專利名稱：生產(chǎn)具有高含量黃酮類化合物和酚類化合物的植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過分子遺傳學方法增加植物中黃酮類化合物和酚類成分的含量的方法，因此，該由分子遺傳學方法制備的植物具有降低的黃烷酮3-羥化酶的活性。
此外，在本發(fā)明的方法中，通過分子生物學方法(例如反義構(gòu)建、共抑制、表達特異性抗體或表達特異性抑制劑)在完整植物或植物部位中完全或部分、永久或短暫地降低了黃烷酮3-羥化酶的活性。
本發(fā)明另外涉及具有高含量黃酮類化合物和酚類成分的植物，其黃烷酮3-羥化酶的酶活性得到了降低。
此外，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的植物或這些植物的部位用作食品、添加劑或用于生產(chǎn)人和動物的治療用組合物、保健用組合物或補藥(汁、茶、提取物、發(fā)酵產(chǎn)品)和生產(chǎn)化妝品的用途。
在植物中發(fā)現(xiàn)了大量酚類物質(zhì)，例如咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、沒食子酸、丁子香酚、木素、香豆素類、木質(zhì)素類、芪類(虎杖苷(polydatin)、白藜蘆醇)、黃酮類化合物(黃酮類、兒茶精類、黃烷酮類、花色素類、異黃酮類)和聚甲氧基化黃酮類。因此，一般酚類也是大量植物衍生的食品和刺激劑的組成成分。某些酚類物質(zhì)具有特別重要意義，因為在與食物一起吸收后，它們可以在人或動物代謝過程中發(fā)揮抗氧化劑作用(Baum,B.O.；Perun,A.L.“抗氧化劑功效與結(jié)構(gòu)”-Soc.Plast.Engrs.Trans.2:250-257,(1962)；Gardner,P.T.；McPhail,D.B.；Duthie,G.G.“在水和有機介質(zhì)中茶的抗氧化劑潛能的電子自旋共振光譜評估”-J.Sci.FoodAgric.76:257-262(1997)；Rice-Evans,C.A.；Miller,N.J.；Pananga,G.“黃酮類化合物和酚酸類的結(jié)構(gòu)-抗氧化活性的關(guān)系”-FreeRaic.Biol.Med.20；933-956,(1996)；Salah,N.；Miller,N.J.；Paganga,G.；Tijburg,L.；Bolwell,G.P.；Rice-Evans,C.“多酚類黃酮化合物作為水相自由基清除劑和作為斷鏈的抗氧化劑”-Arch Biochem Biophys 322:339-346,(1995)；Stryer,L.Biochemistry S.Francisco:Freeman,(1975)；Vieira,O.；Escargueil-Blanc,I.；Meilhac,O.；Basile,J.P.；Laranjinha,J.；Almeida,L.；Salvayre,R.；Negre-Salvayre,A.，“食物酚類化合物對由氧化的LDL誘導的培養(yǎng)的人內(nèi)皮細胞程序死亡的影響”-Br J Pharmacol 123:565-573,(1998))。此外，多酚類還對細胞代謝具有多重性作用。特別是它們可調(diào)制信號轉(zhuǎn)導酶類諸如蛋白激酶C、酪氨酸蛋白激酶和磷脂酰肌醇3-激酶(Agullo,G.；Gamet-payrastre,L.；Manenti,S.；Viala,C.；Remesy,C.；Chap,H.；Payrastre,B.“黃酮類化合物結(jié)構(gòu)與抑制磷脂酰肌醇3-激酶之間的關(guān)系酪氨酸激酶和蛋白激酶C抑制作用的比較”-BiochemPharmacol 53:1649-1657,(1997)；Ferriola,P.C.；Cody,V.；Middleton,E.“由植物黃酮類化合物導致的蛋白激酶C的抑制作用”、“動力學機制與結(jié)構(gòu)活性的關(guān)系”-Biochem Pharmacol 38:1617-1624,(1989)；Cushman,M.；Nagarathman,D.；Burg,D.L.；Geahlen,R.L.“黃酮類化合物類似物的合成和蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶抑制活性”-J Meed Chem 34:798-806,(1991)；Hagiwara,M.