專利名稱：改良型人腫瘤壞死因子的基因及其生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程生產(chǎn)多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域。
腫瘤壞死因子(TNF)主要是由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，具有多種生物功能，如抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮應(yīng)答性、刺激血管新生、介導(dǎo)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生等。最受到人們關(guān)注的是殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無影響的特性。
TNF由Carswell等在1975年發(fā)現(xiàn)，從此，眾多研究者進(jìn)行TNF的研究，他們觀察到TNF對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腫瘤有戲劇性治療效果，當(dāng)從尾靜脈注射一微克TNF后，竟使腫瘤消退，因此引起轟動(dòng)。進(jìn)入80年代，首先從培養(yǎng)的人白血病細(xì)胞HL-60培養(yǎng)液中提取并純化了人TNF；1984年P(guān)ennica和Shirai等人在大腸桿菌中成功地表達(dá)了重組的人TNF，并制成純品，1985年開始了第一例抗癌臨床試驗(yàn)，十年來，美、日、歐洲都已相繼開展了臨床研究，現(xiàn)已進(jìn)入II期臨床研究，在美國尚未獲FDA的批準(zhǔn)，至今還未成為上市商品。經(jīng)過了漫長的臨床觀察，積累了很多有益的經(jīng)驗(yàn)，首先他們摸索了給藥途徑和劑量，對(duì)于大多數(shù)病例都是全身給藥，即靜脈滴注、肌肉注射或皮下注射，少數(shù)病例為瘤體內(nèi)直接注射。全身用藥治療劑量為10-200微克，局部用藥劑量10微克左右，結(jié)果表明瘤內(nèi)直接注射有效率大大提高。某些醫(yī)療機(jī)構(gòu)，如日本高野醫(yī)院試驗(yàn)了90余例，約有50％病例有癥狀改善，生存期延長。但在日本另外19個(gè)醫(yī)療單位對(duì)晚期癌癥進(jìn)行的試驗(yàn)中則很少有效，由此可見，全身用藥時(shí)治療效果不穩(wěn)定，報(bào)道的病例大多無效，而瘤內(nèi)注射以及合并其他抗癌藥使用，使有效率穩(wěn)定在50％以上，個(gè)別病例經(jīng)治療獲痊愈。在治療中發(fā)現(xiàn)TNF毒性較強(qiáng)，用藥后病人普遍出現(xiàn)發(fā)冷、發(fā)熱、有些病例為寒戰(zhàn)高燒達(dá)40℃，伴有惡心，嘔吐，少數(shù)病人有血壓下降。
在國內(nèi)，1987年開始，南京大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)協(xié)作接受了國家“863”任務(wù)—TNF的基因工程，至1990年完成了實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，我們雙方均獨(dú)立地完成了在大腸桿菌中的TNF表達(dá)，近年來，南京大學(xué)初步觀察了少數(shù)病例，和國外情況一致。
到目前為止，TNF的臨床療效遠(yuǎn)不及對(duì)動(dòng)物的抑瘤效果，其主要原因是按公斤體重折算，使用的TNF劑量相差甚遠(yuǎn)，20克體重的小鼠用1μg TNF，抑瘤效果很強(qiáng)，按此推算，對(duì)人體的有效劑量應(yīng)為2-3mg，但這種高劑量伴隨的毒性病人無法耐受，因此，研制高活性、低毒性的改良型TNF勢(shì)在必行。為此，國內(nèi)外研究者紛紛設(shè)計(jì)不同的TNF突變體，至今突變體已逾百種，但真正達(dá)到此目的的僅少數(shù)幾種。
