專利名稱：益生菌的貯存和遞送的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及益生物質(zhì)的貯存和將其遞送至胃腸系統(tǒng)的選定部位。
背景技術(shù)：
益生菌是有科學(xué)記錄表明具有對人類健康有益效果的活微生物食品成分。益生菌也用于動物飼料，以改進(jìn)動物的健康或繁殖力。它們用于寵物食品，主要用于減少不愉快的臭味和提高糞便稠度。
全世界最主要的商業(yè)性益生菌菌株屬于雙歧桿菌和乳桿菌。然而，有些地區(qū)使用來自其它屬的細(xì)菌。例如，中國使用許多其它屬的細(xì)菌，包括芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬。屎腸球菌(Enterococcusfaecium)也在全球使用，但是這個屬牽涉抗生素抗性的轉(zhuǎn)移。在西方世界，雙歧桿菌和乳桿菌二者作為安全且可接受的屬用作益生菌具有很好的跟蹤記錄。其它實(shí)例見Mogensen，G.、Salminen，S.、O＇Brien，J.、Ouwehand，A.、Holzapfe1，W.、Shortt，C.、Fonden，R.、Miller，G.D.、Donohue，D.、Playne，M.、Crittenden，R.、Bianchi-Salvadori，B.、和Zink，R.，2002，“食品微生物-健康受益、安全性評估、和具有用于食品的歷史記錄的菌株”(Foodmicroorganisms health benefits，safety evaluation andstrains with documented history of use in foods)，Internat.Dairy Federation Bulletin No377，4-9；以及Mogensen，G.、Salminen，S.、O＇Brien，J.、Ouwehand，A.、Holzapfel，W.、Shortt，C.、Fonden，R.、Miller，G.D.、Donohue，D.、Playne，M.、Crittenden，R.、Bianchi-Salvadori，B.、和Zink，R.，2002，“具有用于食品的歷史記錄的微生物的調(diào)查表”(Inventory of microorganisms with adocumented history of use in food)，Internat.Dairy FederationBulletin No377，10-19。
研究人員和醫(yī)學(xué)調(diào)查人員廣泛認(rèn)識到，大多數(shù)健康效果是由一種特定菌株賦予的，而且大部分不是泛泛的該物種。盡管許多研究小組根據(jù)有用的益生特性來選擇細(xì)菌用于制造、用于摻入食品、用于在腸道中存活、和用于健康性質(zhì)，然而在出版的嚴(yán)格審查的期刊中缺乏關(guān)于在人體中的性能的資料。
越來越多的證據(jù)表明益生菌食品應(yīng)當(dāng)包含乳桿菌和雙歧桿菌二者的選定菌株。有這樣的概念益生乳桿菌對年輕人是有益的(嬰兒的腸道微生物群落天生富含雙歧桿菌)，而添加益生雙歧桿菌對老年人更為重要。如果不使用益生菌，那么固有的雙歧桿菌的數(shù)目將隨著衰老而減少。雙歧桿菌能夠提供針對病原體的一些保護(hù)，而這不是乳桿菌單獨(dú)能夠有效做到的。
如果希望在健康意義上是有效的，那么腸道的合適區(qū)段中需要有適當(dāng)數(shù)目的存活益生細(xì)菌菌株。大多數(shù)權(quán)威人士認(rèn)為每克食物1千萬個細(xì)菌是合適的飲食劑量。從技術(shù)上講，這相當(dāng)容易實(shí)現(xiàn)。然而，尚未獲得任何益生菌菌株針對任何健康狀況的劑量應(yīng)答曲線。
在制造、冷凍干燥過程中以及在保存期中會發(fā)生細(xì)菌數(shù)目減少。而且，在經(jīng)過胃腸道的通行過程中將發(fā)生進(jìn)一步減少。益生菌培養(yǎng)物將在胃中遭遇pH范圍1.2(空胃)至5.0的胃液。培養(yǎng)物將在胃中停留約40分鐘至長達(dá)5小時。它們還將在胃和小腸中遭遇膽汁鹽、脂酶、水解酶、和蛋白酶，這些酶也能殺死細(xì)菌。直至益生細(xì)菌到達(dá)胃腸中pH較高區(qū)域，它們才能生長或存活。這些區(qū)域是回腸和大腸。在此通行過程中，細(xì)菌還必需與固有的細(xì)菌競爭空間和養(yǎng)分。它們還必需避免被正常的蠕動作用排出消化道，而且它們必需避免被其它生物產(chǎn)生的抗菌劑殺死。對于細(xì)菌而言，它們最有利的生長條件在大腸的前三分之一(大腸近端)。
由此，粘附到大腸的表面諸如腸粘膜層和上皮細(xì)胞壁上的能力成為益生菌的重要特征。使用術(shù)語“集群”，指細(xì)菌具有使之能夠在動態(tài)(on-going)基礎(chǔ)上在胃腸的區(qū)域存活的機(jī)制。通常認(rèn)為胃腸微生物群落在成年人中較為穩(wěn)定，而且不易通過腸生態(tài)系統(tǒng)的條件變化而改變。施用抗生素是例外，但是盡管那樣，腸微生物群落通常在一段時間后重建，而且具有相似的物種組成。
益生細(xì)菌的作用機(jī)制包括·競爭性排除(在腸粘膜表面占有小生境以預(yù)防傳染性物種的集群)；·產(chǎn)生酸性環(huán)境(細(xì)菌的乳酸發(fā)酵導(dǎo)致腸pH降低)；·影響由免疫介導(dǎo)的應(yīng)答；·減少腐敗性和基因毒性腸反應(yīng)(導(dǎo)致前致癌物水平降低)；·釋放抗菌劑，諸如桿菌素。
許多腹瀉性疾病源自小腸機(jī)能失調(diào)，然而在該區(qū)域通常沒有發(fā)現(xiàn)大量的益生細(xì)菌，有一些乳桿菌是例外。幾乎沒有由健康人得到關(guān)于小腸區(qū)域微生物組成的直接證據(jù)。然而，已經(jīng)相當(dāng)充分的證實(shí)了益生細(xì)菌在減少腹瀉性疾病中的功效。它們或是在經(jīng)過小腸時發(fā)揮功能，或是通過免疫效果發(fā)生作用。大多數(shù)免疫反應(yīng)發(fā)生在小腸而非大腸的粘膜壁中，由此，如果認(rèn)為作用機(jī)制是免疫調(diào)控，那么小腸中必需存在益生菌。腹瀉性失調(diào)的其它區(qū)域是大腸。益生菌可以相當(dāng)容易的在該區(qū)域中存活。
除了腹瀉性紊亂以外，益生菌細(xì)菌在減輕乳糖不耐受中也是有效的，只要選擇的細(xì)菌具有較高的β-半乳糖苷酶功能。乳糖不耐受作用出現(xiàn)在腸中。對益生菌做出了很多其它新興的健康主張。這些主張格外集中于腸，例如腸癌、腸易激綜合癥、和炎性腸病(諸如Crohn氏病)。
因此，優(yōu)選在小腸后半段釋放益生乳桿菌。通常打算在大腸釋放雙歧桿菌。雙歧桿菌比乳桿菌更加傾向于引發(fā)免疫應(yīng)答，由此，關(guān)于小腸區(qū)域的雙歧桿菌是極其重要的命題存在爭論。
如果靶部位是小腸，那么必需日常服用益生菌，因?yàn)榧?xì)菌不太可能以足夠數(shù)目粘附到腸壁上(可能除了有些乳桿菌)。然而，如果靶部位是大腸，那么可能不必日常服用，因?yàn)榧?xì)菌可發(fā)生生長和集群。
在針對疾病和其它狀況方面具有優(yōu)良特征的益生菌細(xì)菌可能不具有優(yōu)良的存活特征(例如耐受低pH、膽汁鹽、蛋白裂解酶和水解酶、耐受抗生素、粘附到細(xì)胞壁上)。通常必需在通行至靶部位的過程中保護(hù)細(xì)菌。
可以通過數(shù)種方法來實(shí)現(xiàn)保護(hù)在緩慢釋放制藥學(xué)化合物中包封；在膠或藻酸鹽中包封；在聯(lián)合膠的抗性淀粉或菊粉中包封；通過摻入含抗性淀粉的食品提供保護(hù)；或者摻入乳制品，由其中的蛋白質(zhì)和脂肪提供一些保護(hù)。
美國專利5422121公布了摻入具有親水基團(tuán)的膜形成聚合物和在結(jié)腸中可分解的多糖的包衣，它可用于將藥劑遞送至結(jié)腸。
美國專利5840860公布了通過將短鏈脂肪酸與碳水化合物載體共價相連而將它們遞送至結(jié)腸的方法。
美國專利6060050公布了益生細(xì)菌(諸如雙歧桿菌)與作為載體且還在大腸或胃腸道其它區(qū)域擔(dān)當(dāng)生長或維持培養(yǎng)基的高直鏈淀粉的組合。
美國專利申請20030096002公布了用于受控釋放微生物的基質(zhì)?；|(zhì)由疏水蠟和選自多糖、淀粉、和藻類衍生物或聚合物的釋放改良劑形成。
美國專利6413494公布了由諸如果膠的多糖組成的結(jié)腸藥物遞送載體。
有些益生菌在加工過程中以及在遞送至胃腸道的過程中需要保護(hù)。它們可能對水或氧敏感，而且在加工、貯存、和運(yùn)輸過程中需要保護(hù)以維持生存能力。
歐洲專利1213347公布了通過將酵母和微生物與吸收水的基質(zhì)材料混合而將它們干燥和保存的方法。
本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供包封益生菌以保護(hù)它們免于在加工和貯存過程中退化并使之能夠遞送至胃腸道特定部位的方法。
發(fā)明簡述為此，本發(fā)明提供了益生細(xì)菌配方，其中將一種或多種益生微生物分散于1)蛋白質(zhì)和碳水化合物的水性懸浮液中；2)膜形成蛋白和碳水化合物與脂肪的水包油乳液中；或3)隨后分散于膜形成蛋白和碳水化合物的油中。
可以將懸浮液、分散液、或乳液干燥而形成粉末。
貫穿本說明書，術(shù)語“益生菌”意圖包括這樣的微生物，諸如在(優(yōu)選以活體)單獨(dú)或聯(lián)合遞送至腸道靶區(qū)后展示對人類健康有益的效果的細(xì)菌或真菌等。實(shí)例包括雙歧桿菌、乳桿菌、酵母菌、乳球菌、鏈球菌、丙酸桿菌、和可以證明對宿主產(chǎn)生有益效果的任何其它微生物。可以將益生菌與益生素物質(zhì)混合，或者作為共生或合生物質(zhì)的一部分。
貫穿本說明書，術(shù)語“益生素”指這樣的物質(zhì)，諸如為益生菌提供養(yǎng)分或幫助益生菌的蛋白質(zhì)、肽、或碳水化合物。例如，乳鐵蛋白能夠增強(qiáng)期望細(xì)菌的生長。益生素通常不能在腸道上部消化。益生碳水化合物包括抗性淀粉、馬鈴薯淀粉、或高直鏈淀粉諸如Starplus、改性淀粉(包括羧化淀粉、乙?；矸邸⒈岬矸?、和丁酸淀粉)、非消化性寡糖諸如果糖-、葡萄糖-、木糖-、大豆-、半乳糖-、乳-、菊粉-、阿拉伯糖木聚糖、阿拉伯糖半乳聚糖、半乳糖甘露聚糖、或其消化產(chǎn)物，但是不排除能夠發(fā)揮益生素作用的其它寡糖。
貫穿本說明書，術(shù)語“共生”或“合生”指益生菌和益生素在一起時對人類健康具有協(xié)同的有益效果的組合。
可以將益生細(xì)菌以濃縮液或冷凍干燥的形式導(dǎo)入包封介質(zhì)?？梢詫⒁嫔稚⒂谟椭?，然后用水性懸浮液乳化，再然后干燥而生成攜帶益生菌的包封的油。也可以干燥而生成粉末。可以采用任何合適的干燥技術(shù)，諸如噴霧干燥、冷凍干燥、或折射窗干燥。在益生菌對濕度敏感時，可能優(yōu)選用油懸浮益生菌。油優(yōu)選食用油，而且乳液或通過將乳液干燥獲得的粉末可以用作食品成分，以及飼料添加劑。
可以在包封步驟前將碳水化合物和膜形成蛋白的水性懸浮液或膜形成蛋白和碳水化合物與油混合物的乳液加熱，使糖類與蛋白質(zhì)成分發(fā)生反應(yīng)。如果糖類含有還原性糖基，那么加熱步驟將產(chǎn)生美拉反應(yīng)產(chǎn)物。當(dāng)益生菌對氧敏感時，優(yōu)選將水性懸浮液加熱。
本發(fā)明的包封物形成穩(wěn)定的、堅固的膜或基質(zhì)，將益生菌包埋其中或者圍繞益生菌或油滴形成膜?？梢圆捎每捎糜诎庥偷娜魏蔚鞍踪|(zhì)作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)成分。將碳水化合物與蛋白質(zhì)聯(lián)合。在水性懸浮液中，蛋白質(zhì)不必是膜形成蛋白，因?yàn)樗纬梢嫔陌饣|(zhì)。然而，基于油的系統(tǒng)需要膜形成蛋白。
蛋白質(zhì)優(yōu)選可溶性的，而且優(yōu)選在美拉反應(yīng)的加熱范圍內(nèi)穩(wěn)定，包括酪蛋白、大豆和乳清蛋白質(zhì)、明膠、卵清蛋白、和游離氨基酸基團(tuán)增加的水解蛋白質(zhì)，包括大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。需要注意，在蛋白質(zhì)與碳水化合物反應(yīng)時確保條件不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)膠凝或凝結(jié)，因?yàn)檫@將使得蛋白質(zhì)不能形成有效的膜。優(yōu)選的蛋白質(zhì)是乳蛋白質(zhì)，尤其是酪蛋白或乳清蛋白質(zhì)分離物。酪蛋白在許多應(yīng)用中是優(yōu)選的蛋白質(zhì)，因?yàn)樗杀镜停以谌魏渭訜崽幚?，例如形成美拉反?yīng)產(chǎn)物過程中極其抵抗膠凝。對于嬰兒食品的應(yīng)用，乳清蛋白質(zhì)是優(yōu)選的蛋白質(zhì)來源。蛋白質(zhì)-碳水化合物混合物中美拉反應(yīng)產(chǎn)物的數(shù)量是足以為產(chǎn)品的保存期提供氧清除活性的數(shù)量。包封前所需要的蛋白質(zhì)和碳水化合物之間反應(yīng)的最低限度將取決于包封的具體益生菌菌株的耐氧量。對于特定的蛋白質(zhì)/碳水化合物組合，可以通過發(fā)生的顏色變化的程度來監(jiān)測所形成美拉反應(yīng)產(chǎn)物的程度。另一種測量方法是測定未反應(yīng)的糖。
使碳水化合物和蛋白質(zhì)進(jìn)行美拉反應(yīng)而產(chǎn)生益生細(xì)菌的有效包封物并不是必需的。在混合蛋白質(zhì)和淀粉時發(fā)現(xiàn)，物質(zhì)特別是碳水化合物的微流態(tài)化增強(qiáng)了配方的有效性。
優(yōu)選的碳水化合物是含有還原性基團(tuán)的糖，優(yōu)選選自下組單糖(例如葡萄糖、果糖)、二糖(例如麥芽糖、乳糖)、三糖、寡糖、和葡萄糖糖漿?？梢圆捎萌魏芜€原性糖源，包括蜜。也可以采用與蛋白質(zhì)不發(fā)生美拉反應(yīng)的碳水化合物。
采用寡糖或淀粉(包括抗性淀粉)來改進(jìn)益生菌在(小)腸和結(jié)腸中的遞送和生長屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些物質(zhì)中的一些在腸道上部通常不消化，而且能夠幫助益生菌的生長。
本發(fā)明描述了優(yōu)選的實(shí)施方案。
在圖中圖1圖解了嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)在噴霧干燥過程中的存活。
圖2圖解了乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)Bb-12在噴霧干燥過程中的存活。
圖3圖解了嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)La-5在噴霧干燥過程中的存活。
圖4圖解了嬰兒雙歧桿菌在模擬胃腸通行過程中的存活。
圖5圖解了嬰兒雙歧桿菌在于25℃和50％相對濕度貯存2周后的存活。
圖6圖解了嬰兒雙歧桿菌在于25℃和50％相對濕度貯存5周過程中的存活。
圖7圖解了乳雙歧桿菌Bb-12在于25℃和50％相對濕度貯存5周過程中的存活。
圖8圖解了嬰兒雙歧桿菌在于pH4.0保溫2小時后的存活。
發(fā)明詳述材料實(shí)施例中使用的益生細(xì)菌是雙歧桿菌和乳桿菌，但是也可以通過相同方法將其它益生細(xì)菌菌株包封。
使用益生嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)La-5(Chr.Hansen，丹麥)和對環(huán)境條件具有內(nèi)在不同回復(fù)性的兩種益生雙歧桿菌菌株來調(diào)查微包封技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)Bb-12(Chr.Hansen，丹麥)是對環(huán)境條件(包括低pH)具有較高回復(fù)性和較高耐氧性的較為強(qiáng)壯的益生菌菌株。與乳雙歧桿菌Bb-12相比，嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)(Chr.Hansen，丹麥)對環(huán)境條件較為敏感。
實(shí)施例中使用的蛋白質(zhì)主要是酪蛋白，但是可以容易的用其它蛋白質(zhì)替代配方中的蛋白質(zhì)，諸如乳清蛋白質(zhì)、大豆蛋白質(zhì)、水解蛋白質(zhì)等。
實(shí)施例中使用的碳水化合物包括葡萄糖、寡糖、干葡萄糖糖漿、抗性淀粉、和預(yù)加工淀粉。配方中可以使用其它碳水化合物，諸如乳糖、多糖、麥芽糊精、天然淀粉、改良淀粉等。
脂質(zhì)(植物和動物油、甘油二酯和甘油三酯、n3和n6油等)所用微包封策略策略1已反應(yīng)或未反應(yīng)蛋白質(zhì)和碳水化合物的水性懸浮液中的益生細(xì)菌于60℃制備蛋白質(zhì)-碳水化合物混合物的溶液(其中碳水化合物包括抗性淀粉，淀粉可以直接使用或通過微流態(tài)化預(yù)處理)。將混合物于98℃加熱30分鐘。冷卻至10℃。使用攪拌器將冷凍干燥的細(xì)菌或濃縮物分散到已反應(yīng)溶液中。于120-160℃ Ti和50-70℃ To噴霧干燥。Ti指入口氣體溫度，To指出口氣體溫度。
于60℃制備蛋白質(zhì)-碳水化合物混合物的溶液(其中碳水化合物包括抗性淀粉，淀粉可以直接使用或通過微流態(tài)化預(yù)處理)。冷卻至10℃。使用攪拌器將冷凍干燥的細(xì)菌或濃縮物分散到溶液中。于120-160℃ Ti和50-70℃ To噴霧干燥。
策略2已反應(yīng)或未反應(yīng)之膜形成蛋白和碳水化合物與脂肪的水包油乳液中的益生細(xì)菌于60℃制備蛋白質(zhì)-碳水化合物混合物的溶液(其中碳水化合物包括抗性淀粉，淀粉可以直接使用或通過微流態(tài)化預(yù)處理)，添加油，并將混合物以350巴勻漿。將勻漿化乳液于98℃加熱30分鐘。冷卻至10℃。使用攪拌器將冷凍干燥的細(xì)菌或濃縮物分散到已反應(yīng)溶液中。于120-160℃ Ti和50-70℃ To噴霧干燥。
于60℃制備蛋白質(zhì)-碳水化合物混合物的溶液(其中碳水化合物包括抗性淀粉，淀粉可以直接使用或通過微流態(tài)化預(yù)處理)，添加油，并將混合物以350巴勻漿。冷卻至10℃。使用攪拌器將冷凍干燥的細(xì)菌或濃縮物分散到溶液中。于120-160℃ Ti和50-70℃ To噴霧干燥。
策略3隨后分散于已反應(yīng)或未反應(yīng)膜形成蛋白和碳水化合物的油中的益生細(xì)菌于60℃制備蛋白質(zhì)-碳水化合物混合物的溶液(其中碳水化合物包括抗性淀粉，淀粉可以直接使用或通過微流態(tài)化預(yù)處理)。將混合物于98℃加熱30分鐘。冷卻至10℃。將冷凍干燥的細(xì)菌分散到油中。使用攪拌器將冷凍干燥細(xì)菌懸浮液添加到已反應(yīng)溶液中。于120-160℃ Ti和50-70℃ To噴霧干燥。
于60℃制備蛋白質(zhì)-碳水化合物混合物的溶液(其中碳水化合物包括抗性淀粉，淀粉可以直接使用或通過微流態(tài)化預(yù)處理)。冷卻至10℃。將冷凍干燥的細(xì)菌分散到油中。使用攪拌器將冷凍干燥細(xì)菌懸浮液添加到溶液中。于120-160℃ Ti和50-70℃ To噴霧干燥。
加工和配方的實(shí)例策略1實(shí)施例1(包封的蛋白質(zhì)-糖)在蛋白質(zhì)-糖基質(zhì)中包封的冷凍干燥益生細(xì)菌加工步驟于60℃制備含有酪蛋白酸鈉、寡糖、和干葡萄糖糖漿(Cas-oligo-DGS)混合物的溶液。冷卻至10℃。使用攪拌器將冷凍干燥的細(xì)菌分散到溶液中。于160/65℃ Ti/To噴霧干燥。<p>片劑配制是以高剪切混合器Pellmix 1/8中的濕法粒化為基礎(chǔ)的。將16g微粉化的他克莫司與640g乳糖(125目)、80g月桂基硫酸鈉、和640g羥丙基甲基纖維素Metolose SH90 15.000cP？在高剪切混合器中混合。用泵將純水抽到混合物中，葉輪速度500rpm，加料速率20g/分鐘，隨后捏和3分鐘。將顆粒在盤式干燥器中干燥，并用0.7mm篩網(wǎng)篩分。
將顆粒與480g Avicel PH200混合3分鐘，并在添加16g硬脂酸鎂后再混合0.5分鐘。將混合物在單次沖壓壓片機(jī)Diaf TM20上壓制成片劑。
藥片直徑8mm。藥片形狀圓形，復(fù)合杯。
實(shí)施例14基于侵蝕性HPMC基質(zhì)的受控釋放片劑配制。添加HPMC作為顆粒內(nèi)相的一部分。熔融?；?。
片劑組成
片劑配制是以高剪切混合器Pellmix 1/8中的熔融?；癁榛A(chǔ)的。將16g微粉化的他克莫司與640g乳糖(125目)、120g聚乙二醇6000、48g泊洛沙姆188、和640g羥丙基甲基纖維素SH 90 15.000cP在高剪切混合器中混合。將混合器輥筒的夾套加熱至80℃，并在葉輪速度1000rpm下加熱混合物直至PEG和泊洛沙姆的熔點(diǎn)。熔化后，以800rpm繼續(xù)捏和4分鐘。將顆粒用0.7mm篩網(wǎng)篩分，并在盤上冷卻。將顆粒與480g Avicel PH200混合3分鐘，并在添加16g硬脂酸鎂后再混合0.5分<p>在蛋白質(zhì)-糖-高直鏈淀粉基質(zhì)中包封的冷凍干燥益生細(xì)菌加工步驟于60℃制備15％w/w酪蛋白酸鈉溶液，然后添加糖。于60℃制備10％w/w Hylon VII分散液。將酪蛋白酸鈉-糖溶液和Hylon VII分散液混合到一起。冷卻至10℃。使用攪拌器將冷凍干燥的細(xì)菌添加到蛋白質(zhì)-糖-淀粉混合液中。于160/65℃ Ti/To噴霧干燥。
實(shí)施例4(包封的蛋白質(zhì)-糖-RS(MF))在蛋白質(zhì)-糖-微流化高直鏈淀粉基質(zhì)中包封的冷凍干燥益生細(xì)菌加工步驟于60℃制備15％w/w蛋白質(zhì)溶液，然后添加糖。于60℃制備20％w/w Hylon VII分散液，于121℃加熱60分鐘，冷卻，添加剩余的水至含10％w/w總固體，并以800巴微流態(tài)化3次。將蛋白質(zhì)-糖溶液和微流態(tài)化Hylon VII分散液混合到一起。冷卻至10℃。使用攪拌器將冷凍干燥的細(xì)菌添加到蛋白質(zhì)-糖-淀粉混合液中。于160/65℃ Ti/To噴霧干燥。
策略2實(shí)施例5(包封的蛋白質(zhì)-糖-油乳液)
在蛋白質(zhì)-糖-油乳液中包封的冷凍干燥益生細(xì)菌加工步驟于60℃制備含有酪蛋白酸鈉、寡糖、和干葡萄糖糖漿(Cas-oligo-DGS)混合物的溶液，使用攪拌器添加油，并以250巴勻漿。冷卻至10℃。使用攪拌器將冷凍干燥的細(xì)菌分散到乳狀液中。于160/65℃ Ti/To噴霧干燥。
實(shí)施例6(包封的蛋白質(zhì)-糖-油MRP乳液)在加熱反應(yīng)的蛋白質(zhì)-糖-油乳液中包封的冷凍干燥益生細(xì)菌加工步驟于60℃制備含有酪蛋白酸鈉、寡糖、和干葡萄糖糖漿(Cas-oligo-DGS)混合物的溶液，添加油，并以250巴勻漿。將乳液于98℃加熱30分鐘。冷卻至10℃。使用攪拌器將冷凍干燥的細(xì)菌分散到乳液中。于160/65℃ Ti/To噴霧干燥。
實(shí)施例7(包封的蛋白質(zhì)-糖-RS(MF)-油乳液)在蛋白質(zhì)-糖-微流化高直鏈淀粉-油乳液中包封的冷凍干燥益生細(xì)菌加工步驟于60℃制備15％w/w蛋白質(zhì)溶液，然后添加糖。于60℃制備20％w/w Hylon VII分散液，于121℃加熱60分鐘，冷卻，添加剩余的水至含10％w/w總固體，并以800巴微流態(tài)化3次。將蛋白質(zhì)-糖溶液和微流態(tài)化Hylon VII分散液混合到一起。添加油并以250巴勻漿。冷卻至10℃。使用攪拌器將冷凍干燥的細(xì)菌添加到乳液中。于160/65℃ Ti/To噴霧干燥。
策略3實(shí)施例8(包封的(油中)-蛋白質(zhì)-糖)在油中且在蛋白質(zhì)-糖基質(zhì)中包封的冷凍干燥益生細(xì)菌加工步驟于60℃制備含有酪蛋白酸鈉、寡糖、和干葡萄糖糖漿(Cas-oligo-DGS)混合物的溶液。冷卻至10℃。將冷凍干燥的細(xì)菌分散到油中。使用攪拌器將冷凍干燥細(xì)菌的分散液添加到溶液中。于160/65℃ Ti/To噴霧干燥。
直接參考圖15，切削刀具100還可相對于進(jìn)刀方向F定向，使得在切削刃125的頂表面117與工件10的軸15相交形成小于90°的軸角AA，并優(yōu)選的在0°到30°之間。表中提出的以下實(shí)施例表示采用根據(jù)本發(fā)明的組件的結(jié)果。
具有1/2英寸IC的圓形刀具以類似于本發(fā)明在圖9中配置的方式固定在刀夾上，并安裝在Mori Seiki MT 253機(jī)床上。曾在干的條件下進(jìn)行過這種試運(yùn)轉(zhuǎn)。切削刀具是KC8050鍍層硬質(zhì)合金。KC8050牌號是由Kennametal公司制造的專利牌號。工件是具有約為6英寸初徑的圓材，并由1040碳鋼制成。
表
*刀具以工件RPM此數(shù)值的倍數(shù)轉(zhuǎn)動**側(cè)面磨損等于或超過0.015英寸的時間***表面速度保持恒定，當(dāng)工件直徑減少時需要增加工件的轉(zhuǎn)動速度。
至此已對刀夾不可轉(zhuǎn)動地固定在主軸內(nèi)這樣作了論述，就是將主軸的轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)化為刀夾的轉(zhuǎn)動，而刀夾的轉(zhuǎn)動又轉(zhuǎn)化為切削刀具的轉(zhuǎn)動。然而，這種配置需要主軸旋轉(zhuǎn)。但是完全有可能采用固定的主軸和輔<p>
PVFA(＝N-乙烯基甲酰胺)/PVAm(＝聚乙烯胺)-商業(yè)名稱分別為Lupamin和Luredur，購自BASF-Lupamin 9030用于30％水解度的樣品(樣品B)-Lupamin 9095用于＞90％水解度的樣品(樣品D)-Luredur 8097用于50％水解度的樣品(樣品C、F至H和K)-分子量400.000-制備含10％陽離子聚合物的溶液PEI(聚乙烯亞胺)-用于樣品E)
表V
如表IV和表V及圖21所示，與陽極不含玻璃纖維的基本上相似的電池相比，陽極含有PA-01或PA-10玻璃纖維(Hollingsworth &Vose Company)的電池可在較高的放電速率(安培)下提供大于約10％的容量(安培-小時)。
實(shí)施例1824個鉛酸電池的電池組(12伏，90安培-小時容量(20小時)，帶有吸光的玻璃隔板)的陽極片制備如下。
將20磅的PA-20玻璃纖維(Hollingsworth & Vose Company)、12.5磅的Hammond增充劑(Hammond Lead Products)、1320磅的氧化鉛(可使用Barton方法制備)和75千克的水在85轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌下順序加到Oxmaster混合器中。將混合物混合2分鐘，然后在攪拌下加入125磅的硫酸水溶液。將混合物混合7分鐘，得到的糊狀物其在制備中的最大溫度為61℃、立方重量為72.4克/立方英寸、滲透度為17、水比值為0.125和酸比值為0.095。
糊狀物被帶式涂覆在柵格上，并使用具有如下參數(shù)的急驟干燥爐涂覆的板片重量為544-574克(雙倍)、厚度為0.079-0.083英寸、干燥后板片水分為7～8％、干燥后實(shí)際板片水分為9.2％和實(shí)際干燥爐最小溫度為400。
使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)一步處理板片，使用標(biāo)準(zhǔn)鉛酸電池處理技術(shù)制備24個鉛酸電池的電池組。
與未包封細(xì)菌相比，圖1顯示了所有三種微包封策略都在噴霧干燥過程中保護(hù)了益生菌。(圖1中的“未包封的”指將冷凍干燥益生菌樣品分散于水中并噴霧干燥。)微包封在噴霧干燥過程中實(shí)質(zhì)性保護(hù)了益生雙歧桿菌的存活能力。
在噴霧干燥過程中對嬰兒雙歧桿菌而言策略1似乎是最有效。對這種敏感菌株獲得了益生菌存活能力的提高超過3個數(shù)量級(3個log10單位)。
圖2顯示了乳雙歧桿菌Bb-12的存活普遍比敏感的嬰兒雙歧桿菌菌株高得多。
許多微包封處理使得乳雙歧桿菌Bb-12在噴霧干燥過程中的存活能力保持在相同數(shù)量級內(nèi)(存活能力的下降少于1個log10單位)。
在策略3的各種處理之間觀察到它們保護(hù)乳雙歧桿菌Bb-12存活能力的差異。
因?yàn)橹貞矣谒睦鋬龈稍锶殡p歧桿菌Bb-12不能噴霧干燥，所以不可能比較這種菌株的包封在噴霧干燥過程中的效果。
圖3顯示了許多包封處理很好的維持了嗜酸乳桿菌La-5在噴霧干燥過程中的存活能力。許多微包封處理能夠在噴霧干燥過程中維持超過50％的存活能力，但在最有效的處理中存在菌株差異。
總之，圖1顯示了所用包封策略在噴霧干燥過程中的保護(hù)作用，而圖2和3顯示了乳雙歧桿菌Bb-12和嗜酸乳桿菌La-5的存活能力在噴霧干燥后在很大程度上維持完好。
微包封在胃腸通行過程中的好處為了模擬胃腸通行過程中的存活條件，讓微包封和未微包封益生細(xì)菌通過模擬胃和小腸條件的兩階段體外模型。在第一個階段，將重復(fù)的1.0g每種噴霧干燥包封處理樣品與10ml模擬胃液(SGF)混合，并于37℃保溫2小時，同時持續(xù)以100rpm攪動。2小時后，用1M氫氧化鈉(逐滴加入以防止對活細(xì)胞的可能損傷)將樣品的pH調(diào)至6.8，然后向pH調(diào)好的樣品中添加10ml SIF，并于37℃再保溫3小時，同時持續(xù)以100rpm攪動。然后測定存活細(xì)胞數(shù)目。
如下制備SGF和SIF(參考文獻(xiàn)美國藥典(2000)和國家制藥廠(USP 24NF19，羅克維爾，馬里蘭)模擬胃液(SGF)(pH1.2)將1.0g氯化鈉、1.6g胃蛋白酶、和3.5ml濃鹽酸(36％)溶于去離子水，用去離子水補(bǔ)足至終體積500ml。溶液的最終pH是1.2。
模擬腸液(SIF)(pH6.8)將3.4g磷酸氫鉀溶于450ml去離子水。向其中添加38.5ml 0.2M氫氧化鈉和6.25g胰酶(8xUSP級)。將溶液于4℃攪動過夜，并用1M氫氧化鈉或0.2M鹽酸將pH調(diào)至6.8。用去離子水將體積補(bǔ)足至500ml。
圖4顯示了所有三種微包封策略都提高了菌株的存活能力。(“未包封(冷凍干燥)”指圖4和所有后續(xù)附圖中的冷凍干燥益生菌樣品。)。
與未包封的冷凍干燥細(xì)菌相比，微包封實(shí)質(zhì)性保護(hù)了益生嬰兒雙歧桿菌的存活能力。策略2和3最具保護(hù)性。
與存活能力在相同條件下幾乎下降4個數(shù)量級(4個log10單位)的未包封的細(xì)菌相比，包封在這種敏感益生菌菌株中幾乎實(shí)現(xiàn)了100％的存活。
微包封在非冷凍貯存過程中的好處在于25℃和50％相對濕度貯存5周的過程中評估包封的和未包封的益生細(xì)菌的存活率。2周和5周后評估細(xì)菌的存活率。如上所述觀察存活的數(shù)目。
圖5顯示了于25℃和50％相對濕度貯存2周后所有三種微包封策略都在一定程度上保護(hù)了菌株的存活能力。
微包封實(shí)質(zhì)性保護(hù)了益生菌的存活能力。圖4顯示了所有三種微包封策略都提高了菌株的存活能力。(“未包封的(冷凍干燥)”指圖4和所有后續(xù)附圖中的冷凍干燥益生菌樣品。)與非冷凍貯存的未包封的冷凍干燥細(xì)菌相比，微包封實(shí)質(zhì)性保護(hù)了益生嬰兒雙歧桿菌的存活能力。策略2和3最具保護(hù)性。
使用相同處理在非冷凍條件下貯存2周后，來自對環(huán)境條件諸如氧敏感的物種的這種益生菌菌株的存活能力保持在相同數(shù)量級內(nèi)(下降少于1個log10單位)。
相反，未包封的冷凍干燥細(xì)菌的存活能力降低了超過5個數(shù)量級。
圖6顯示，與非包封的細(xì)菌相比，微包封在非冷凍貯存過程中實(shí)質(zhì)性保護(hù)了益生嬰兒雙歧桿菌的存活能力。貯存5周后，涵蓋策略2和在蛋白質(zhì)-RS(MF)中包封的(策略1)處理在維持嬰兒雙歧桿菌的存活能力方面最有效。
于25℃和50％相對濕度貯存5周后，采用策略2的細(xì)菌微包封使得存活計數(shù)的下降維持在少于2個log10單位，相比較而言，對未包封的細(xì)菌觀察到存活計數(shù)下降了超過8個log10單位。
與未包封的細(xì)菌相比，圖7顯示了于25℃和50％相對濕度貯存5周的過程中所用三種微包封策略都在更大程度上保護(hù)了菌株的存活能力。
與未包封的冷凍干燥細(xì)菌相比，微包封在非冷凍貯存過程中實(shí)質(zhì)性保護(hù)了益生乳雙歧桿菌Bb-12的存活能力。未包封的細(xì)菌的存活能力在貯存2周后低于檢測限制1000CFU/g。因此，在這個點(diǎn)上描述未包封的冷凍干燥細(xì)菌的存活百分率代表了最大可能存活百分率，而且可能是高估了。
5周后在存活百分率方面的受益在2-4個log10單位之間。
微包封在低pH環(huán)境中的好處通過于例如pH4.0的保溫來評估微膠囊針對適度低pH保護(hù)細(xì)菌的能力。將包封的噴霧干燥和未包封的冷凍干燥益生細(xì)菌(0.12g冷凍干燥粉等價物)在10ml 0.2M醋酸鹽緩沖液pH4.0中混合，并于37℃保溫2小時，同時持續(xù)以100rpm攪動。保溫2小時后，用1M氫氧化鈉將樣品的pH調(diào)至6.8，并將它們于37℃(室溫)再保溫1小時以實(shí)現(xiàn)由膠囊釋放細(xì)菌。如上所述對樣品進(jìn)行存活細(xì)菌計數(shù)。
圖8顯示了所有三種微包封策略都在一定程度上保護(hù)了菌株的存活能力，于pH4.0保溫后存活能力平均提高了2-3個log10單位。(“未包封的冷凍干燥”指冷凍干燥益生菌樣品。)與未包封的冷凍干燥細(xì)菌相比，微包封實(shí)質(zhì)性保護(hù)了益生嬰兒雙歧桿菌的存活能力。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會，可以在與本文所述不同的實(shí)施方案中實(shí)行本發(fā)明而不違背本發(fā)明的基本教導(dǎo)。
權(quán)利要求
1.包封的益生菌，其中將一種或多種益生微生物分散于1)蛋白質(zhì)和碳水化合物的水性懸浮液中；2)膜形成蛋白和碳水化合物與脂肪的水包油乳液中；或3)油中，其隨后分散于膜形成蛋白和碳水化合物。
2.權(quán)利要求1中要求的包封的益生菌，其中碳水化合物含有還原性糖基。
3.權(quán)利要求1或2中要求的包封的益生微生物，其中將一種或多種益生素物質(zhì)與益生微生物混合。
4.權(quán)利要求1或2中要求的包封的益生微生物，其中膜形成組合物中的碳水化合物是益生素碳水化合物。
5.權(quán)利要求1中要求的包封的益生微生物，其中蛋白質(zhì)是酪蛋白或乳清蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求1或2中要求的包封的益生微生物，其中碳水化合物是抗性淀粉或高直鏈淀粉。
7.權(quán)利要求2中要求的包封的益生細(xì)菌，其中蛋白質(zhì)和碳水化合物經(jīng)過加熱加工。
8.權(quán)利要求2中要求的包封的益生細(xì)菌，其中蛋白質(zhì)和碳水化合物在添加益生細(xì)菌前在存在油或脂肪的條件下經(jīng)過加熱加工。
9.權(quán)利要求3中的益生細(xì)菌配方，其中淀粉經(jīng)過加熱和/或微流態(tài)化加工。
10.權(quán)利要求1中要求的包封的益生微生物，其經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥而形成粉末。
11.權(quán)利要求1中要求的包封的益生微生物，其中益生微生物選自雙岐桿菌、乳桿菌、酵母菌、乳球菌、鏈球菌和丙酸桿菌。
12.益生菌粉末，其由選自雙歧桿菌、乳桿菌、酵母菌、乳球菌、鏈球菌和丙酸桿菌的益生細(xì)菌組成，包封在酪蛋白或乳清蛋白質(zhì)和寡糖的膜形成混合物中。
13.權(quán)利要求12中要求的益生菌粉末，其中膜形成混合物經(jīng)過加熱而在寡糖與酪蛋白或乳清蛋白質(zhì)之間形成美拉反應(yīng)產(chǎn)物。
14.權(quán)利要求12中要求的益生菌粉末，其中益生細(xì)菌是液體益生菌濃縮物。
15.權(quán)利要求12中要求的益生菌粉末，其中益生細(xì)菌被冷凍干燥。
全文摘要
通過將益生微生物分散于膜形成蛋白和碳水化合物的水性懸浮液中；膜形成蛋白和碳水化合物與脂肪的水包油乳液中；或隨后分散于膜形成蛋白和碳水化合物的油中，從而將益生微生物微包封?？梢詫⑷橐夯驊腋∫焊稍锒纬煞勰??？梢詫⒁嫔稚⒂谟椭?，然后用水性懸浮液乳化，再干燥而生成攜帶益生菌的包封的油。也可以干燥而生成粉末。在益生菌對水敏感時，可優(yōu)選油懸浮的益生菌。優(yōu)選的蛋白質(zhì)是酪蛋白或乳清蛋白質(zhì)，而碳水化合物可以是抗性淀粉或具有還原性糖基的糖類。當(dāng)益生菌對氧敏感時，將蛋白質(zhì)和碳水化合物加熱，從而在包封膜中產(chǎn)生美拉反應(yīng)產(chǎn)物。
文檔編號A61K47/26GK1859920SQ200480028464
公開日2006年11月8日 申請日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月1日
發(fā)明者R·克里騰丹, L·圣關(guān)斯里, M·A·奧格斯汀 申請人:聯(lián)邦科學(xué)和工業(yè)研究組織