；Inoue,S.；Tanaka,T.；Nunoki,K.；Ito,M.；Hidaka,H.“作為酪氨酸蛋白激酶類和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類抑制劑的黃酮化合物的不同作用”-Biochem Pharmacol 37:2987-2992,(1998)),這些酶可以下調(diào)誘導型NO合酶(Kobuchi,H.；Droy-Lefaix,M.T.；Christen,Y.；Packer,L.“銀杏提取物(EGb761)在巨噬細胞細胞系RAW264.7中對氧化氮產(chǎn)生的抑制作用”-Biochem Pharmacol53:897-903,(1997)并調(diào)節(jié)例如白細胞介素(interleucins)和粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)的基因表達(Kobuchi,H.；Droy-Lefaix,M.T.；Christen,Y.；Packer,L.“銀杏提取物(EGb761)在巨噬細胞細胞系RAW 264.7中對氧化氮產(chǎn)生的抑制作用”-BiochemPharmacol 53:897-903,(1997)；Wolle,J.；Hill,R.R.；Ferguson,E.；Devall,L.J.；Trivedi,B.K.；Newton,R.S.；Saxena,U.“新型黃酮類化合物對腫瘤壞死因子誘導的血管細胞粘附分子-1基因表達的選擇性抑制作用。對轉(zhuǎn)錄因子NF-kB沒有作用”-Atherioscler Thromb Vasc Biol 16:1501-1508,(1996))。目前可接受的觀點是這些作用有利于預防梗死、心血管疾病、糖尿病、各種確定的癌癥、腫瘤和其它慢性疾病(Bertuglia,S.；Malandrino,S.；Colantuoni,A.“天然黃酮類化合物翠雀素對糖尿病性微血管病的作用”-Arznei-Forsch/Drug Res 45:481-485,(1995)；Griffiths,K.；Adlercreutz,H.；Boyle,P.；Denis,L.；Nicholson,R.I.；Morton,M.S.Nutrition and Cancer Oxford:Isis Medical Media,(1996)；Hertog,M.G.L.；Fesrens,E.J.M.；Hollman,P.C.K.；Katan,M.B.；Kromhout,D.“食物抗氧化劑黃酮類化合物和冠心病的危害Zutphen晚期研究”-TheLancet 342:1007-1011,(1993)；Kapiotis,S.；Hermann,M.；Held,I.；Seelos,C.；Ehringer,H.；Gmeiner,B.M.“食物衍生的血管發(fā)生抑制劑染料木黃酮預防LDL氧化并防止內(nèi)皮細胞被致動脈粥樣化LDL所損害”-Arterioscler Thromb Vasc Biol 17:2868-74,(1997)；Stampfer,M.J.；Hennekens,C.H.；Manson,J.E.；Colditz,G.A.Rosner,B.；Willet,W.C.“女性中維生素E消耗與冠脈疾病危害”-New Engl J Med 328:1444-1449,(1993)；Tijburg,L.B.M.；Mattern,T.；Folts,J.D.；Weisgerber,U.M.；Katan,M.B.“茶的黃酮類化合物與心血管疾病綜述”-Crit Rev Food Sci Nutr 37:771-785,(1997)；Krik,E.A.；Sutherland,P.；Wang,S.A.；Chait,A.；Leboeuf,R.C.“食物的黃酮類化合物降低C57BL/6小鼠而非LDL受體缺陷小鼠的血漿膽固醇和動脈粥樣硬化”-J Nutr 128:954-9,(1998)-參考文獻-)。一系列治療用組合物、保健用組合物和補藥的作用以其酚類物質(zhì)含量為基礎(chǔ)，它們由此獲自合適的植物(Gerritsen,M.E.；Carley,W.W.；Ranges,G.E.；Shen,C.P.；Phan,S.A.；Ligon,G.F.；Perry,C.A.