異香草醛。
3、 一種預(yù)防或治療帕金森病的藥物組合物，由有效量的生物類黃酮 類或多酚類化合物或其可藥用的鹽與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組成。
4、 按照權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于所述的生物類 黃酮類或多酚類化合物選自山柰酚-3氧蕓香糖苷、脫水紅花黃色素B、 6-羥基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖苷、(2S)-4， ，5-二鞋基-6，7-二氧葡萄糖二 氫黃酮苷、,丁、槲皮素、香草醛或異香草醛。
全文摘要
本發(fā)明公開了生物類黃酮類或多酚化合物在預(yù)防和治療帕金森病中的用途。所述的生物類黃酮類或多酚化合物可選自山柰酚-3氧蕓香糖苷、脫水紅花黃色素B、6-羥基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖苷、(2S)-4’，5-二羥基-6，7-二氧葡萄糖二氫黃酮苷、蘆丁、槲皮素、香草醛或異香草醛。本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生物類黃酮類或多酚化合物具有與帕金森病相關(guān)蛋白DJ-1相互作用的活性。通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生物類黃酮類或多酚化合物具有抗氧化應(yīng)激，防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞或原代神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生以及提高酪氨酸羥化酶活性等藥理活性，可用于預(yù)防或治療帕金森病。
文檔編號A61K31/352GK101433545SQ20081024046
公開日2009年5月20日 申請日期2008年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者偉 曲, 有賀寬芳, 果德安, 蒲小平 申請人:北京大學(xué)