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1,4-二羥基-2-萘甲酸的制造方法

文檔序號:1092729閱讀:262來源:國知局
專利名稱:1,4-二羥基-2-萘甲酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及使用丙酸菌發(fā)酵的1,4-二羥基-2-萘甲酸(以下也稱DHNA)的高濃度制造方法及其培養(yǎng)物的味道改善技術(shù)。
背景技術(shù)
已知DHNA以往作為染料、顏料和感光材料用作工業(yè)材料,至今通過有機(jī)化學(xué)合成法開發(fā)了各種合成法。本發(fā)明者對與它們不同的DHNA的制造方法進(jìn)行研究后,發(fā)現(xiàn)丙酸菌在菌體內(nèi)外大量產(chǎn)生DHNA,同時發(fā)現(xiàn)從該培養(yǎng)物采集的含DHNA的組合物、或者1,4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽具有改善乳糖不耐癥患者攝入牛奶時的腹部不適癥狀的作用,可以用于代謝性骨疾病的預(yù)防治療(專利文獻(xiàn)1)。采用該方法,可以將DHNA用于飲食品和醫(yī)藥品,但是含DHNA的組合物從味道的角度看未必令人滿意,難以用于眾多商品。
專利文獻(xiàn)1國際公開第WO 03/016544號小冊子發(fā)明的揭示發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的目的在于提供基于丙酸菌發(fā)酵的、味道得到改善的含DHNA的組合物的高效的制造方法。
解決課題的方法本發(fā)明者為了得到抑制了苦味的含DHNA的組合物從各方面進(jìn)行了認(rèn)真研究后,完全意外地獲得了有用的新發(fā)現(xiàn),即通過在丙酸菌發(fā)酵的一定的時期進(jìn)行培養(yǎng)基的空氣通氣,培養(yǎng)物中的DHNA濃度升高。此外,通過在培養(yǎng)后的培養(yǎng)物中添加丙酸菌的碳源,在弱堿性條件下進(jìn)行低溫保存,雖然培養(yǎng)結(jié)束了,但DHNA濃度升高。另外,還發(fā)現(xiàn)由此得到的含DHNA的組合物的苦味受到抑制,味道良好,可以用于飲食品和醫(yī)藥品。
即,本發(fā)明提供1,4-二羥基-2-萘甲酸的制造方法,其特征在于,對屬于丙酸菌的1,4-二羥基-2-萘甲酸生產(chǎn)菌在厭氧的條件下開始培養(yǎng),培養(yǎng)基中的碳源濃度達(dá)到3.5質(zhì)量%以下時,向培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行空氣通氣來培養(yǎng)。
此外,本發(fā)明提供1,4-二羥基-2-萘甲酸的制造方法,其特征在于,對屬于丙酸菌的1,4-二羥基-2-萘甲酸生產(chǎn)菌在厭氧的條件下進(jìn)行培養(yǎng),向得到的培養(yǎng)物中添加碳源,在弱堿性下于3~20℃進(jìn)行保存。
本發(fā)明提供1,4-二羥基-2-萘甲酸的制造方法,其特征在于,對屬于丙酸菌的1,4-二羥基-2-萘甲酸生產(chǎn)菌在厭氧的條件下開始培養(yǎng),培養(yǎng)基中的碳源濃度達(dá)到3.5質(zhì)量%以下時,向培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行空氣通氣來培養(yǎng),再向得到的培養(yǎng)物中添加碳源,在弱堿性下于3~20℃進(jìn)行保存。
此外,本發(fā)明提供含有通過上述制造方法得到的1,4-二羥基-2-萘甲酸的組合物。
此外,本發(fā)明提供作為有效成分含有通過上述制造方法得到的1,4-二羥基-2-萘甲酸的組合物的腹部不適癥狀改善用飲食品、腹部不適癥狀改善劑、代謝性骨疾病預(yù)防治療用飲食品或代謝性骨疾病預(yù)防治療劑。
此外,本發(fā)明提供含有通過上述制造方法得到的1,4-二羥基-2-萘甲酸的組合物在腹部不適癥狀改善用飲食品、腹部不適癥狀改善劑、代謝性骨疾病預(yù)防治療用飲食品或代謝性骨疾病預(yù)防治療劑的制造中的應(yīng)用。