“黃酮類化合物抑制細胞因子誘導的內(nèi)皮細胞粘著蛋白的基因表達”-Am J Pathol 147:278-292,(1995)；Lin,J.K.；Chen,Y.C.；Huang,Y.T.；lin-Shiau,S.Y.“抑制蛋白激酶C和核癌基因表達作為芹菜配基和姜黃色素對癌癥化學預防作用的可能的分子機理”-J Cell Biochem Suppl 28-29:39-48,1997；Zi,X.；Mukhtar,H.；Agarval,R.“黃酮類化合物抗氧化劑水飛薊素的新癌癥化學預防作用抑制內(nèi)源性腫瘤啟動子TBFα的mRNA表達”-Biochem Biophys Res Comm 239:334-339,1997)。此外，已知某些植物衍生的食品或由它們制備的刺激劑對各種疾病具有確定的作用。例如，在白葡萄酒而非紅葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的白藜蘆醇(還包括其它成分)對梗死、心血管疾病和癌癥起作用(Gelm,B.D.；McAndrews,J.M.；Chien,P.-Y；Jameson,J.L.“在葡萄和葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的多酚類化合物白藜蘆醇是雌激素受體的興奮劑”-Proc Natl Acad Sci USA 94:14138-14143,(1997)；Jang,M.；Cai,L.；Udeani,G.O.；Slowing,K.V.；Thomas,C.F.；Beecher,C.W.W.；Fong,H.H.S.；Farnsworth,N.R.；Kinghorn,A.D.；Mehtha,R.G.；Moon,R.C.,Pezzuto,J.M.“來源于葡萄的天然產(chǎn)物白藜蘆醇的癌癥化學預防作用”-Science 275:218-220,(1997)。在諸如兒茶素、表兒茶酸-3-沒食子酸、表棓兒茶素和表棓兒茶素-3-沒食子酸這樣的物質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)了類似作用，上述物質(zhì)均是在茶(Camellia sinensis)葉中發(fā)現(xiàn)的。特別地，用未發(fā)酵的茶葉(綠茶)制成的飲料具有保健作用(Hu,G.；Han,C.；Chen,J.“用綠茶和(-)-表棓兒茶素沒食子酸抑制小鼠體內(nèi)的癌基因的表達”-Nutr Cancer 24:203-209；(1995)；Scholz,E；Bertram,B.Camellia sinensis(L.)O.Kuntze.Der Teestrauch[the teashrub].Z.Phytotherapie 17:235-250,(1995)；Yu,R.；Jiao,J.J.；Duh,J.L.；Gudehithlu,K.；Tan,T.H.；Kong,A.N.“用綠茶的多酚類激活促分裂原激活的蛋白激酶類調(diào)節(jié)抗氧化反應性元件介導的Ⅱ期酶基因表達中的潛在信號途徑”-Carcinigenesis 18:451-456,(1997)；Jankun,J.；Seiman,S.H.；Swiercz,R.“為什么飲用綠茶可以預防癌癥”-Nature 387:561,(1997)。此外，來自桔果的聚甲氧基化黃酮類也表現(xiàn)出潛在的抗癌作用(Chem,J.；Montanari,A.M.；Widmer,W.W.“分離自冷壓dancy紅桔果皮油固體的兩種新型聚甲氧基化(polymethoxylierte)黃酮，它們屬于一類具有潛在抗癌活性的化合物”-J Agric Food Chem 45:364-368,(1997))。
本發(fā)明的目的是尋找到一種增加農(nóng)作物植物黃酮類化合物和酚類成分含量的簡便而低廉的方法。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以?；h(huán)己烷二酮類的生長調(diào)節(jié)劑進行生理研究為出發(fā)點，通過目前可獲得的基因工程方法可以生產(chǎn)出以高含量治療、保健或滋補成分為特征的植物，來實現(xiàn)上述目的。
