大豆苷元的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種大豆苷元的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆異黃酮(Soybean Isoflavones，SIF)是大豆中具有重要生理活性的多酸類黃 酮化合物，母體結(jié)構(gòu)如下：
[0003]
[0004] 大豆異黃酮在天然大豆中的主要存在方式是以3-苯并吡喃為母核，并結(jié)合了糖基 的糖苷，種類共12種。
[0005]
[0006] 大豆素(Daidzein)、黃豆黃素(Glycitein)和染料木素(Genistein)，這3種為游離 型，總稱為大豆苷元;還有就是與其對應(yīng)的9種結(jié)合型糖苷:葡萄糖苷、乙?；咸烟擒蘸捅?二?；咸烟擒崭?種。在天然的大豆異黃酮產(chǎn)品中，易被人體吸收的活性功能成分是游離 型苷元，此部分僅占大豆異黃酮總量的2%~3%，其余是不易被人體吸收的結(jié)合型糖苷，占 97 %~98%。結(jié)合型中的乙?；咸烟擒蘸捅；咸烟擒詹环€(wěn)定，加熱后會發(fā)生轉(zhuǎn)化， 使游離型苷元含量增加。
[0007] 天然大豆苷元的獲得主要有兩種途徑：一是從大豆中直接提取，二是由結(jié)合型大 豆異黃酮轉(zhuǎn)化而來。與轉(zhuǎn)化相關(guān)的技術(shù)主要有酸堿水解法、酶水解法，最主要的酶有葡萄 糖苷酶、葡萄糖酸酶、α-半乳糖苷酶、乳糖酶、真菌乳糖酶和乳糖酶F等;微生物降解法，對產(chǎn) 葡萄糖苷酶的菌種研究主要集中在酵母、曲霉、木霉以及細(xì)菌。綜合目前的相關(guān)研究，存 在的問題是，大豆苷元的提取率和轉(zhuǎn)化率都比較低，市售的大豆異黃酮產(chǎn)品總黃酮含量在 30%~80%，而且其中苷元含量也很低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明是要解決現(xiàn)有轉(zhuǎn)化方法大豆苷元的轉(zhuǎn)化率，純度低的問題，提供一種大豆 苷元的制備方法。
[0009]本發(fā)明大豆苷元的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：
[00? 0] -、原料熱處理:對原料進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理的具體方法為炒制，炒制時間為103s， 炒制溫度為130~140°C;所述原料為大豆異黃酮；
[0011]二、發(fā)酵：
[0012]將步驟一炒制過的原料加入到BHI液體培養(yǎng)中，然后接入河生腸桿菌LJ-G1菌液， 接種量為5%，發(fā)酵條件為:初始pH為7.8~8.2，溫度為38~40°C，時間為38~40h;
[0013]三、耦合酶解發(fā)酵：
[0014]將液態(tài)黑曲霉β_葡萄糖苷酶稀釋8000倍后，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的海藻酸鈉緩沖溶液 混合均勻，然后用注射器緩慢的滴入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的殼聚糖溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的CaC12 溶液組成的混合液中，形成微膠囊，然后將其放于4°C硬化2h，再用真空抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾，移 至體積分?jǐn)?shù)〇. 2%的戊二醛中，于40~45°C交聯(lián)1~1.5h，用蒸餾水洗滌3遍，沖去未結(jié)合的 游離酶以及固定化酶表面的戊二醛，得到海藻酸鈉-殼聚糖-β_葡萄糖苷酶-固定化酶；
[0015] 待步驟二的發(fā)酵時間剩余3~4h時，添加固定化酶于發(fā)酵液中，進(jìn)行耦合酶解發(fā) 酵，初始pH為6.5~7.5、酶解時間為3~4h，得酶解發(fā)酵液；
[0016] 四、純化干燥：
[0017] 將酶解發(fā)酵液于3000~3500r/min離心30~40min，取上清液用活性炭進(jìn)行脫色30 ~40min，每50mL上清液加入3g活性炭，再經(jīng)大孔樹脂純化，得到大豆苷元甲醇溶液，旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)除去溶劑，干燥，制得大豆苷元產(chǎn)品。
[0018] 步驟一中所述大豆異黃酮購買自石家莊健禾生物科技有限公司。
[0019] 步驟二中所述河生腸桿菌LJ-G1已于2014年在文獻(xiàn)《一株素食者產(chǎn)雌馬酚腸道菌 的分離與鑒定》(李笑梅.賈冰心.食品科學(xué)，2014年03期）中公開。
[0020] 步驟二中河生腸桿菌LJ-G1菌液的活菌數(shù)為55 X 105CFU/mL。
[0021] 步驟二中炒制過的原料質(zhì)量與BHI液體培養(yǎng)基的體積比為lg: 166mL。