另外,本發(fā)明提供腹部不適癥狀的處置方法或代謝性骨疾病的處置方法,其特征在于,給予有效量的含有通過上述制造方法得到的1,4-二羥基-2-萘甲酸的組合物。
發(fā)明的效果若采用本發(fā)明,則可以高效地生產(chǎn)DHNA,而且得到的含DHNA的組合物的味道良好,可以用于飲食品、醫(yī)藥品。
附圖的簡單說明[

圖1]表示改變切換到空氣通氣的時間的情況下的DHNA濃度的變化。
表示改變切換到空氣通氣的時間的情況下的乳糖濃度的變化。
表示切換到空氣通氣的時間和丙酸菌數(shù)量的變化。
表示改變切換到空氣通氣的時間的情況下的丙酸濃度的變化。
表示改變切換到空氣通氣的時間的情況下的醋酸濃度的變化。
表示改變空氣通氣的流量的情況下的DHNA濃度。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的制造方法中所使用的丙酸菌只要是DHNA產(chǎn)生菌,沒有特別限定,較好是屬于丙酸桿菌屬的菌,可以例舉例如費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、特氏丙酸桿菌(P.thoenii)、產(chǎn)丙酸丙酸桿菌(P.acidipropionici)、詹氏丙酸桿菌(P.jensenii)等干酪用菌,貪婪丙酸桿菌(P.avidum)、瘡皰丙酸桿菌(P.acnes)、嗜淋巴丙酸桿菌(P.lymphophilum)、顆粒丙酸桿菌(P.granulosam)等。其中,較好是費(fèi)氏丙酸桿菌,更好是P.freudenreichii IFO 12424和P.freudenreichii ATCC 6207、P.freudenreichii ET-3(FERM P-18454)。
本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基較好是含有碳源的培養(yǎng)基,本發(fā)明中的碳源是指丙酸菌可利用的碳源。可以例舉例如乳糖、葡萄糖、乳酸、甘油、麩質(zhì)、纖維素等,特別好是乳糖。培養(yǎng)開始前的培養(yǎng)基中的碳源含量較好是4~8質(zhì)量%,更好是4~7質(zhì)量%,特別好是4~6.7質(zhì)量%。其中,作為碳源含有乳糖的培養(yǎng)基可以例舉乳清粉、酪蛋白、脫脂奶粉、或者將乳清進(jìn)行透析處理而使乳糖含量減少的乳清蛋白濃縮物、或者更高純度地分離乳糖的乳清蛋白分離物。它們可以直接使用,或者進(jìn)行蛋白酶處理后使用,可以通過添加以下成分來制備培養(yǎng)基酵母提取物、胰蛋白胨等蛋白胨,葡萄糖、乳糖、乳糖的乳糖酶處理物等可以作為丙酸菌利用的碳源的單糖類和/或雙糖類等適量的糖類,乳酸、甘油、麩質(zhì)、纖維素、乳清礦物等礦物成分,以及根據(jù)需要添加的牡蠣、生姜等含有大量礦物成分的動植物性食品或其提取物。以下,例舉培養(yǎng)基原料中以脫脂奶粉的蛋白酶處理物為主要成分的培養(yǎng)基制備方法的一個例子。
將脫脂奶粉用水溶解,使其濃度達(dá)到10~20質(zhì)量%,將溫度調(diào)整至47℃。向其中以脫脂奶粉量的2.5質(zhì)量%添加蛋白酶,分解脫脂奶粉溶液中的蛋白質(zhì)。蛋白酶可以例舉動植物來源或細(xì)菌來源的蛋白質(zhì)分解酶,酸性、中性、堿性都可以使用。分解進(jìn)行6小時,分解中的溫度調(diào)整至47℃,pH調(diào)整至6.8。pH的調(diào)整可以使用碳酸鉀水溶液。利用蛋白酶的分解結(jié)束后,通過將脫脂奶粉溶液加溫至80℃,保持10分鐘,使蛋白酶失活。失活后,用水使脫脂奶粉的質(zhì)量濃度達(dá)到10%并混勻,添加脫脂奶粉的1~10質(zhì)量%、較好是3~7質(zhì)量%的啤酒酵母提取物后,進(jìn)行滅菌。滅菌條件在使用高壓滅菌鍋的情況下設(shè)為121℃下、7分鐘以上,使用滅菌加熱板的情況下設(shè)為140℃以上、4秒以上。這樣得到的培養(yǎng)基中通常含有4~5質(zhì)量%的乳糖。
培養(yǎng)在厭氧條件下進(jìn)行。厭氧條件可以是例如氮?dú)狻⒑?、氬氣、氫氣等惰性氣體中的一種或兩種以上的組合,其中較好是氮?dú)饣蚨趸細(xì)夥障碌臈l件。更具體來說,在發(fā)酵罐中使氮?dú)?、二氧化碳等在上方通氣,進(jìn)行攪拌,將培養(yǎng)基溫度調(diào)整為33℃。培養(yǎng)基溫度穩(wěn)定在33℃后,接種丙酸菌起子,在厭氧條件下開始培養(yǎng)。起子可以使用丙酸菌的活化培養(yǎng)液或培養(yǎng)液的菌體濃縮物等。向培養(yǎng)基的添加量的標(biāo)準(zhǔn)在前者的情況下為相對于培養(yǎng)基0.05%、在后者的情況下為0.3%左右,這些量可以根據(jù)需要適當(dāng)?shù)馗淖儭?br> 在培養(yǎng)溫度為20~40℃、培養(yǎng)基的pH為中性~微酸性(較好是pH5.5~7.5)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。為了抑制培養(yǎng)中的酸度上升,可以使用碳酸鉀水溶液、碳酸鈉水溶液等已知作為中和劑的公知的試劑。
接著,對向培養(yǎng)基空氣通氣的方法進(jìn)行說明。通過該方法DHNA生產(chǎn)量的增大是令人吃驚的。對于通過連續(xù)地進(jìn)行空氣通氣使DHNA的生產(chǎn)量增大的原因并不清楚,但由于該空氣通氣,丙酸菌開始消耗丙酸。
開始空氣通氣的時間為培養(yǎng)基中的碳源濃度達(dá)到3.5質(zhì)量%以下時,標(biāo)準(zhǔn)之一是丙酸菌的碳源枯竭的24小時前??諝馔忾_始的時間更好是碳源濃度達(dá)到1.0~3.5質(zhì)量%時,特別好是達(dá)到1.5~3.0質(zhì)量%時。通過在碳源濃度達(dá)到3.5質(zhì)量%以下時進(jìn)行空氣通氣,丙酸菌除了碳源之外開始消耗丙酸,最終碳源基本枯竭??諝馔忾_始時的培養(yǎng)基中的丙酸菌數(shù)量較好是在1.0×1010cfu/mL(10.0log cfu/mL)以上,更好是1.4×1010cfu/mL(10.1log cfu/mL)以上。由此,可以使培養(yǎng)基中的碳源基本枯竭。在前述的含乳糖的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)開始后約48小時后,乳糖濃度達(dá)到3.5質(zhì)量%以下,成為空氣通氣開始的時間。已知在中途添加乳糖、葡萄糖之類成為丙酸菌的碳源的糖類的培養(yǎng)方法(例如專利文獻(xiàn)1,日本專利特開平10-304871號公報),但本發(fā)明中最好是不在中途添加這些糖類而使碳源枯竭。
通過空氣通氣的空氣的供給量較好是對于丙酸菌產(chǎn)生刺激的程度的量。若作為與該條件相當(dāng)?shù)囊粋€例子例舉實(shí)驗(yàn)室規(guī)模(1.5L容量)下的具體例子,則在使用分布器以攪拌機(jī)葉輪150rpm的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的情況下,空氣的供給量為2L以上/分,更好是2L/分~4L/分,可以根據(jù)容量、攪拌速度、裝置等進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。液中的溶解氧量超過所需時,丙酸菌的繁殖停止,DHNA的產(chǎn)生也停止。在前述的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的情況下,通常在自培養(yǎng)開始約168小時終止培養(yǎng)。
空氣通氣的方法可以例舉在培養(yǎng)基中插入多孔性的通氣管由整個管輸送空氣的方法,和用分布器輸送氣泡的方法。
由此,積聚在培養(yǎng)基和菌體中的DHNA在停止培養(yǎng)后馬上可以由該培養(yǎng)物供于DHNA的采集。此外,培養(yǎng)的終點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)為菌數(shù)達(dá)到穩(wěn)定期,自培養(yǎng)基中的碳源枯竭后3~5天。
接著,對在培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)物中添加丙酸菌的碳源、在弱堿性下于3~20℃保存來制造DHNA的方法進(jìn)行說明。在這里,培養(yǎng)物可以是前述的空氣通氣后的培養(yǎng)物,也可以是沒有經(jīng)過空氣通氣的厭氧或微好氧條件下的培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)物。