將諸如前環(huán)己烷二酮-鈣(Prohexadion-Ca)和Trinexapac-ethyl(早先稱作Cimectacarb)這樣的?；h(huán)己烷二酮類用作抑制植物縱向生長的生物調(diào)節(jié)劑。其生物調(diào)節(jié)作用的原因在于它們可阻斷促進縱向生長的赤霉素的生物合成。由于它們與2-酮戊二酸(oxoglutarsure)的結(jié)構(gòu)相關(guān)性，所以它們可抑制需要2-酮戊二酸作為共底物的某些雙加氧酶類(Rademacher,W，在(PlantBiochemical Regulators)中的“植物生長延緩劑的生化作用”，Gausman,HW(編輯)，Marcel Dekker,Inc.,New York,pp.169-200(1991))。已知這類化合物也參與酚類的代謝且由此能夠在各種植物品種中抑制花色素形成(Rademacher,W等，在《(Progress in PlantGrowth Regulation)中的“?；h(huán)己烷二酮類-一類新型生長延緩劑的作用方式”，Kaessen,CM,van loon,LC,Vreugdenhil,D(編輯)，Kluwer Academic Publishers,Dordrecht(1992))。認為這種對酚類成分平衡的作用是前己二酮-鈣抗火燒病副作用的原因(Rademacher,W等，“前己二酮-鈣-一種用于具有令人感興趣的生化特征的蘋果的新型植物生長調(diào)節(jié)劑，Poster在1998年7月7-10日在芝加哥舉行的第25屆美國植物生長調(diào)節(jié)協(xié)會年會上提出”)。A.Lux-Endrich(1998年在Weihenstephan的慕尼黑科技大學的PhD論文)發(fā)現(xiàn)在她對前己二酮-鈣抗火燒病作用機理的研究過程中，在蘋果細胞培養(yǎng)物中，前己二酮-鈣引起了酚類物質(zhì)含量增加了幾倍以上，在此過程中，發(fā)現(xiàn)了一系列通常沒有找到的酚類。在這些研究中還發(fā)現(xiàn)前己二酮-鈣可使蘋果苗組織中出現(xiàn)相對高含量的Luteoliflavan和北美圣草素。Luteoliflavan通常不會出現(xiàn)在蘋果組織中，而北美圣草素僅作為黃酮類化合物代謝的中間產(chǎn)物以小量出現(xiàn)。然而，在經(jīng)處理的組織中沒有檢測到預計的黃酮類化合物兒茶素和花青素或它們僅以明顯減少的量出現(xiàn)(S.Rmmelt等在第8屆國際火燒病研討會上提交的論文，Kusadasi,Turkey,1998年10月12-15日)。
目前可接受的觀點是前環(huán)己烷二酮-鈣、trinexapac-ethyl和其它酰基環(huán)己烷二酮類可抑制在酚類物質(zhì)代謝中起重要作用的2-酮戊二酸-依賴性羥化酶類。它們主要是查耳酮合成酶(CHS)和黃烷酮3-羥化酶(F3H)(W.Heller和G.Forkman，在(Flavonoids)中的“生物合成”，Harborne,JB(編輯)，Chapman和Hall,New York,1988)。然而，不能排除?；h(huán)己烷二酮類還可抑制其它目前還未知的其它2-酮戊二酸-依賴性羥化酶類。另外，很明顯，還注意到植物中缺乏兒茶素、花青素和其它黃酮類化合物合成的終產(chǎn)物且關(guān)鍵酶苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)的活性通過反饋機制得到了提高。不過，由于CHS和F3H持續(xù)受到抑制這一事實，所以不能形成這些黃酮類化合物的終產(chǎn)物且結(jié)果是luteoliflavan、北美圣草素和其它酚類的形成得到了增加(附

圖1)。
因為黃烷酮3-羥化酶(F3H)的酶活性降低，所以黃酮類化合物北美圣草素、原花色素類(3位C原子上被氫取代)例如luteoforol、luteoliflavan、apigeniflavan和tricetiflayan以及上述結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)的同源和異源寡聚體和聚合物的產(chǎn)量提高。
當植物中黃烷酮3-羥化酶(F3H)的酶活性降低之后，發(fā)現(xiàn)了高濃度的酚類羥基肉桂酸(對羥基肉桂酸、阿魏酸、芥子酸)、水楊酸或繖形酮、包括由它們形成的同源和異源寡聚體和聚合物。諸如(例如)根皮素這樣的查耳酮的濃度和諸如(例如)白藜蘆醇這樣的茋類的濃度同樣得到了提高。
由于黃烷酮3-羥化酶(F3H)的酶活性降低，所以黃酮類、酚類化合物、查耳酮類和芪類的糖苷的濃度也得到了提高。
根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)和由此而得的推論，生產(chǎn)出遺傳修飾的農(nóng)作物植物，其中通過反義構(gòu)建物在完整植物或各個植物器官或植物組織中完全或部分、永久或短暫地降低了F3H的活性，使得治療、保健或滋補用成分的含量在數(shù)量和質(zhì)量上均得到了改善。
可以將本發(fā)明通過以反義方向表達黃烷酮3-羥化酶而用于增加黃酮類化合物和酚類化合物含量的方法成功地用于下列農(nóng)作物植物，但該方法并不限于所述的植物葡萄樹、櫻桃、番茄、李子、黑刺李、烏飯樹(Blaubeere)、草莓、桔果(諸如柑橘、葡萄柚)、木瓜、紅球甘藍(Rotkohl)、嫩莖花椰菜(Broccoli)、抱子甘藍(Rosenkohl)、可可豆、羽衣甘藍(Grünkohl)、胡蘿卜、歐芹、芹菜、洋蔥、大蒜、茶、咖啡、啤酒花、大豆、油菜、燕麥、小麥、黑麥、黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa)、銀杏。
此外，本發(fā)明涉及用本發(fā)明方法生產(chǎn)的具有高含量黃酮類化合物和酚類成分并具有降低的黃烷酮3-羥化酶的酶活性的植物。
另一種生產(chǎn)通過反義技術(shù)降低黃烷酮3-羥化酶活性的植物的替代方法是，使用從文獻中得知的其它分子遺傳學方法諸如共抑制或特異性抗體的表達以便實現(xiàn)這一作用。
此外，本發(fā)明涉及用本發(fā)明方法生產(chǎn)的植物或這些植物的部位用作食品、食品添加劑或用于生產(chǎn)人和動物的治療用組合物、保健用組合物或滋補用組合物(汁、茶、提取物、發(fā)酵產(chǎn)品)和生產(chǎn)化妝品的用途。
令人意外的是，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)按照本發(fā)明生產(chǎn)的植物或這些植物的部位或由它們產(chǎn)生的產(chǎn)品(茶、提取物、發(fā)酵產(chǎn)品、汁等)具有下列作用(1)體外抗氧化能力(電子自旋共振(ESR)、LDL氧化、總體抗氧化能力、NO清除)得到改善；(2)觀察到了對酶類、特別是信號轉(zhuǎn)導酶類(蛋白激酶C、酪氨酸蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶)的調(diào)制作用；(3)在內(nèi)皮細胞、淋巴細胞和平滑肌細胞中誘導氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子(NF-kB、AP-1)的調(diào)制作用；(4)涉及炎癥疾病病理(細胞因子IL-1和IL-8、巨噬細胞趨化蛋白1(MCP-1)、粘著因子ICAM-1和VCAM-1)的靶基因的基因表達的調(diào)節(jié)作用得到了調(diào)制；(5)誘導了抗聚集作用；(6)抑制了肝細胞中的膽固醇合成；(7)存在抗增殖/抗腫瘤作用。
實施例1從番茄(Lycopersion esculentum Mill.cv.Moneymaker)中克隆黃烷酮3-羥化酶的基因?qū)⒎?Lycopersion esculentum Mill.cv.Moneymaker)的成熟果實洗滌、干燥并使用無菌刀片將果皮與種子、中柱和木質(zhì)部分離。將果皮(約50g)冷凍在液氮中。然后，在摻合機中粉碎該物質(zhì)。在預冷卻的研缽中，用100ml勻化培養(yǎng)基處理粉碎的物質(zhì)并混合。接著將混懸液通過無菌紗布壓榨而轉(zhuǎn)入離心瓶中。接下來加入1/10個體積的10％SDS并劇烈混合所述物質(zhì)。在冰上放置10分鐘后，加入1個體積的苯酚/氯仿并將離心瓶密封且劇烈混合內(nèi)含物。以4000rpm離心15分鐘后，將上清液轉(zhuǎn)入新反應容器中。隨后進行三次以上的苯酚/氯仿提取和一次氯仿提取。然后，加入1個體積的3M NaAc和2.5個體積的乙醇。在-20℃下將核酸沉淀過夜。第二天早晨，在冷凍離心機(4℃)中以10,000rpm將核酸沉淀15分鐘。棄去上清液并將沉淀重新懸浮于5-10ml的3M冷NaAc中。將該洗滌步驟重復兩次。將沉淀用80％乙醇洗滌。當完全干燥時，將沉淀溶于約0.5ml的無菌DEPC水并用光度法測定RNA濃度。