本發(fā)明的目的在于創(chuàng)造一種抗癌效果好，毒性低的藥物；另外，考慮到大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)經(jīng)濟(jì)效益，我們構(gòu)建了一種高效表達(dá)體系，發(fā)酵時(shí)間短，培養(yǎng)基成分較普遍，分離純化步驟少，最后得率高。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括1.改良型TNF基因構(gòu)建2.改良型TNF基因在大腸桿菌中高效表達(dá)3.表達(dá)產(chǎn)物分離純化我們?cè)O(shè)計(jì)的改良型TNF，缺失了N-端四個(gè)氨基酸，即刪除第三、四位的絲氨酸和第七、八位的蘇氨酸、脯氨酸，另外，將第五位的絲氨酸改為堿性氨基酸-賴氨酸，最后產(chǎn)生的TNF變體為153個(gè)氨基酸組成的蛋白，分子中由于多了一個(gè)賴氨酸，堿性較強(qiáng)。本發(fā)明按照上述設(shè)計(jì)思想，合成了引物，以PCR法擴(kuò)增了長度為160bp基因片段，經(jīng)酶切，再替換天然TNF基因的相應(yīng)片段。將改造過的TNF基因經(jīng)NcoI和BamHI雙酶切插入表達(dá)載體PET-11d中轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21，經(jīng)篩選獲得陽性克隆，經(jīng)過培養(yǎng)，SDS-PAGE檢測(cè)，表明在分子量17KD處新出現(xiàn)一條很粗條帶為表達(dá)產(chǎn)物，掃描結(jié)果，表達(dá)的蛋白占菌體總蛋白約50％。
將工程菌培養(yǎng)過夜，收集菌體，超聲破菌，離心收集上清液，再用硫酸銨沉淀，經(jīng)透析，上DEAE-纖維素(DE52)柱層析，收集洗脫峰，用SDS-PAGE檢測(cè)，將含純品的部分合并。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是創(chuàng)造了一種活性高、毒性低的新型抗癌藥。其關(guān)鍵是改造天然TNF的N-端結(jié)構(gòu)。TNF的活性是通過其受體而發(fā)揮作用的，凡影響TNF和受體結(jié)合的因素，都會(huì)影響活力?，F(xiàn)在已經(jīng)知道在TNF分子中，5，31-35，84-87，117-119和143-148位氨基酸和活性密切相關(guān)，另外，TNF的N-端對(duì)活力也有影響，缺失N-端幾個(gè)氨基酸往往使活力增加，因?yàn)門NF的N端游離于分子三級(jí)結(jié)構(gòu)表面，對(duì)鄰近的受體結(jié)合區(qū)有干擾作用。也就是說N-端雖不直接和受體結(jié)合，但可調(diào)節(jié)和修飾生物學(xué)活性。
構(gòu)建了高效基因表達(dá)體系，使表達(dá)蛋白占菌體總蛋白約50％。這種表達(dá)產(chǎn)物為可溶性的活性形式，而不是包涵體。
摸索一條適用于大規(guī)模生產(chǎn)的簡(jiǎn)便生產(chǎn)工藝。發(fā)酵時(shí)間短(12-16小時(shí))，不需任何誘導(dǎo)，分離純化步驟較少，最后得率高，每立升發(fā)酵液可獲純品30-40mg。因此，經(jīng)濟(jì)效益巨大。
本發(fā)明所述改良型腫瘤壞死因子，可用做治療惡性腫瘤的藥物。
下面是
具體實(shí)施例方式(一)改良型TNF基因的構(gòu)建，具體如下1.天然TNF基因克隆至M13中，抽提M13/TNFF重組DNA以此作為模板。
2.合成一對(duì)PCR引物5′-引物總長度為44個(gè)核苷酸，其中15個(gè)核苷酸和天然TNF基因匹配，另外，含有BamHI、HindIII和NcoI的酶切位點(diǎn)，還將Ser的密碼子改為Lys的密碼子。
具體序列如下5′-ATT CCT CTT CGA AGG TAC CAA GCA TTT GCA AGA CTG TTT GGT CA-33′-引物和天然TNF基因中編碼44-51位氨基酸密碼序列相同，含有kpnI酶切位點(diǎn)。
具體序列為5′—GCC ATG GTG TTC GAC CAA CAG TGC GTC-3′3.PCR以10ng M13/TNF重組DNA為模板，用上述一對(duì)引物擴(kuò)增30個(gè)周期(45℃-72-℃-92℃)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％agarose電泳檢查，主要為160bp一個(gè)條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。從凝膠中回收此條帶，用BamHI和KpnI雙酶切，再從凝膠中回收。
4.將M13/TNF(天然)重組雙鏈DNA，經(jīng)BamHI和KpnI雙酶切，用1％agarose電泳，回收大片段。
5.將以BamHI和KpnI切后的PCR片段和M13/TNF(天然)大的片段，加T4DNA連接酶使這二個(gè)片段連接，再轉(zhuǎn)化至TG1中，經(jīng)雜交篩選(用5′-引物為探針)，選出所需的克隆，再制備DNA，用NcoI和BamI切出改良后的TNF基因。經(jīng)DNA序列測(cè)定，證明N-端的序列和預(yù)計(jì)的序列一致。