設(shè)定向培養(yǎng)物添加的碳源量,使培養(yǎng)物中的碳源濃度較好是達(dá)到0.2~3.0質(zhì)量%、更好是0.4~2.5質(zhì)量%、特別好是0.8~2.2質(zhì)量%。此外,為了使其達(dá)到弱堿性,較好是添加碳酸鉀、碳酸鈉、磷酸鈉等堿,使培養(yǎng)物的pH達(dá)到7~9,特別好是7.5~8.5。此外,保存溫度較好是3~20℃,特別好是3~15℃,更好是5~15℃。保存時間較好是1~3周,特別好是1~2周。
通過這樣的弱堿性下的低溫保存,培養(yǎng)物中的DHNA含量上升。因此,不需要新的設(shè)備、節(jié)省空間、而且保存中可以增大DHNA量的本方法可以說是非常有用且高效的制造方法。
接著,對DHNA的采集方法進(jìn)行說明。較好是對得到的培養(yǎng)物使用吸附色譜法。吸附劑可以在較廣的范圍內(nèi)使用活性炭或合成吸附劑(例如ダイアイオンHP-20,三菱化學(xué)株式會社制)等反相類的吸附劑。首先,將吸附劑填充到柱中,用0.5%(w/v)抗壞血酸鈉水溶液洗滌。接著,將得到的培養(yǎng)物添加到柱中(棄取通過液),再用0.5%(w/v)抗壞血酸鈉水溶液除去水溶性部分。然后,用添加了0.5%(w/v)抗壞血酸鈉的乙醇洗脫,通過濃縮該乙醇洗脫部分,可以得到含有高濃度DHNA的組合物。再進(jìn)行純化,可以得到純凈的DHNA或它的鹽。從柱中出來的DHNA的洗脫液可以使用甲醇等其它醇代替乙醇。此外,作為替代它的方法,也可以從離心分離培養(yǎng)物回收的上清液,使用液相色譜法分離DHNA。使用異抗壞血酸鈉代替抗壞血酸鈉也是可以的,它們被用作DHNA的穩(wěn)定劑,本發(fā)明中,除了抗壞血酸、異抗壞血酸這些游離的酸之外,還可以同樣地使用脂肪酸酯及其它各種酯類、堿金屬鹽、其它鹽類。
DHNA的鹽可以例舉藥學(xué)上或食品學(xué)上允許的鹽,代表性的鹽可以例舉鈉、鉀、鋰等的一價金屬鹽,鎂、鈣、鋅等的多價金屬鹽,氨、乙醇胺等的無機(jī)或有機(jī)胺鹽等。此外,也可以通過使用本身公知的反應(yīng)進(jìn)行鹽置換。該鹽可以使用與無機(jī)酸(例如鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)的鹽、或與有機(jī)酸(例如甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、安息香酸、甲磺酸、苯磺酸)的鹽等,但這些是示例,本發(fā)明并不局限于這些鹽。
由于DHNA包含在DHNA產(chǎn)生菌的培養(yǎng)物中(菌體內(nèi)和/或外),所以可以不使用吸附色譜法,而對培養(yǎng)物本身通過使用旋轉(zhuǎn)式汽化機(jī)等進(jìn)行濃縮,從而得到含有高濃度DHNA的組合物。此外,可以濃縮通過通常的離心分離法從培養(yǎng)物分離菌體而得到上清。這樣得到的組合物根據(jù)使用的方式可以直接使用,也可以加工成粉末狀。
這樣得到的含DHNA的組合物的DHNA濃度高,苦味受到抑制,味道良好。因此,本發(fā)明的含DHNA的組合物或者DHNA或其鹽以飲食用或醫(yī)藥品的方式都可以使用,例如通過作為醫(yī)藥品直接給藥,或者通過作為特定保健用食品等特別用途食品、營養(yǎng)功能食品直接攝入,再或者通過預(yù)先添加在各種食品(牛奶、清涼飲料、發(fā)酵乳、酸奶、干酪、面包、餅干、脆點(diǎn)心、匹薩餅等)中并攝入,可以改善腸道菌群,緩解攝入牛奶時出現(xiàn)的腹部不適癥狀,預(yù)防治療代謝性骨疾病。
