專利名稱：黑鯛腫瘤壞死因子α基因的重組表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域中功能基因的克隆、重組表達(dá)和純化等技術(shù)，具體地說是黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)腫瘤壞死因子α(BS TNFα)基因的克隆、重組表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的分離純化與鑒定等。
背景技術(shù)：
水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物高密度、集約化的快速發(fā)展，使得養(yǎng)殖病害日趨嚴(yán)重，各種病害頻繁爆發(fā)，已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的主要瓶頸。各類農(nóng)藥、抗生素盲目無序和頻繁使用，不僅對(duì)病害的預(yù)防與治療沒有起到明顯作用，而且，由于這些藥物的大量使用嚴(yán)重破壞了自然生態(tài)環(huán)境，藥品的殘留已經(jīng)直接威脅到人類的健康，因此，發(fā)現(xiàn)和尋找通用性強(qiáng)，防治效果好，廣譜無污染的新型病害預(yù)防和治療藥物，成為人們亟待解決的重要課題之一。
TNF又稱惡質(zhì)素(cachectin)、細(xì)胞毒因子(cytotoxin factor)或分化誘導(dǎo)因子(differentiation inducing factor)，它是1975年由Carswell發(fā)現(xiàn)的一種存在于血清中，具有殺傷腫瘤細(xì)胞，并使體內(nèi)腫瘤發(fā)生壞死的細(xì)胞因子。TNFα可由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞、腦細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌(Vassalla，1992)，于體內(nèi)外均能殺傷腫瘤細(xì)胞并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；并且可以通過刺激T細(xì)胞，誘導(dǎo)MHC的表達(dá)，參與和調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥及發(fā)熱反應(yīng)(Camussi，1991)，是機(jī)體炎癥反應(yīng)中最重要的促炎細(xì)胞因子。TNFα的主要功能包括抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞；誘導(dǎo)白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的分化，抑制成脂基因的表達(dá)，抑制脂肪細(xì)胞分化；促進(jìn)T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)MHC I類分子表達(dá)，誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生；誘導(dǎo)活化B細(xì)胞增殖和Ig的分泌；促炎活性和免疫調(diào)節(jié)活性，包括活化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)呼吸代謝爆發(fā)，提供細(xì)胞的吞噬能力，誘導(dǎo)NK細(xì)胞，發(fā)揮細(xì)胞毒的作用；以及對(duì)病毒復(fù)制的調(diào)控等生物學(xué)活性。
腫瘤壞死因子α在動(dòng)物體內(nèi)的含量很低(皮克或納克量級(jí))，且半衰期短(幾小時(shí)至幾天)，分離和純化體內(nèi)腫瘤壞死因子α非常困難，極大地限制了對(duì)其功能的研究以及進(jìn)一步的開發(fā)和利用(kuby，1997)。70年代末和80年代初，伴隨分子克隆技術(shù)的成熟和發(fā)展，多種細(xì)胞系的建立，為細(xì)胞因子的研究帶來了新的發(fā)展空間，到90年代末，已獲得了大量細(xì)胞因子及其受體基因。目前，臨床上應(yīng)用的生物工程制品中，細(xì)胞因子占據(jù)了絕大多數(shù)市場份額，包括干擾素、集落刺激因子、白介素和腫瘤壞死因子等。
由于TNF等細(xì)胞因子在哺乳類動(dòng)物炎癥反應(yīng)中具有廣泛生物學(xué)活性及其在免疫系統(tǒng)中免疫調(diào)控的核心地位，多年來，人們一直在低等動(dòng)物中尋找TNF存在的證據(jù)。Ottaviani(1993)和Wittwer(1999)分別在軟體動(dòng)物和昆蟲中發(fā)現(xiàn)有TNF類似成分。在魚類腫瘤壞死因子的研究方面，Hardie(1994)和Jang(1995)應(yīng)用生物學(xué)交叉反應(yīng)，證明了魚類存在TNFα類似的成分。Hirono于2000年通過EST技術(shù)首次從牙鲆中克隆到TNFα基因。Laing和Zou于2001年應(yīng)用同源基因克隆技術(shù)，從虹鱒魚中克隆到兩個(gè)結(jié)構(gòu)相近的TNF-α基因。隨后，在鯉魚(Saeij，2003)、金頭鯛(Garcia-Castillo J，2002)，斑馬魚(Bobe，2001)叉尾鲴(Zou，2003)，真鯛(蔡中華，2003)等經(jīng)濟(jì)魚中相繼發(fā)現(xiàn)了TNFα的基因序列。