首先用3.3μl的3M乙酸鈉溶液、2μl的1M硫酸鎂溶液處理20μg的總RNA并用DEPC水將所得混合物制成100μl的終體積。向該體系中加入1微升不含RNase的DNase(Boehringer Mannheim)并在37℃下將該混合物培養(yǎng)45分鐘。通過用苯酚/氯仿/異戊醇振搖提取而除去酶后，用乙醇沉淀RNA并將沉淀溶于100μl DEPC水。使用cDNA試劑盒(Gibco BRL)將來自該溶液中的2.5μg的RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。
使用來源于編碼黃烷酮3-羥化酶的cDNA克隆的氨基酸序列鑒定了初級序列中的保守區(qū)(Britsch等Eur.J.Biochem.217,745-754(1993))，而它們可用作設計簡并PCR寡核苷酸的基礎(chǔ)。使用肽序列SRWPDK(碧冬茄(Petunia hybrida)序列FL3HPETHY中的147-152位氨基酸)測定5’寡核苷酸且它具有下列序列5’-TCI(A/C)G(A/G)TGG CC(A/C/G)GA(C/T)AA(A/G)CC-3。
通過使用肽序列DHQAVV(碧冬茄序列FL3HPETHY中的276-281位氨基酸)推定的寡核苷酸序列如下5’-CTT CAC ACA(C/G/T)GC(C/T)TG(A/G)TG(A/G)TC-3 。
使用Perkin-Elmer的tTth聚合酶、按照制造商的說明進行PCR反應。所用的模板是1/8的cDNA(相當于0.3μg的RNA)。PCR程序如下
30個循環(huán)94℃4秒；40℃30秒；72℃2分鐘；72℃10分鐘。
按照制造商的說明將片段克隆入Promega’s載體pGEM-T中。
通過測序來檢驗該片段的正確性。使用存在于載體pGEM-T的多接頭中的限制切割位點NcoⅠ和PstⅠ分離PCR片段并使用T4-聚合酶使突出端鈍端化。將該片段克隆入SmaⅠ-(鈍端化)切割載體pBinAR(Hfgen和Willmitzer,PlantSci.66:221-230(1990))中(參見附圖2)。該載體含有CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子(Franck等，Cell 21:285-294(1980))和來自章魚氨酸合酶基因的終止信號(Gielen等，EMBO J 3:835-846(1984))。這種載體在植物中介導對抗菌素卡那霉素的耐受性。所得的DNA構(gòu)建體中含有有義和反義方向的PCR片段。將所述的反義構(gòu)建體用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。
附圖2片段A(529bp)含有CaMV 35S啟動子(花椰菜花葉病毒的6909-7437位核苷酸)。片段B含有反義方向的F3H基因片段。片段C(192bp)含有章魚氨酸合酶基因的終止信號。
使用5’RACE系統(tǒng)克隆來自番茄(Lycopersion esculentum Mill.cv.Moneymaker)的黃烷酮3-羥化酶的較長cDNA片段。
因用于反義構(gòu)建體的F3H PCR片段的尺寸較小，未能成功地產(chǎn)生具有降低的F3H的mRNA瞬變平衡量的植物。為了排除這一情況，應使用較長F3H片段生產(chǎn)第二種反義構(gòu)建體。
將5’RACE法(用于快速擴增cDNA末端的系統(tǒng))用于克隆較長的F3H片段。
通過將5’RACE系統(tǒng)(Life TechnologiesTM的2-0版)用于快速擴增cDNA末端的5’RACE法來延伸F3H PCR片段。
總RNA分離自番茄(Lycopersion esculentum Mill.cv.Moneymaker)的成熟番茄果實(參見上文)。
使用GSP-1(基因特異性引物)5’-TTCACCACTGCCTGGTGGTCC-3’、按照制造商的說明進行cDNA的第一鏈合成。在RNase消化后，使用Life TechnologiesTM的GlassMAx自旋系統(tǒng)、按照制造商的說明純化cDNA。
使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶將細胞因子均聚物加入到純化的單鏈F3H cDNA的3’末端上。
使用結(jié)合在GSP-1識別序列3’區(qū)上游的第二種基因特異性引物(GSP-2)擴增5’-延長的F3H cDNA且由此使“嵌套式”PCR得以進行。所用的5’引物是“5’RACE縮短的錨定引物”，它由制造商提供且與cDNA的均聚化dC尾互補。