為了制造前述食品,作為主要成分可以組合水和蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)類、有機(jī)酸、果汁、調(diào)味品類等??梢岳e全脂奶粉、脫脂奶粉、部分脫脂奶粉、酪蛋白、乳清粉、乳清蛋白、乳清蛋白濃縮物、乳清蛋白分離物、α-酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳吩嚀、大豆蛋白、雞蛋蛋白、肉蛋白等動植物性蛋白質(zhì),它們的水解產(chǎn)物,黃油,乳清礦物,奶油,乳清,非蛋白質(zhì)狀態(tài)的氮,唾液酸,磷脂、乳糖等各種乳來源成分;蔗糖、葡萄糖、果糖、糖醇類、麥芽糖、寡糖類、化工淀粉(除糊精之外,可溶性淀粉、英國淀粉、氧化淀粉、淀粉酯、淀粉醚等)、食物纖維等碳水化合物;豬油、魚油等動物性油脂;棕櫚油、紅花油、玉米油、菜油、椰子油等植物性油脂,它們的分選油、加水油、酯交換油等植物性油脂;維生素A、維生素B族、維生素C、異抗壞血酸、維生素D族、維生素E、維生素K族、維生素P、維生素Q、維生素PP、煙酸、泛酸、生物素、肌醇、膽堿、葉酸等各種維生素;鈣、鉀、鎂、鈉、氯、銅、鐵、錳、鋅、硒、氟、硅、碘等礦物質(zhì);蘋果酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸等有機(jī)酸或有機(jī)酸鹽等??梢詮乃鼈冎羞m當(dāng)選擇一種或兩種以上進(jìn)行添加。上述各種成分除了合成品,根據(jù)需要添加大量含有它們的食品也是理想的。此外,其形態(tài)并不局限于前述食品,只要到最終制品都維持活性,沒有特別限定,可以是液狀、固體狀(包括顆粒、粉末、片狀、凝膠狀)、半固體狀(包括凍膠狀)、糊狀、乳化狀等任意形態(tài)。
將本發(fā)明所述組合物、或者DHNA或其鹽作為醫(yī)藥品使用的情況下,可以以各種形態(tài)給藥。其形態(tài)可以是通過例如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑等口服給藥。上述各種制劑可以按照常規(guī)方法在主劑中使用賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、矯味劑、除臭劑、溶解助劑、懸濁劑、包覆劑等醫(yī)藥制劑技術(shù)領(lǐng)域中通??墒褂玫囊阎闹鷦﹣磉M(jìn)行制劑化。
實(shí)施例以下,例舉試驗(yàn)例、實(shí)施例,對本發(fā)明進(jìn)行說明,但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。以下的試驗(yàn)例和實(shí)施例中,DHNA的定量按照WO 03/016544第9頁所記載的方法進(jìn)行。乳糖濃度的測定通過使用乳糖電極的流式注射(flowinjection)分析法(使用王子計(jì)測機(jī)器株式會社制,流式注射分析裝置,BioFlow Analyzer(商品名))進(jìn)行。丙酸菌數(shù)量的測定用BL瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行。丙酸、醋酸濃度用HPLC法(柱RS pak KC-811+前柱KC-G,檢測445nm)進(jìn)行測定。
空氣通氣切換時間的討論(1)培養(yǎng)基的制備將150g脫脂奶粉(明治乳業(yè)株式會社制)溶解于1000g水中,將溫度調(diào)整至47℃。向其中添加3.75g蛋白酶,在47℃下進(jìn)行6小時蛋白質(zhì)的分解。蛋白質(zhì)分解中的pH用碳酸鉀溶液調(diào)整至6.6~6.8。蛋白質(zhì)分解后,通過加溫至80℃,保持10分鐘,使蛋白酶失活,添加7.5g啤酒酵母提取物,用碳酸鉀溶液將pH調(diào)整至6.95。用水將溶液的容量調(diào)整至1500mL,放入2L容量的發(fā)酵罐中,進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌。滅菌條件為121℃、7分鐘。
(2)培養(yǎng)條件在發(fā)酵罐中用氮?dú)馔猓古囵B(yǎng)基溫度穩(wěn)定在33℃,添加0.75mL凍結(jié)濃縮起子(P.freudenreichii ET-3),開始培養(yǎng)。發(fā)酵中的溫度調(diào)整至33℃,pH調(diào)整至6.5,用氮?dú)馔狻H的調(diào)整使用40%(wt/wt)的碳酸鉀水溶液。培養(yǎng)方法實(shí)施以下的5種。
1)自培養(yǎng)開始到結(jié)束持續(xù)氮?dú)馔猓?)除了自培養(yǎng)開始72小時后、96小時后添加培養(yǎng)液的2%重量的乳糖之外,與1)同樣;