(二)改良型TNF基因在大腸桿菌中的表達(dá)將表達(dá)載體PET-11d用NcoI和BamI雙酶切，加入改良的TNF基因(用同兩種酶切)，加連接酶轉(zhuǎn)化至BL-21(DE3)用32P標(biāo)記該基因作探針，選出陽性克隆。
將陽性克隆接種于2ml LB/Amp(100μg/ml)培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，接種入200ml LB/Amp(50μg/ml)培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。
(三)產(chǎn)物的分離純化1.將培養(yǎng)液5,000rpm離心15分鐘，4℃，收集菌體。
2.超聲破菌將收集的1克菌體懸于pH8.2 10mM磷酸緩沖液中，超聲10分鐘(超聲15秒，間歇15秒)。
3.12,000rpm，4℃離心15分鐘，收集上清。用SDS-PAGE檢測(cè)上述細(xì)胞裂解液，在分子量17,000處有一條很粗條帶，經(jīng)掃描含量約50％，由此可見，表達(dá)產(chǎn)物主要為可溶性而不是包涵體。
4.硫酸銨分部在細(xì)胞裂解液中加固體硫酸銨至60％飽和度(0℃)，放置過夜(0℃)，12,000rpm，4℃離心15分鐘，保留沉淀部分，用pH8.220mM磷酸緩沖液10ml溶解沉淀，并對(duì)此緩沖液透析24小時(shí)。離心10,000rpm，4℃10分鐘，丟棄沉淀，上清進(jìn)一步作柱層析。
5.DEAE-纖維素(DE-52)柱層析將處理后的DE-52裝柱(Φ2.6×20cm)，用pH8.210mM磷酸緩沖液平衡，透析后的樣品上柱，并用此緩沖液充分洗滌，穿過峰丟棄。再用pH8.220mM磷酸緩沖液洗脫，收集洗脫峰。
經(jīng)蛋白定量測(cè)定，洗脫峰總蛋白為8mg，即200ml發(fā)酵液獲純蛋白10mg，若以每立升發(fā)酵液計(jì)算可得40mg，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，銀染或考馬斯亮藍(lán)染色主要為一條帶，另在分子量三萬左右有一細(xì)帶，含量約5％，經(jīng)Western印跡分析，SDS-PAGE上顯示的兩個(gè)條帶均呈陽性，說明分子量三萬的條帶為TNF的二聚體。
用HPLC凝膠柱分析出現(xiàn)一個(gè)單峰。
活力測(cè)定用L929方法，并測(cè)蛋白，計(jì)算比活。
純品比活為3-8×107u/mg。
權(quán)利要求
1.一種改良型人腫瘤壞死因子基因特征是刪除TNF第三、四位的絲氨酸和第七、八位的蘇氨酸、脯氨酸的密碼子，將第五位的絲氨酸改為賴氨酸密碼子，經(jīng)基因表達(dá)產(chǎn)生由153個(gè)氨基酸組成的TNF變體蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良型TNF基因，其特征是改造過的TNF基因經(jīng)NcoI和BamHI雙酶切插入表達(dá)載體PET-11d中轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21，經(jīng)篩選得陽性克隆，將陽性克隆接種于2ml LB/Amp(100μg/ml)培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，接種入200ml LB/Amp(50μg/ml)培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)液，其特征是將培養(yǎng)液過夜，收集菌體，超聲破菌，離心，收集上清液，再用硫酸銨沉淀，經(jīng)透析，上DEAE-纖維素(DE52)柱層析，收集洗脫峰，用SDS-PAGE檢測(cè)，將含純品的部分合并。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良型TNF基因，其特征是可用做治療惡性腫瘤的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程生產(chǎn)多肽藥物領(lǐng)域，用于治療惡性腫瘤。本發(fā)明所述改良型TNF為刪除TNF第三、四位的絲氨酸和第七、八位的蘇氨酸、脯氨酸，將第五位的絲氨酸改為賴氨酸，由153個(gè)氨基酸組成的TNF變體蛋白。改良后的TNF基因在大腸桿菌中高效表達(dá)并分離純化成單一組分純品，比活為3-8×10
文檔編號(hào)C12N15/70GK1123326SQ9411149
公開日1996年5月29日 申請(qǐng)日期1994年11月9日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月9日
發(fā)明者徐賢秀 申請(qǐng)人:南京大學(xué)