魚類腫瘤壞死因子α的體外重組與活性鑒定工作現(xiàn)在也正在進(jìn)行。真鯛TNFα在大腸桿菌中的表達(dá)已經(jīng)完成(蔡中華，2004)；對(duì)已完成的虹鱒TNFα的重組表達(dá)與活性鑒定研究表明，重組TNFα具有與哺乳類相似的生物學(xué)活性，1ng/ml，10ng/ml和100ng/ml重組TNFα都可以刺激IL-1β的表達(dá)，在10ng/ml和100ng/ml的濃度范圍內(nèi)，重組TNF對(duì)包括IL-1β、TNFα、COX2和IL-8等細(xì)胞因子有顯著的誘導(dǎo)作用。相似的結(jié)果也表現(xiàn)在誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞的吞噬活性和趨化白細(xì)胞的遷移能力上，重組TNFα對(duì)細(xì)胞的吞噬和趨化有明顯的劑量依賴性，以10-20ng/ml對(duì)細(xì)胞吞噬和趨化能力最強(qiáng)，而過高的濃度如100-200ng/ml，反而會(huì)降低細(xì)胞的吞噬和趨化能力(蔡中華等2003)。我們利用RT-PCR和RACE技術(shù)，從黑鯛中克隆到腫瘤壞死因子α基因(BS TNFα)，并在GenBank登陸(序列注冊(cè)號(hào)為AY335443)發(fā)明內(nèi)容腫瘤壞死因子在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和疾病控制等方面都有重要的作用，但是機(jī)體自身分泌腫瘤壞死因子產(chǎn)量低，半衰期端，不易分離純化。本發(fā)明針對(duì)這些特點(diǎn)和不足，利用已經(jīng)克隆到的黑鯛腫瘤壞死因子α基因(BSTNFα)，采用分子重組技術(shù)，對(duì)黑鯛腫瘤壞死因子α基因進(jìn)行了體外重組，構(gòu)建了大腸桿菌和酵母表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)，在體外表達(dá)了黑鯛腫瘤壞死因子α，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化和鑒定，建立了純化和鑒定方法，提供了黑鯛腫瘤壞死因子α基因的重組表達(dá)與應(yīng)用。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案為黑鯛腫瘤壞死因子α基因的重組表達(dá)方法，包括重組載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與篩選、表達(dá)產(chǎn)物的分離純化和鑒定，分別說明如下1)重組載體構(gòu)建根據(jù)黑鯛腫瘤壞死因子α成熟肽的cDNA序列，利用一對(duì)特異性引物rTF和rTR在其兩端引入BamHI和HindIII兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，克隆到表達(dá)載體，載體包括pQE系列、pET系列、pGEX-4T系列，pPIC系列以及pGAPZ系列；2)轉(zhuǎn)化與篩選將構(gòu)建的得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α、Jm109、XL1-blue或畢赤酵母、巴斯德酵母中，分別以載體引物和基因特異性引物進(jìn)行PCR雙向篩選；獲得的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒純化，限制性內(nèi)切酶消化驗(yàn)證；并經(jīng)序列測定鑒定后，所篩選的陽性克隆作為預(yù)備工程菌株，分別對(duì)細(xì)菌或酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；3)表達(dá)產(chǎn)物的分離純化采用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)工程菌的表達(dá)，直接取上清液或經(jīng)裂解液或玻璃珠裂解細(xì)胞，用親和層法進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳鑒定。
所述重組載體構(gòu)建，分為原核系統(tǒng)表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)黑鯛腫瘤壞死因子α成熟肽的cDNA序列(GenBank注冊(cè)號(hào)為AY335443)，利用一對(duì)基因特異性引物rTF 5′-TAGGAT CCC TGA GGC GCA TCA GCA G-3′和rTR 5′-GCG AAG CTT AAG TGCAAA CAC ACC GAA G-3′，分別在引物兩端引入BamHI、HindIII兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，在經(jīng)感染的黑鯛cDNA上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物亞克隆到表達(dá)載體pQE30，完成原核系統(tǒng)表達(dá)載體的構(gòu)建；真核系統(tǒng)表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)黑鯛腫瘤壞死因子α成熟肽的cDNA序列(GenBank注冊(cè)號(hào)為AY335443)，采用另一對(duì)含酶切位點(diǎn)的特異性引物ryTF 5’-CAG AGC TCG CAA AAT GCT GAG GCG CAT CA-3’和yrTR5’-ATG GAT CCT AAG TGC AAA CAC ACC GAA-3’，該特異性引物分別含SacI和BamHI兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，在黑鯛經(jīng)鰻弧菌感染的頭腎cDNA文庫中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SacI和BamHI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶消化后，亞克隆到pMETA(invitrogen)等穿梭型表達(dá)載體上，完成用于不同宿主轉(zhuǎn)化所需的表達(dá)載體構(gòu)建。
所述誘導(dǎo)原核工程菌在大腸桿菌表達(dá)的誘導(dǎo)劑為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)；誘導(dǎo)重組酵母工程菌在酵母表達(dá)的誘導(dǎo)劑為甲醇。
經(jīng)誘導(dǎo)后，融合表達(dá)的菌液經(jīng)裂解液或玻璃珠裂解，分泌型表達(dá)細(xì)胞直接收集上清液，用6His單克隆抗體進(jìn)行免疫親和層析，或用鎳金屬親和層析純化，以SDS-PAGE電泳鑒定；所述鎳金屬親和層析純化使用的鎳金屬親和純化膠體是Ni-NTA(Qiagen)。
在表達(dá)產(chǎn)物的分離純化后應(yīng)進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的活性鑒定，其鑒定方法為，以純化后的重組黑鯛腫瘤壞死因子α重組蛋白，體外刺激黑鯛和真鯛的巨噬細(xì)胞，檢測白介素1β、TNFα、TGFβ和IL8細(xì)胞因子被重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；以純化后的重組黑鯛腫瘤壞死因子α重組蛋白，體外刺激黑鯛和真鯛的巨噬細(xì)胞，可以增加巨噬細(xì)胞的細(xì)胞吞噬和趨化能力。
本發(fā)明是黑鯛腫瘤壞死因子α(BS TNFα)基因的體外表達(dá)與純化技術(shù)；本發(fā)明將黑鯛腫瘤壞死因子α基因的編碼區(qū)克隆到表達(dá)載體，在大腸桿菌和酵母中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，并在體外進(jìn)行純化；本發(fā)明表達(dá)產(chǎn)物可用于魚類免疫機(jī)制的理論研究，并可用于制作飼料添加劑、疫苗的免疫增強(qiáng)劑以及病害防治藥物以及其他醫(yī)藥產(chǎn)品。表達(dá)產(chǎn)物可以誘導(dǎo)其它魚類細(xì)胞因子的表達(dá)(如IL-1β等)，增強(qiáng)魚類巨噬細(xì)胞吞噬與趨化能力，提高魚類菌苗的免疫效價(jià)和免疫保護(hù)力。
具體實(shí)施例方式
黑鯛腫瘤壞死因子α基因重組載體構(gòu)建方法，重組載體構(gòu)建是(1)根據(jù)克隆得到的黑鯛腫瘤壞死因子α成熟肽的cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物rTF 5′-TAG GAT CCC TGA GGC GCA TCA GCA G-3′和rTR5′-GCG AAG CTT AAG TGC AAA CAC ACC GAA G-3′用于BSTNF在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，在這對(duì)引物的兩端引入BamHI和HindIII兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，在黑鯛經(jīng)鰻弧菌感染的頭腎cDNA文庫中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用膠回收試劑盒(上海中科開瑞生物芯片公司)純化PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamHI和HindIII兩個(gè)限制性內(nèi)切酶消化后，按照相應(yīng)的克隆載體使用說明書將酶切片段亞克隆到pQE30(Qiagen)等表達(dá)載體。
PCR反應(yīng)條件如下黑鯛頭腎cDNA文庫 1μl10X PCR buffer5μl25mM MgCL23μl2.5mM dNTP2μl10uM rTF(rTF) 2μl10uM rTR(rTR) 2μl5U/μl Taq酶 0.25μl加水補(bǔ)到總體積為50μlPCR反應(yīng)條件1個(gè)循環(huán)94℃ 5min；10循環(huán)94℃ 45s，67℃ 30s(每個(gè)循環(huán)降低0.6℃)，72℃ 45s；25個(gè)循環(huán)，94℃ 45s，61℃ 30s，72℃ 45s；1個(gè)循環(huán)72℃ 10min，4℃保存。