3)自培養(yǎng)開始24小時后,從氮?dú)馔馇袚Q到空氣通氣(2L/分);4)自培養(yǎng)開始48小時后,切換到空氣通氣(2L/分);5)自培養(yǎng)開始72小時后,切換到空氣通氣(2L/分);它們?nèi)荚谂囵B(yǎng)開始168小時后結(jié)束培養(yǎng)。
(3)結(jié)果DHNA濃度、乳糖濃度、丙酸菌數(shù)量、丙酸濃度、醋酸濃度的經(jīng)時變化分別如圖1、圖2、圖3、圖4、圖5所示。由該結(jié)果可知,通過4)、5)得到的培養(yǎng)物中,DHNA的濃度達(dá)到約45μg/mL(圖1)。此外,還發(fā)現(xiàn)4)、5)中,96小時后乳糖基本枯竭(圖2),自培養(yǎng)開始持續(xù)增加的丙酸濃度緩慢減少(圖4)。丙酸菌數(shù)量,除了3),培養(yǎng)結(jié)束時都超過了1.0×1010cfu/mL(10.0log cuf/mL),4)、5)達(dá)到了約1.0×1011cfu/mL(11.0 log cuf/mL)(圖3)。
由上可知,通過自培養(yǎng)開始至少48小時后從氮?dú)馔馇袚Q到空氣通氣,可以得到含有高濃度DHNA的培養(yǎng)物(圖6)。此外,切換時的乳糖濃度,4)為3.3質(zhì)量%,5)為2.9質(zhì)量%(圖2)。
空氣通氣量的討論除了改變空氣通氣量之外,以與試驗(yàn)例1的5)同樣的條件進(jìn)行培養(yǎng)。自發(fā)酵開始72小時后,將空氣通氣的流量改變?yōu)?.5L/分、1.0L/分、2.0L/分、4.0L/分,進(jìn)行培養(yǎng)。其結(jié)果,通過將流量定為2.0L/分以上,自培養(yǎng)開始144小時后,DHNA濃度達(dá)到約40μg/mL。
將180g脫脂奶粉(明治乳業(yè)株式會社制)溶解于1000g水中,將溫度調(diào)整至47℃。向其中添加3.75g蛋白酶,在47℃下進(jìn)行3小時蛋白質(zhì)的分解。蛋白質(zhì)分解中的pH用碳酸鉀溶液調(diào)整至6.6~6.8。蛋白質(zhì)分解后,通過加溫至80℃,保持10分鐘,使蛋白酶失活,添加7.5g啤酒酵母提取物、15g乳糖,用碳酸鉀溶液將pH調(diào)整至6.95。用水將溶液的容量調(diào)整至1500mL,放入2L容量的發(fā)酵罐中,進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌(乳糖濃度約6.1質(zhì)量%)。滅菌條件設(shè)為121℃、7分鐘。滅菌后,在發(fā)酵罐中用氮?dú)馔猓古囵B(yǎng)基溫度穩(wěn)定在33℃,添加0.75mL凍結(jié)濃縮起子(P.freudenreichii ET-3),開始培養(yǎng)。發(fā)酵中的溫度調(diào)整至33℃,pH調(diào)整至6.5,用氮?dú)馔狻H的調(diào)整使用40%(wt/wt)的碳酸鉀水溶液。自培養(yǎng)開始72小時后,從氮?dú)獾耐馇袚Q到空氣通氣,自培養(yǎng)開始168小時后結(jié)束培養(yǎng)??諝馔鈺r的空氣流量設(shè)為2L/分,攪拌速度設(shè)為150rpm。其結(jié)果,得到了DHNA的濃度達(dá)到52μg/mL的培養(yǎng)物。72小時后的乳糖濃度為約1.9質(zhì)量%,丙酸菌數(shù)量為3.5×1010cfu/mL。
將120kg脫脂奶粉(明治乳業(yè)株式會社制)溶解于750kg水中,將溫度調(diào)整至47℃。向其中添加2.5kg蛋白酶,將pH調(diào)整至7.6,在47℃下進(jìn)行3小時蛋白質(zhì)的分解。分解結(jié)束后,通過加溫至80℃,保持10分鐘,使蛋白酶失活,添加5kg啤酒酵母提取物、10kg乳糖,以140℃、4秒進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌。滅菌開始前的培養(yǎng)基pH為6.9。滅菌后,用水將培養(yǎng)基量調(diào)整至1000L(乳糖濃度約6.1質(zhì)量%),在發(fā)酵罐中用氮?dú)庖?0L/分通氣,使培養(yǎng)基溫度穩(wěn)定在33℃,添加3.0L起子(P.freudenreichii ET-3)。