[0022] 步驟三中稀釋后的黑曲霉β_葡萄糖苷酶液與海藻酸鈉緩沖溶液的體積比是1:10。 [0023] 步驟三所述混合液中殼聚糖溶液和CaCl2溶液的體積比為1:1。
[0024]步驟三中加了酶的海藻酸鈉緩沖溶液與混合液的體積比為11:20。
[0025]步驟三中固定化酶的質(zhì)量與發(fā)酵液的體積比為1 g: 14.5mL。
[0026]步驟三中質(zhì)量分?jǐn)?shù)2 %的海藻酸鈉緩沖溶液是由海藻酸鈉和緩沖溶液組成，其中 海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，緩沖溶液由0.2mol/l磷酸二氫鈉和O.lmol/1醋酸組成，pH為5。 [0027]步驟四中大孔樹脂純化條件為:料液比1:1.8，pH為4,解析時間為6~7h。
[0028] 本發(fā)明的有益效果：
[0029] 1、本發(fā)明方法對原料進(jìn)行熱處理的目的是將結(jié)合型大豆異黃酮糖苷結(jié)構(gòu)中糖苷 鍵處理成易于酶水解狀態(tài)，其中炒制的方法更有利于對大豆苷元的轉(zhuǎn)化，而且具有設(shè)備簡 單、成本低、易于實現(xiàn)的特點。
[0030] 2、本發(fā)明方法將黑曲霉β-葡萄糖苷酶束縛在載體上，使得價格昂貴的β-葡萄糖苷 酶可以反復(fù)使用，降低成本。
[0031] 3、本發(fā)明方法是集物理加熱、酶解、微生物發(fā)酵于一體的復(fù)合技術(shù)，設(shè)備、工藝條 件較簡單，易于實現(xiàn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。而且酶利用率高，產(chǎn)生的廢液污染小，易處理。本發(fā) 明方法的大豆苷元轉(zhuǎn)化率可達(dá)到60%~76.8%，制備的產(chǎn)品大豆苷元的純度可達(dá)35%~ 47.3%〇
【附圖說明】
[0032]圖1為實施例2中三種預(yù)處理方法對大豆苷元含量變化的影響。
【具體實施方式】
[0033] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
【具體實施方式】 [0034] 一:本實施方式大豆苷元的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：
[0035] -、原料熱處理:對原料進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理的具體方法為炒制，炒制時間為103s， 炒制溫度為130~140°C;所述原料為大豆異黃酮；
[0036]二、發(fā)酵：
[0037]將步驟一炒制過的原料加入到BHI液體培養(yǎng)中，然后接入河生腸桿菌LJ-G1菌液， 接種量為5%，發(fā)酵條件為:初始pH為7.8~8.2，溫度為38~40°C，時間為38~40h;
[0038]三、耦合酶解發(fā)酵：
[0039]將液態(tài)黑曲霉β_葡萄糖苷酶(為市售商品）稀釋8000倍后，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的海藻 酸鈉緩沖溶液混合均勻，然后用注射器緩慢的滴入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的殼聚糖溶液和質(zhì)量分 數(shù)2%的CaCl2溶液組成的混合液中，形成微膠囊，然后將其放于4°C硬化2h，再用真空抽濾 機(jī)進(jìn)行抽濾，移至體積分?jǐn)?shù)0.2%的戊二醛中，于40~45°C交聯(lián)1~1.5h，用蒸餾水洗滌3遍， 沖去未結(jié)合的游離酶以及固定化酶表面的戊二醛，得到海藻酸鈉-殼聚糖-β-葡萄糖苷酶-固定化酶；
[0040]待步驟二的發(fā)酵時間剩余3~4h時，添加固定化酶于發(fā)酵液中，進(jìn)行耦合酶解發(fā) 酵，初始pH為6.5~7.5、酶解時間為3~4h，得酶解發(fā)酵液；
[0041 ] 四、純化干燥：
[0042] 將酶解發(fā)酵液于3000~3500r/min離心30~40min，取上清液用活性炭進(jìn)行脫色30 ~40min，每50mL上清液加入3g活性炭，再經(jīng)大孔樹脂純化，得到大豆苷元甲醇溶液，旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)除去溶劑，干燥，制得大豆苷元產(chǎn)品。
[0043]步驟一中所述大豆異黃酮購買自石家莊健禾生物科技有限公司。
[0044]步驟三中所述河生腸桿菌LJ-G1已于2014年在文獻(xiàn)《一株素食者產(chǎn)雌馬酚腸道菌 的分離與鑒定》(李笑梅.賈冰心.食品科學(xué)，2014年03期）中公開。
【具體實施方式】 [0045] 二:本實施方式與一不同的是:步驟二中河生腸桿菌 LJ-G1菌液的活菌數(shù)為55 X 105CFU/mL。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0046] 三:本實施方式與一不同的是: