專利名稱：新型堿性蛋白酶變體及含有該新型堿性蛋白酶變體的洗滌劑和清洗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及源自于天然或改良枯草桿菌蛋白酶的新型堿性蛋白酶變體。根據(jù)遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)枯草桿菌蛋白酶的編號(hào)，所述變體與目前已知的枯草桿菌蛋白酶相比，具有兩個(gè)氨基酸位置199I和211G，和至少一個(gè)有利于分子穩(wěn)定的改良，優(yōu)選在點(diǎn)突變后位置3的蘇氨酸和/或位置4的異亮氨酸。特別優(yōu)選的是變體遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。該變體與其他的蛋白酶變體相比在洗滌劑和清洗劑中具有更好的洗滌性能。除該酶以外，本發(fā)明還涉及其在各種不同技術(shù)工藝中的應(yīng)用，特別涉及含有該新型堿性蛋白酶變體的洗滌劑和清洗劑。
枯草桿菌蛋白酶型的蛋白酶(Subtilase，枯草桿菌肽酶，EC3.4.21.62)基于催化活性的氨基酸被歸于絲氨酸蛋白酶。其是由微生物，特別是芽孢桿菌天然產(chǎn)生和分泌的。其起著非特異內(nèi)肽酶的作用，也就是說它可水解任何位于肽或蛋白質(zhì)內(nèi)部的酰胺鍵。其最適pH大多處于明顯的堿性范圍。有關(guān)該家族的綜述例如可見R.Bott和C.Betzel主編，New York，1996年出版的“Subtilisin enzymes”第75-95頁由R.Siezen撰寫的文章“Subtilases類枯草桿菌-蛋白酶(Subtilisin-likeProteases)”。枯草桿菌蛋白酶適合于多種可能的技術(shù)應(yīng)用，特別是用作洗滌劑或清洗劑的活性成分。
除例如淀粉酶，脂肪酶或纖維素酶的酶外，蛋白酶在數(shù)十年來已被廣泛用作洗滌劑和清洗劑的活性成分。其具有將洗滌物如紡織品或器皿上所含蛋白的污漬加以分解的能力。水解產(chǎn)物由于其相對(duì)高的水溶性而隨洗滌水一起沖走或被其他的洗滌劑或清洗劑的成分作用，溶解，乳化或懸浮。由此使得在酶與洗滌劑和清洗劑的其他成分之間產(chǎn)生協(xié)同作用。
枯草桿菌蛋白酶基于其優(yōu)良的酶解特性如穩(wěn)定性或最適pH值使得其在洗滌劑和清洗劑蛋白酶中占據(jù)一突出的地位。在下述將列舉目前在洗滌劑中應(yīng)用的枯草桿菌蛋白酶，其部分是天然的分子，而部分是借助誘變由野生型酶獲得的變體。
在J.Bacteriol.第159卷，第811-819頁Vasantha等人(1984)和在Nucleic acid Research，第11卷，第7911-7925頁J.A.Wells等人(1983)的研究中已公開了分別來源于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，以及枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的枯草桿菌蛋白酶BPN’。而在專利公布WO95/07991和WO95/30010中敘述了通過酶在環(huán)-區(qū)域的點(diǎn)突變所獲得的變體，其與底物結(jié)合降低的同時(shí)提高了水解速率。例如在專利公布WO95/29979中公開了含有該BPN’-變體的洗滌劑。
在本專利申請中所研究的兩個(gè)氨基酸位置，即位置3和4，并不處于環(huán)-區(qū)域；如上述申請中的敘述，殘基199和211分別與位于BPN’分子的第6環(huán)位置205以及217同源。所述環(huán)參與底物的結(jié)合。對(duì)BPN’而言，在位置205處天然地具有一異亮氨酸(I)。在公布WO95/07991中提出了大量可能用于替換天然在位置217上的酪氨酸(Y)的氨基酸，但均與分子的穩(wěn)定突變無關(guān)；即使一217G突變被要求保護(hù)，也僅是與其他的在該底物-結(jié)合的環(huán)中催化補(bǔ)償?shù)狞c(diǎn)突變有關(guān)。唯一真正公開的在位置205和/或217上具有替換的變體(S.14)是，在其中兩個(gè)殘基已被空間充滿的通常也是脂族氨基酸所替換。同樣的情況見公布WO95/29979。在公布WO95/30010中的枯草桿菌蛋白酶，當(dāng)其在第6環(huán)中具有一突變時(shí)，那末在不同環(huán)中至少具有另一個(gè)突變。作為217G變體公開的例子有Y217G/S188D或那些甚至帶有多個(gè)非第6環(huán)的替換，其同源性氨基酸在本發(fā)明的變體中無改變。
枯草桿菌蛋白酶BPN’用作枯草桿菌蛋白酶的參照酶，尤其涉及位置編號(hào)時(shí)。例如在申請EP130756中以BPN’的編號(hào)標(biāo)出了所有枯草桿菌蛋白酶涉及的點(diǎn)突變。這些點(diǎn)突變也包括位置217，其對(duì)應(yīng)于本發(fā)明酶的位置211。其他相關(guān)位置在該文中并未予以先行描述。
蛋白酶枯草桿菌蛋白酶Carlsberg在J.Biol.Chem.，第243卷，第2184-2191頁E.L.Smith等人(1968)和在Nucl.Acids Res.，第13卷，第8913-8926頁Jacobs等人(1985)的出版物中進(jìn)行了介紹。其天然來自于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和可從丹麥Novozymes A/S公司，Bagsvaerd以商品名Alcalase購得。通過點(diǎn)突變所獲得的變體在提高水解率的同時(shí)對(duì)底物的結(jié)合減少，公開在例如公布WO 96/28566中。如同上所述及的BPN’申請，在這些變體的分子的環(huán)-區(qū)域中進(jìn)行了一個(gè)或多個(gè)的替換；一變體204I/216G(Carlsberg編號(hào))在其中未被預(yù)先述及。
蛋白酶PB92天然產(chǎn)自于親堿細(xì)菌Bacillus nov.spec 92和以商品名Maxacal從荷蘭的Gist-Brocades公司，Delft獲得。其原始序列已在專利申請EP 283075中述及。通過點(diǎn)突變所獲得的所述酶的變體，適合應(yīng)用于洗滌劑和清洗劑中的酶，在公布WO94/02618和EP 328229中公開。從這些申請的第一個(gè)中僅變體L211G/N212D具有一個(gè)與本文要求保護(hù)的變體相同的替換；而在第二個(gè)申請中沒有相關(guān)的變體出現(xiàn)。
枯草桿菌蛋白酶147和309被Novozymes公司分別以商品名Esperase以及Savinase銷售。其來源于Bacillus clausii-菌株，在申請GB 1243784中作了公開。例如在公布WO89/06279，WO95/30011，WO99/27082和WO00/37599中公開了通過點(diǎn)突變開發(fā)的在洗滌劑和清洗劑中使用該酶的變體的情況。
公布WO89/06279旨在對(duì)該蛋白酶達(dá)到較高的氧化穩(wěn)定性，提高的蛋白水解率和改良的洗滌性能。由其(P.14)得出，只有在一定位置上進(jìn)行替換才可使枯草桿菌蛋白酶147或309分子的物理或化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變；這里未提及位置3，4或211。公布WO95/30011中描述了枯草桿菌蛋白酶309的變體，其在分子的環(huán)-范圍內(nèi)具有點(diǎn)突變和由此在水解率提高的同時(shí)顯現(xiàn)對(duì)底物的吸附減少；這里未提及在位置3或4上的突變；唯一真正與本發(fā)明申請變體相對(duì)應(yīng)的點(diǎn)突變是取代L211G，而其無論如何不可能與取代V199I相關(guān)聯(lián)。在公布WO99/27082中，例如從枯草桿菌蛋白酶309中開發(fā)出了變體，并由此提高了其洗滌效果，通過一個(gè)以上氨基酸的插入使得該活性環(huán)被加大。其取代與本發(fā)明的不同。
其他在洗滌劑和清洗劑中被使用的蛋白酶的例子有-得自芽孢桿菌的蛋白酶164-A1，Chemgen Corp.，Gaithersburg，MD，USA和Vista Chemical Company，Austin，TX，USA(WO93/07276)；-得自芽孢桿菌的堿性蛋白酶PD138 NCIMB 40338，Novozymes(WO93/18140)；-得自芽孢桿菌ferm.BP-3376的蛋白酶K-16，Kao Corp.，Tokyo，Japan(US 53444770)；-由Nedkov等人1985在Biol.Chem.Hoppe-Seyler，第366卷第421-430頁所敘述的枯草桿菌蛋白酶DY，其在公布WO96/28557叔述為特別適合于用作洗滌劑和清洗劑，雖然重新通過在活性環(huán)上的特異性點(diǎn)突變，但還是沒有V204I變體(相應(yīng)于按照本發(fā)明酶的位置199)，或單獨(dú)或與其他取代組合；和-由普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)(Meloun等人，F(xiàn)EBS Lett.1983，第195-200頁)產(chǎn)生的和例如在公布WO96/28558中優(yōu)化的Thermitase。
在大量可能的Thermitase變體中，在最后提及的文獻(xiàn)中也述及到替換L221G的變體(相當(dāng)于本發(fā)明酶的位置211)。由于該酶天然地在位置209(相當(dāng)于本發(fā)明酶的199)上具有異亮氨酸，在相應(yīng)位置(相當(dāng)于199I/L211G)對(duì)本發(fā)明重要的其中兩個(gè)氨基酸殘基先前在此已加以描述，但沒有附加的特征，使得分子在這兩個(gè)氨基酸在該位置存在時(shí)處于穩(wěn)定。特別是由于在位置3上的蘇氨酸和/或在位置4上的異亮氨酸(按照遲緩芽孢桿菌-堿性蛋白酶)使得穩(wěn)定性喪失，這在先前也已被描述。然而thermitase在位置10和11上具有氨基酸殘基絲氨酸和精氨酸，它們同源于遲緩芽孢桿菌蛋白酶所述的兩個(gè)位置(與WO91/00345的順序相比)。
此外，Thermitase為一種分子，其序列與其他枯草桿菌蛋白酶具有顯著的偏差(Meloun等人，第198頁)。因此在成熟蛋白質(zhì)的Thermitase和遲緩芽孢桿菌-堿性蛋白酶間同系物具有45％的同一性(62％類似的氨基酸)。類似的也適用于蛋白酶K(WO96/28556)，其與遲緩芽孢桿菌-堿性蛋白酶的同系物在成熟蛋白質(zhì)水平上僅具有33％的同一性(46％類似的氨基酸)。
其他的蛋白酶例如在申請EP 199404，EP 251446，WO91/06637和WO95/10591中所述，其被Procter & Gamble Comp.公司，Cincinnati，OH，USA分別稱作“蛋白酶A”，“蛋白酶B”， “蛋白酶C”以及“蛋白酶D”和在洗滌劑和清洗劑中加以應(yīng)用(比較WO00/47707，第73頁)。申請EP 199404中的蛋白酶為不同的變體，其是基于專利EP130756，但不具有與本申請相關(guān)的位置變體(比較EP 199404 A2，第20欄)。在專利EP 251446 B1(第49頁)的實(shí)施例10中指出，變體Y217G與野生型酶相比穩(wěn)定性較低，并由此該替換不再被繼續(xù)關(guān)注。按照公布WO91/06637，“蛋白酶C”通過在位置123和274的點(diǎn)突變而加以區(qū)分。按照WO95/10591，“蛋白酶D”的所有變體均在位置76上發(fā)生突變，而在本發(fā)明的蛋白酶中卻無變化，并且與BPN’是相同的；同樣適用于本申請以及專利WO95/10615，US 6017871和US6066611。
其他已知的蛋白酶可獲自Novozymes公司的商品名為Durazym，Relase，Everlase，Nafizym，Natalase和Kannase，Genencor公司的商品名為Purafect，Purafect OxP和Properase，Advanced BiochemicalsLtd.公司，Thane，India的商品名為Protosol和Wuxi Snyder BiopruductsLtd.，China的商品名為Wuxi的蛋白酶。
為改善枯草桿菌蛋白酶的洗滌功效，許多申請運(yùn)用了將其它氨基酸插入在活性環(huán)中的對(duì)策，例如除已述的申請外還有以下述WO00/37599，WO00/37621至WO00/37627和WO00/71683至WO00/71691所公開的申請。
另一對(duì)策為改變分子的表面電荷。例如在公布WO91/00334，WO91/00335，WO91/00345，EP 479870，EP 945502和EP 563103中介紹了大量的氨基酸-替換，由此可使得分子的等電點(diǎn)提高或降低。公布WO00/24924由此得出一識(shí)別相應(yīng)合適變體的方法。對(duì)于WO96/34935也同樣適合，按照相同原理也可改變分子的疏水性。
另一改善枯草桿菌蛋白酶洗滌功效的對(duì)策為在已知分子中隨機(jī)導(dǎo)入點(diǎn)突變和測試所獲得變體對(duì)洗滌功效的作用。例如專利US 5700676遵循了該對(duì)策，其中作為唯一與本發(fā)明有關(guān)的位置，除若干其他替換外，在位置217(BPN’編號(hào))上的替換被述及。同樣適合的有專利US5310675，US 5801038，US 5955340和公布WO99/20723和WO99/20727。在專利US 4760025中建議的唯一突變與本發(fā)明有關(guān)的是在位置217上的突變，因?yàn)槠渑c活性中心有關(guān)。所有這些文獻(xiàn)并未提示本發(fā)明的其他替換可在洗滌功效上起重要作用。
現(xiàn)代的酶發(fā)展方向是將已知蛋白的相互有關(guān)的元件通過統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合成到新酶中，使其具有乞今未達(dá)到的性能。這樣的方法也概括地稱為指導(dǎo)演化法。對(duì)此例如有下述的方法StEP-法(Zhao等人(1998)，Nat.Biotechnol.，第16卷第258-261頁)，隨機(jī)引發(fā)重組法(Shao等人(1998)，Nucleic Acids Res.，第26卷第681-683頁)，DNA-改組法(Stemmer，W.P.C.(1994)，Nature，第370卷第389-391頁)或RACHITT(Coco，W.M.等人(2001)，Nat.Biotechnol.，第19卷第354-359頁)。
另一特別的補(bǔ)充對(duì)策為提高所涉及蛋白酶的穩(wěn)定性和由此提高其作用效能。這種對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定法被用于化妝品中，例如在US 5230891中敘述。對(duì)洗滌劑和清洗劑而言，與其不同，常用的穩(wěn)定法是借助于點(diǎn)突變。因此按照US 6087315和US 6110884，采用其他氨基酸殘基替換特定的酪氨酸殘基可使蛋白酶穩(wěn)定。其他的可能性例如為-按照EP 583339用脯氨酸替換特定的氨基酸殘基；-按照EP 995801向分子表面引入較極性的或帶電荷的基團(tuán)；-改變金屬離子的結(jié)合，特別是鈣結(jié)合的位置，例如按照公布WO88/08028和WO 88/08033的教導(dǎo)；在專利US 5340735，US 5500364，US 5985639和US 6136553中報(bào)道了其他使枯草桿菌蛋白酶穩(wěn)定的可能性，特別是對(duì)于得自于遲緩芽孢桿菌的那些枯草桿菌蛋白酶。
遲緩芽孢桿菌(B.lentus)的堿性蛋白酶為得自于芽孢桿菌種(Bacillus species)的高堿性蛋白酶。以保藏編號(hào)DSM 5483給出了其中一種菌株(WO91/02792以及EP 493398和US 5352604)。在WO92/21760，WO95/23221和WO98/30669中公開了通過點(diǎn)突變所獲得的并在洗滌劑和清洗劑中可應(yīng)用的酶變體。
野生型酶來源于最初通過篩選堿性芽孢桿菌菌株而獲得的產(chǎn)品，并且自身表現(xiàn)為一相對(duì)高的氧化穩(wěn)定性和洗滌劑作用。在公布WO91/02792以及EP 493398和US 5352604中，描述了其在宿主地衣芽孢桿菌ATCC 53926中的異源表達(dá)。在所述US專利的權(quán)利要求中，特征是指位置208，210，212，213和268，但是在位置61和211無替換變體，后者是遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶的特征。
公布WO92/21760也公開了野生型遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶的氨基酸序列為SEQ ID NO52和其核苷酸序列為SEQ ID NO106。除此之外在該申請中公開了51種不同的變體，這些變體與野生型在眾多位置相區(qū)別，其中還有S3T，V4I和V199I。
公布WO95/23221和WO98/30669也表明遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶變體適合于在洗滌劑和清洗劑中的使用，該變體在3個(gè)位置S3T，V4I和V199I與本發(fā)明的酶相對(duì)應(yīng)。除此之外，其具有2個(gè)或3個(gè)其他的相對(duì)于得自遲緩芽孢桿菌DSM 5483的野生型酶的點(diǎn)突變。其中一些攜帶另一在位置211，即211D的突變(變體F49，F(xiàn)54和F55)；結(jié)果，所述申請要求替換211D和211E的權(quán)利。
正如長時(shí)間來進(jìn)行的研究所表明，對(duì)于在洗滌劑和清洗劑中使用的替代蛋白酶存在高的需求。最近的公布如WO00/71683至WO00/71691證實(shí)，長期以來建立的枯草桿菌蛋白酶蛋白酶家族始終存在對(duì)其在洗滌劑和清洗劑中應(yīng)用的優(yōu)化要求。其隨之而來進(jìn)行了大量的工作以使得涉及酶的氨基酸序列發(fā)生變化。然而人們不可能輕易地從可能的可計(jì)算的酶性能中推斷出所述酶在洗滌劑或清洗劑配方中的行為(對(duì)照US 5801039，US 5985639和US 6136553)。其他的因素如對(duì)氧化劑的穩(wěn)定性，由于表面活性劑的變性，折疊效應(yīng)或所期望的與其他成分的協(xié)同作用也在這里起著重要的作用。
本發(fā)明的目的是找出在技術(shù)應(yīng)用中具有改良效果的枯草桿菌蛋白酶。特別是應(yīng)找出那些可改善洗滌劑和/或清洗劑的洗滌和清洗性能的枯草桿菌蛋白酶。
部分目的不僅改善蛋白酶的水解活性，而且還應(yīng)在相應(yīng)的洗滌劑和清洗劑配方中的穩(wěn)定性。
本專利申請針對(duì)該問題研究了對(duì)策，特別相對(duì)于在公布WO91/02792，WO92/21760和WO95/23221中公開的用于洗滌劑和清洗劑中的分子，對(duì)得自遲緩芽孢桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行了進(jìn)一步的改良。
驚奇地發(fā)現(xiàn)，在位置199和211的氨基酸異亮氨酸和甘氨酸可導(dǎo)致洗滌性能提高，所述性能通過在位置3以及4上的氨基酸蘇氨酸和異亮氨酸或許由于穩(wěn)定性效果而得以增強(qiáng)。
按照本發(fā)明，該目的將通過枯草桿菌蛋白酶型的堿性蛋白酶來解決，其特征在于，按照得自遲緩芽孢桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的編號(hào)，在位置199具有異亮氨酸和位置211具有甘氨酸和至少一種穩(wěn)定作用氨基酸，優(yōu)選由于在位置3上的氨基酸蘇氨酸和在位置4上的異亮氨酸。
其同樣也可借助枯草桿菌蛋白酶變體來解決，其特征在于，按照得自遲緩芽孢桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的編號(hào)，在位置199具有異亮氨酸和位置211具有甘氨酸，以及更優(yōu)選的是另有在位置3上的氨基酸蘇氨酸和在位置4上的異亮氨酸中的一個(gè)或兩個(gè)。
其同樣也可借助枯草桿菌蛋白酶變體來解決，其特征在于，按照得自遲緩芽孢桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的編號(hào)，在位置3具有蘇氨酸，在位置4上有異亮氨酸，在位置199上有異亮氨酸和在位置211上有甘氨酸。
特別是其可通過合適的枯草桿菌蛋白酶型的堿性蛋白酶來解決，其特征在于，所述堿性蛋白酶天然產(chǎn)生于芽孢桿菌或來源于這樣的枯草桿菌蛋白酶，特別是來自于遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶。
很特殊的是，其可由天然產(chǎn)生于遲緩芽孢桿菌DSM 5483的堿性蛋白酶或來源于這樣的堿性蛋白酶來解決，以及其中特別是按照SEQID NO.4中所示的氨基酸序列遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。
遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶變體M131具有特征替換S3T/V4I/A188P/V193M/V199I，應(yīng)看作為WO 92/21760的變體，其與本發(fā)明的變體遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G具有最高度的同源性，其在3個(gè)位置上與按照本發(fā)明的變體相對(duì)應(yīng)。兩個(gè)替換A188P和V193M有差異，在該位置上本發(fā)明的變體與野生型相同。如自公布WO95/30011所看到的，得自于遲緩芽孢桿菌-枯草桿菌蛋白酶的氨基酸193處于第6環(huán)的起始處，而氨基酸188不在任何環(huán)中，而是處于其間該蛋白質(zhì)的緊密范圍內(nèi)。就這點(diǎn)而言，兩個(gè)突變處于結(jié)構(gòu)上不同的分子范圍中。按照本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)，對(duì)野生型氨基酸而言該兩個(gè)位置188和193的回復(fù)和另一在位置211的突變，也就是說在第6環(huán)的后區(qū)域，導(dǎo)致一酶在洗滌和清洗性能方面優(yōu)于至今已知的酶，特別是先前已知的遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶。
本發(fā)明特別優(yōu)選的酶與公布WO95/23221和WO98/30669的變體不同在于，多個(gè)位置被回復(fù)了，也就是說又與野生型相同，以及在于未空間節(jié)省的和無電荷的氨基酸甘氨酸處于位置211以替代野生型的亮氨酸或所述變體的天冬氨酸。
從酶解的角度來看，令人驚奇的是改良洗滌以及清洗性能的效果通過在一氨基酸上的替換得以實(shí)現(xiàn)，其大概是參與了底物結(jié)合和/或反應(yīng)的催化；也就是說用一縮短質(zhì)子的甘氨酸側(cè)鏈替代空間節(jié)省的疏水的亮氨酸側(cè)鏈。同時(shí)相對(duì)與野生型，該第6環(huán)的第二個(gè)突變位置，即199，不由異亮氨酸回復(fù)為野生型的纈氨酸。與公布WO95/23221或WO98/30669相比，點(diǎn)突變產(chǎn)生一酸性基團(tuán)，即L211D或L211E將比其他突變位置上的野生型序列的回復(fù)更明顯。開始引用的不同枯草桿菌蛋白酶活性環(huán)變異的文獻(xiàn)，特別是WO95/30011，與位置211的變異一起已提示在另一活性環(huán)中可發(fā)生其他的變化，或在同樣環(huán)內(nèi)部發(fā)生強(qiáng)烈的變化，例如V199S/L211D，P204E/L211G或G196S/L211G，為抵償在催化方面的變化，決不保留V199I的替換。
從工業(yè)應(yīng)用的角度來看，特別是在洗滌劑和清洗劑中，令人驚奇地這導(dǎo)致功效的改善，特別是導(dǎo)致增強(qiáng)這種酶對(duì)不同污物的洗滌和清洗功效的作用。本發(fā)明枯草桿菌蛋白酶在相應(yīng)的洗滌劑和/或清洗劑配方(對(duì)比實(shí)施例2至5)中的成功應(yīng)用可以推測相關(guān)的變體也具有高的穩(wěn)定性，以使該酶足夠長時(shí)間地保持活性，并因此有助于改善性能。
本發(fā)明的主題是枯草桿菌蛋白酶型的堿性蛋白酶，其特征在于，根據(jù)來自遲緩芽胞桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的編號(hào)具有在位置199的異亮氨基酸和在位置211的甘氨酸以及至少一個(gè)穩(wěn)定作用氨基酸。優(yōu)選該穩(wěn)定作用氨基酸是位置3的氨基酸蘇氨酸或位置4的異亮氨酸中的一個(gè)。
本發(fā)明主題的另一實(shí)施方案是枯草桿菌蛋白酶類的堿性蛋白酶，其特征在于，根據(jù)來自遲緩芽胞桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的編號(hào)具有在位置3的蘇氨酸、在位置4的異亮氨酸、在位置199的異亮氨酸和在位置211的甘氨酸；其自然由枯草桿菌屬，特別是遲緩枯草桿菌形成，或者是由這樣的枯草桿菌屬衍生的枯草桿菌蛋白酶；其是由遲緩枯草桿菌DSM 5483天然形成的或者由它們衍生的枯草桿菌蛋白酶，根據(jù)在SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列特別是遲緩枯草桿菌-堿性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。
本發(fā)明主題的另一實(shí)施方案是由相應(yīng)的枯草桿菌蛋白酶型的堿性蛋白酶衍生的蛋白質(zhì)，特別是通過片段化或缺失突變、通過插入突變、通過取代突變或者通過至少一部分與至少另一種蛋白質(zhì)融合獲得的；這些蛋白質(zhì)附加的特征在于，它們可以額外地衍生化，它們具有蛋白酶解活性，優(yōu)選具有與起始分子或非衍生的分子相比更高的蛋白酶解活性，更特別地具有改善的功效，和/或額外地加以穩(wěn)定。
本發(fā)明的另一主題是用于編碼在本發(fā)明的主題中說明的蛋白質(zhì)的核酸，特別是編碼枯草桿菌蛋白酶的核酸，其核苷酸序列與在SEQ IDNO.3中給出的核苷酸序列一致，特別在編碼位置199異亮氨酸和位置211甘氨酸的區(qū)域中，更特別在編碼位置3蘇氨酸、位置4異亮氨酸、位置199異亮氨酸和位置211甘氨酸的區(qū)域中。
本發(fā)明的又一主題是載體，其含有上述核酸區(qū)域，特別是含有編碼在本發(fā)明第一主題中描述的任何蛋白質(zhì)或衍生物的的核酸區(qū)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，涉及克隆載體，其含有上述核酸區(qū)域，特別地含有編碼在本發(fā)明第一主題中描述的任何蛋白質(zhì)或衍生物的核酸區(qū)域；或者涉及表達(dá)載體，其包含上述核酸區(qū)域和特別地包含編碼在本發(fā)明第一主題中描述的任何蛋白質(zhì)或衍生物并使生物合成成為可能的核酸區(qū)域。
本發(fā)明的另一主題是細(xì)胞，其包含上述本發(fā)明主題的載體；其優(yōu)選表達(dá)在本發(fā)明第一主題中描述的任何蛋白質(zhì)或衍生物或者可以被誘導(dǎo)表達(dá)該蛋白質(zhì)或衍生物，特別是在使用上述表達(dá)載體的情況下；優(yōu)選其特征在于，它們是細(xì)菌，特別是那些將形成的蛋白質(zhì)分泌在周圍介質(zhì)中的細(xì)菌；優(yōu)選其特征在于，它們是芽孢桿菌屬細(xì)菌，特別是遲緩芽胞桿菌、地衣形芽胞桿菌、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)或嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)；或者其特征在于，它們是真核細(xì)胞，特別是那些翻譯后修飾形成的蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞。
本發(fā)明的另一主題是在使用上述宿主細(xì)胞和/或在使用上述載體和/或在使用上述核酸下制備本發(fā)明第一主題的蛋白酶或衍生物的方法。
本發(fā)明的又一主題是一種組合物，其特征在于，其包含本發(fā)明第一主題的蛋白酶，特別是洗滌劑或清洗劑，特別優(yōu)選是每克組合物包含2μg至20mg量的蛋白酶；優(yōu)選那些其特征在于附加地包含另一種酶，特別是其他蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶和/或脂肪酶。
本發(fā)明的另一主題是用于處理紡織原料或用于織物保養(yǎng)的組合物，其特征在于，其僅或除其它活性成分外包含本發(fā)明第一主題的蛋白酶，特別是用于具有天然成分的纖維或紡織品，更特別是用于那些含羊毛或絲的纖維或紡織品。
本發(fā)明的另一主題是機(jī)械清洗紡織品或硬表面的方法，其特征在于，在所述方法的至少一個(gè)步驟中使本發(fā)明第一主題的蛋白酶活化，優(yōu)選每次使用量是40μg至4g，特別優(yōu)選是400μg至400mg。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于處理紡織原料或用于織物保養(yǎng)的方法，其特征在于，在所述方法的至少一個(gè)步驟中使本發(fā)明第一主題的蛋白酶活化，特別是用于含有天然成分的紡織原料或織物，尤其是含有羊毛或絲的那些紡織原料或織物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明第一主題的蛋白酶的應(yīng)用，其用于清洗織物或硬質(zhì)表面，優(yōu)選每次用量為40μg至4g，特別優(yōu)選400μg至400mg。
本發(fā)明的又一主題是本發(fā)明第一主題的蛋白酶的應(yīng)用，其用于活化洗滌劑或清洗劑的成分或使其失活。
本發(fā)明的另一主題是本發(fā)明第一主題的蛋白酶的應(yīng)用，其用于生物化學(xué)分析或用于合成低分子量的化合物或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一主題是本發(fā)明第一主題的蛋白酶的應(yīng)用，其用于制備、純化或合成天然物質(zhì)或有價(jià)值的生物材料。
本發(fā)明的另一主題是本發(fā)明第一主題的蛋白酶的應(yīng)用，其用于處理天然原料，特別是用于表面處理，更特別是在處理皮革的方法中應(yīng)用。
本發(fā)明的另一主題是本發(fā)明第一主題的蛋白酶的應(yīng)用，其用于獲得或處理紡織加工中的原料或者中間產(chǎn)品，特別是用于除去織物上的保護(hù)層。
本發(fā)明的另一主題是本發(fā)明第一主題的蛋白酶的應(yīng)用，其用于處理紡織原料或用于織物保養(yǎng)，特別是用于處理羊毛或絲綢或含羊毛或絲綢的混紡織品。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明第一主題的蛋白酶的應(yīng)用，其用于處理照相膠片，特別是用于處理含明膠或類似的保護(hù)層。
本發(fā)明的另一主題是本發(fā)明第一主題的蛋白酶的應(yīng)用，其用于制備食品或動(dòng)物飼料。
本發(fā)明的另一主題是含有本發(fā)明第一主題的蛋白酶的化妝品或包含本發(fā)明第一主題的蛋白酶的化妝方法或本發(fā)明第一主題的蛋白酶用于化妝目的的應(yīng)用，特別是在相應(yīng)的方法或相應(yīng)的組合物領(lǐng)域中。
根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)表示一種由天然氨基酸組成的聚合物，基本上由直鏈構(gòu)成，并為了發(fā)揮其功能大多數(shù)呈現(xiàn)三維結(jié)構(gòu)。表1中列出了19種蛋白質(zhì)原(proteinogenen)的天然存在的L-氨基酸以及在本申請中采用的它們的縮寫即1個(gè)字母的和3個(gè)字母的代碼。
表1蛋白酶原的氨基酸
這些名稱代碼中的一種與數(shù)字組合表示在各自的位置上具有何種氨基酸殘基的特定蛋白質(zhì)。所以例如S3表示在位置3(從相關(guān)蛋白質(zhì)的N-末端開始)上的絲氨酸殘基。該位置上的點(diǎn)突變例如被氨基酸蘇氨酸代替根據(jù)該命名法可以縮寫為S3T。為了表示具有多個(gè)點(diǎn)突變的變體，相互之間的正斜線使這種替換分隔開。因此變體S3T/V4I的特征在于，先前在所述變體位置3上存在的絲氨酸被蘇氨酸代替，而位置4上的纈氨酸被異亮氨酸代替。
本發(fā)明所示的位置，除非另有說明，是指相關(guān)蛋白質(zhì)在每種情況下的成熟形式，即無信號(hào)肽(參見下文)。
在本發(fā)明的意義中，酶是指一種蛋白質(zhì)，它起著某種生化功能。蛋白酶或者具有蛋白酶解功能的酶例如，通常理解為那些水解蛋白質(zhì)的酰胺鍵(特別是那些位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的鍵)的蛋白酶或酶，因此它們也被叫做內(nèi)肽酶。枯草桿菌蛋白酶就是這樣的內(nèi)肽酶，其天然由革蘭氏陽性菌形成的并且大多數(shù)是分泌型的，或者是由其例如通過分子生物方法從后者衍生的，并且經(jīng)部分區(qū)域例如形成結(jié)構(gòu)的或者攜帶官能團(tuán)的區(qū)域與天然枯草桿菌蛋白酶成為同系物。其例如描述在R.Siezen的文章“Subtilases類枯草桿菌-蛋白酶”，《枯草桿菌酶》(“Subtilisinenzymes”)第75至95頁，由R.Bott和C.Betzel編輯，New York，1996。
很多蛋白質(zhì)，作為所謂的蛋白前體(Praproteine)，與一個(gè)信號(hào)肽一起形成。在這種情況下，信號(hào)肽表示這種蛋白的N-末端，其功能通常是保證形成的蛋白質(zhì)從生產(chǎn)細(xì)胞釋放到胞質(zhì)或者周圍的介質(zhì)中，和/或保證其正確的折疊。然后信號(hào)肽在自然狀態(tài)下被一種信號(hào)肽酶從原始蛋白上切下來，從而使蛋白在沒有N末端氨基酸的情況下具有其真正的催化活性。根據(jù)WO91/02792中的附圖1，來自遲緩芽孢桿菌DSM5483枯草桿菌蛋白酶的蛋白質(zhì)前體包含380個(gè)氨基酸，對(duì)此該成熟的蛋白質(zhì)僅包含269個(gè)氨基酸；以該成熟蛋白質(zhì)的第一個(gè)氨基酸開始編號(hào)，在這種情況下也可以從蛋白質(zhì)前體的序列以序號(hào)112丙氨酸開始編號(hào)。根據(jù)SEQ ID NO.1和2，來自地衣芽孢桿菌ATCC 68614的枯草桿菌蛋白酶的信號(hào)肽具有111個(gè)氨基酸，并且成熟肽具有269個(gè)氨基酸。正如由SEQ ID NO.2得知，在不切分的情況下，完整蛋白質(zhì)的長度為380個(gè)氨基酸。根據(jù)SEQ ID NO.3和4，這點(diǎn)同樣適合于特別優(yōu)選的實(shí)施方案。
由于它們的酶活性，成熟的肽即合成后經(jīng)處理的酶比起蛋白前體來說在工業(yè)應(yīng)用上更受青睞。
前體蛋白(Pro-Proteine)就是沒有活性的蛋白前體。其具有信號(hào)序列的前體(Vorlaufer)被稱作前體蛋白的前體(Pra-Pro-Proteine)。
在本發(fā)明的意義中，核酸是那些天然由核苷酸組成并被稱作信息載體的分子，其用于編碼蛋白質(zhì)或酶中的線性氨基酸序列。它們可能是單鏈的，也可能是互補(bǔ)于此單鏈的單鏈，或者是雙鏈。作為天然永久的信息載體，這些核酸DNA更適用于分子生物學(xué)工程。相比之下，為了在自然環(huán)境中例如在正在表達(dá)的細(xì)胞中實(shí)施本發(fā)明，形成RNA，從而對(duì)于本發(fā)明有很重要作用的RNA分子亦代表本發(fā)明的實(shí)施方案。
同樣在本發(fā)明的意義中，對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)的核酸信息單元被稱作基因。在DNA中，所有三個(gè)可能讀碼框中的兩條互補(bǔ)鏈都必須考慮到。此外，需要注意的是，不同的密碼三聯(lián)體可能編碼同一種氨基酸，因此，某種特定氨基酸序列可以從許多不同的并且也許僅有非常低同一性的核苷酸序列(遺傳密碼子的簡并性)得到。除此以外，不同的生物在應(yīng)用密碼子上也存在差異。由于這些原因，不管是氨基酸序列還是核苷酸序列都必須列入保護(hù)范圍，并且公開的核苷酸序列在每種情況下應(yīng)只被看作編碼某氨基酸序列的舉例。
在目前常用方法的幫助下，如化學(xué)合成或者聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，結(jié)合分子生物學(xué)和/或蛋白質(zhì)化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法，專業(yè)技術(shù)人員已經(jīng)能夠根據(jù)已知DNA和/或氨基酸序列生產(chǎn)完整的基因。對(duì)此理想的出發(fā)點(diǎn)是由保藏的和/或商業(yè)上可獲得的微生物制備DNA。這種方法例如公開在“Lexikon der Biochemie”，Spektrum Akademischer Verlag，Berlin，1999，Vol.1，第267-271頁和Vol.2，第227-229頁上。
核苷酸序列的變化被稱為突變，其可以通過本身已知的分子生物學(xué)方法得到。根據(jù)變化的類型，突變分為例如缺失突變、插入突變、替代突變，或者不同的基因抑或基因的不同部分被相互融合在一起(“改組”的突變)；這些就是基因突變。與此相關(guān)的生物就稱為突變體。從這些突變核酸中得到的蛋白被稱為變體。例如，缺失突變、插入突變、替代突變或者融合導(dǎo)致了基因的缺失突變、插入突變、替代突變或融合，以及在蛋白質(zhì)水平上，導(dǎo)致對(duì)應(yīng)的缺失變體、插入變體或者替代變體或者融合蛋白。
在本發(fā)明的意義中，載體被認(rèn)為是由核酸組成的元件，這些核酸包括一個(gè)目的基因作為特征核酸區(qū)。它們能夠在物種或細(xì)胞系中經(jīng)若干代或細(xì)胞分裂作為穩(wěn)定的遺傳元件建立起來，所述遺傳元件能夠獨(dú)立于基因組的其他部分復(fù)制。載體是特殊的質(zhì)粒，即環(huán)形的遺傳元件，尤其是它們被用于細(xì)菌的時(shí)候。在基因工程中，用于儲(chǔ)存進(jìn)而進(jìn)行所謂的基因操作(即所謂的克隆載體)的載體與在宿主細(xì)胞中生成目的基因即促進(jìn)特定蛋白表達(dá)的載體是有區(qū)別的。這些載體都被認(rèn)為是表達(dá)載體。
通過同源化，也就是說與已知酶比較(例如通過比對(duì)進(jìn)行)，由氨基酸或核苷酸序列得出所涉及酶的酶活性成為可能。酶活性能夠被那些不參與實(shí)際反應(yīng)的其他蛋白區(qū)域定性或者定量的修飾。這例如涉及酶穩(wěn)定性、活性、反應(yīng)條件或底物特異性。
因此，術(shù)語蛋白酶被理解為除催化活性中心的少量氨基酸殘基的功能外的所有功能，這些功能是通過整個(gè)其余蛋白質(zhì)或其余蛋白質(zhì)的一部分或大部分對(duì)真正的催化活性區(qū)域的影響而產(chǎn)生的。在本發(fā)明的意義中，這些修飾的功能或部分活性，只要它們有助于蛋白酶解反應(yīng)，單獨(dú)也被認(rèn)為是蛋白酶解活性。輔助功能或者部分活性包括，例如底物的結(jié)合、中間產(chǎn)物或者終產(chǎn)物的結(jié)合、激活或抑制或介導(dǎo)對(duì)水解活性的控制效果。因此這例如也涉及遠(yuǎn)離活性中心的結(jié)構(gòu)單元的形成。對(duì)于本發(fā)明的蛋白質(zhì)來說，第二個(gè)前提條件當(dāng)然是通過真正的活性殘基本身的化學(xué)行為或者附加地通過修飾部分的作用獲得肽鍵的水解。此外同樣可以通過例如本發(fā)明蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)部分定性或定量地修飾其它蛋白酶的活性。其它因素的影響也被認(rèn)為是蛋白酶解活性?；钚缘鞍酌竿瑯右彩悄切┢浠钚栽诮o定的時(shí)間例如通過抑制劑而封閉的酶。它們主要適于進(jìn)行相應(yīng)的蛋白酶解反應(yīng)是至關(guān)重要的。
片段是指那些比天然蛋白質(zhì)或那些對(duì)應(yīng)于完全翻譯的基因更短并且例如也可通過合成得到的任何蛋白或者肽。在氨基酸序列的基礎(chǔ)上，它們能被設(shè)計(jì)成特異的完整蛋白。例如它們可以具有相同的結(jié)構(gòu)，或可發(fā)揮蛋白水解活性或者部分活性，例如底物的絡(luò)合。片段及初始蛋白的缺失變體基本上是一樣的。然而，片段是相對(duì)較小的，缺失變體只是缺失小區(qū)域因此僅缺乏個(gè)別的部分功能。
在本發(fā)明的意義中，嵌合或者雜交蛋白是由那些來自相同或不同生物的不同多肽鏈天然產(chǎn)生的元件組成的蛋白。這個(gè)過程也就是改組或融合突變。融合的目的是例如，在融合部分本發(fā)明的蛋白的幫助下生成或者修飾某種酶的功能。因此在本發(fā)明的意義中，這樣的嵌合蛋白是否由單個(gè)的多肽鏈或者多個(gè)承擔(dān)不同功能的亞基組成是不重要的。為了實(shí)現(xiàn)最后提及的這種方案，有可能例如可以翻譯后或者在純化步驟之后馬上通過有針對(duì)性的蛋白酶切割將單個(gè)的嵌合多肽鏈拆成多個(gè)多肽鏈。
通過插入突變得到的蛋白被稱為是變體，這種變體能夠通過本身已知的方法把核酸或蛋白片段插入到起始序列中而得到。因?yàn)樗鼈兓臼且恢碌?，它們能被置于一個(gè)嵌合蛋白中，在這些嵌合蛋白中，區(qū)別僅在于蛋白的不變部分與整個(gè)蛋白的大小比例不同。在插入突變蛋白中，外源蛋白的比例低于嵌合蛋白。
倒置突變，即部分序列的倒置，被看作一種缺失和插入的特殊形式。同樣適用于分子不同部分的重組，這與原始的氨基酸序列相異。這也可以被看作是一種缺失變體，作為原始蛋白的插入變體或者改組變體。
在本發(fā)明的意義中，衍生物是指其純的氨基酸鏈已經(jīng)化學(xué)修飾的蛋白。這種衍生化作用可通過宿主生物以生物方法結(jié)合蛋白合成進(jìn)行。分子生物學(xué)的方法可以用于此目的。這些衍生物也可以化學(xué)方法來實(shí)施，例如根據(jù)發(fā)明將氨基酸的側(cè)鏈化學(xué)轉(zhuǎn)化或者通過共價(jià)結(jié)合將另一個(gè)化合物結(jié)合到蛋白上。該化合物可以是如通過雙官能化合物與根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白結(jié)合的另一蛋白。當(dāng)結(jié)合的底物是抑制劑時(shí)，這種修飾例如可以影響底物的特異性或者與該底物的結(jié)合強(qiáng)度，或者導(dǎo)致酶活性的暫時(shí)性凍結(jié)。例如對(duì)于存放的時(shí)間也是這樣的。衍生化作用也被認(rèn)為包括對(duì)大分子載體地共價(jià)結(jié)合。
在本發(fā)明的意義中，所有的酶、蛋白、片段及衍生物被集體的冠以蛋白的上位概念，除非它們需要清晰的指稱。
酶的功效在各種情形下被認(rèn)為是在所屬技術(shù)領(lǐng)域里的效能。這是基于實(shí)際的酶解活性，但是也依賴于其他與這個(gè)過程相關(guān)的因素。這些因素包括穩(wěn)定性、底物結(jié)合、與攜底物的物質(zhì)相互作用或與其他成分相互作用，尤其是協(xié)同作用。
在本發(fā)明的意義中，洗滌劑的洗滌或潔凈功效是指所涉及的洗滌劑對(duì)污染的物品例如織物或者具有硬表面的物體所發(fā)揮的效果。評(píng)價(jià)這種洗滌劑中的單個(gè)組分例如單個(gè)酶對(duì)整個(gè)洗滌劑的洗滌和潔凈功效的作用。畢竟由一種酶的酶解性能不能不加考慮地推斷出其它酶對(duì)洗滌劑的洗滌功效的作用。這里在除去污物時(shí)，其它的因素例如穩(wěn)定性、底物結(jié)合、洗滌物與洗滌劑的其它成分的結(jié)合和相互作用，尤其是協(xié)同作用也起重要作用。
依據(jù)1977年4月28日布達(dá)佩斯條約微生物保藏的國際認(rèn)可，下面與公布WO91/02792的微生物于1989年8月10日保藏在不倫瑞克(Braunschweig)的德意志微生物保藏中心(the Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)遲緩芽孢桿菌DSM5483。其在這里的保藏號(hào)是DSM 5483(PA5-A0155，菌株2-1)。與這種生物材料的特點(diǎn)相關(guān)的重要數(shù)據(jù)，列于WO91/02792的表1中(第5至7頁)。由該生物獲得的與本申請?zhí)貏e相關(guān)的堿性蛋白酶的DNA和氨基酸序列分別由SEQ ID NO106和SEQ ID NO52獲知。
根據(jù)來源于遲緩芽胞桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的編號(hào)(WO92/21760)，該成熟蛋白質(zhì)的位置3、4、199和211對(duì)本發(fā)明是特別重要的。根據(jù)表2，這些位置與最重要的枯草桿菌蛋白酶的位置是同源的；該同源性也轉(zhuǎn)錄到所有其它的枯草桿菌蛋白酶上。所以，例如在R.Bott和C.Betzel編輯的“Subtilases類枯草桿菌-蛋白酶”第75至95頁的R.Siezen的文章《枯草桿菌酶》(“Subtilisin enzymes”)(NewYork，1996)中描述了20個(gè)以上相關(guān)枯草桿菌蛋白酶與枯草桿菌蛋白酶BPN’的已知序列的比對(duì)。
表24個(gè)對(duì)本發(fā)明特別重要的位置的同源性
本發(fā)明的遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶-變體的氨基酸序列與這些重要的開始描述的枯草桿菌蛋白酶即枯草桿菌蛋白酶309(Savinase)、枯草桿菌蛋白酶PB92、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg和枯草桿菌蛋白酶BPN’的比對(duì)同樣列于本申請的附圖1中。
基于各種已知的枯草桿菌蛋白酶之間高度的結(jié)構(gòu)同源性和其發(fā)揮的水解內(nèi)源性酰胺鍵的相同反應(yīng)機(jī)理可以預(yù)料到，上述點(diǎn)突變在每種情況下在相關(guān)分子的前后顯示出可比的作用。特別地根據(jù)本申請的教導(dǎo)可以預(yù)料到，在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)鑒于其在洗滌劑和清洗劑中的應(yīng)用而被研制的枯草桿菌蛋白酶是通過采用這種點(diǎn)突變來進(jìn)一步改善其對(duì)洗滌和/或清洗功效的作用。
特別地，在同源位置上采用氨基酸異亮氨酸199和甘氨酸211有助于提高現(xiàn)有技術(shù)已知酶對(duì)洗滌劑和/或清洗劑中的洗滌和/或清洗功效的作用。然而，根據(jù)對(duì)來源于遲緩芽胞桿菌的堿性蛋白酶的經(jīng)驗(yàn)，相關(guān)分子的至少一個(gè)附加的穩(wěn)定作用氨基酸有益于替換。
具有氨基酸位置199I和211G的本發(fā)明蛋白酶的穩(wěn)定性例如可以通過連接在聚合物上來提高。這樣的一種方法例如描述在US 5230891中。其要求該蛋白質(zhì)在相應(yīng)的組合物中使用之前，經(jīng)化學(xué)鍵合步驟結(jié)合在這種聚合物上。
優(yōu)選的穩(wěn)定作用本身是通過分子的點(diǎn)突變進(jìn)行的。因?yàn)檫@樣在獲得蛋白質(zhì)之后就無需其它的加工步驟。對(duì)此適合的幾種點(diǎn)突變是現(xiàn)有技術(shù)本身已知的。所以，可以根據(jù)US 6087315和US 6110884這樣來穩(wěn)定該蛋白酶，即將一定的酪氨酸殘基與其它殘基交換。本發(fā)明的由遲緩芽胞桿菌衍生的蛋白質(zhì)上的應(yīng)用將意味著SEQ ID NO.2的位置89、161、165、208和257中的酪氨酸殘基的交換；在遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶的其它兩個(gè)這里描述的位置反正已經(jīng)被酪氨酸占據(jù)。
其它的可能性例如是—根據(jù)EP 583339一定的氨基酸殘基與脯氨酸交換；這對(duì)于由遲緩芽胞桿菌衍生的酶來說，意味著替換S55P、A96P、A166P、A188P和/或S253P；—根據(jù)EP 995801在分子表面上引入極性的或帶電荷的基團(tuán)；—例如根據(jù)公布WO88/08028和WO88/08033的教導(dǎo)，改變金屬離子的結(jié)合，特別是鈣的結(jié)合位置。根據(jù)這些申請的第一個(gè)，一個(gè)或多個(gè)參與鈣結(jié)合的氨基酸殘基被帶負(fù)電荷的氨基酸替換。根據(jù)這些申請的第二個(gè)，同時(shí)在這兩個(gè)殘基精氨酸/甘氨酸的序列的至少一個(gè)序列中進(jìn)行點(diǎn)突變；例如在來源于遲緩芽胞桿菌的枯草桿菌蛋白酶中，這涉及在位置60/61、115/116和212/213中的NG序列。
—根據(jù)US 5453372，可以通過在表面上的一定突變來保護(hù)蛋白質(zhì)免受變性劑例如表面活性劑的影響。在遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶中位置134、155、158、164、188和/或189對(duì)應(yīng)于這里描述的位置。另一可比的可能性描述在專利US 5340735、US 5500364、US 5985639和US 6136553中。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸殘基的穩(wěn)定作用是按照來源于遲緩芽胞桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的編號(hào)通過在位置3上的蘇氨酸和/或在位置4上的異亮氨酸來進(jìn)行的。
在本發(fā)明的實(shí)施例中研究的變體可以推測出，為了在與氨基酸199I和211G的相互配合中賦予它們改善的洗滌功效，其提高的穩(wěn)定性是決定性的因素，與這種理論無關(guān)，所有的其特征在于根據(jù)來源于遲緩芽胞桿菌DSM 5483的編號(hào)其在位置199上具有異亮氨酸和在位置211上具有甘氨酸和附加地具有在位置3上的蘇氨酸和在位置4的異亮氨酸這兩個(gè)氨基酸中的一個(gè)的枯草桿菌蛋白酶類的蛋白酶是解決本發(fā)明目的的手段。
此外，優(yōu)選這種變體，其除具有位置199異亮氨酸和位置211甘氨酸外，不但具有在位置3上的蘇氨酸還具有在位置4上的異亮氨酸。
優(yōu)選這樣的堿性蛋白酶(由芽胞桿菌天然形成或者由其衍生)的相應(yīng)變體。因?yàn)檠堪麠U菌-蛋白酶一開始對(duì)各種不同的工業(yè)應(yīng)用來說就具有有利的性能。對(duì)此包括一定的耐溫度、抗氧化或變性劑的穩(wěn)定性。此外，人們在微生物蛋白酶上獲得許多有關(guān)它們的生物技術(shù)制備方法方面的經(jīng)驗(yàn)，這些技術(shù)例如涉及合適克隆載體的構(gòu)建、宿主細(xì)胞和發(fā)酵條件的選擇或風(fēng)險(xiǎn)例如變應(yīng)原活性(Allergenizitat)的評(píng)估。
特別地，現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)確立了來源于遲緩芽胞桿菌的枯草桿菌蛋白酶或者由遲緩芽胞桿菌天然形成的蛋白酶衍生的枯草桿菌蛋白酶例如用于洗滌劑和清洗劑中。對(duì)此包括上面提及的蛋白酶枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309和遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶。根據(jù)本發(fā)明，人們獲得的制備和使用這些酶的豐富經(jīng)驗(yàn)有利于這些酶的進(jìn)一步開發(fā)。對(duì)此例如包括其與其它化合物例如洗滌劑或清洗劑的成分的配伍性。
特別優(yōu)選的實(shí)施方案涉及本發(fā)明的蛋白酶，其是從由遲緩芽胞桿菌DSM 5483形成的蛋白酶衍生的。其中例如包括那些在公布WO92/21760或95/23221或WO98/30669中描述的。本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是具有本發(fā)明的在第199、211、3和/或位置4中的取代的酶的進(jìn)一步開發(fā)。
在本申請中研究的遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G是來源于遲緩芽胞桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的進(jìn)一步開發(fā)，其在公布WO92/21760的序列表中以SEQ IDNO52公開了氨基酸序列和以SEQ ID NO106公開了核苷酸序列。
對(duì)于這種新的變體來說，可以確定其對(duì)洗滌劑或清洗劑的洗滌和清洗功效的作用大于可比的并在現(xiàn)有技術(shù)中也用于該目的的遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶F49和Savinase(實(shí)施例2至5)。在序列表中，這種變體的氨基酸序列在編號(hào)SEQ ID NO.2下給出。在序列表中編碼氨基酸-序列的基因在編號(hào)SEQ ID NO.1下給出。此外，由于遺傳密碼的簡并性，可以設(shè)想到許多其它的同樣編碼所述變體的核酸，并且它們也是本發(fā)明主題中的一種優(yōu)選的替代實(shí)施方式。
形成在序列表中給出的DNA序列和氨基酸序列的遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶變體S3T/V4I/V199I/L211G的細(xì)菌，特別是芽胞桿菌菌株，例如是根據(jù)本申請的實(shí)施例1中描述的方法制備的。
通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的分子生物方法可以由迄今為止已知的堿性蛋白酶獲得其它的蛋白質(zhì)。這些方法例如詳細(xì)描述在Fritsch，Sambrook和Maniatis編的“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(Molecular cloninga laboratorymanual)”，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York，1989中。
對(duì)此例如包括經(jīng)取代誘變或經(jīng)其它點(diǎn)突變被賦予其在特殊應(yīng)用中的附加的性能的變體，例如同WO00/36069中所公開的，由于改變表面電荷，或者同WO99/27082中所公開的，由于改變參與催化或底物結(jié)合的環(huán)。同樣也可以使該變體的較大的部分區(qū)域經(jīng)歷誘變。所以例如片段形成或缺失誘變的目的是選擇蛋白酶的特定的部分功能或者相反將部分功能排除在外，例如底物結(jié)合或經(jīng)分子的某些區(qū)域產(chǎn)生的與其它化合物的相互作用。
通過插入、取代或融合可以使本發(fā)明的蛋白酶具有附加的功能。其中例如可以設(shè)想到在某些結(jié)構(gòu)域上的連接，例如同公布WO99/57154至WO99/57159中描述的在纖維素-結(jié)合-結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。其中描述的氨基酸接頭可以通過由蛋白酶、接頭-區(qū)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成同一的融合蛋白而實(shí)現(xiàn)。這樣的結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可以由同樣的或其它的蛋白酶產(chǎn)生，以便增強(qiáng)本發(fā)明的蛋白酶在蛋白酶底物上的結(jié)合。這可以提高局部蛋白酶濃度，而該濃度的提高在單一的應(yīng)用中是有利的，例如在處理原材料時(shí)。
提及的蛋白酶可以進(jìn)一步被衍生化，特別地以便使其對(duì)于各自的應(yīng)用目的來說最佳化。其中涉及例如描述在申請DE 40 13 142中的化學(xué)修飾。其例如可以通過連接低或高分子量的化合物來改性，例如可以通過不同的有機(jī)體與蛋白質(zhì)生物合成相結(jié)合自然地進(jìn)行，如在合成時(shí)通過真核宿主細(xì)胞在N-末端附近連接脂肪酸自由基或者糖基化作用。因此本發(fā)明的實(shí)施方案還是被進(jìn)一步衍生化的蛋白酶或片段。
與本發(fā)明的蛋白質(zhì)在洗滌劑或清洗劑中的應(yīng)用相關(guān)，例如與其它具有洗滌活性的物質(zhì)或酶的連接是特別有意義的?？杀鹊倪B接-附著物(Ansatze)例如描述在專利公布WO00/18865和WO00/57155中的纖維素-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。與此類似，也可以連接在大分子化合物上，例如一些聚乙二醇，以修飾該分子的其它性能例如穩(wěn)定性或皮膚相容性。這樣的修飾例如描述在專利US 5230891中，以便使所述的蛋白酶更適合于在化妝品中使用。
本發(fā)明蛋白質(zhì)的衍生化在最廣義上是這些酶的制備。根據(jù)蛋白質(zhì)的獲得、加工或制備可以使其中的一種蛋白質(zhì)與其它不同物質(zhì)結(jié)合，例如來自可生產(chǎn)的微生物的培養(yǎng)物。因?yàn)榭缮a(chǎn)蛋白酶的微生物的培養(yǎng)上清液已經(jīng)具有蛋白酶解活性，這表明粗的提取物已經(jīng)具有相應(yīng)的用途，例如用于使其它蛋白原失去活性。
例如為了增加蛋白質(zhì)的存儲(chǔ)穩(wěn)定性，可以將某些其他物質(zhì)有針對(duì)性地加入到其中，因此本發(fā)明特有的蛋白質(zhì)的所有制品也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這也與蛋白質(zhì)在某一制品中實(shí)際上是否發(fā)揮酶活性無關(guān)。因?yàn)橛锌赡苄枰鞍踪|(zhì)在儲(chǔ)藏階段沒有或具有很少活性，而僅僅在使用時(shí)發(fā)揮其蛋白酶解功能。這取決于，例如，蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)，或可能產(chǎn)生于源自制品中的一種或多種伴隨物質(zhì)與本發(fā)明蛋白質(zhì)的可逆結(jié)合。特別地，蛋白酶與蛋白酶抑制劑的結(jié)合制品是現(xiàn)有技術(shù)中已知的(WO00/01826)。其中也涉及抑制劑經(jīng)接頭，特別是氨基酸接頭連接在各自蛋白酶上的融合蛋白質(zhì)(WO00/01831)。
當(dāng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)一步產(chǎn)生蛋白酶解活性時(shí)，上述本發(fā)明蛋白質(zhì)的進(jìn)一步開發(fā)、衍生化和制備是特別希望的，因?yàn)檫@是其在本發(fā)明中應(yīng)用的前提條件。優(yōu)選通過所有類型的突變和/或衍生化獲得的蛋白酶與起始分子或未衍生化的分子相比具有提高的蛋白酶解活性，并且特別地在其各自預(yù)期的工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域具有改善的功效。對(duì)此特別地包括在洗滌劑或清洗劑中應(yīng)用時(shí)其洗滌和/或清洗功效的改善。
這點(diǎn)例如通過本發(fā)明的點(diǎn)突變與其它涉及催化反應(yīng)(例如在活性中心)點(diǎn)突變的組合是可能的。所以例如根據(jù)公布WO95/30011的教導(dǎo)，本發(fā)明的蛋白酶(其是由遲緩芽胞桿菌-枯草蛋白酶衍生的)在環(huán)-區(qū)域突變或者導(dǎo)入其他氨基酸是可能的。這種研究例如描述在以下列公開的申請中WO00/37599、WO00/37621至WO00/37627和WO00/71683至WO00/71691中。
在反應(yīng)介質(zhì)中與其它活性化合物相互作用并因此例如通過折疊作用影響整個(gè)反應(yīng)的酶區(qū)域的缺失是一種所需的進(jìn)一步開發(fā)。類似地，可以設(shè)想與其它活性酶例如與其它蛋白酶的融合來提高水解速率。
例如，在儲(chǔ)存期間，通過抑制劑的結(jié)合，蛋白酶解活性的可逆阻斷可以終止自動(dòng)蛋白酶解，并因此在反應(yīng)介質(zhì)中稀釋時(shí)產(chǎn)生高的蛋白酶解率。例如在純化過程中，與特定的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的連接可以相對(duì)于在洗液中的蛋白酶濃度來說提高底物附近的蛋白酶濃度，并因此提高蛋白酶對(duì)該洗滌劑功效的作用。
由現(xiàn)有技術(shù)已知，有許多提高酶，特別是在洗滌劑和清洗劑中使用的酶的穩(wěn)定性的可能性(參見上文)。其中出于實(shí)用性的理由，基于點(diǎn)突變的方法特別是本發(fā)明相關(guān)的。所有上面已經(jīng)描述的可能性可以相互組合用于本發(fā)明的變體。因?yàn)楦鶕?jù)WO89/09819可以假設(shè)多個(gè)起穩(wěn)定作用的突變具有疊加效果。所以本發(fā)明的變體已經(jīng)通過兩個(gè)氨基酸3T或4I中的一個(gè)或兩個(gè)穩(wěn)定，可以通過連接在聚合物上進(jìn)一步來穩(wěn)定。但是其也可以在該分子的其它位置具有起穩(wěn)定作用的突變，例如通過一個(gè)或多個(gè)上述酪氨酸殘基的取代引入特定的脯氨酸殘基，改變表面電荷或者改變鈣的結(jié)合部位。
核酸形成了蛋白質(zhì)以及其生產(chǎn)的幾乎所有常見分子生物學(xué)研究和發(fā)展的起點(diǎn)。對(duì)此特別地包括基因的序列測定和對(duì)應(yīng)氨基酸序列的衍生、誘變的每種方式和蛋白質(zhì)的表達(dá)。例如在Fritsch，Sambrook和Maniatis編的“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊”，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，New York，1989中描述了這樣的方法。因此用于編碼本發(fā)明第一主題的蛋白質(zhì)或其衍生物的核酸構(gòu)成本發(fā)明的第二主題。
在DNA水平上，本發(fā)明的蛋白質(zhì)通過所有通常概括為術(shù)語“蛋白質(zhì)工程”的方法進(jìn)一步被優(yōu)化用作各種用途。特別有可能在蛋白質(zhì)的水平上獲得下列性能改善衍生蛋白質(zhì)的抗氧化性、對(duì)變性劑或蛋白酶、高溫、酸或強(qiáng)堿條件的穩(wěn)定性、對(duì)鈣或其它輔因子的敏感性的改變、免疫原性或變應(yīng)原作用的降低。
本發(fā)明突變的基因包括例如那些對(duì)個(gè)別的有針對(duì)性的堿基替換或隨機(jī)點(diǎn)突變、個(gè)別堿基或部分序列缺失，同其他基因或基因片段融合或者倒置負(fù)責(zé)的基因。這些突變或者修飾可以使由相關(guān)的核酸衍生的酶更適合特定的應(yīng)用。這樣的誘變能夠有目的地進(jìn)行，或者通過隨機(jī)方法，例如利用隨后以活性為目標(biāo)的對(duì)克隆基因識(shí)別和/或篩選和選擇方法來進(jìn)行。
特別地在用于編碼蛋白質(zhì)片段的核酸的情況下，不但在有義而且在反義定向中考慮所有的三個(gè)讀碼框。因?yàn)檫@些寡核苷酸可以通過聚合酶-鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)作為出發(fā)點(diǎn)來合成相關(guān)的核酸。這樣的寡核苷酸，特別地在它們覆蓋對(duì)應(yīng)于四個(gè)氨基酸位置3、4、199和/或211的任何區(qū)域時(shí)，明顯屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。這同樣適用于那些恰好在這些位置具有可變序列的那些寡核苷酸。所以在許多引物的群體內(nèi)部同樣存在至少一個(gè)用來編碼對(duì)這些位置來說相應(yīng)于SEQ ID NO.3的部分序列的寡核苷酸。這同樣適用于反義寡核苷酸，例如用于調(diào)節(jié)表達(dá)的反義寡核苷酸。
本發(fā)明蛋白酶的進(jìn)一步研究方向特別地可以在公開出版物P.N.Bryan《蛋白質(zhì)工程》(“Protein engineering”)(2000)，Biochim.Biophys.Acta，第1543卷，第203至222頁中介紹的觀點(diǎn)中獲得。
優(yōu)選用于編碼枯草桿菌蛋白酶-蛋白酶的核酸，其核苷酸序列與在SEQ ID NO.3中給出的核苷酸序列相符。這特別地適用于編碼位置199異亮氨酸和位置211甘氨酸的區(qū)域，更特別地適用于編碼位置3蘇氨酸、位置4異亮氨酸、位置199異亮氨酸和位置211甘氨酸的區(qū)域。
這優(yōu)選適用于那些由遲緩芽胞桿菌-蛋白酶的序列導(dǎo)出的寡核苷酸，并且特別在其是由遲緩芽胞桿菌DSM 5483-蛋白酶的序列衍生的寡核苷酸時(shí)。在特別優(yōu)選的情況下，該核酸編碼本發(fā)明的變體遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G和/或與在SEQ ID NO.3中給出的核苷酸序列相符。
用于編碼蛋白酶解活性的插入或融合突變體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所以對(duì)這些活性負(fù)責(zé)的區(qū)域例如可以與纖維素結(jié)合的結(jié)構(gòu)域融合或者在催化的非活性區(qū)域中具有點(diǎn)突變，以便將產(chǎn)生的蛋白質(zhì)連接在聚合物上或者以便降低其變應(yīng)原活性。
為了使用本發(fā)明相關(guān)的核酸，以適合的方式將它們連接在載體中。這些載體包括例如來自細(xì)菌質(zhì)粒、來自病毒或細(xì)菌噬菌體的那些載體或者主要是合成的載體。它們成為有關(guān)基因、其表達(dá)或者所屬蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)和生化研究的起點(diǎn)。因此本發(fā)明的主題是包含上述核酸分子特別是那些用于編碼上述蛋白酶的核酸分子的載體。
本發(fā)明主題優(yōu)選的實(shí)施方案是克隆載體。除了儲(chǔ)藏、生物擴(kuò)增和篩選目的基因以外，克隆載體適于特定基因的分子生物學(xué)特征。同時(shí)它們是要求保護(hù)的核酸的可轉(zhuǎn)運(yùn)和可儲(chǔ)存形式，并且它們也是分子生物技術(shù)優(yōu)選的起點(diǎn)，這些分子生物技術(shù)不局限于細(xì)胞，例如PCR或體外誘變方法。優(yōu)選的克隆載體含有用于編碼上述蛋白酶的核酸區(qū)域。
本發(fā)明的表達(dá)載體是在生物生產(chǎn)體系中實(shí)施本發(fā)明第二主題的核酸并因此制備本發(fā)明主題的蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)。本發(fā)明主題的優(yōu)選實(shí)施方案是表達(dá)載體，它們自己攜帶對(duì)表達(dá)必須的基因元件，例如原先位于基因上游的天然啟動(dòng)子或來自其它生物體的啟動(dòng)子。這些元件例如能以所謂表達(dá)盒的形式安裝。優(yōu)選這些表達(dá)載體包含用于編碼上述蛋白酶的核酸區(qū)域。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是細(xì)胞，其包含本發(fā)明第三主題的載體。該細(xì)胞例如使相應(yīng)基因的擴(kuò)增以及突變或者轉(zhuǎn)錄和翻譯和最后的生物技術(shù)的生產(chǎn)成為可能，因此形成了本發(fā)明的微生物學(xué)范圍。
本發(fā)明主題的實(shí)施方案是宿主細(xì)胞，其表達(dá)本發(fā)明的任何蛋白質(zhì)或者能夠被誘導(dǎo)來表達(dá)該蛋白質(zhì)，因此它們使其的生物技術(shù)制備成為可能。對(duì)此它們必須包含以適合的方式經(jīng)載體獲得相關(guān)的基因，也就是說它們被轉(zhuǎn)化為相關(guān)的基因。這種載體可以在宿主細(xì)胞中染色體外作為單獨(dú)的遺傳因子存在或者被整合在染色體中，其中優(yōu)選上述任一種表達(dá)載體。
原則上，合適的宿主細(xì)胞包括所有生物，即原核生物、真核細(xì)胞或藍(lán)藻。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是那些容易進(jìn)行遺傳操作的細(xì)胞，例如就其表達(dá)載體轉(zhuǎn)化及其穩(wěn)定建立而言，如單細(xì)胞的真菌或者細(xì)菌。此外，優(yōu)選的宿主細(xì)胞的特征在于容易進(jìn)行微生物和生物技術(shù)操作。這包括例如易培養(yǎng)、高生長率、對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的要求很低、產(chǎn)量高以及對(duì)外源蛋白質(zhì)的分泌速率。特定個(gè)例的最佳表達(dá)系統(tǒng)往往需要從現(xiàn)有技術(shù)所提供的大量不同的系統(tǒng)中通過試驗(yàn)確定。通過這種方法，本發(fā)明的每個(gè)蛋白質(zhì)可以從大量宿主生物中得到。
優(yōu)先的實(shí)施方案是宿主細(xì)胞，它們的活性可以通過基因調(diào)節(jié)元件進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如通過受控添加化學(xué)物質(zhì)，通過改變培養(yǎng)條件或者根據(jù)細(xì)胞密度。這種可控的表達(dá)使特別經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)成為可能。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是細(xì)菌，特別是那些將所形成的蛋白質(zhì)分泌到周圍介質(zhì)中的細(xì)菌，這是由于細(xì)菌的特點(diǎn)在于具有更短的換代時(shí)間和對(duì)培養(yǎng)條件的要求低。因此可以獲得一種低成本的方法。在革蘭氏陰性細(xì)菌例如大腸桿菌(E.coli)的情況下，大量的蛋白質(zhì)被分泌到周質(zhì)體空間中。這對(duì)于特定的應(yīng)用是有利的。與此相反，革蘭氏陽性細(xì)菌例如芽孢桿菌將分泌的蛋白質(zhì)立即保存在該細(xì)胞周圍的營養(yǎng)介質(zhì)中，按照本發(fā)明的另一實(shí)施方案直接從中純化出表達(dá)的本發(fā)明的蛋白質(zhì)。在公布WO01/81597中也公開了一種方法，按照該方法可以使革蘭氏陰性細(xì)菌分泌出表達(dá)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案使用遲緩芽孢桿菌DSM 5483本身，以同源性表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。然而，與此相反優(yōu)選異源表達(dá)。對(duì)于異源表達(dá)，優(yōu)選的細(xì)菌包括芽孢桿菌屬，特別是地衣芽孢桿菌、液化芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或者其它的種或者嗜堿芽孢桿菌菌株。因?yàn)檫@些菌本身形成可比的枯草桿菌蛋白酶，所以通過該方法可以獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)與由宿主菌株內(nèi)源形成的枯草桿菌蛋白酶的混合物。這樣的一種遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶在地衣芽胞桿菌ATCC 53926中的共表達(dá)例如描述在公布WO91/02792(EP 493398 B1)中；這里存在許多可能的表達(dá)載體。可以預(yù)料到，在這種載體的幫助下和/或在這種宿主體系中可以制備本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)的變體，特別是由遲緩芽胞桿菌那些變體，更特別是由遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。
本發(fā)明主題另一優(yōu)選的實(shí)施方案是真核宿主細(xì)胞，特別是那些翻譯后修飾形成蛋白質(zhì)的細(xì)胞。適合的真核細(xì)胞的實(shí)例是真菌例如放線菌(Actinomyceten)或者酶母如糖酵母(Saccharomyces)或克魯伯氏酵母(Kluyveromyces)。這種體系特別地與蛋白質(zhì)合成一起進(jìn)行的這種修飾包括例如低分子量化合物的結(jié)合，例如膜錨分子或寡糖。這種寡糖修飾例如對(duì)于所制備的蛋白質(zhì)的變應(yīng)原活性(Allergenizitaet)的降低來說是希望的。
本發(fā)明獨(dú)特的主題是制備本發(fā)明的蛋白酶或衍生物的方法。所以例如借助于上述DNA和氨基酸序列(它們可以由序列表獲得)按照本身已知的分子生物方法有可能合成相應(yīng)的寡肽和寡核苷酸直至完整的基因和蛋白質(zhì)。從已知的生產(chǎn)枯草桿菌蛋白酶的微生物出發(fā)可以進(jìn)一步分離出其它的天然產(chǎn)物，以測定其枯草桿菌蛋白酶序列，以及根據(jù)本文所述的指南進(jìn)一步照它們加以開發(fā)。對(duì)于相應(yīng)的制備方法可以培養(yǎng)這種細(xì)菌并加以利用。類似地，按照例如在公布WO91/02792中公開的載體的模式，可以開發(fā)出一種新的表達(dá)載體。本發(fā)明的實(shí)施方案在所附的核酸序列的基礎(chǔ)上是無細(xì)胞的表達(dá)體系，其中蛋白質(zhì)生物合成在體外實(shí)施。所有上面已經(jīng)描述的元件同樣也組合成新的方法，以便制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)。因此對(duì)于本發(fā)明的每個(gè)蛋白質(zhì)來說可以想象出許多可能的方法步驟的組合，所以應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定每個(gè)具體個(gè)案的最佳的方法。
本發(fā)明的獨(dú)特的主題是組合物，其特征在于含有本發(fā)明的蛋白酶。
本發(fā)明酶的幾乎所有可能的工業(yè)應(yīng)用均取決于在相應(yīng)介質(zhì)中使用功能性的酶。所以例如微生物可能的應(yīng)用渴望一種組合物，其中該酶通常以預(yù)先制備的高純度形式與所需的反應(yīng)組分或助劑結(jié)合在一起。用于處理原材料或用于化妝品制品的組合物同樣是以其特殊配方為特征的。根據(jù)本發(fā)明，所有的這些配方均應(yīng)該是具有本發(fā)明酶的組合物。
本發(fā)明主題的優(yōu)選實(shí)施方案是洗滌劑或清洗劑。因?yàn)椋缭诒景l(fā)明的實(shí)施例中所說明的一樣，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，從遲緩芽胞桿菌DSM5483獲得的枯草桿菌蛋白酶-變體199I/211G(根據(jù)遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶的編號(hào))和具有替換S3T/V4I/V199I/L211G的遲緩芽胞桿菌-變體對(duì)各種污漬提供了明顯提高的功效(對(duì)比實(shí)施例2和3)。這在使用相同活性下超過確定的洗滌劑-蛋白酶的水平。這同樣有利于相應(yīng)的洗碗機(jī)用組合物(對(duì)比實(shí)施例4和5)。這種效果不但在不同的溫度下而且在不同的濃度下均是可再現(xiàn)的。
所有可能類型的洗滌劑，既包括濃縮物也包括不用稀釋加以使用的組合物均屬于本發(fā)明的主題；商業(yè)規(guī)模的使用，用于洗衣機(jī)或用于手洗。對(duì)此包括例如用于織物、地毯或天然纖維的洗滌劑，按照本發(fā)明對(duì)此使用術(shù)語洗滌劑。它們也包括例如用于洗碗機(jī)或手工洗碗的洗滌劑或用于硬表面，例如金屬、玻璃器皿、瓷器、陶器、瓦片、寶石、涂漆面、塑料、木制品或皮革的清洗劑。對(duì)于這些來說，根據(jù)本發(fā)明使用術(shù)語清洗劑。任何類型的清洗劑都是本發(fā)明的實(shí)施方案，只要其中加入本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的實(shí)施方案包含所有按照現(xiàn)有技術(shù)中確定的和/或所有適當(dāng)?shù)谋景l(fā)明組合物的提供形式。這些包括例如固體、粉末、液體、膠狀或膏狀組合物，如果需要由若干相組成，擠壓式或非擠壓式。此外提供形式還包括包裝在大容器內(nèi)和一份中的壓出膠、顆粒、片劑及小袋。
本發(fā)明的組合物包含本發(fā)明的酶，每克組合物中其用量是2μg至20mg，并且越來越優(yōu)選的是5μg至17.5mg，20μg至15mg，50μg至10mg，100μg至7.5mg，200μg至5mg，以及500μg至1mg。因此可以推出每次應(yīng)用的用量是40μg至4g，更優(yōu)選是50μg至3g，100μg至2g，200μg至1g，以及特別優(yōu)選是400μg至400mg。
這種組合物的蛋白酶活性可以按照在《表面活性劑》(Tenside)第7卷(1970)第125至132頁中描述的方法測定。與此相應(yīng)，該蛋白酶單位是以PE(蛋白酶-單元)給出的。該組合物的蛋白酶活性總計(jì)達(dá)每克組合物1,500,000蛋白酶單位。
除了對(duì)本發(fā)明必需的酶之外，本發(fā)明的洗滌劑任選包含其他成分，例如表面活性劑，如非離子、陰離子和/或兩性表面活性劑和/或漂白劑和/或助洗劑以及任選其他常規(guī)成分。
優(yōu)選的非離子表面活性劑為烷氧基化的，有利的是乙氧基化的，特別優(yōu)選含有8-18個(gè)碳原子以及平均每mol醇1-12mol環(huán)氧乙烷(EO)的伯醇，其中醇?xì)埢梢允侵辨湹?，或?yōu)選在位置2上被甲基支化的，優(yōu)選以混合形式含有直鏈和甲基支鏈的殘基，所以其通常以羰基合成醇?xì)埢嬖?。然而，尤其?yōu)選的是包含具有12-18碳原子、天然來源的醇的直鏈殘基以及平均每mol醇2-8 EO的脂肪醇乙氧基化物，例如椰子油醇、棕櫚油醇、牛油醇或油醇。優(yōu)選的乙氧基化醇包括，例如含有3或4 EO的C12-14醇、含有7EO的C9-11醇、含有3EO、5EO、7 EO或8EO的C13-15醇、含有3EO、5EO或7 EO的C12-18醇及其混合物，例如含有3 EO的C12-14醇和含有5 EO的C12-18醇的混合物。上述乙氧化的程度是統(tǒng)計(jì)平均值，對(duì)于特殊產(chǎn)品來說，這個(gè)平均值可能是整數(shù)或分?jǐn)?shù)。優(yōu)選的醇乙氧基化物具有窄的同系物分布(窄范圍乙氧基化物，NRE)。除了這些非離子表面活性劑之外，也可以使用高于12EO的脂肪醇。這類脂肪醇的例子是包含14 EO、25 EO、30 EO或40 EO的牛油醇。
另一類或作為非離子表面活性劑單用或與其他非離子表面活性劑合用的優(yōu)選非離子表面活性劑是烷氧基化的、優(yōu)選乙氧基化的、或乙氧基化和丙氧基化的優(yōu)選包含1-4個(gè)碳原子的烷基鏈的脂肪酸烷酯，特別是脂肪酸甲酯。
另一類優(yōu)選使用的非離子表面活性劑是烷基多葡糖苷(APG)。合適的烷基多葡糖苷對(duì)應(yīng)于通式RO(G)z，其中R是直鏈或支鏈的，特別是2-甲基支鏈的、飽和或不飽和的、含有8-22個(gè)以及優(yōu)選12-18個(gè)碳原子的脂族基，G是含有5或6個(gè)碳原子的糖單元，優(yōu)選是葡萄糖。糖苷化的程度z介于1.0-4.0之間，優(yōu)選在1.0-2.0之間，以及更優(yōu)選在1.1-1.4之間。優(yōu)選使用直鏈烷基多葡糖苷，即烷基多葡糖苷，其中多糖基部分是葡萄糖單元以及烷基部分是正-烷基基團(tuán)。
氧化胺類的非離子表面活性劑，例如N-椰油烷基-N，N-二甲胺氧化物以及N-牛油烷基-N，N-二羥乙胺氧化物，和脂肪酸鏈烷醇酰胺類也適用。這些非離子表面活性劑的所用量優(yōu)選不多于乙氧基脂肪醇量，尤其不多于其量的一半。
其它合適的表面活性劑為多羥基脂肪酸酰胺，對(duì)應(yīng)于通式(II) 其中RCO是包含6-22個(gè)碳原子的脂族?；琑1是氫、含有1-4個(gè)碳原子的烷基或羥烷基基團(tuán)，以及[Z]是直鏈或支鏈的、包含3-10個(gè)碳原子和3-10個(gè)羥基的多羥烷基。多羥基脂肪酸酰胺為已知物質(zhì)，其通常可通過將還原糖用氨、烷基胺或鏈烷醇胺加以還原性胺化，繼而用脂肪酸、脂肪酸烷酯或脂肪酸氯加以?；@得。
這組多羥基脂肪酸酰胺還包括對(duì)應(yīng)于式(III)的化合物 其中R是含有7-12個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基或者鏈烯基，R1是含有2-8個(gè)碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)化的烷基基團(tuán)或者芳香基團(tuán)，以及R2是含有1-8個(gè)碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)化的烷基基團(tuán)或芳香基團(tuán)或者是烷氧基基團(tuán)，但優(yōu)選C1-4的烷基或者苯基基團(tuán)，以及[Z]是直鏈的多羥基烷基基團(tuán)，其烷基鏈至少被2個(gè)羥基取代，或者該基團(tuán)的烷氧基化，優(yōu)選乙氧基化或丙氧基化的衍生物。優(yōu)選由還原糖例如葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、甘露糖或木糖的還原性胺化而獲得。然后通過例如以醇鹽作為催化劑與脂肪酸甲酯反應(yīng)，可將N-烷氧基或N-芳氧基取代的化合物轉(zhuǎn)化成所需的多羥基脂肪酸酰胺。
合適的陰離子表面活性劑是例如那些磺酸酯和硫酸酯類。合適的磺酸酯類表面活性劑優(yōu)選是C9-13的烷基苯磺酸酯、烯烴磺酸酯，即烯烴和羥烷基磺酸酯的混合物，以及例如通過氣態(tài)三氧化硫的磺酸化接著堿化或酸化磺酸化產(chǎn)物而從帶有中間或末端雙鍵的C12-18單烯烴中獲得的二磺酸酯。其它合適的磺酸酯類表面活性劑是例如通過氯磺化作用或磺化氧化作用接著水解或中和而從C12-18烷烴中獲得的鏈烷磺酸酯。α-磺基脂肪酸的酯(磺酸酯)，例如氫化椰子油、棕櫚核油或牛油脂肪酸的α-磺酸化甲酯也適用。
其它合適的陰離子表面活性劑有磺基化脂肪酸甘油酯。本發(fā)明上下文中的脂肪酸甘油酯指單酯、二酯和三酯及其混合物，其由單甘油與1-3mol的脂肪酸的酯化作用或者在甘油三酯和0.3-2mol的甘油發(fā)生酯交換反應(yīng)進(jìn)行生產(chǎn)而得來的。優(yōu)選的磺基化脂肪酸甘油酯是含6-22個(gè)碳原子的飽和脂肪酸的磺化產(chǎn)物，例如己酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸或山萮酸。
優(yōu)選的烷(鏈烯)基硫酸鹽是堿金屬鹽，以及具體是C12-18的脂肪醇的硫酸半酯的鈉鹽，例如椰油脂肪醇、牛油脂肪醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鯨蠟醇或硬脂醇或C10-20的羰基合成醇以及具有同樣鏈長仲醇的對(duì)應(yīng)的半酯。其它優(yōu)選的烷(鏈烯)基硫酸鹽是那些具有上述鏈長、含有基于石化產(chǎn)品的合成的、直鏈烷基鏈，并且它們的降解行為類似于基于油化品原料的對(duì)應(yīng)的化合物。C12-16烷基硫酸酯、C12-15烷基硫酸酯以及C14-15烷基硫酸酯從洗滌技術(shù)的觀點(diǎn)出發(fā)而優(yōu)選。其它合適的陰離子表面活性劑是2，3-烷基硫酸酯。
用1-6mol的環(huán)氧乙烷乙氧基化的直鏈或者支鏈C7-21醇例如含有平均3.5mol環(huán)氧乙烷(EO)的2-甲基支鏈的C9-11醇或者是含有1-4 EO的C12-18脂肪醇的硫酸單酯也同樣適用。鑒于他們高的發(fā)泡能力，他們僅以相對(duì)小的量使用，例如按重量計(jì)在清洗劑中的量為1％-5％。
其它合適的陰離子表面活性劑是烷磺基琥珀酸的鹽，其也已知是磺基琥珀酸鹽或磺基琥珀酸酯，以及表示磺基琥珀酸與醇，優(yōu)選脂肪醇，以及特別是乙氧基化的脂肪醇而形成的單酯或/或二酯。優(yōu)選的磺基琥珀酸酯含有C8-18脂肪醇?xì)埢蚱浠旌衔铩Ｌ貏e優(yōu)選的磺基琥珀酸酯含有衍生自乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇部分，其在分離中考慮時(shí)，代表非離子的表面活性劑(描述參見上文)。在這些磺基琥珀酸鹽中，那些衍生自窄范圍乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇部分尤其優(yōu)選。在烷(鏈烯)基鏈中優(yōu)選含有8-18個(gè)碳原子的烷(鏈烯)基琥珀酸或其鹽也同樣適用。
其它合適的陰離子表面活性劑尤其是肥皂。合適的肥皂是飽和脂肪酸肥皂，如月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、氫化芥子酸和山萮酸的鹽，以及尤其衍生自天然脂肪酸如椰油、棕櫚核油或牛油脂肪酸的肥皂混合物。
陰離子表面活性劑包括肥皂可以鈉、鉀或銨鹽及作為有機(jī)堿如單-、二-或三乙醇胺的可溶性鹽的形式存在。陰離子表面活性劑優(yōu)選以鈉或鉀鹽的形式存在，更優(yōu)選的是鈉鹽形式。
表面活性劑在本發(fā)明的洗滌劑中存在的總量優(yōu)選5-50重量％，特別是8-30重量％，以最終組合物計(jì)。
本發(fā)明的組合物可包含漂白劑。在那些能在水中產(chǎn)生H2O2而充當(dāng)漂白劑的化合物中，過碳酸鈉，過硼酸鈉鹽四水合物和過硼酸鈉一水合物是特別的重要。其它有用的漂白劑有例如過氧焦磷酸鹽、檸檬酸的過水合物和產(chǎn)生H2O2的過酸鹽或過酸，如過硫酸鹽或過硫酸。也可使用脲過氧水合物過尿素，其化學(xué)式為H2N-CO-NH2·H2O2。如果需要，組合物中也可含有有機(jī)類的漂白劑，特別是用于清洗硬表面，例如在洗碗機(jī)中，雖然原則上有機(jī)漂白劑也可用于洗衣劑。典型的有機(jī)漂白劑是二?；^氧化物，例如二苯甲酰基過氧化物。其它典型的有機(jī)漂白劑是過氧酸，其中烷基過氧酸和芳基過氧酸作為例子特別提及。優(yōu)選的代表是過氧苯甲酸及其環(huán)取代的衍生物，例如烷基過氧苯甲酸，還有過氧-α-萘甲酸和單過鄰苯二甲酸鎂鹽，脂族或取代的脂族過氧酸，例如過氧月桂酸、過氧硬脂酸、ε-苯二(甲)酰亞氨基過氧己酸(PAP)、o-羧基苯甲酰氨基過氧己酸、正壬烯氨基過酸性脂肪酸和正壬烯氨基過琥珀酸鹽，以及脂族和芳脂族的過氧二羧酸，例如1，12-二過氧羧酸、1，9-二過氧壬二酸、二過氧癸二酸、二過氧巴西基酸、二過氧苯二甲酸、2-癸基二過氧丁烷-1，4-二酸、N，N-對(duì)苯二甲酰-二(6-氨基過氧己酸)。
漂白劑的含量是1-40重量％，特別是10至20重量％，其中有利地使用過硼酸鹽一水合物或者過碳酸鹽如果洗滌溫度等于或者低于60℃，以及特別是對(duì)衣物進(jìn)行預(yù)處理，為了提高漂白效果，組合物中可含有漂白活化劑。合適的漂白活化劑是形成脂族過氧羧酸的化合物，所述脂族過氧羧酸優(yōu)選含有1-10個(gè)碳原子，以及更優(yōu)選含有2-4個(gè)碳原子和/或在過水解條件下任選取代的過苯甲酸。攜帶具有上述碳原子數(shù)的O-和/或N-?；?或任選取代的苯甲酰基的物質(zhì)是適用的。優(yōu)選的漂白活化劑是聚酰化的烷撐二胺，特別是四乙酰基乙烯二胺(TAED)、酰化的三嗪衍生物，特別是1，5-二乙?；?2，4-二氧代六氫-1，3，5-三嗪(DADHT)、酰化的甘脲，特別是1，3，4，6-四乙?；孰?TAGU)、N-?；鶃啺?，特別是正壬?；牾啺?NOSI)、?；谋椒踊撬猁}，特別是正壬?；蛘呤钱惾甚；u苯磺酸鹽(正-或異-NOBS)、?；u羧酸，例如三乙基-O-乙?；鶛幟仕猁}(TEOC)、羧酸酐，特別是鄰苯二甲酸酐、靛紅酸酐和/或琥珀酸酐、羧酸酰胺，例如N-甲基二乙酰胺、乙交酯、酰化多元醇，特別是三醋精、乙二醇二乙酸酯、異丙烯基乙酸酯、2，5-雙乙酸基-2，5-二氫呋喃和烯醇酯，它們從德國專利申請DE 196 16 693和DE 196 16 767中得知，乙酰化的山梨醇和甘露醇及其混合物(SORMAN)，它們在歐洲專利申請EP 0 525 239中描述，?；茄苌?，特別是五乙?；咸烟?PAG)、五乙?；?、四乙?；咎呛桶艘阴；樘牵约耙阴；娜芜xN-烷基化葡糖胺和葡糖酸內(nèi)酯、三唑和三唑衍生物和/或粒狀的己內(nèi)酰胺和/或己內(nèi)酰胺衍生物，優(yōu)選的是N-乙酰化內(nèi)酰胺，例如N-苯甲酰己內(nèi)酰胺和N-乙酰己內(nèi)酰胺，這些是從國際專利公布WO-A-94/27970、WO-A-94/28102、WO-A-94/28103、WO-A-95/00626、WO-A-95/14759和WO-A-95/17498中得來。從德國專利申請DE-A-19616 769中得知的取代的親水性?；铱s醛和在德國專利申請DE-A-19616 770以及國際專利公布WO-A-95/14075中描述的?；鶅?nèi)酰胺也優(yōu)選采用。與從德國專利申請DE-A-44 43 177中得知的常規(guī)漂白活化劑組合也可采用。腈衍生物，例如氰基吡啶、四腈(Nitrilquats)，例如N-烷基銨乙腈，和/或氨腈衍生物也可使用。優(yōu)選的漂白活化劑為4-(辛酰氧基)-苯磺酸鈉、正壬?；虍惾甚Ｑ趸交撬狨?正或異-NOBS)、十一酰氧基苯磺酸酯(UDOBS)、十二酰氧基苯磺酸鈉(DOBS)、十一酰氧基苯甲酸(DOBA，OBC 10)和/或十二酰氧基苯磺酸酯(OBS 12)以及N-甲基嗎啉鎓乙腈(MMA)。這類漂白活化劑常用量以整個(gè)組合物計(jì)為0.01-20重量％，優(yōu)選0.1-15重量％，以及更優(yōu)選1-10重量％。
除了或代替上述的常規(guī)漂白活化劑，所謂的漂白催化劑也可摻入。漂白催化劑是促進(jìn)漂白的過渡金屬鹽或者是過渡金屬配合物如錳、鐵、鈷、釕或者鉬-Salen配合物或者羰基配合物。具有含氮的三角配體的錳、鐵、鈷、釕、鉬、鈦、釩和銅的配合物，以及鈷、鐵、銅、釕-氨合物的復(fù)合物體也可以用做漂白催化劑，優(yōu)選使用在DE 19709 284 A1中描述的化合物。依照WO99/63038，乙腈的衍生物以及依照WO99/63041，漂白活化的過渡金屬配合物與淀粉酶組合后也能發(fā)生漂白活化的效果。
本發(fā)明的組合物通常含有一種或多種助洗劑(Builder)，特別是沸石、硅酸鹽、碳酸鹽、有機(jī)共助洗劑以及磷酸鹽，假使根據(jù)生態(tài)環(huán)境對(duì)使用這些磷酸鹽沒有反對(duì)意見的話。磷在洗碗機(jī)洗滌劑中是尤其優(yōu)選的主要材料。
合適的晶體層狀硅酸鈉對(duì)應(yīng)于通式NaMSixO2x+1·yH2O，其中M是鈉或者氫，x是1.6-4，優(yōu)選1.9至4.0之間的數(shù)，以及y是0-20之間的數(shù)，x值優(yōu)選為2、3或4。這樣的晶體層狀硅酸鹽記載在如歐洲專利申請EP-A-0 164 514中。對(duì)應(yīng)于上述通式的優(yōu)選的晶體層硅酸鹽是其中M為鈉、x為2或3的那些。β-和δ-二硅酸鈉Na2Si2O5·yH2O均特別優(yōu)選。這些化合物可從市場上購得，如SKS(Clariant)。因此SKS-6主要是δ-二硅酸鈉，其化學(xué)式為Na2Si2O5·yH2O，而SKS-7主要是β-二硅酸鈉。通過與酸(例如檸檬酸或碳酸)反應(yīng)，δ-二硅酸鈉生成kanemite NaHSi2O5·H2O，其以SKS-9和SKS-10(Clariant)在市場上銷售。對(duì)這些層狀硅酸鹽進(jìn)行化學(xué)修飾也有優(yōu)勢。例如，層狀硅酸鹽的堿度可受到適度的影響。與δ-二硅酸鈉相比，摻雜磷酸或者碳酸的層狀硅酸鹽已經(jīng)修飾了晶體形態(tài)，他們?nèi)芙飧於绎@示出與δ-二硅酸鈉相關(guān)的鈣結(jié)合能力增加。層狀硅酸鹽具有一般的經(jīng)驗(yàn)式xNa2O·y H2O·zP2O5，其中x與y的比例對(duì)應(yīng)于0.35-0.6，x和z的比例對(duì)應(yīng)于1.75-1200，以及y和z的比例對(duì)應(yīng)于4-2,800，它們在專利申請DE 19601063中有記載。層狀硅酸鹽的溶解度還可通過利用特別精細(xì)顆粒的層狀硅酸鹽來提高。晶體層狀硅酸鹽和其他成分的化合物也可采用。尤其引人關(guān)注的是與纖維素衍生物組成的化合物，其在崩解效果上具有優(yōu)勢，并尤其用于洗滌劑片劑中，以及與聚羧酸如檸檬酸或聚合的聚羧酸組成的化合物，例如丙烯酸的共聚物。
其他有用的助洗劑是無定形硅酸鈉鹽，其模量(Na2O∶SiO2比率)為1∶2-1∶3.3，優(yōu)選為1∶2-1∶2.8，以及更優(yōu)選是1∶2-1∶2.6，其可以延遲崩解并表現(xiàn)多重洗滌循環(huán)特性。與常規(guī)的無定形硅酸鈉相關(guān)的溶解推遲可由多種方法獲得，例如表面處理、混合/壓實(shí)或通過過干燥法。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“無定形”同樣可理解為包括“X-射線無定形”。換一種說法，硅酸鹽并不產(chǎn)生任何強(qiáng)烈的X-射線反射，這在X-射線衍射實(shí)驗(yàn)中是晶體物質(zhì)的特征，但最多有一個(gè)或多個(gè)具有幾度衍射角寬的散射X-輻射的最大值。然而，在電子衍射實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)硅酸鹽粒子產(chǎn)生彎曲或者甚至尖銳的衍射最大值時(shí)，甚至可獲得特別好助洗劑特性。這個(gè)可解釋表示這些產(chǎn)品具有微晶區(qū)域，大小介于10至數(shù)百nm，優(yōu)選上限為50nm以及更優(yōu)選上限達(dá)20nm。尤其優(yōu)選壓實(shí)的無定型硅酸鹽、混合的無定型硅酸鹽以及干燥的X-射線-無定形硅酸鹽。
根據(jù)本發(fā)明所用的精細(xì)晶體、含有結(jié)合水的合成沸石優(yōu)選是沸石A和/或沸石P。沸石MAP(Crosfield公司的銷售產(chǎn)品)是尤其優(yōu)選的P-型沸石。然而，沸石X和A、X和/或P的混合物也可適用。依照本發(fā)明，優(yōu)選的是使用例如，商業(yè)上可得到的沸石X和沸石A的共晶體化物(約80重量％的沸石X)，其由CONDEA Augusta S.p.A.公司以VEGOBOND AX商品名銷售，并可由下式描述nNa2O·(1-n)K2O·Al2O3·(2-2.5)SiO2·(3.5-5.5)H2O。
適合的沸石的平均粒子尺寸小于10μm(體積分布，測量方法Coulter Counter)，并優(yōu)選含有18-22重量％，以及更優(yōu)選的20-22重量％的結(jié)合水。
眾所周知的磷酸鹽當(dāng)然也可用作助洗劑，倘若它們的應(yīng)用對(duì)處于生態(tài)環(huán)境的理由不應(yīng)避免。在大量市場上可得到的磷酸鹽中，堿金屬磷酸鹽在洗滌劑工業(yè)中最為重要，三磷酸五鈉和三磷酸五鉀(鈉和鉀的三磷酸鹽)尤其優(yōu)選。
“堿金屬磷酸鹽”是各種磷酸的堿金屬(特別是鈉和鉀)鹽的集合術(shù)語，包括偏磷酸(HPO3)n和正磷酸(H3PO4)以及更高分子量的代表。磷酸鹽兼有各種優(yōu)點(diǎn)他們充當(dāng)堿性載體，阻止石灰沉積在機(jī)器零件上以及在織物上石灰結(jié)殼，此外，有助于清潔效果。
磷酸二氫鈉(NaH2PO4)以二水化合物(密度1.91gcm-3，熔點(diǎn)60°)和一水化合物(密度2.04gcm-3)存在。這兩種鹽都是白色非常易溶于水的粉末，加熱后失去結(jié)晶水，并在200℃下轉(zhuǎn)化為弱酸性的二磷酸鹽(二磷酸氫二鈉，Na2H2P2O7)，以及在更高溫度時(shí)轉(zhuǎn)化為三偏磷酸鈉(Na3P3O9)和長鏈高分子量偏磷酸鈉(Maddrell鹽)(參見下文)。NaH2PO4顯示酸性反應(yīng)。用氫氧化鈉調(diào)整磷酸到pH值4.5，然后噴霧干燥所得“漿”就可形成NaH2PO4。磷酸二氫鉀(原或者一元磷酸鉀、磷酸氫鉀、KDP)KH2PO4是白色鹽，其密度為2.33gcm-3，熔點(diǎn)253°(分解形成多磷酸鉀(KPO3)x)，并且易溶于水。
硫酸氫二鈉(次磷酸鈉)Na2HPO4是無色、易溶于水的晶體鹽。以無水、帶2mol水(密度2.066gcm-3，95℃時(shí)失水)、帶7mol水(密度1.68gcm-3，熔點(diǎn)48°時(shí)失去5水)以及12mol水(密度1.52gcm-3，熔點(diǎn)35°失去5水)的形式存在，在100°時(shí)變成無水，在急劇加熱下，就會(huì)轉(zhuǎn)變成二磷酸鹽Na4P2O7。以酚酞作指示劑，用蘇打水中和磷酸就能制備磷酸氫二鈉。磷酸氫二鉀(次級(jí)或者二元磷酸鉀)K2HPO4是無定型的白色鹽、易溶于水。
磷酸三鈉，叔磷酸鈉，Na3PO4，是無色晶體，作為十二水合物，其密度是1.62gcm-3，熔點(diǎn)是73-76℃(分解)，作為十水合物，其熔點(diǎn)為100℃(對(duì)應(yīng)于19-20％ P2O5)，無水形式的密度為2.536gcm-3(對(duì)應(yīng)于39-40％ P2O5)。通過堿性反應(yīng)磷酸三鈉易溶于水，其制備方法是通過蒸發(fā)濃縮恰好1mol磷酸二鈉和1mol氫氧化鈉的溶液。磷酸三鉀(三級(jí)或者三元磷酸鉀)K3PO4是白色易潮解的顆粒粉末，密度2.56gcm-3，熔點(diǎn)1340°，通過堿性反應(yīng)易溶于水。例如如果托馬斯(Thomas)礦渣與煤和硫酸鉀一起加熱，就形成磷酸三鉀。盡管價(jià)格更高，但由于它們更易溶，所以在洗滌劑工業(yè)中，高效磷酸鉀通常比相應(yīng)的鈉化合物更受歡迎。
二磷酸四鈉(焦磷酸鈉)Na4P2O7以無水形式(密度2.534gcm-3，熔點(diǎn)988°，有時(shí)是880°)和十水合物的形式存在(密度1.815-1.836gcm-3，熔點(diǎn)94°時(shí)失水)。這兩個(gè)物質(zhì)都是無色晶體，通過堿性反應(yīng)溶于水中。當(dāng)磷酸氫二鈉加熱到200°以上，或通過磷酸與蘇打以化學(xué)計(jì)量比反應(yīng)并噴霧干燥該溶液就形成焦磷酸鈉。十水合物絡(luò)合重金屬鹽和硬鹽，由此減少了水的硬度。二磷酸鉀(焦磷酸鉀)K4P2O7以三水合物的形式存在，是一種無色吸濕性粉末，密度2.33gcm-3，溶于水，在25°時(shí)，1％溶液pH值為10.4。
相對(duì)高分子量的磷酸鈉和磷酸鉀是通過濃縮NaH2PO4或KH2PO4形成的。它們可劃分成環(huán)型，即鈉和鉀的偏磷酸鹽，以及鏈型，即鈉和鉀的多磷酸鹽。特別是鏈型有很多不同的名稱熔合或煅燒的磷酸鹽、格雷姆鹽(Graham鹽)、四聚偏磷酸鉀(Kurrol鹽)以及Maddrell鹽。所有更高的鈉和鉀的磷酸鹽都統(tǒng)稱為濃縮的磷酸鹽。
在工業(yè)上有重要用途的三磷酸五鈉Na5P3O10(三聚磷酸鈉)是非吸濕性白色水溶性鹽，其不帶水或帶6個(gè)水分子結(jié)晶，具有通式NaO-[P(O)(ONa)-O]n-Na，其中n＝3。在室溫條件下，大約17克無結(jié)晶水的鹽溶于100克的水中，在60°時(shí)是約20克，而在100°時(shí)大約是32克。將這種溶液加熱2小時(shí)到100°，大約8％的正磷酸鹽和15％的二磷酸通過水解形成。在制備三磷酸五鈉時(shí)，將磷酸與蘇打水溶液或者氫氧化鈉以化學(xué)計(jì)量比反應(yīng)，并將溶液噴霧干燥。同格雷姆鹽和磷酸氫鈉相似，三磷酸五鈉溶解許多不溶性的金屬化合物(包括石灰肥皂等)。市場上的三磷酸五鈉K5P3O10例如按重量計(jì)都是50％溶液(＞23％ P2O5，25％ K2O)的形式。多磷酸鉀廣泛應(yīng)用于洗滌劑工業(yè)中。還存在三磷酸鉀鈉，根據(jù)本發(fā)明，也可使用。例如當(dāng)三偏磷酸鈉用氫氧化鉀水解時(shí)形成三磷酸鉀鈉
(NaPO3)3+2KOHNa3K2P3O10+H2O根據(jù)本發(fā)明，它們可以完全相同的方式用作三聚磷酸鈉、三聚磷酸鉀或者它們的混合物。根據(jù)本發(fā)明，三聚磷酸鈉和三聚磷酸鈉鉀兩者的混合物或者三聚磷酸鉀和三聚磷酸鉀鈉兩者的混合物或者三聚磷酸鈉和三聚磷酸鉀和三聚磷酸鈉鉀三者的混合物也可使用。
本發(fā)明的洗滌劑/清洗劑中的有機(jī)共助洗劑尤其包括多羧酸鹽或多羧酸、聚體多羧酸鹽、多天冬氨酸、聚乙縮醛、任選氧化糊精、其他有機(jī)共助洗劑(參見下文)和膦酸酯。下面描述這些類物質(zhì)。
有用的有機(jī)助洗劑例如為以其鈉鹽形式使用的多羧酸，其中多羧酸應(yīng)理解為攜帶一個(gè)以上酸官能團(tuán)的羧酸。只要對(duì)生態(tài)是安全的，這些羧酸包括例如檸檬酸、己二酸、丁二酸、戊二酸、蘋果酸、酒石酸、馬來酸、反丁烯二酸、糖酸、氨基羧酸、次氮基三乙酸(NTA)及其混合物。優(yōu)選的鹽是多羧酸的鹽，如檸檬酸、己二酸、丁二酸、戊二酸、酒石酸、糖酸及其混合物。
這些酸本身就可使用。除了它們助洗效應(yīng)以外，這些酸也通常具有使成分酸化的性質(zhì)，因此在洗滌劑或清洗劑中用來建立相對(duì)較低和適中的pH值，除非pH值要求通過混合其他成分而得到。在這方面特別提及系統(tǒng)相容性和對(duì)環(huán)境安全的酸，如檸檬酸、乙酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙醇酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、葡萄酸以及它們的任意混合物。然而，無機(jī)酸尤其是硫酸，或堿尤其是銨或堿金屬的氫氧化物也可用作pH調(diào)節(jié)劑。這些調(diào)節(jié)劑存在于本發(fā)明的組合物中，其量優(yōu)選不高于20重量％，以及特別為1.2-17重量％。
其他合適的助洗劑有聚合的多羧酸鹽，例如是聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的堿金屬鹽，例如那些相對(duì)分子量為500-700,000g/mol的。
本說明書中提及的聚合多羧酸鹽的分子量是各自酸形式的重均分子量Mw，其主要利用紫外檢測儀通過凝膠滲透色譜法(GPC)測定。測定根據(jù)聚丙烯酸的外標(biāo)進(jìn)行，所述外標(biāo)依靠其與所研究聚合物的結(jié)構(gòu)相似性而提供實(shí)際的分子量值。這些值完全不同于以聚苯乙烯磺酸為標(biāo)準(zhǔn)測定的分子量值。以聚苯乙烯磺酸為標(biāo)準(zhǔn)測定的分子量一般高于本說明書中提到的分子量。
尤其合適的聚合物是聚丙烯酸酯，其優(yōu)選具有2,000-20,000g/mol的分子量。由于具有優(yōu)良的溶解性，該組優(yōu)選的代表是短鏈聚丙烯酸酯，其分子量為2,000-10,000g/mol，以及特別為3,000-5,000g/mol。
此外，合適的還有共聚合的聚羧酸酯，特別是丙烯酸與甲基丙烯酸的那些共聚合的聚羧酸酯，以及丙烯酸或甲基丙稀酸與馬來酸的那些共聚合的聚羧酸酯。證明含有50-90重量％丙烯酸以及50-10重量％馬來酸的丙烯酸/馬來酸共聚物尤其合適。以游離酸計(jì)，它們的相對(duì)分子量一般為2,000 to 70,000g/mol，優(yōu)選在20,000-50,000g/mol，更優(yōu)選在30,000-40,000g/mol。(共)聚合的聚羧酸酯可以粉末形式或者水溶液的形式利用。(共)聚合的聚羧酸酯在清洗劑中所占的含量為0.5-20重量％，特別為1-10重量％。
為了改善水中的溶解度，這些聚合體也可包含烯丙基磺酸，如烯丙基羥苯磺酸以及甲代烯丙基磺酸作為單體。
特別優(yōu)選的聚合物是由2種以上不同單體單元構(gòu)成的可生物降解的聚合物，如那些含有丙烯酸和馬來酸以及乙烯醇或乙烯醇衍生物作為單體的，或者那些含有以丙烯酸和2-烷基烯丙基磺酸和糖衍生物作為單體的。
其他優(yōu)選的共聚物是那些優(yōu)選含有丙烯醛和丙烯酸/丙烯酸鹽或丙烯醛和乙烯基醋酸酯作為單體的共聚物。
其他優(yōu)選的助洗劑是聚合的氨基二元羧酸、其鹽或其前體。聚天冬氨酸或者鹽及其衍生物是特別優(yōu)選的。
其他合適的助洗劑是聚縮醛，它們可通過二醛與含有5-7個(gè)碳原子和至少3個(gè)羥基的多羥基羧酸反應(yīng)得到。優(yōu)選的聚縮醛可從二醛如乙二醛、戊二醛、對(duì)苯二醛及其混合物得到，以及從多羥基羧酸如葡糖酸和/或葡庚糖酸獲得。
其他合適的有機(jī)助洗劑是糊精，如碳水化合物的低聚物或聚合物，它們可由部分水解淀粉獲得。通過常規(guī)方法如酸或者酶催化的方法進(jìn)行水解反應(yīng)。水解產(chǎn)物優(yōu)選平均分子量為400-500,000g/mol。優(yōu)選具有右旋糖當(dāng)量(DE)0.5-40，特別為2-30的多糖，其中與DE為100的右旋糖比較，該DE是衡量多糖的還原效果的常用尺度。DE為3-20的麥芽糊精和DE為20-37的干葡萄糖糖漿以及具有相對(duì)高的分子量為2,000-30,000g/mol的所謂黃、白糊精都可采用。
這些糊精的氧化衍生物是它們與氧化劑的反應(yīng)產(chǎn)物，所述氧化劑能將糖環(huán)的至少一個(gè)醇官能團(tuán)氧化成羧酸官能團(tuán)。本發(fā)明組合物中尤其優(yōu)選的有機(jī)助洗劑是根據(jù)EP 472 042、WO97/25399和EP 755 944的氧化淀粉或其衍生物。
其他合適的共助洗劑是羥二琥珀酸鹽以及其他二琥珀酸的衍生物，優(yōu)選二琥珀酸化乙二胺。乙二胺-N，N’-二琥珀酸鹽(EDDS)優(yōu)選以鈉鹽或者鎂鹽形式使用。就此而論，丙三醇二琥珀酸酯和丙三醇三琥珀酸酯也是優(yōu)選對(duì)象。在含沸石、碳酸鹽和/或含硅酸鹽的組合物中使用量為3-15重量％。
其它有用的有機(jī)助洗劑是例如乙?；牧u基羧酸及其鹽，其可任選以內(nèi)酯形式出現(xiàn)并含有至少4個(gè)碳原子、至少一個(gè)羥基和最多2個(gè)酸性基團(tuán)。
具有共助洗劑特性的另一類物質(zhì)是膦酸鹽。對(duì)此特別是羥基鏈烷和氨基鏈烷膦酸鹽。在羥基鏈烷膦酸鹽中，1-羥基乙烷-1，1-二膦酸鹽(HEDP)作為共助洗劑尤為重要。優(yōu)選使用鈉鹽，其中二鈉鹽顯示中性反應(yīng)，以及四鈉鹽顯示堿性反應(yīng)(pH9)。優(yōu)選的氨基鏈烷膦酸鹽有乙二胺四亞甲基膦酸鹽(EDTMP)、二乙基三胺五亞甲基膦酸鹽(DTPMP)及其更高的同系物。優(yōu)選使用中性反應(yīng)的鈉鹽形式，如EDTMP的六鈉鹽或者DTPMP的七-和十鈉鹽。在膦酸鹽中，HEDP優(yōu)選用作助洗劑。另外，氨基鏈烷膦酸鹽具有顯著的重金屬結(jié)合能力。因此，尤其如果洗滌劑里亦含有漂白劑，有益的是可利用氨基鏈烷膦酸鹽，特別為DTPMP，或者上述膦酸鹽的混合物。
另外，任何能與堿土金屬離子形成復(fù)合物的化合物都可用作共助洗劑。
本發(fā)明的洗滌劑中可任選包含其量高達(dá)90重量％的助洗劑。其含量優(yōu)選高達(dá)75重量％。本發(fā)明的洗滌劑的助洗劑含量尤其為5-50重量％。在本發(fā)明的洗滌劑用于硬表面清潔，特別是用于餐具的機(jī)械洗滌時(shí)，助洗劑的含量尤其為5-88重量％，其中在這種洗滌劑中優(yōu)選不含水不溶性的助洗劑。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的特別用于洗碗機(jī)的洗滌劑包含20-40重量％的水溶性有機(jī)助洗劑，特別是堿金屬檸檬酸鹽，含有5-15重量％的堿金屬碳酸鹽以及20-40重量％的堿金屬二硅酸鹽。
在液體至凝膠形式的洗滌劑/清洗劑的組合物中可用的溶劑來源于例如一元醇或者多元醇、烷醇胺或乙二醇醚的基團(tuán)，條件是在指定的濃度范圍內(nèi)它們能與水混合。這些溶劑優(yōu)選選自乙醇，正或異丙醇，丁醇，乙二醇甲醚，乙二醇乙醚，乙二醇丙醚，乙二醇一-正丁醚，二乙二醇甲醚，二乙二醇二乙醚，丙二醇甲基、乙基或丙基醚，二丙二醇單甲基或單乙基醚，二異丙二醇單甲基或單乙基醚，甲氧基、乙氧基或丁氧基三甘醇，1-丁氧基乙氧基-2-丙醇，3-甲基-3-甲氧基丁醇，丙二醇叔-丁醚以及這些溶劑的混合物。
在本發(fā)明的液體至凝膠形式的洗滌劑/清洗劑中，溶劑的含量為0.1-20重量％，優(yōu)選低于15重量％，以及特別低于10重量％。
為了調(diào)節(jié)粘度，可向本發(fā)明組合物中加入一種或者多種增稠劑，例如增稠體系。這些高分子量物質(zhì)也稱為膨脹劑通常吸收大量液體并且在此過程中膨脹，以便最終變成粘滯的純?nèi)芤夯蚰z狀溶液。
合適的增稠劑是無機(jī)或者聚合的有機(jī)化合物。無機(jī)增稠劑包括例如聚硅酸、粘土礦物如蒙脫石、沸石、硅石和膨潤土。有機(jī)增稠劑來源于天然聚合物、改性的天然聚合物和完全合成的聚合物。天然存在的聚合物的例子有瓊脂、角叉菜、黃蓍膠、阿拉伯膠、藻酸鹽、果膠、聚糖、瓜耳膠、刺槐豆膠、淀粉、糊精、明膠以及干酪素?？捎米髟龀韯┑母男蕴烊痪酆象w主要來源于改性淀粉和纖維素。這里例如是羧甲基纖維素及其他纖維素醚、羥基乙基和羥基丙基纖維素以及樹膠醚。完全合成的增稠劑包括聚合物，如聚丙烯和聚甲基丙烯化合物、乙烯基聚合物、聚羧酸、聚醚、聚亞胺、聚酰胺和聚氨基甲酸酯。
以制成的組合物計(jì)，增稠劑的用量最高達(dá)5重量％，優(yōu)選0.05-2重量％，以及特別在0.1-1.5重量％。
本發(fā)明的洗滌劑/清洗劑可任選含有螯合劑、電解液和其他助劑，如熒光增白劑、泛灰抑制劑、銀腐蝕抑制劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、泡沫抑制劑、研磨劑、染料和/或香精，以及微生物活性成分和/或紫外吸收劑作為它的補(bǔ)充成分。
本發(fā)明的織物洗滌劑可包含二氨基1，2-二苯乙烯二磺酸的衍生物或其堿金屬鹽作為熒光增白劑。合適的熒光增白劑有例如4，4’-雙-(2-苯胺基-4-嗎啉基-1，3，5-三嗪基-6-氨基)-1，2-二苯乙烯-2，2’-二磺酸的鹽或者相似組成的化合物，所述化合物的嗎啉基可被二乙醇氨基、甲氨基、苯胺基或者2-甲氧基乙氨基替代。也可使用取代的二苯基苯乙烯基型的增白劑，如4，4’-雙-(2-磺苯乙烯基)-二苯基、4，4’-雙-(4-氯-3-磺苯乙烯基)-二苯基或者4-(4-氯苯乙烯基)-4’-(2-磺苯乙烯基)-二苯基的堿金屬鹽。上述熒光增白劑的混合物也可以使用。
泛灰抑制劑的作用是使從織物纖維上溶解出的污物保持懸浮于洗滌液中。合適的泛灰抑制劑是大多數(shù)的天然有機(jī)物的水溶性膠體，如淀粉、動(dòng)物膠、明膠、淀粉或纖維素的羧酸乙醚或者磺酸乙醚的鹽，也可以是纖維素或淀粉的酸性硫酸酯的鹽。包含酸性基團(tuán)的水溶性聚酰胺也適用此目的。淀粉衍生物除了上面提及的以外，例如還有乙醛淀粉等也都可使用。纖維素乙醚如羧甲基纖維素(鈉鹽)、甲基纖維素、羥烷基纖維素以及混合醚，如甲基羥乙基纖維素、甲基羥丙基纖維素、甲基羧甲基纖維素及其混合物優(yōu)選使用，例如以該洗滌劑計(jì)，其用量為0.1-5重量％。
為了保護(hù)銀器免遭腐蝕，可以在本發(fā)明的洗碗洗滌劑中使用銀腐蝕抑制劑。現(xiàn)有技術(shù)中，銀腐蝕抑制劑是已知的，并包括例如，苯并三唑、氯化鐵(III)以及硫酸鈷。例如，從歐洲專利EP 0 736 084 B1已知，特別適合與酶一起使用的銀腐蝕抑制劑有錳、鈦、鋯、鉿、釩、鈷或鈰鹽和/或絡(luò)合物，在這些絡(luò)合物中上述金屬元素以氧化數(shù)II、II、IV、V或VI的一種形式存在。這些化合物的例子有MnSO4、V2O5、V2O4、VO2、TiOSO4、K2TiF6、K2ZrF6、Co(NO3)2、Co(NO3)3及其混合物。
污漬釋放劑或污漬驅(qū)除劑通常是聚合物，當(dāng)這些聚合物用于洗滌劑中時(shí)，它們就給洗滌的纖維提供污漬排斥特性和/或支持洗滌劑的其他成分懸浮污漬的能力。在這些聚合物用于硬表面的清洗劑中時(shí)，也能觀測到可比的效果。
特別有效并且長期以來已知的污漬釋放劑是具有二羧酸、烷撐二醇以及聚亞烷基二醇單元的共聚酯。例子為聚對(duì)苯二甲酸乙二酯和聚乙二醇的共聚物或混合聚合物(DT 16 17 141或DT 22 00 911)。DE-OS2253063中提到酸性組合物，其中含有由二堿性羧酸和亞烷基或環(huán)亞烷基聚乙二醇組成的共聚物。在DE-PS 28 57 292、DE-PS 33 24 258以及EP 0 253 567中描述了對(duì)苯二甲酸亞乙酯和聚環(huán)氧乙烷-對(duì)苯二甲酸酯的共聚物和它們在洗滌劑中的應(yīng)用。歐洲專利EP 066 944涉及組合物，其含有由乙二醇、聚乙二醇、芳族二羧酸與磺化芳族二羧酸以一定摩爾比構(gòu)成的共聚酯。歐洲專利EP 0 185 427描述了甲基-或乙基-末端的聚酯，其含有對(duì)苯二甲酸亞乙酯和/或亞丙酯單元和聚環(huán)氧乙烷-對(duì)苯二甲酸酯單元，以及描述了含有此種污漬釋放聚合物的洗滌劑。歐洲專利EP 0 241 984涉及聚酯，這種聚酯除了含有氧乙烯基團(tuán)和對(duì)苯二甲酸單元以外，還包含取代的亞乙基單元和甘油單元。歐洲專利EP 0 241 985公開了一種聚酯，其除了含有氧乙烯基團(tuán)和對(duì)苯二甲酸以外，還含有1，2-亞丙基、1，2-亞丁基和/或3-甲氧基-1，2-亞丙基和甘油單元，并且其以C1-4烷基為末端。歐洲專利申請EP 0 272 033描述了包含聚對(duì)苯二甲酸亞丙酯和聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯單元的至少部分以C1-4烷基或?；鶠槟┒说木埘ァW洲專利EP 0 274 907描述了包含以磺乙基為末端的對(duì)苯二甲酸酯的污漬釋放聚酯。根據(jù)歐洲專利申請EP 0357 280，包含對(duì)苯二甲酸、亞烷基二醇和聚-C2-4-乙二醇單元的污漬釋放聚酯可通過不飽和端基的磺化來制備。國際專利公布WO95/32232涉及酸性芳族污漬釋放聚酯。國際專利公布WO97/31085描述用于棉織物的未聚合的污漬驅(qū)除劑，其含有若干官能團(tuán)單元第一單元例如可能是陽離子的，能通過靜電相互作用吸附到棉表面，以及第二單元是疏水的，負(fù)責(zé)遺留在水/棉界面上的活性物質(zhì)。
適用于本發(fā)明的織物洗滌劑中的染料轉(zhuǎn)移抑制劑尤其包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯咪唑、聚合的N-氧化物，如聚-(乙烯基吡啶-N-氧化物)和乙烯基吡咯烷酮與乙烯基咪唑的共聚物。
在機(jī)器清洗過程中使用時(shí)，將泡沫抑制劑加入到洗滌劑中會(huì)大有好處。合適的泡沫抑制劑例如是具有較高含量的C18-24脂肪酸的天然或合成來源的皂類。合適的非表面活性劑類的泡沫抑制劑是例如有機(jī)聚硅氧烷及其與微細(xì)的任選硅烷化的硅酸以及石臘、臘、微晶臘的混合物，以及它們與硅烷化的硅酸或者二-硬脂酰亞乙基二酰胺的混合物。不同泡沫抑制劑的混合物，如硅酮、石蠟和蠟的混合物也可以被有效的利用。泡沫抑制劑，特別是含硅氧烷-和/或含石蠟-的泡沫抑制劑優(yōu)選固定到粒狀水溶性的或水分散的支持物上。尤其優(yōu)選石蠟和二-硬脂酰亞乙基二酰胺的混合物。
另外，本發(fā)明的硬表面清洗劑可含有研磨劑組分，特別是選自石英粉、鋸末、塑料粉、白堊和玻璃微珠以及它們的混合物的。存在于本發(fā)明清洗劑中的研磨劑，其量優(yōu)選不超過20重量％，特別為5-15重量％。
將染料和香精加入到本發(fā)明的洗滌劑/清洗劑中以改善產(chǎn)品的美學(xué)印象，并給消費(fèi)者不僅提供所需要的洗滌和清潔功效而且還提供了視覺和感觀上“特別的和可辨認(rèn)”的產(chǎn)品。合適的芳香油或香料包括個(gè)別的芳香化合物，如酯、醚、醛、酮、醇和烴類的合成產(chǎn)品。酯類的芳香化合物例如是乙酸芐酯、異丁酸苯氧基乙基酯、乙酸p-叔丁基環(huán)己酯、乙酸芳樟酯、乙酸二甲基芐基原酯、乙酸苯基乙酯、苯甲酸芳樟酯、甲酸芐基酯、氨基乙酸乙基甲基苯酯、丙酸烯丙基環(huán)己酯、丙酸甲基苯基原酯和水楊酸芐酯。醚包括例如芐基乙基醚；醛包括例如含有8-18個(gè)碳原子的直鏈鏈烷醛(Alkanale)、檸檬醛、香茅醛、香茅基含氧乙醛、仙客來醛、羥基香茅醛、鈴蘭醛和Bourgeonal；酮包括例如紫羅酮、α-異甲基紫羅酮以及甲基柏木酮；醇包括茴香腦、香茅醇、丁子香酚、香葉醇、沉香醇、苯乙基醇和松油醇；以及烴最主要包括萜烯，如苧烯和蒎烯。然而，優(yōu)選使用各種香精的混合物一起產(chǎn)生誘人的香味。象這樣的芳香油也可包含天然香精混合物，這些混合物可得自植物源如松樹、柑橘屬植物、茉莉、綠葉刺蕊草、玫瑰或衣蘭衣蘭油。還可適用的有鼠尾草油、春黃菊油、丁香油、蜜蜂花油、薄荷油、肉桂葉油、酸橙花油、杜松子油、巖蘭油、乳香油、楓子香油和巖薔薇油，以及橙花油、苦橙油、桔皮油和檀香油。洗滌劑/清洗劑的染料含量通常低于0.01重量％，而香料卻可占到整個(gè)組合物的2重量％。
香料可直接摻入到洗滌劑/清洗劑中，同樣有利地是將香味涂覆到載體上，所述載體能夠增強(qiáng)香氣在洗滌物上的附著力，并通過緩慢釋放香氣給處理過的織物特別提供持久的芳香。合適的載體物質(zhì)例如是環(huán)糊精，其中環(huán)糊精/香料復(fù)合物還可附加地用其它助劑涂覆。另一優(yōu)選的芳料載體是已描述過的沸石X，它也能夠代替表面活性劑或與表面活性劑混合吸收香氣。因此，含有所述沸石X的洗滌劑/清洗劑是優(yōu)選的，其中所述香料至少部分吸收在沸石上。
專業(yè)人員毫無困難地選擇的優(yōu)選的染料具有高的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，不受組合物中的其他常規(guī)成分和受光的影響，并且對(duì)織物纖維不顯示顯著的直接染色性從而不給它們上色。
為了防治微生物，洗滌劑/清洗劑可以含有抗菌活性成分。依賴抗菌譜和作用機(jī)理，抗菌劑分為細(xì)菌抑制劑和殺菌劑、真菌抑制劑和殺真菌劑等。這些組的重要代表是例如苯扎氯胺、烷芳基磺酸鹽、鹵代苯酚和苯酚醋酸汞化物。在本發(fā)明教導(dǎo)的范圍中，術(shù)語“抗微生物活性”和“抗微生物活性物質(zhì)”具有本領(lǐng)域的常規(guī)意義，如K.H.Wallhuβer在“Praxis der Sterilisation，Desinfektion-KonservierungKeimidentifizierung-Betriebshygiene”(第5版，Stuttgart/New YorkThieme，1995)中所定義，其中所述的任何具有抗微生物活性的物質(zhì)均可使用。合適的抗微生物活性成分優(yōu)選選自醇、胺、醛、抗微生物的酸及其鹽、羧酸酯、酰胺、苯酚、苯酚衍生物、聯(lián)苯、聯(lián)苯基烷、尿素衍生物、氧和氮縮醛和縮甲醛、芐脒、異噻唑啉、鄰苯二甲酰亞胺衍生物、吡啶衍生物、抗微生物的表面活性化合物、胍、抗微生物的兩性化合物、喹啉、1，2-二溴代-2，4-二氰基丁烷、碘代-2-丙基丁基氨基甲酸酯、碘、碘遞體、過氧化合物、鹵化合物以及上述的任意混合物。
因此抗微生物活性成分可選自乙醇、正丙醇、異丙醇、1，3-丁二醇、苯氧基乙醇、1，2-丙二醇、甘油、十一烯酸、苯甲酸、水楊酸、Dihydracetsaure、鄰-苯基酚、N-甲基嗎啉乙腈(MMA)、2-芐基-4-氯酚、2，2’-亞甲基-雙-(6-溴代-4-氯酚)、4，4’-二氯-2’-羥基聯(lián)苯乙醚(Dichlosan)、2，4，4’-三氯-2’-羥基二苯基醚(Trichlosan)、Chlorhexidin、N-(4-氯苯基)-N-3，4-二氯苯基)-脲、N，N′-(1，10-癸烷二基二-1-嘧啶基-4-亞基)-雙-(1-辛胺)-二氫氯化物、N，N′-雙-(4-氯苯基)-3，12-二亞氨基-2，4，11，13-四氮雜四癸烷二亞氨基酰胺、葡糖魚精蛋白、抗微生物的表面活性季化合物、胍包括二胍和聚胍，如1，6-雙-(2-乙基己基二胍基己烷)-二氫氯化物、1，6-雙-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-苯基-N1，N1-甲基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，6-二氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-[N1N1′-β-(對(duì)-甲氧基苯基)-二胍基-N5，N5′]-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1N1′-α-甲基-β-苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-對(duì)-硝基苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、ωω-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-二-正丙基醚二氫氯化物、ωω′-二-(N1，N1′-對(duì)-氯苯基二胍基-N5，N5′)-二-正丙基醚四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，4-二氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-對(duì)-甲基苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，4，5-三氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-[N1，N1′-α-(對(duì)-氯苯基)-乙基二胍基-N5，N5′]-己烷二氫氯化物、ωω-二-(N1，N1′-對(duì)-氯苯基二胍基-N5，N5′)-間-二甲苯二氫氯化物、1，12-二-(N1，N1′-對(duì)-氯苯基二胍基-N5，N5′)-十二烷二氫氯化物、1，10-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-癸烷四氫氯化物、1，12-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-十二烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、乙烯-雙-(1-甲苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(對(duì)-甲苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(3，5-二甲基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(對(duì)-叔戊基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(壬基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(正丁基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(2，5-二乙氧基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(2，4-二甲基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(鄰-聯(lián)苯雙縮胍)、乙烯-雙-(混合-戊基萘基雙縮胍)、正丁基乙烯-雙-(苯基雙縮胍)、三亞甲基-雙-(鄰-甲苯基雙縮胍)、正丁基三亞甲基-雙-(苯基雙縮胍)以及相應(yīng)的鹽，如醋酸鹽、葡糖酸鹽、氫氯化物、氫溴化物、檸檬酸鹽、亞硫酸氫鹽、氟化物、聚馬來酸鹽、正椰油烷基肌氨酸鹽、亞磷酸鹽、次亞磷酸鹽、過氟辛酸鹽、硅酸鹽、山梨酸鹽、水楊酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、亞氨基醋酸鹽、肉桂酸鹽、硫氰酸鹽、精氨酸鹽、苯四酸鹽、四羧基丁酸鹽、安息香酸鹽、戊二酸鹽、單氟磷酸鹽、過氟丙酸鹽和它們的混合物。鹵化二甲苯和甲酚衍生物，如對(duì)-氯-間-甲酚或?qū)?氯-間-二甲苯，并且植物起源的天然殺菌劑(如香料和香草)以及動(dòng)物和微生物起源的天然抗菌劑也是合適的。優(yōu)選的抗菌劑有抗菌性表面活性的四元化合物、植物起源和/或動(dòng)物起源的天然抗菌劑，以及最優(yōu)選的是至少一個(gè)植物起源的抗菌劑，其來自咖啡因、可可堿和茶堿以及香精油如丁子香酚、麝香草酚和香葉醇，和/或至少一個(gè)動(dòng)物起源的抗菌劑，其來自酶如牛奶蛋白、溶菌酶以及乳過氧化物酶和/或至少一個(gè)抗菌性表面活性的四元化合物，其包含銨、锍、鏻、碘鎓或砷鎓基、過氧化合物和氯化合物。微生物起源的物質(zhì)即所謂的殺菌素也可以使用。
適合用作抗微生物活性成分的季銨化合物(QAC)具有通式(R1)(R2)(R3)(R4)N+X-，其中R1-R4可以相同或不同，并代表C1-22烷基、C7-28芳烷基或雜環(huán)基，其中兩個(gè)或在芳香化合物如吡啶的情況下甚至是三個(gè)基團(tuán)與氮原子一起形成雜環(huán)基，如吡啶鎓或咪唑鎓化合物，以及X-代表鹵離子、硫酸根離子、氫氧根離子或類似的陰離子。為了達(dá)到最佳抗微生物活性，這些取代基中至少一個(gè)優(yōu)選具有8-18，更優(yōu)選12-16個(gè)碳原子的鏈長。
QAC可以通過叔胺與烷基化試劑反應(yīng)得到，所述烷基化試劑如氯代甲烷、芐基氯、硫酸二甲酯、十二烷基溴，以及環(huán)氧乙烷。帶有一個(gè)長烷基鏈和兩個(gè)甲基的叔胺的烷基化尤其簡單，同樣在氯代甲烷的幫助下在溫和條件下可以進(jìn)行含兩個(gè)長鏈基團(tuán)和一個(gè)甲基的叔胺的季銨化。含三個(gè)長烷基或者羥基取代的烷基的胺缺乏活性，并優(yōu)選采用硫酸二甲酯來季銨化。
合適的QAC是例如芐烷銨氯化物(N-烷基-N，N-二甲基芐基氯化銨，CAS No.8001-54-5)、Benzalkon B(m，p-二氯芐基二甲基-C12-烷基氯化銨，CAS No.58390-78-6)、苯佐氯銨(芐基-十二基-雙-(2-羥乙基)-氯化銨)、十六烷三甲基溴化銨(N-十六烷基-N，N-三甲基溴化銨，CASNo.57-09-0)、苯索氯銨(N，N-二甲基-N-[2-[2-[對(duì)-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯氧基]-乙氧基]-乙基]-芐基氯化銨，CAS No.121-54-0)、二烷基二甲基氯化銨，如二-正癸基二甲基氯化銨(CAS No.7173-51-5-5)、二癸基二甲基溴化銨(CAS No.2390-68-3)、二辛基二甲基氯化銨、1-十六烷基氯化吡啶鎓(CAS No.123-03-5)和噻唑啉碘化物(CAS No.15764-48-1)以及它們的混合物。尤其優(yōu)選的QAC是含有C8-18烷基的芐烷氯化銨，特別是C12-14-烷基-芐基-二甲基-氯化銨。
苯扎鹵銨和/或取代的苯扎鹵銨是商業(yè)上可獲得的，如來自Lonza的B arquat、來自Mason的Marquat、來自Witco/Sherex的Variquat以及來自Lonza的Hyamine和來自Lonza的Bardac。其他商業(yè)上可獲得的抗微生物活性成分有N-(3-氯烯丙基)-hexaminium氯化物，如來自Dow的Dowicide和Dowicil，芐索氯銨，如來自Rohm & Haas的Hyamine1622，甲基苯索氯銨，如來自Rohm&Haas的Hyamine10X，十六烷基吡啶鎓氯化物，如來自Merrell Labs的氯化十六烷基吡啶。
該抗微生物活性成分的用量在0.0001-1重量％的范圍內(nèi)，優(yōu)選在0.001-0.8重量％的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在0.005-0.3重量％的范圍內(nèi)，以及最優(yōu)選在0.01-0.2重量％的范圍內(nèi)。
另外，該洗滌劑可任選含有紫外吸收劑，所述吸收劑可吸附到經(jīng)處理的織物上，并增強(qiáng)纖維和/或其他組合物成分的光穩(wěn)定性。紫外吸收劑是有機(jī)物質(zhì)(濾光劑)，它們能吸收紫外線并以長波輻射如熱的形式釋放吸收的能量。
具有這些所需特性的化合物是例如通過無輻射鈍化而具有作用的化合物以及具有位置2和/或位置4取代基的二苯甲酮的衍生物。此外其他合適的紫外吸收劑是取代的苯并三唑、3-苯基-取代的丙烯酸鹽(位置2上任選用氰基取代的肉桂酸衍生物)、水楊酸鹽、有機(jī)Ni復(fù)合物和天然物質(zhì)，如傘形酮和內(nèi)生的尿刊酸。聯(lián)苯基以及主要是1，2-二苯乙烯衍生物具有特別的意義，例如在EP 0728749 A中所述的商業(yè)上以TinosorbFD和TinosorbFR ex Ciba可得到的。合適的UV-B吸收劑包括3-苯亞甲基樟腦或3-苯亞甲基降樟腦和它的衍生物，如在EP-B1 0693471中所述的3-(4-甲基苯亞甲基)-樟腦；4-氨基苯甲酸衍生物，優(yōu)選4-(二甲基氨基)-苯甲酸-2-乙基己基酯、4-(二甲基氨基)-苯甲酸-2-辛基酯和4-(二甲基氨基)-苯甲酸戊基酯；肉桂酸的酯，優(yōu)選4-甲氧基肉桂酸-2-乙基己基酯、4-甲氧基肉桂酸丙基酯、4-甲氧基肉桂酸異戊基酯、2-氰基-3，3-苯基肉桂酸-2-乙基己基酯(氰雙苯丙烯酸辛酯)；水楊酸的酯，優(yōu)選水楊酸-2-乙基己基酯、水楊酸-4-異丙基芐基酯、水楊酸高薄荷基酯；二苯甲酮的衍生物，優(yōu)選2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基-4′-甲基二苯甲酮、2，2′-二羥基-4-甲氧基二苯甲酮；亞芐基丙二酸的酯，優(yōu)選4-甲氧基亞芐基丙二酸二-2-乙基己基酯；三嗪衍生物，如2，4，6-三苯胺-(對(duì)-羰基-2′-乙基-1′-己氧基)-1，3，5-三嗪和EP0818450 A1中所述的辛基三嗪酮或者二辛基丁氨基三嗪酮(UvasorbHEB)；丙烷-1，3-二酮如1-(4-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-丙烷-1，3-二酮；如EP 0694521 B1中所述的酮三環(huán)(5.2.1.0)癸烷衍生物。其他合適的UV-B吸收劑有2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和堿金屬、堿土金屬、銨、烷基銨、烷醇銨及其葡糖銨鹽；二苯甲酮的磺酸衍生物，優(yōu)選2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸及其鹽；3-苯亞甲基樟腦的磺酸衍生物，如4-(2-氧代-3-亞龍腦基甲基)-苯磺酸和2-甲基-5-(2-氧代-3-亞龍腦基)-磺酸及其鹽。
典型的UV-A過濾劑具體有苯甲酰甲烷的衍生物，如1-(4′-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-丙烷-1，3-二酮、4-叔丁基-4′-甲氧基聯(lián)苯甲酰甲烷(Parsol 1789)、1-苯基-3-(4′-異丙基苯基)-丙烷-1，3-二酮和DE19712033 A1(BASF)中所述的烯胺化合物。UV-A和UV-B過濾劑當(dāng)然可以混合物的形式利用。除了上面提到的可溶性物質(zhì)外，不溶的光封閉色素，也就是細(xì)分散的優(yōu)選“毫微化的”金屬氧化物或鹽也可以用于這種目的。適合的金屬氧化物的例子具體有氧化鋅、二氧化鈦以及鐵、鋯、硅、鎂、鋁和鈰的氧化物以及它們的混合物。硅酸鹽(滑石)、硫酸鋇和硬脂酸鋅也可作為鹽使用。氧化物和鹽以色素的形式應(yīng)用在護(hù)膚的乳劑和裝飾性化妝品上。顆粒直徑平均小于100nm，優(yōu)選在5-50nm之間，以及更優(yōu)選在15-30nm之間。它們一般為球形，盡管橢圓或其他非球形顆粒也能用。這些色素也可經(jīng)表面處理，也就是說親水性的或疏水性的。典型的例子是包覆的二氧化鈦，如Titandioxid T805(Degussa)和EusolexT2000(Merck)。合適的疏水型包覆材料首要是硅氧烷，以及其中尤其是三烷氧基辛硅烷或者二甲硅油。微粉化的氧化鋅優(yōu)選使用。其他合適的UV過濾劑可以在P.Finkel，SFW-Journal 122，第543頁(1996)的綜述中找到。
UV吸收劑的常用量在0.01-5重量％的范圍內(nèi)，以及優(yōu)選在0.03-1重量％的范圍內(nèi)。
通常用于洗滌劑和清洗劑的成分還包括清潔和清洗活性的酶。同時(shí)，以除本發(fā)明蛋白質(zhì)之外的其它酶為特征的洗滌劑/清洗劑是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。對(duì)此例如是其它的蛋白酶以及氧化還原酶、角質(zhì)酶、酯酶和/或半纖維素酶，特別優(yōu)選是脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶和/或β-葡聚糖酶。
數(shù)十年來，將酶例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶或纖維素酶作為洗滌劑和清潔劑中的活性組分使用。它們各自對(duì)相關(guān)組合物的洗滌或清潔功效的作用是在蛋白酶的情況下降解含蛋白質(zhì)污物的能力，在淀粉酶的情況下降解含淀粉的污物，在脂肪酶的情況下裂解脂肪的活性。纖維素酶除其去污即基本洗滌和清潔功效外，特別由于其對(duì)洗滌劑的二次洗滌功效的作用和由于其對(duì)織物的纖維作用優(yōu)選在洗滌劑中使用。特定的水解產(chǎn)物被洗滌劑和清潔劑中的常規(guī)組分損壞、溶解、乳化或懸浮或者由于其高的溶解度被洗液沖洗出，因此獲得酶和其他組分之間的協(xié)同作用效果。
蛋白酶在天然纖維，特別是棉或絲上具有與纖維素酶對(duì)組合物的二次洗滌功效可比的效果。由于它們對(duì)織物表面結(jié)構(gòu)的影響，可以對(duì)該材料產(chǎn)生柔順的影響，并因此防止糾結(jié)。
其它酶通過它們特殊的酶功效增加相應(yīng)組合物的清洗功效。這些酶包括例如β-葡聚糖酶(WO 99/06515和WO 99/06516)、蟲漆酶(WO00/39306)或者果膠溶解酶(WO 00/42145)，這些具體用于特殊的清洗劑中。
在本發(fā)明的組合物中首先考慮使用從微生物例如細(xì)菌或真菌獲得的酶。他們以本身已知的方法從合適的微生物中通過發(fā)酵方法而獲得，這些微生物例如在德國公開申請DE 1940488和DE 2121397，在美國專利US 3,623,957和US 4,264,738，在歐洲專利申請EP 006 638和在國際專利公布WO 91/02792中有所描述。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或其他蛋白質(zhì)特別在儲(chǔ)存期間應(yīng)用穩(wěn)定劑來保護(hù)，例如避免通過物理作用、氧化或蛋白酶解而造成其變性、分解或失活。
一組穩(wěn)定劑是可逆的蛋白酶抑制劑，它能在洗滌劑稀釋之后在洗液中解離。芐脒氫氯化物和亮抑酶肽就為此目的而確立。硼砂、硼酸或它們的鹽或酯也經(jīng)常用于這種目的，它們首先包括例如在WO95/12655中由芳香基鄰位取代的苯基硼酸、在WO 92/19707中由芳香基間位取代的苯基硼酸和在US 5,972,873中由芳香基對(duì)位取代的苯基硼酸或它們的鹽或酯。在WO 98/13460和EP 583 534中公開了肽醛，也就是具有還原C末端的寡肽，特別是那些含有2-50個(gè)單體的，用于可逆性抑制洗滌劑蛋白酶。肽的可逆性蛋白酶抑制劑尤其包括卵類粘蛋白(WO 93/00418)。例如，WO 00/01826公開了針對(duì)蛋白酶枯草桿菌素的特異性可逆的肽抑制劑，用于含蛋白酶的組合物中，而WO00/01831公開了相應(yīng)的蛋白酶和抑制劑的融合蛋白質(zhì)。
其他酶的穩(wěn)定劑有氨基醇，如單-、二-、三-乙醇-和-丙醇胺和它們的混合物、例如從EP 0 378 261和WO 97/05227中得知的最多達(dá)C12的脂族羧酸，如琥珀酸，其他羧酸或上述酸的鹽。德國專利申請DE19650537中為此目的公開了封端的脂肪酸酰胺烷氧酸鹽。如WO97/18287中所公開，某些用作助洗劑的有機(jī)酸額外能夠穩(wěn)定存在的酶。
除了上面所有多羥基化合物如甘油、乙二醇、丙二醇或山梨醇以外，低級(jí)脂族醇也是其他常用的酶穩(wěn)定劑。同樣可以使用鈣鹽，例如醋酸鈣和在EP 0 028 865中為此目的公開的甲酸鈣，以及例如根據(jù)歐洲專利申請EP 0 378 262的鎂鹽也可使用。
聚酰胺寡聚物(WO 99/43780)或者聚合物，例如木質(zhì)素(WO97/00932)，水溶性乙烯基共聚物(EP 828 762)或者如EP 702 712中所公開的纖維素乙醚、丙烯酸聚合物和/或聚酰胺可對(duì)酶制劑產(chǎn)生穩(wěn)定作用，以克服物理影響或者pH值的變化。包含了聚胺-N-氧化物的聚合物(EP 587 550和EP 581 751)同時(shí)擔(dān)當(dāng)酶穩(wěn)定劑和染料轉(zhuǎn)移抑制劑。其它聚合物穩(wěn)定劑是除了在WO97/05227所公開的其他成分以外的直鏈C8-18聚氧化烯。如WO97/43377和WO98/45396所公開，烷基聚糖苷可穩(wěn)定本發(fā)明組合物中的酶成分，甚至提高它們的功效。如WO98/17764所公開，交聯(lián)的含氮化合物擔(dān)當(dāng)著污漬釋放劑和酶穩(wěn)定劑的雙重作用。根據(jù)WO97/32958，疏水性非離子聚合物與其它穩(wěn)定劑的混合物對(duì)纖維素酶有穩(wěn)定的作用，因此這些或者相似的組成也同樣適合本發(fā)明中所必需的酶。
如EP 780 466所公開，還原劑和抗氧化劑將增加酶對(duì)氧化分解的穩(wěn)定性。含硫的還原劑例如從EP 0 080 748和EP 0 080 223中得知。其它的例子是亞硫酸鈉(EP 533 239)和還原糖類(EP 656 058)。
在很多情況下，還采用穩(wěn)定劑的組合，例如在WO 96/31589中多羥基化合物、硼酸和/或硼砂的組合，在EP 126 505中硼酸或硼酸鹽、還原鹽與丁二酸或其它二羧酸的組合，或者硼酸或硼酸鹽與多羥基或多氨基化合物的組合以及與如EP 080 223中所披露的還原鹽的組合。根據(jù)WO98/13462，肽/乙醛穩(wěn)定劑的效果可通過與硼酸和/或硼酸衍生物和多羥基化合物的組合來增強(qiáng)，根據(jù)WO98/13459，其還可通過添加鈣離子而進(jìn)一步增強(qiáng)。
具有穩(wěn)定的酶活性的組合物代是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。特別優(yōu)選的是含有以上面提到的幾種方法而加以穩(wěn)定的酶的組合物。
因?yàn)楸景l(fā)明的組合物可以任何可想到的形式提供，所以在任何適合于加入特定組合物的配方中的本發(fā)明酶，均是本發(fā)明的實(shí)施方案。對(duì)此例如是液體組合物、固體顆?；蚰z囊。
以膠囊化形式提供來保護(hù)酶或其它成分不受其它組分例如漂白劑的影響，或者使緩釋成為可能。膠囊按照大小可以劃分為毫膠囊、微膠囊或者納膠囊，其中對(duì)于酶來說微膠囊特別優(yōu)選。例如，這樣的膠囊在專利公布WO 97/24177和DE 19918267中公開。另一可能的膠囊化方法在于從蛋白質(zhì)溶液與淀粉或淀粉衍生物的溶液或懸浮液混合開始，將蛋白質(zhì)包封在這些物質(zhì)中。一個(gè)如此膠囊化的方法在德國申請DE 19956382“微膠囊酶的生產(chǎn)方法(A process for the production ofmicroencapsulated enzymes)”中公開。
在固體組合物的情況下，該蛋白質(zhì)例如以干燥的、造粒的和/或膠囊化的形式使用。它們可以單獨(dú)即作為單相添加，或者與其它組分一起在同相中以壓實(shí)或未壓實(shí)形式添加。如果微膠囊化的酶以固態(tài)形式生產(chǎn)，則可按照現(xiàn)有技術(shù)已知的方法從加工獲得的水溶液中除去水，例如噴霧干燥、離心或者再溶解。以這種方式獲得的顆粒大小通常為50-200μm。
可以從按照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行的蛋白質(zhì)分離和制備開始將酶和本發(fā)明必需的蛋白質(zhì)以濃縮的水或非水溶液、懸浮液或乳液加入本發(fā)明的液體、凝膠狀或糊狀組合物中，同樣也可以凝膠狀或膠囊化或作為干燥粉末加入。本發(fā)明的這種洗滌劑或者清洗劑一般通過簡單混合成分來制備，所述成分以固體物質(zhì)本身或作為溶液加入自動(dòng)攪拌器中。
除基本洗滌功效外，在洗滌劑中包含的蛋白酶還可以滿足通過蛋白酶解裂解活化其它酶組分或者在相應(yīng)的作用時(shí)間之后使其失活的功用，例如在公布WO94/29426或EP 747 471中所公開的。通過本發(fā)明的酶也可以獲得可比的調(diào)節(jié)功能。此外，本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及那些具有由蛋白酶敏感材料制成的膠囊的組合物，其例如在預(yù)期的時(shí)間點(diǎn)被本發(fā)明蛋白質(zhì)水解并釋放出其內(nèi)容物。在其它多相組合物的情況下也可以獲得可比的效果。
本發(fā)明特有的主題是處理紡織原料或者織物保養(yǎng)的組合物，其特征在于，其僅含有或者除其它成分外還包含本發(fā)明的蛋白酶。因?yàn)樘貏e是天然纖維例如羊毛和絲的區(qū)分在于其獨(dú)特的微觀表面結(jié)構(gòu)特征。正如在R.Breier的文章“Melliand Textilberichte”1.4.2000(第263頁)中用許多羊毛的實(shí)例所說明的，所述表面結(jié)構(gòu)能長期能導(dǎo)致所不希望的效果，例如一些糾結(jié)。為了避免這種效果，使用本發(fā)明的組合物處理這些天然原材料，這些組合物例如有助于在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上使魚鱗狀的表面結(jié)構(gòu)光滑并因此防止糾結(jié)。特別優(yōu)選的實(shí)施方案是這種用于纖維或具有天然組分和特別是具有羊毛或絲的織物的組合物。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，含有本發(fā)明蛋白酶的組合物被這樣配制，即其一般可以作為保養(yǎng)劑使用，例如通過在洗滌過程中加入，在洗滌之后使用或者其應(yīng)用不依賴于洗滌。所需的效果在于，獲得光滑的織物表面結(jié)構(gòu)和/或預(yù)防和/或減少織物損壞。
本發(fā)明特有的主題是機(jī)械清潔織物或硬表面的方法，其特征在于，在洗滌過程的至少一個(gè)步驟中使本發(fā)明的蛋白酶活化。
機(jī)械清洗織物的方法的特征在于若干個(gè)方法步驟，所述步驟包括將不同的具有清潔活性的物質(zhì)施用到待清洗物上，并且在作用時(shí)間之后漂洗，或者以其它的方式將該待清洗物用清潔劑或該清潔劑的溶液處理。這同樣適合于機(jī)械清洗其他所有的非織物的材料，這些材料被概括為術(shù)語硬表面。這種方法可以在至少一個(gè)洗滌步驟中加入本發(fā)明的蛋白質(zhì)，并且是本發(fā)明的實(shí)施方案。
優(yōu)選的方法是其中本發(fā)明酶每次應(yīng)用的用量是40μg至4g，逐步優(yōu)選地是50μg至3g，100μg至2g，200μg至1g，特別優(yōu)選是400μg至400mg。
因?yàn)楸景l(fā)明的酶已經(jīng)自然具有溶解蛋白質(zhì)的活性，并且它們也可以在本來不具有清洗力的介質(zhì)(例如單純的緩沖液)中顯示所述活性，所以這種機(jī)械清洗織物的方法的單個(gè)分步驟可由在所需的情況下除穩(wěn)定的化合物、鹽或緩沖物質(zhì)外加入本發(fā)明的酶作為唯一的具有清洗活性的組分所組成。這是本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案。
本發(fā)明特有的主題是處理紡織原料或用于紡織品保養(yǎng)的方法，其特征在于，在至少一個(gè)洗滌步驟中使本發(fā)明的蛋白酶具有活性。因此涉及一種方法，其中制備的材料以用于紡織品中，例如為了抗氈精加工，或者例如涉及一種方法，該方法在穿舊的紡織品的清洗中增加了保養(yǎng)成分。盡管蛋白酶對(duì)某些織物產(chǎn)生上述作用，但是在優(yōu)選的實(shí)施方案中涉及紡織原料或含有天然成分特別是含有羊毛和絲的紡織品。
本發(fā)明特有的主題是本發(fā)明蛋白酶的應(yīng)用，其用于洗滌紡織品，或者是硬表面。因?yàn)楸景l(fā)明的酶，特別地按照上述方法，可以用來清除紡織品或硬表面的類蛋白質(zhì)的污物。機(jī)械方法之外的應(yīng)用，例如手洗或者人工除去紡織品或硬表面的污漬是優(yōu)選的實(shí)施方式。
優(yōu)選在本發(fā)明酶的應(yīng)用中，每次使用的用量是是40μg至4g，逐步優(yōu)選地是50μg至3g，100μg至2g，200μg至1g，特別優(yōu)選是400μg至400mg。
本發(fā)明特有的主題是本發(fā)明的蛋白酶使洗滌劑或清洗劑的成分活化或失活的應(yīng)用。因?yàn)椋阎囊粯?，洗滌劑或清洗劑的蛋白質(zhì)組分通過蛋白酶的作用而失去活性。本發(fā)明具體涉及使用這種本來所不希望的作用。同樣通過蛋白酶解可以僅使其它的組分活化，例如當(dāng)所述組分是一種由真正的酶和其相應(yīng)的抑制劑組成的雜合蛋白質(zhì)時(shí)，如在公布WO00/01831中所公開的。這種調(diào)節(jié)的另一實(shí)例是其中的活性組分已包封在一種易受酶攻擊的材料中來保護(hù)或控制其活性。因此本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用于失活、活化或釋放反應(yīng)中。
本發(fā)明特有的主題是本發(fā)明蛋白酶的應(yīng)用，其用于生物化學(xué)或分子生物分析，特別是在酶分析方法中。根據(jù)本發(fā)明和Rmpp，“LexikonChemie”(Version 2.0，Stuttgart/New YorkGeorg Thieme Verlag，1999)，術(shù)語酶分析是指每一種利用特定的酶或底物來一方面測定底物本身或其濃度或者另一方面測定酶本身或活性的任何生物化學(xué)分析。應(yīng)用領(lǐng)域是所有與生物化學(xué)相關(guān)的領(lǐng)域。本發(fā)明主題的優(yōu)選實(shí)施方案是在序列分析領(lǐng)域中用于測定端基。
本發(fā)明特有的主題是本發(fā)明蛋白酶的應(yīng)用，其用于制備、純化或合成天然物質(zhì)或生物原料。所以例如在天然物質(zhì)或生物原料的純化過程中需要從所述物質(zhì)中清除蛋白質(zhì)污物。對(duì)此例如涉及低分子量化合物、所有的細(xì)胞組分和儲(chǔ)存物質(zhì)或者蛋白質(zhì)。這不但在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模中而且在大工業(yè)規(guī)模中例如可按照生產(chǎn)原料的生物技術(shù)方法來進(jìn)行。
本發(fā)明的蛋白酶用于合成蛋白質(zhì)或其它低分子量化合物出現(xiàn)在由其天然催化的反應(yīng)的逆向中，例如當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)片段相互結(jié)合或者將氨基酸連接到不是主要由蛋白質(zhì)組成的化合物上時(shí)。這種應(yīng)用例如描述在申請EP 380362中。
本發(fā)明特有的主題是本發(fā)明蛋白酶的應(yīng)用，其用于處理從中應(yīng)該除去蛋白質(zhì)污物的天然原料，其中主要是非生物方法獲得的原料，例如那些來自農(nóng)業(yè)的原料。
優(yōu)選的實(shí)施方案是用于表面處理，特別是在處理經(jīng)濟(jì)上有意義的原料皮革的工藝中的應(yīng)用。鞣革工藝，特別是在堿性柔化步驟中(Rmpp，“Lexikon Chemie”，Version 2.0，Stuttgart/New YorkGeorg ThiemeVerlag，1999)借助于蛋白酶從皮革材料中除去水溶性蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)，尤其在堿性條件下和采用變性劑時(shí)，對(duì)此是特別適合的。
本發(fā)明特有的主題是本發(fā)明蛋白酶的應(yīng)用，其用于獲得或者處理紡織品加工中的原材料或中間產(chǎn)品。對(duì)此的實(shí)例是加工棉花，其在被稱作制漿的步驟中必須除莢；另一實(shí)例是處理羊毛；類似地也可用于加工粗絲。酶方法，特別是在其環(huán)境相容性方面，優(yōu)于可比的化學(xué)方法。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)用于除去紡織品，特別是中間產(chǎn)品或原材料的保護(hù)層或者使其表面光滑，之后它們在隨后的工藝步驟中被進(jìn)一步處理。
在本發(fā)明特有的主題中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)用于處理紡織原料或用于紡織品的保養(yǎng)，特別是用于羊毛或絲綢或含羊毛或絲綢的混合紡織品的表面處理。這不但適用于這種紡織品的制備而且適用于使用期間的保養(yǎng)，例如在該紡織品清洗時(shí)(參見上文)。
本發(fā)明特有的主題是本發(fā)明蛋白酶的應(yīng)用，其用于處理照相膠片，特別是除去含明膠或類似的保護(hù)層。因?yàn)槟z片例如X線膠片被這樣的保護(hù)層特別是由含銀鹽的明膠乳液涂覆，它們在載體材料曝光之后必須去除。對(duì)此，特別是在堿性或略微變性的反應(yīng)條件下可以使用本發(fā)明的蛋白酶。
本發(fā)明特有的主題是本發(fā)明蛋白酶的應(yīng)用，其用于制備食品或動(dòng)物飼料。所以自古以來蛋白酶已經(jīng)被用于產(chǎn)品生產(chǎn)。對(duì)此的實(shí)例是凝乳酶用于奶酪或其它奶制品的制備過程中。可以加入本發(fā)明的蛋白質(zhì)或者完全采用本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行該過程。同樣用于非營養(yǎng)目的富含碳水化合物的食品或食品原料，例如面粉或糊精，可以用合適的蛋白酶處理，以便從其中除去伴隨的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白酶也適合于這種應(yīng)用，尤其當(dāng)其在堿性或略微變性的條件下進(jìn)行時(shí)。
相應(yīng)地也適用于動(dòng)物飼料的生產(chǎn)。這里除完全除去蛋白質(zhì)外還感興趣的是用蛋白酶僅短時(shí)間地處理類蛋白質(zhì)原料或原料混合物，以便使其對(duì)于家禽來說更易消化。
本發(fā)明特有的主題是具有本發(fā)明蛋白酶的化妝用組合物或者使用本發(fā)明蛋白酶的化妝方法，或者本發(fā)明的蛋白酶用于化妝目的，特別是在相應(yīng)的方法或相應(yīng)的組合物的范圍內(nèi)。
因?yàn)榈鞍酌冈谌祟惼つw的細(xì)胞再生過程(脫皮)中扮演重要的角色(T.Egelrud等，Acta Derm.Venerol.，第71卷(1991)，第471至474頁)。因此蛋白酶也作為生物活性組分被用于皮膚保養(yǎng)產(chǎn)品中以便促進(jìn)干性皮膚中增多的橋粒結(jié)構(gòu)的退化，例如根據(jù)公布WO95/07688或WO99/18219。例如在WO97/07770中描述了枯草桿菌蛋白酶，特別是上述的遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶-變體用于化妝目的。本發(fā)明的蛋白酶，特別是那些例如在突變或通過添加合適的與其相互作用的物質(zhì)來控制其活性的蛋白酶同樣適合在皮膚或頭發(fā)洗滌或氧護(hù)組合物中作為活性組分。特別優(yōu)選這些酶的制品，其如上所述例如通過連接在大分子載體上而被穩(wěn)定(對(duì)照US 5230891)和/或通過在高變應(yīng)原位置的點(diǎn)突變而被衍生化，所以它們與人皮膚的相容性增加。
因此，這種蛋白酶用于化妝目的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的主題，特別是在相應(yīng)組合物中的應(yīng)用，例如香波、皂或洗滌液，或者在以霜的形式提供的護(hù)理組合物中的應(yīng)用。同樣在脫皮藥物中的應(yīng)用也包括在本發(fā)明的權(quán)利要求中。
實(shí)施例實(shí)施例1本發(fā)明蛋白酶的制備所有的分子生物學(xué)操作方法均按照標(biāo)準(zhǔn)方法，例如在Fritsch、Sambrool和Maniatis編輯的“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊”，Cold SpringHarbour Laboratory Press，New York，1989年或者國際專利公布WO92/21760中說明的。
突變載體的構(gòu)建突變從蛋白酶變體遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶M 131開始進(jìn)行。這個(gè)變體描述在WO92/21760中，并且形成它的菌株根據(jù)該申請以名稱地衣形芽胞桿菌ATCC 68614保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，MD，USA。該菌株在表達(dá)盒中含有在芽胞桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pCB56M131上的基因，所述表達(dá)盒包含啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及ATG-起始密碼子，及與前體蛋白質(zhì)融合的來自地衣形芽胞桿菌ATCC 53926的堿性蛋白酶的22氨基末端的氨基酸，以及遲緩芽胞桿菌DSM 5483-堿性蛋白酶的突變序列。變體遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶M131與天然的序列相比具有下列的突變S3T、V4I、A188P、V193M、V199I。
為了突變，整個(gè)表達(dá)盒借助于限制酶Bam HI和Sac I切割，并克隆到同樣用Bam HI和Sac I切割的載體pUC18(Amersham PharmaciaBiotech，F(xiàn)reiburg，德國)中。然后這樣獲得的載體pUC18M131進(jìn)行下列的突變步驟。載體pUC18M131描述在附圖2中。在SEQ ID NO.1中記錄了包含遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶M131的表達(dá)盒的DNA片段；SEQ ID NO.2表示由其導(dǎo)出的氨基酸序列。在SEQ ID NO.1中描述的Bam HI-Sac I-片段在附圖2描述的載體pUC18M131中從位置1延伸至位置177 1；其余的載體區(qū)域與起始質(zhì)粒pUC18的相同。
突變首先在位置188和193中恢復(fù)遲緩芽胞桿菌DSM 5483的堿性蛋白酶的原始序列。對(duì)此按照制造商的說明書采用Stratagene的QuikChange方法(La Jolla，CA，USA)。按照該體系，在使用兩個(gè)互補(bǔ)的包含各種突變的引物下，在聚合酶反應(yīng)中制備突變的質(zhì)粒。在借助于Dpnl消化起始質(zhì)粒之后，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)XL-1 blue中。該獲得的克隆，如果合適，可以借助于通過突變導(dǎo)入的限制酶切位點(diǎn)而輕易地識(shí)別，在每種情況下按照鏈終止方法，借助于常規(guī)的試劑盒通過DNA測序進(jìn)行檢查。
為了將編碼位置188的氨基酸的三聯(lián)體CAA(脯氨酸)轉(zhuǎn)換成GCC(丙氨酸)，使用下列兩個(gè)引物5’-TCA CAG TAT GGC GCC GGGCTT GAC ATT-3’以及5-AAT GTC AAG CCC GGC GCC ATA CTGTGA-3’。它們在直接鄰近突變之處包含未改變氨基酸序列的Nar 1-限制酶切位點(diǎn)。
為了將編碼位置193的氨基酸的三聯(lián)體ATG(甲硫氨酸)轉(zhuǎn)化為ATT(異亮氨酸)，采用下列兩個(gè)引物5’-GGG CTT GAC ATT GTG GCACCC GGG GTA AAC-3’以及5’-GTT TAC CCC GGG TGC CAC AATGTC AAG CCC-3’。它們在直接鄰近突變之處包含未改變氨基酸序列的Xma Cl-限制酶切位點(diǎn)。
包含雙向突變的質(zhì)粒的克隆為隨后在位置211的三聯(lián)體TTA(亮氨酸)突變?yōu)镚GA(甘氨酸)提供了模板。對(duì)此使用下列兩個(gè)互補(bǔ)序列5’-ACG TAT GCT AGC GGA AAC GGT ACA TCG-3’以及5’-CGA TGTACC GTT TCC GCT AGC ATA CGT-3’的引物。它們在直接鄰近突變之處包含未改變氨基酸序列的Nhe 1-限制酶切位點(diǎn)。然后通過DNA測序核查用Nhe 1產(chǎn)生的所需片段的克隆。
編碼整個(gè)蛋白酶的BLAP-S3T、V4I、V199I、L211G突變基因的DNA-序列在序列表中以SEQ ID NO.3給出。由此可以導(dǎo)出在序列表中SEQ ID NO.4下給出的氨基酸序列。該遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶-變體由于與來自遲緩芽胞桿菌DSM 5483的野生型酶有不同的位置，故被稱作遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。
突變體的表達(dá)和蛋白酶制備具有突變序列的表達(dá)盒作為Bam HI-Sac I-片段再被克隆在載體pCB56M131中，代替在SEQ ID NO.1中描述的片段，并且轉(zhuǎn)化到枯草芽胞桿菌DB 104中。菌株枯草芽胞桿菌DB 104具有基因型his、nprR2、nprE18、aprA3(Kamamura，F(xiàn).和Doi，R.H.1984，J.Bacteriol.，第160卷，第442至444頁)。DNA轉(zhuǎn)化到芽胞桿菌中，按照在WO91/02792中描述的最初由Chang和Cohen開發(fā)的原生質(zhì)體方法(1979；Molec.Gen.Genet.，第168卷，第111至115頁)的變體方案進(jìn)行。
因此獲得的蛋白酶-陽性克隆在鑒定之后在2000毫升搖瓶的500毫升MLBSP-培養(yǎng)基(10g/l酪胨；10g/l色氨酸，10g/l酵母抽提物均來自Becton Dickinson，Cockeysville；5g/l NaCl；27g/l琥珀酸鈉；100mg/lMgSO4·7H2O；75mg/l CaCl2·2H2O；0.5μM MnC12；0.5μM FeSO4；2％(w/v)葡萄糖；50mM PIPES-緩沖液(由pH為7.2的1M儲(chǔ)液制成)；75mM KPO4(由pH為7.0的1.5M儲(chǔ)液制成)；pH＝7.0，用KOH調(diào)節(jié)，以及10μg/ml四環(huán)素)中在37℃和每分鐘200轉(zhuǎn)下溫育72小時(shí)。將細(xì)胞離心分離之后獲得的上清液在確定蛋白酶活性(按照在《表面活性劑》(Tenside)第7卷(1970)，第125至132頁描述的方法)之后用于下面的試驗(yàn)中。
實(shí)施例2在下面的兩個(gè)實(shí)施例中使用以標(biāo)準(zhǔn)方式污染的紡織品，該紡織品由材料檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)，St.Galler，Schweiz，Switzerland(EMPA)或者Waschereiforschungsanstalt，Krefeld，德國購得。在實(shí)施例2中試驗(yàn)下列的污漬/紡織品A(在棉織物上的血跡/牛奶/煙灰)、B(在棉織物上的血跡/牛奶/墨汁)、C(在聚酯-棉-混合織物上的血跡/牛奶/墨汁)以及D(在棉織物上的雞蛋/煙灰)。利用耐洗牢度試驗(yàn)儀(launderometer)，將這些試驗(yàn)材料檢測各種洗滌劑組合物的清洗功效。為此目的，調(diào)整固液比為1∶12，并將織物在40℃下清洗30分鐘。劑量為每升清洗液中特定洗滌劑為5.88g。水硬度為16°德國制硬度。
具有下列組成的洗滌劑基本配方作為對(duì)照洗滌劑(用重量百分比表示)4％直鏈烷基苯磺酸鹽(鈉鹽)、4％ C12-18脂肪醇硫酸鹽(鈉鹽)、5.5％C12-18脂肪醇x7 EO、1％皂鈉、11％碳酸鈉、2.5％無定型二硅酸鈉(Sadium disilicate)、20％過硼酸鈉四水合物、5.5％ TAED、25％沸石A、4.5％聚羧酸酯、0.5％膦酸鹽、2.5％粒狀泡沫抑制劑、5％硫酸鈉，其余為水、熒光增白劑和鹽。對(duì)于各種測試系列，將下列的蛋白酶加入到對(duì)照洗滌劑中，以使在每種情況下的最終濃度為每升清洗液中蛋白酶解活性為2.250PE遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶F49(WO95/23221；制造商Biozym，Kundl，Australia)、Savinase(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)以及本發(fā)明的蛋白酶遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。
清洗后，以硫酸鋇的白度作為標(biāo)準(zhǔn)100％，與之對(duì)比測出洗過織物的白度。測量用的是Datacolor SF500-2分光光度計(jì)，測試條件為460nm(紫外阻擋濾光片3)、孔徑30mm、無光澤面、光源類型D65、10°、d/8°。下表3中給出了測試結(jié)果，以反射率％表示，即和硫酸鋇比較的百分?jǐn)?shù)，表3還列出每種情況下的起始值。所示值是4次測量的平均值。它們是所包含的酶對(duì)所用洗滌劑的清洗功效的作用的直接指標(biāo)。
表3
從表中可以看出，本發(fā)明的蛋白酶與常規(guī)的蛋白酶遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶F49和Savinase相比在所有污漬上均表現(xiàn)對(duì)具體組合物的洗滌功效具有更大的作用。
實(shí)施例3除實(shí)施例2中給出的污漬/紡織品外這里還使用了試樣E(在棉花上的血跡)。將這些紡織品與實(shí)施例2中相同的方式并用相同的洗滌液在Launderometer中進(jìn)行測定。與實(shí)施例2相比唯一的不同在于現(xiàn)在在60℃的溫度下洗滌。同樣如在上述實(shí)施例中所描述的一樣進(jìn)行該試驗(yàn)系列的評(píng)價(jià)；結(jié)果列于下面的表4中。
表4
如這些結(jié)果所示，在60℃的洗滌溫度下，本發(fā)明的堿性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G在對(duì)每種情況下的組合物的洗滌功效方面同樣超過其它用于洗滌劑的蛋白酶遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶F49和Savinase或者在誤差范圍內(nèi)至少不相上下。
實(shí)施例4在標(biāo)準(zhǔn)化條件下將具有硬的光滑表面的容器與下列污漬接觸(A)半熟蛋、(B)蛋/奶、(C)混合淀粉和(D)肉末，并45℃下用家用洗碗機(jī)(MieleG 676)的正常操作程序清洗。洗滌劑的用量為每一清洗循環(huán)為20g；水的硬度為16°德國制硬度。
下列基本配方用于洗碗劑(所有值按重量百分比計(jì))55％三磷酸鈉(以無水計(jì)算)、4％無定型二硅酸鈉(以無水計(jì)算)、22％碳酸鈉、9％過硼酸鈉、2％TAED、2％非離子表面活性劑，其余為水、染料和香精。對(duì)于各種測試，將各種蛋白酶酶，即遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶F49、Savinase以及本發(fā)明的蛋白酶-變體遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G以每清洗循環(huán)活性為10000PE相同活性的方式加入到基本配方中。這相當(dāng)于每克洗滌劑濃縮物有約0.1毫克的蛋白酶-蛋白質(zhì)。
清洗后，污漬A至C的除去按重量差測定，以％表示。對(duì)此，受污染后清洗的容器的重量與容器的初始重量之間的差異和未清洗的容器與其初始重量之間的差異有關(guān)。這種關(guān)系可看成是去除百分率。對(duì)污漬D在清洗之后按照0(＝不變，即十分顯著的污漬)到10(＝無可辨別的污漬)等級(jí)進(jìn)行目測評(píng)估。下表5列出了所獲得的結(jié)果。這里給出的是9次測量的平均值。它們是所包含的酶對(duì)所用洗滌劑的清洗功效的作用的直接指標(biāo)。
表5
這些結(jié)果表明，在洗碗機(jī)洗滌劑中，本發(fā)明的堿性蛋白酶S3T/V41I/V199I/L211G對(duì)洗滌功效的作用優(yōu)于試驗(yàn)的蛋白酶，或者至少不相上下；并且在相對(duì)低的使用活性下也是這樣的。
實(shí)施例5
同前述實(shí)施例，將容器與相同的污漬接觸，并以相同的方式用每種情況下相同的清洗劑配方清洗。唯一的區(qū)別在于，在每種情況下蛋白酶的用量是20000PE。這相當(dāng)于在每種情況下洗滌劑濃縮物中含有約0.2毫克的蛋白酶。以與實(shí)施例4中相同的方式獲得的測量結(jié)果列于下表6中。
表6
。



序列表<110>漢高兩合股份公司(Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien)<120>新型堿性蛋白酶變體及含有該新型堿性蛋白酶變體的洗滌劑和清洗劑(Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch-undReinigungsmittel enthaltend diese neuen AlkalischenProtease-Varianten)<130> SCT033039-47<140>
<141>
<150> DE 10121463.4-41<151>2001-05-02<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1773<212>DNA<213>地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)ATCC 68614<220>
<221>CDS<222>(233)..(1375)<220>
<221>mat_肽<222>(566)..(1375)<400>1ggatcctcgg gacctctttc cctgccaggc tgaagcggtc tattcatact ttcgaactga 60acatttttct aaaacagtta ttaataacca aaaaatttta aattggtcct ccaaaaaaat 120aggcctacca tataattcat tttttttcta taataaatta acagaataat tggaatagat 180tatattatcc ttctatttaa attattctga ataaagagga ggagagtgag ta atg atg 238Met Met-110
agg aaa aag agt ttt tgg ctt ggg atg ctg acg gcc ttc atg ctc gtg 286Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met Leu Val-105-100 -95ttc acg atg gca tcg atc gca tcg gct gct gag gaa gca aaa gaa aaa 334Phe Thr Met Ala Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys Glu Lys-90 -85 -80tat tta att ggc ttt aat gag cag gaa gct gtc agt gag ttt gta gaa 382Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe Val Glu-75 -70 -65caa gta gag gca aat gac gag gtc gcc att ctc tct gag gaa gag gaa 430Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu Glu Glu-60 -55 -50gtc gaa att gaa ctg ctt cat gag ttt gaa acg att cct gtt tta tcc 478Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val Leu Ser-45 -40 -35 -30gtt gag tta agc cca gaa gat gtg gac gcg ctt gaa ctt gat cca gcg 526Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp Pro Ala-25 -20 -15att tct tat att gaa gag gat gca gaa gta acg aca atg gcg caa aca 574Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala Gln Thr-10 -5 -1 1atc cca tgg gga att agc cgt gtg caa gcc ccg gct gcc cat aac cgt 622Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His Asn Arg5 10 15gga ttg aca ggt tct ggt gta aaa gtt gct gtc ctc gat aca ggt att 674Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile20 25 30 35tcc act cat cca gac tta aat att cgt ggt ggc gct agc ttt gta cca 718Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro40 45 50ggg gaa cca tcc act caa gat ggg aat ggg cat ggc acg cat gtg gcc 766Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala55 60 65
ggg acg att gct gct tta aac aat tcg att ggc gtt ctt ggc gta gcg 814Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala70 75 80cct agt gcg gaa cta tac gct gtt aaa gtt tta gga gcc gac ggt aga 862Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Arg85 90 95ggt gca atc agc tcg att gcc caa ggg ttg gaa tgg gca ggg aac aat 910Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly Asn Asn100 105 110 115ggc atg cac gtt gct aat ttg agt tta gga agc cct tcg cca agt gcc 958Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro Ser Ala120 125 130aca ctt gag caa gct gtt aat agc gcg act tct aga ggc gtt ctt gtt 1006Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val Leu Val135 140 145gta gcg gca tct ggg aat tca ggt gca agc tca atc agc tat ccg gcc 1054Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser Tyr Pro Ala150 155 160cgt tat gcg aac gca atg gca gtc gga gct act gac caa aac aac aac 1102Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn Asn Asn165 170 175cgc gcc agc ttt tca cag tat ggc cca ggg ctt gac att atg gca cca 1150Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Pro Gly Leu Asp Ile Met Ala Pro180 185 190 195ggg gta aac att cag agc aca tac cca ggt tca acg tat gcc agc tta 1198Gly Val Asn Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser Leu200 205 210aac ggt aca tcg atg gct act cct cat gtt gca ggt gca gca gcc ctt 1246Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu215 220 225gtt aaa caa aag aac cca tct tgg tcc aat gta caa atc cgc aac cat 1294Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg Asn His230 235 240
cta aag aat acg gca acg agc tta gga agc acg aac ttg tat gga agc 1342Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr Gly Ser245 250 255gga ctt gtc aat gca gaa gcg gca aca cgc taa tcaataaaaa aaccgtgtgc 1395Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg260 265 270gcttaaaggg cacagctttt tttgtgtatg aatcgaaaaa agagaacaga tcgcaggtct 1455caaaaatcga gcgtaaaggg ttgtttaaag ctctttacgc tcgcaggtct tatcgctata 1515caatggaaaa ttcacgtctt ttgactttca tggcatattt atttaagtat tcgtttgctt 1575tttcgtactc tccgtttttc tggtacctcc ttctactatg ggaaaggtct gatcaatgtc 1635gaagctgccg ctcaataaca tattctaaca aatagcatat agaaaaagct agtgttttta 1695gcactagctt tttcttcatt ctgatgaagg ttgttcaata ttttgaatcc gttccatgat 1755cgtcgggtac cgagctct 1773<210>2<211>380<212>PRT<213>地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)ATCC 68614<400>2Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met1 5 10 15Leu Val Phe Thr Met Ala Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys20 25 30Glu Lys Tyr Leu Ile GIy Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe35 40 45Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu50 55 60Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val65 70 75 80Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp85 90 95Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala100 105 110
Gln Thr Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His115 120 125Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr130 135 140Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe145 150 155 160Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His165 170 175Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly180 185 190Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp195 200 205Gly Arg Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly210 215 220Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro225 230 235 240Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val245 250 255Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser Tyr260 265 270Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn275 280 285Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Pro Gly Leu Asp Ile Met290 295 300Ala Pro Gly Val Asn Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala305 310 315 320Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala325 330 335Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg340 345 350Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr355 360 365Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg370 375 380<210>3<211>1143<212>DNA<213>人工序列(Künstliche sequenz)<220>
<223>遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶(Bacillus lentus Alkalische Protease)
S3T/V4I/V199I/L211G<220>
<221>CDS<222>(1)..(1143)<220>
<221>mat_肽<222>(334)..(1143)<400>3atg atg agg aaa aag agt ttt tgg ctt ggg atg ctg acg gcc ttc atg48Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met-110-105-100ctc gtg ttc acg atg gca tcg atc gca tcg gct gct gag gaa gca aaa96Leu Val Phe Thr Met Ala Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys-95 -90 -85 -80gaa aaa tat tta att ggc ttt aat gag cag gaa gct gtc agt gag ttt144Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe-75 -70 -65gta gaa caa gta gag gca aat gac gag gtc gcc att ctc tct gag gaa192Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu-60 -55 -50gag gaa gtc gaa att gaa ctg ctt cat gag ttt gaa acg att cct gtt240Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val-45 -40 -35tta tcc gtt gag tta agc cca gaa gat gtg gac gcg ctt gaa ctt gat288Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp-30 -25 -20cca gcg att tct tat att gaa gag gat gca gaa gta acg aca atg gcg336Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala-15 -10 -5 -1 1caa aca atc cca tgg gga att agc cgt gtg caa gcc ccg gct gcc cat384Gln Thr Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His5 10 15aac cgt gga ttg aca ggt tct ggt gta aaa gtt gct gtc ctc gat aca432
Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr20 25 30ggt att tcc act cat cca gac tta aat att cgt ggt ggc gct agc ttt480Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe35 40 45gta cca ggg gaa cca tcc act caa gat ggg aat ggg cat ggc acg cat528Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His50 55 60 65gtg gcc ggg acg att gct gct tta aac aat tcg att ggc gtt ctt ggc576Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly70 75 80gta gcg cct agt gcg gaa cta tac gct gtt aaa gtt tta gga gcc gac624Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp85 90 95ggt aga ggt gca atc agc tcg att gcc caa ggg ttg gaa tgg gca ggg672Gly Arg Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly100 105 110aac aat ggc atg cac gtt gct aat ttg agt tta gga agc cct tcg cca720Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro115 120 125agt gcc aca ctt gag caa gct gtt aat agc gcg act tct aga ggc gtt768Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val130 135 140 145ctt gtt gta gcg gca tct ggg aat tca ggt gca agc tca atc agc tat816Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser Tyr150 155 160ccg gcc cgt tat gcg aac gca atg gca gtc gga gct act gac caa aac864Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn165 170 175aac aac cgc gcc agc ttt tca cag tat ggc gcc ggg ctt gac att gtg912Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val180 185 190gca ccc ggg gta aac att cag agc aca tac cca ggt tca acg tat gct960
Ala Pro Gly Val Asn Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala195 200 205agc gga aac ggt aca tcg atg gct act cct cat gtt gca ggt gca gca 1008Ser Gly Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala210 215 220 225gcc ctt gtt aaa caa aag aac cca tct tgg tcc aat gta caa atc cgc 1056Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Ash Val Gln Ile Arg230 235 240aac cat cta aag aat acg gca acg agc tta gga agc acg aac ttg tat 1104Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr245 250 255gga agc gga ctt gtc aat gca gaa gcg gca aca cgc taa 1143Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg260 265 270<210>4<211>380<212>PRT<213>人工序列(Künstliche sequenz)<223>遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶(Bacillus lentus Alkalische Protease)S3T/V4I/V199I/L211G<400>4Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met1 5 10 15Leu Val Phe Thr Met Ala Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys20 25 30Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe35 40 45Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu50 55 60Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val65 70 75 80Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp85 90 95Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala100 105 110Gln Thr Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His115 120 125
Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr130 135 140Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe145 150 155 160Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His165 170 175Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly180 185 190Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp195 200 205Gly Arg Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly210 215 220Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro225 230 235 240Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val245 250 255Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser Tyr260 265 270Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn275 280 285Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val290 295 300Ala Pro Gly Val Asn Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala305 310 315 320Ser Gly Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala325 330 335Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg340 345 350Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr355 360 365Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg370 375 380
權(quán)利要求
1.一種枯草桿菌蛋白酶型的堿性蛋白酶，其特征在于，根據(jù)遲緩芽胞桿菌(Bacillus lentus)DSM 5483枯草桿菌蛋白酶的編號(hào)，其具有在位置199的異亮氨基酸和在位置211的甘氨酸以及至少一個(gè)穩(wěn)定作用氨基酸。
2.一種枯草桿菌蛋白酶型的堿性蛋白酶，其特征在于，根據(jù)遲緩芽胞桿菌DSM 5483枯草桿菌蛋白酶的編號(hào)，其具有在位置199的異亮氨基酸和在位置211的甘氨酸并附加地具有位置3的蘇氨酸和位置4的異亮氨酸中的任一氨基酸。
3.一種枯草桿菌蛋白酶型的堿性蛋白酶，其特征在于，根據(jù)遲緩芽胞桿菌DSM 5483枯草桿菌蛋白酶的編號(hào)，其具有在位置3的蘇氨酸、在位置4的異亮氨酸、在位置199的異亮氨酸和在位置211的甘氨酸。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的堿性蛋白酶，其特征在于，其是由芽胞桿菌，特別是遲緩芽胞桿菌自然形成或者是由這樣的芽胞桿菌衍生的枯草桿菌蛋白酶。
5.權(quán)利要求4所述的堿性蛋白酶，其特征在于，其是由遲緩芽胞桿菌DSM 5483天然形成或者由其衍生的枯草桿菌蛋白酶，特別是根據(jù)SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的遲緩芽胞桿菌-堿性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。
6.從權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的蛋白酶衍生的蛋白質(zhì)，特別是通過斷裂或缺失突變、插入突變、取代突變或是通過至少一部分與至少另一種蛋白質(zhì)融合獲得的蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其進(jìn)一步被衍生化。
8.權(quán)利要求6或7所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其具有蛋白酶解活性，與起始分子或非衍生化的分子相比優(yōu)選具有更高的蛋白酶解活性，更特別地具有改善的功效。
9.權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其附加地被穩(wěn)定化。
10.一種用于編碼在權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的核酸。
11.一種編碼枯草桿菌蛋白酶的核酸，其核苷酸序列與SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列相對(duì)應(yīng)，特別是在編碼位置199的異亮氨酸和位置211的甘氨酸的區(qū)域中，更特別是在編碼位置3的蘇氨酸、位置4的異亮氨酸、位置199的異亮氨酸和位置211的甘氨酸的區(qū)域中。
12.一種載體，其含有權(quán)利要求10或11所述的核酸區(qū)域，特別是含有編碼在權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或衍生物的核酸區(qū)域。
13.一種克隆載體，其含有權(quán)利要求10或11所述的核酸區(qū)域，特別是含有編碼在權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或衍生物的核酸區(qū)域。
14.一種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求10或11所述的核酸區(qū)域，特別是含有編碼在權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或衍生物并使其生物合成成為可能的核酸區(qū)域。
15.一種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所述的載體。
16.一種宿主細(xì)胞，其表達(dá)或可被誘導(dǎo)表達(dá)在權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或衍生物，特別是通過使用權(quán)利要求14所述的表達(dá)載體。
17.權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，其是細(xì)菌，特別是一種將形成的蛋白質(zhì)分泌在周圍介質(zhì)中的細(xì)菌。
18.權(quán)利要求17所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，其是枯草桿菌屬細(xì)菌，特別是遲緩芽胞桿菌(Bacillus lentus)、地衣形芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)或嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)。
19.權(quán)利要求15或16所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，其是真核細(xì)胞，特別是一種翻譯后修飾形成的蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
20.一種使用權(quán)利要求15至19中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞和/或使用權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所述的載體和/或使用權(quán)利要求10或11所述的核酸來制備權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶或衍生物的方法。
21.一種組合物，其特征在于，其包含權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶，特別是一種洗滌劑或清洗劑，更優(yōu)選是每克所述組合物包含2μg至20mg的酶量。
22.權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，其進(jìn)一步包含另一種酶，特別是其他蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶和/或脂肪酶。
23.一種用于處理紡織原料或用于織物保養(yǎng)的組合物，其特征在于，其僅包含或除其它活性成分以外還包含權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶，特別是用于纖維或具有天然成分的紡織品，更特別是用于那些含羊毛或絲的紡織品的組合物。
24.一種機(jī)械清洗紡織品或硬表面的方法，其特征在于，在清洗過程的至少一個(gè)步驟中使權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶活化，優(yōu)選每次使用的用量是40μg至4g，特別優(yōu)選是400μg至400mg。
25.一種用于處理紡織原料或用于織物保養(yǎng)的方法，其特征在于，在清洗過程的至少一個(gè)步驟中使權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶活化，特別是用于紡織原料或含有天然成分的紡織品，更特別是用于那些含羊毛或絲的紡織品的方法。
26.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶的應(yīng)用，其用于清洗紡織品或硬表面，優(yōu)選每次使用的用量是40μg至4g，特別優(yōu)選是400μg至400mg。
27.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶的應(yīng)用，其用于活化洗滌劑或清洗劑的成分或使其失活。
28.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶的應(yīng)用，其用于生物化學(xué)分析或用于合成低分子量的化合物或蛋白質(zhì)。
29.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶的應(yīng)用，其用于制備、純化或合成天然物質(zhì)或生物材料。
30.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶的應(yīng)用，其用于處理天然原料，特別是用于表面處理，更特別是在處理皮革的方法中的應(yīng)用。
31.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶的應(yīng)用，其用于獲得或處理紡織品生產(chǎn)中的原料或者中間產(chǎn)品，特別是用于除去織物上的保護(hù)層。
32.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶的應(yīng)用，其用于處理紡織原料或用于織物保養(yǎng)，特別是用于處理羊毛或絲綢或含羊毛或絲綢的混紡織品。
33.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶的應(yīng)用，其用于處理照相膠片，特別是用于除去含明膠或類似物的保護(hù)層。
34.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶的應(yīng)用，其用于制備食品或動(dòng)物飼料。
35.一種包含權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶的化妝品，或一種包含權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶的化妝方法，或權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的蛋白酶用于化妝目的的應(yīng)用，特別是在相應(yīng)方法或相應(yīng)組合物的范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型堿性蛋白酶變體，其源自天然或改良的枯草桿菌蛋白酶。與目前已知的枯草桿菌蛋白酶相比，該得自遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)枯草桿菌蛋白酶的變體具有兩個(gè)氨基酸位置199I和211G，和至少一個(gè)有利于分子穩(wěn)定的改良，特別是點(diǎn)突變后在位置3具有蘇氨酸和/或在位置4具有異亮氨酸。作為例子，對(duì)變體遲緩芽孢桿菌－堿性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G進(jìn)行了研究。該變體與其他的蛋白酶－變體相比對(duì)洗滌劑和清洗劑的洗滌性能具有更大的作用。除該酶以外，本發(fā)明還涉及其在各種不同技術(shù)工藝中應(yīng)用，特別是涉及含有該新型堿性蛋白變體的洗滌劑和清洗劑。
文檔編號(hào)A61K8/96GK1505679SQ02809246
公開日2004年6月16日 申請日期2002年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月2日
發(fā)明者貝婭特麗克絲·克特維茨, 卡爾-海因茨·毛雷爾, 羅蘭·布雷韋斯, Ｒ虼摹っ 錐, 布雷韋斯, 貝婭特麗克絲 克特維茨 申請人:漢高兩合股份公司