將如此擴增稱作F3H延長的的cDNA按照制造商的說明克隆入Promega’s載體pGEM-T中。
通過測序證明所述cDNA的同一性。
使用存在于載體pGEM-T的多接頭中的限制切割位點NcoⅠ和PstⅠ分離F3H延長的的cDNA片段并使用T4-聚合酶使突出端鈍端化。將該片段克隆入SmaⅠ-(鈍端化)切割載體pBinAR(Hfgen和Willmitzer,1990)中(參見附圖3)。該載體含有CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子(Franck等，1980)和來自章魚氨酸合酶基因的終止信號(Gielen等，1984)。這種載體在植物中介導對抗菌素卡那霉素的耐受性。所得的DNA構(gòu)建體中含有有義和反義方向的PCR片段。將所述的反義構(gòu)建體用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。
附圖3片段A(529bp)含有CaMV 35S啟動子(花椰菜花葉病毒的6909-7437位核苷酸)。片段B含有反義方向的F3H基因片段。片段C(192bp)含有章魚氨酸合酶基因的終止信號。
實施例2表達反義方向黃烷酮3-羥化酶亞片段的轉(zhuǎn)基因番茄(Lycopersion esculentum Mill.cv.Moneymaker)的生產(chǎn)所用的方法是Ling等在Plant Cell Report 17,843-847(1998)中所述的方法。在約22℃下用16-小時光照/8-小時黑暗方式進行培養(yǎng)。
通過在4％濃度的次氯酸鈉溶液中培養(yǎng)10分鐘來對番茄種子(Lycopersicon esculentum Mill.cv.Moneymaker)進行滅菌，且隨后用無菌蒸餾水洗滌3-4次并置于用3％蔗糖、pH 6.1補充的MS培養(yǎng)基上用于發(fā)芽。在發(fā)芽時間達7-10天后，備好子葉用于轉(zhuǎn)化。
第1天用1.5ml約10日的煙草混懸液培養(yǎng)物覆蓋含有“MSBN”培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿。將平板用薄膜覆蓋并在室溫下培養(yǎng)至第2天為止。
第2天以不形成氣泡的方式將無菌濾紙置于用煙草混懸液培養(yǎng)物覆蓋的平板上。將切成十字形的子葉置于濾紙的上部朝下處。在培養(yǎng)室內(nèi)將培養(yǎng)皿培養(yǎng)3天。
第5天將農(nóng)桿菌培養(yǎng)物(LBA4404)通過以約3000g離心10分鐘來沉淀并重新懸浮于MS培養(yǎng)基中以使OD為0.3。將子葉部分放入這種混懸液并在室溫和緩慢振搖下培養(yǎng)30分鐘。然后，將子葉部分在無菌濾紙上進行一定的干燥并放回其原始平板以便在培養(yǎng)室內(nèi)持續(xù)培養(yǎng)3天。
第8天將共培養(yǎng)的子葉部分置于MSZ2K50+β上并在培養(yǎng)室內(nèi)再培養(yǎng)4周。然后將它們進行傳代培養(yǎng)。
將形成的苗轉(zhuǎn)入根誘導培養(yǎng)基中。
在成功地生根后，測試該植物并轉(zhuǎn)入溫室。
實施例3原代大鼠肝細胞培養(yǎng)物中膽固醇生物合成的抑制儲備溶液的制備將含有A)僅天然黃烷酮3-羥化酶基因(對照)和B)如實施例2中所述，另外含有反義方向的黃烷酮3-羥化酶亞片段的10-20mg成熟番茄cv.“Moneymaker”凍干物確切稱重，并用得到10mM總黃酮類化合物儲備溶液的量的DMSO處理。在本試驗開始前立即制備這些儲備溶液的培養(yǎng)基稀釋液。進行10-4-10-8M的10倍稀釋步驟。