發(fā)酵中的溫度調(diào)整至33℃,pH調(diào)整至6.5,用氮?dú)馔?。pH的調(diào)整使用23%(wt/wt)的碳酸鉀水溶液。自培養(yǎng)開始72小時后,從氮?dú)獾耐馇袚Q到空氣通氣,自培養(yǎng)開始168小時后結(jié)束培養(yǎng)??諝馔鈺r的空氣流量設(shè)為200L/分,攪拌速度設(shè)為52rpm。其結(jié)果,得到了DHNA的濃度達(dá)到42μg/mL的培養(yǎng)物。培養(yǎng)開始72小時后的乳糖濃度為約1.5質(zhì)量%,丙酸菌數(shù)量為3.0×1010cfu/mL。
向前述實(shí)施例2得到的含DHNA的培養(yǎng)物中添加1.0%抗壞血酸鈉、2.0%乳糖,將pH調(diào)整至8.0后,在10℃下保存2周,結(jié)果DHNA濃度達(dá)到了55μg/mL。
此外,將乳糖換成葡萄糖,同樣地進(jìn)行保存后,DHNA濃度比培養(yǎng)結(jié)束時有所增加。
除了培養(yǎng)中,不切換到空氣通氣,持續(xù)氮?dú)馔庵?,以與實(shí)施例1全部相同的條件進(jìn)行操作。其結(jié)果,得到了DHNA的濃度為32μg/mL的培養(yǎng)物。
將前述實(shí)施例1得到的含DHNA的培養(yǎng)物加入到120g的純酸乳酪(明治乳業(yè)株式會社制)中,制備的酸奶的感官評價如表1和表2所示。加入了通過本發(fā)明方法得到的含DHNA的培養(yǎng)物的酸奶的DHNA濃度高,與以往的方法(純酸乳酪中加入比較例得到的含DHNA的培養(yǎng)物的酸奶),沒有酸味,苦味也感覺不到。


×不好 △稍差 ○普通 ◎優(yōu)良 -沒感覺在純酸乳酪中添加1g純酸乳酪120g[表2]

×不好 △稍差 ○普通 ◎優(yōu)良 -沒感覺在純酸乳酪中添加2g純酸乳酪120g[實(shí)施例5]將120kg脫脂奶粉(明治乳業(yè)株式會社制)溶解于750kg水中,將溫度調(diào)整至47℃。向其中添加2.5kg蛋白酶,將pH調(diào)整至7.6,在47℃下進(jìn)行6小時蛋白質(zhì)的分解。分解結(jié)束后,通過加溫至80℃,保持10分鐘,使蛋白酶失活,添加5kg啤酒酵母提取物、10kg乳糖,以140℃、4秒進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌。滅菌開始前的培養(yǎng)基pH為6.9。滅菌后,用水將培養(yǎng)基量調(diào)整至1000L(乳糖濃度約6.1質(zhì)量%),在發(fā)酵罐中用氮?dú)庖?0L/分通氣,使培養(yǎng)基溫度穩(wěn)定在33℃,添加3.0L起子(P.freudenreichii ET-3)。培養(yǎng)中的溫度調(diào)整至33℃,pH調(diào)整至6.5,用氮?dú)馔?。pH的調(diào)整使用23%(wt/wt)的碳酸鉀水溶液。自培養(yǎng)開始72小時后,從氮?dú)獾耐馇袚Q到空氣通氣,自培養(yǎng)開始168小時后結(jié)束培養(yǎng)。空氣通氣時的空氣流量設(shè)為200L/分,攪拌速度設(shè)為52rpm。其結(jié)果,得到了DHNA的濃度達(dá)到48μg/mL的培養(yǎng)物。培養(yǎng)開始72小時后的乳糖濃度為約3.0質(zhì)量%,丙酸菌數(shù)量為2.9×1010cfu/mL。
向前述實(shí)施例5得到的含DHNA的培養(yǎng)物中添加1.0%抗壞血酸鈉、1.0%乳糖,將pH調(diào)整至8.0后,在10℃下保存2周,結(jié)果DHNA濃度達(dá)到了60μg/mL。
權(quán)利要求
1.1,4-二羥基-2-萘甲酸的制造方法,其特征在于,對屬于丙酸菌的1,4-二羥基-2-萘甲酸生產(chǎn)菌在厭氧的條件下開始培養(yǎng),在培養(yǎng)基中的碳源濃度達(dá)到3.5質(zhì)量%以下時,向培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行空氣通氣來培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的制造方法,其特征還在于,培養(yǎng)基是含有4~8質(zhì)量%碳源的培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的制造方法,其特征還在于,厭氧條件為氮?dú)饣蚨趸細(xì)夥障碌臈l件。
4.1,4-二羥基-2-萘甲酸的制造方法,其特征在于,對屬于丙酸菌的1,4-二羥基-2-萘甲酸生產(chǎn)菌在厭氧的條件下進(jìn)行培養(yǎng),向得到的培養(yǎng)物中添加碳源,在弱堿性下于3~20℃進(jìn)行保存。
5.如權(quán)利要求4所述的制造方法,其特征還在于,培養(yǎng)物中的碳源添加量為使培養(yǎng)物中的碳源濃度達(dá)到0.2~3質(zhì)量%的量。
6.如權(quán)利要求4或5所述的制造方法,其特征還在于,保存為將培養(yǎng)物的pH設(shè)為7~9,在3~20℃下保存1周~3周。
7.1,4-二羥基-2-萘甲酸的制造方法,其特征在于,對屬于丙酸菌的1,4-二羥基-2-萘甲酸生產(chǎn)菌在厭氧的條件下開始培養(yǎng),在培養(yǎng)基中的碳源濃度達(dá)到3.5質(zhì)量%以下時,向培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行空氣通氣來培養(yǎng),再向得到的培養(yǎng)物中添加碳源,在弱堿性下于3~20℃進(jìn)行保存。
8.如權(quán)利要求7所述的制造方法,其特征還在于,培養(yǎng)基是含有4~8質(zhì)量%碳源的培養(yǎng)基。
9.如權(quán)利要求7或8所述的制造方法,其特征還在于,厭氧條件為氮?dú)饣蚨趸細(xì)夥障碌臈l件。
10.如權(quán)利要求7~9中的任一項(xiàng)所述的制造方法,其特征還在于,培養(yǎng)物中的碳源添加量為使培養(yǎng)物中的碳源濃度達(dá)到0.2~3質(zhì)量%的量。
11.如權(quán)利要求7~9中的任一項(xiàng)所述的制造方法,其特征還在于,保存為將培養(yǎng)物的pH設(shè)為7~9,在3~20℃下保存1周~3周。
12.含1,4-二羥基-2-萘甲酸的組合物,其特征在于,所述1,4-二羥基-2-萘甲酸通過權(quán)利要求1~11中的任一項(xiàng)所述的制造方法得到。
13.腹部不適癥狀改善用飲食品,其特征在于,作為有效成分含有權(quán)利要求12所述的組合物。
14.腹部不適癥狀改善劑,其特征在于,作為有效成分含有權(quán)利要求12所述的組合物。
15.代謝性骨疾病的預(yù)防治療用飲食品,其特征在于,作為有效成分含有權(quán)利要求12所述的組合物。
16.代謝性骨疾病預(yù)防治療劑,其特征在于,作為有效成分含有權(quán)利要求12所述的組合物。
17.權(quán)利要求12所述的組合物在腹部不適癥狀改善用飲食品的制造中的應(yīng)用。
18.權(quán)利要求12所述的組合物在腹部不適癥狀改善劑的制造中的應(yīng)用。
19.權(quán)利要求12所述的組合物在代謝性骨疾病的預(yù)防治療用飲食品的制造中的應(yīng)用。
20.權(quán)利要求12所述的組合物在代謝性骨疾病預(yù)防治療劑的制造中的應(yīng)用。
21.腹部不適癥狀的處置方法,其特征在于,給予有效量的權(quán)利要求12所述的組合物。
22.代謝性骨疾病的處置方法,其特征在于,給予有效量的權(quán)利要求12所述的組合物。
全文摘要
1,4-二羥基-2-萘甲酸的制造方法,其特征在于,對屬于丙酸菌的1,4-二羥基-2-萘甲酸生產(chǎn)菌在厭氧條件下開始培養(yǎng),在培養(yǎng)基中的碳源濃度達(dá)到3.5質(zhì)量%以下時,向培養(yǎng)基中進(jìn)行空氣通氣來培養(yǎng)。
文檔編號A61P19/00GK1860236SQ20048002845
公開日2006年11月8日 申請日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月1日
發(fā)明者吉市圭介, 依田伸生 申請人:明治乳業(yè)株式會社
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