肝細胞培養(yǎng)物的制備通過灌注膠原酶而從雄性Sprague-Dawley大鼠(240-290g)獲得原代肝細胞(Gebhardt等，Arzneimittel-Forschung/Drug Res.41:800-804(1991)1990)。以125,000細胞/cm2的細胞密度在膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿(6-孔平板，Greiner,Nürtingen)內(nèi)補充了10％小牛血清的Williams培養(yǎng)基E中培養(yǎng)肝細胞。Gebhardt等在CellBiol.Toxicol.6:369-372(1990)且Mewes等在Cancer Res.53:5135-5142(1993)中發(fā)現(xiàn)了特別是在培養(yǎng)基上的更具體的情況。2小時后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入不含血清的補充了0.1μM胰島素的培養(yǎng)基中。再進行20小時后，將它們用于本試驗。在每種情況中，在來自2-3只大鼠的三份獨立的培養(yǎng)物中檢測測試物質(zhì)。
用測試物質(zhì)A和B培養(yǎng)肝細胞培養(yǎng)物。
為了證明膽固醇的生物合成受到測試物質(zhì)A和B的影響，將肝細胞培養(yǎng)物總計保持22小時。然后，將它們與補充了14C乙酸鹽(僅微量)的不含血清的Williams培養(yǎng)基E以及在指定濃度下的測試物質(zhì)一起培養(yǎng)2小時。在每一系列試驗中均包括對照組。方法如Gebhardt(1991)和Gebhardt在Lipids 28；613-619(1993)中具體描述。微量14C乙酸鹽快速與胞內(nèi)乙酰輔酶A集合體互換且由此將14C乙酸鹽混入由＞90％膽固醇組成的可以按照可靠方式測定的固醇部分中(Gebhardt,1993)。
用于影響膽固醇生物合成的分析方法通過Gebhardt(1991)的方法測定混入固醇部分(非水解的脂類)中的14C乙酸鹽。在所用的應用Extrelut柱(Merck,Darmstadt)的提取方法中，除去95％以上的14C乙酸鹽(和由它形成的小量的其它低分子量代謝物)。本試驗要求在測試物質(zhì)作用下進行膽固醇與前體固醇類的相對合成率之間的比較(Gebhardt,1993)。
肝細胞培養(yǎng)物的視覺和微生物質(zhì)量檢測在培養(yǎng)試驗之前和之后，對所用的所有培養(yǎng)物在顯微鏡下以可見方式檢驗微生物的污染情況和細胞單層的完整性。在任意樣品中沒有觀察到細胞形態(tài)上的可識別的改變(特別是在高濃度下)。這基本上不包括由測試物質(zhì)的細胞毒性作用影響的試驗結(jié)果。
對所有培養(yǎng)物進行的常規(guī)無菌試驗顯示無論在何種情況下都沒有微生物污染的痕跡。
結(jié)果來自未經(jīng)遺傳修飾的(對照組)番茄的樣品A)無論在何種情況下都沒有顯示出對膽固醇生物合成的作用。相反，來自含有反義方向黃烷酮3-羥化酶亞片段的番茄的樣品B顯著抑制了膽固醇的生物合成。
權(quán)利要求
1．一種增加植物中黃酮類化合物和酚類成分的含量的方法，其中通過分子遺傳學方法來生產(chǎn)植物，其中降低了黃烷酮3-羥化酶的活性。
2．一種如權(quán)利要求1中所述用于增加植物中黃酮類化合物和酚類成分的含量的方法，其中通過分子生物學方法(例如反義構(gòu)建物、共抑制、表達特異性抗體或表達特異性抑制劑)在完整植物或植物部位中完全或部分、永久或短暫地降低了黃烷酮3-羥化酶的活性。
3．一種如權(quán)利要求1或2中所述的方法，其中所述的植物是葡萄樹、櫻桃、番茄、李子、黑刺李、烏飯樹、草莓、桔果(諸如柑橘、葡萄柚)、木瓜、紅球甘藍、嫩莖花椰菜、抱子甘藍、可可豆、羽衣甘藍、胡蘿卜、歐芹、芹菜、洋蔥、大蒜、茶、咖啡、啤酒花、大豆、油菜種子、燕麥、小麥、黑麥、黑果腺肋花楸、銀杏。
4．一種通過權(quán)利要求1-3中任意一項所述方法生產(chǎn)的具有高含量黃酮類化合物和酚類成分的植物，其中降低了黃烷酮3-羥化酶的酶活性。
5．通過權(quán)利要求1-3中任意一項所述方法生產(chǎn)的植物或這些植物部位用作食品、食品添加劑或用于生產(chǎn)人和動物的治療用組合物、保健用組合物或滋補用組合物(汁、茶、提取物、發(fā)酵產(chǎn)品)和生產(chǎn)化妝品的用途。
全文摘要
在用于增加植物中黃酮類化合物含量的方法中,通過分子遺傳學方法生產(chǎn)植物,其中降低了黃烷酮3－羥化酶的活性。
文檔編號A61P43/00GK1314943SQ00801147
公開日2001年9月26日 申請日期2000年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月17日
發(fā)明者W·拉德馬赫爾, K·克雷默, J·施維登, K·赫爾貝斯 申請人:Basf公司