限制性內(nèi)切酶消化條件如下0.1μg DNA2μl10X buffer2μlBamHI(Promega)1μlHindIII(Promega) 1μlddH2O to 20μl將上述反應(yīng)體系混合，于37℃孵育3小時(shí)，1％瓊脂糖電泳，紫外燈檢測。
(2)設(shè)計(jì)另一對(duì)引物ryTF 5’-CAG AGC TCG CAA AAT GCT GAG GCG CATCA-3’和ryTR5’-ATG GAT CCT AAG TGC AAA CAC ACC GAA-3’用于BSTNF在酵母系統(tǒng)表達(dá)，該特異性引物分別含SacI和BamHI兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，在黑鯛經(jīng)鰻弧菌感染的頭腎cDNA文庫中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SacI和BamHI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶消化后，亞克隆到pMETA(invitrogen)等穿梭型表達(dá)載體上，完成用于不同宿主轉(zhuǎn)化所需的表達(dá)載體構(gòu)建。
PCR反應(yīng)條件如下黑鯛頭腎cDNA文庫 1μl
10X PCR buffer 5μl25mM MgCL23μl2.5mM dNTP 2μl10uM rTF(ryTF) 2μl10uM rTR(ryTR) 2μl5U/μl Taq酶 0.25μl加水補(bǔ)到總體積為50μlPCR反應(yīng)條件1個(gè)循環(huán)94℃ 5min；10循環(huán)94℃ 45s，67℃ 30s(每個(gè)循環(huán)降低0.6℃)，72℃ 45s；25個(gè)循環(huán)，94℃ 45s，61℃ 30s，72℃ 45s；1個(gè)循環(huán)72℃ 10min，4℃保存。
限制性內(nèi)切酶消化條件如下0.1μg DNA 2μl10X buffer 2μlSacI(Promega) 1μlBamHI(Promega) 1μlddH2O to 20μl將上述反應(yīng)體系混合，于37℃孵育3小時(shí)，1％瓊脂糖電泳，紫外燈檢測。
轉(zhuǎn)化與篩選(方法)用電轉(zhuǎn)化或化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法，將構(gòu)建得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌和酵母菌，篩選序列和插入方向正確的陽性克隆作為預(yù)備工程菌株，并誘導(dǎo)表達(dá)。以SDS PAGE鑒定工程菌是否表達(dá)，以及表達(dá)產(chǎn)量，篩選高效表達(dá)的菌株作為表達(dá)工程菌。
具體過程為1)制備感受態(tài)細(xì)胞挑取過夜培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)菌克隆(XL1-blue)細(xì)菌于5ml液體培養(yǎng)基中，220rpm在搖床37℃培養(yǎng)2小時(shí)。再將上步5ml液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入100ml LB液體培養(yǎng)基中，在搖床(220rpm/min)37℃培養(yǎng)3小時(shí)左右，使OD600約0.3。有效的轉(zhuǎn)化，細(xì)菌的量應(yīng)不超過108/ml。在無菌條件下，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到無菌的一次性的用冰預(yù)冷的離心管中，冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻到0℃。于4℃4000rpm離心10min，回收細(xì)胞。倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。將細(xì)菌沉淀重懸于10ml 0.1M冰冷的CaCl2里，冰上放置15min，4℃離心10min回收細(xì)胞。每50ml培養(yǎng)物用2ml 0.1mM的CaCl2重懸沉淀，每4ml重懸的細(xì)胞中加入140ul DMSO，冰上放置15min。每份懸液中再加入140ul DMSO，重新放入冰浴中。感受態(tài)細(xì)胞分裝于Eppendorf管中。100ul/管，保存于-70℃冰箱。
2)轉(zhuǎn)化取出凍存的感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置5-10分鐘待其溶解。加入10μl連接產(chǎn)物.冰浴30min。將此混合物置于42℃水浴45s-60s，迅速將反應(yīng)物冰上放置2-3min，加入250μl SOC培養(yǎng)液。于37℃搖床220rpm振搖60min。取出培養(yǎng)物，將培養(yǎng)液涂布于含100μg/ml青霉素的平板上，待反應(yīng)液被平板吸干后，將平板放在37℃孵育過夜。16-20hr之后，取平板檢查，并進(jìn)行克隆篩選。
3)重組子的篩選可用麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，利用其顏色反應(yīng)判斷可能的重組子。一般地，有插入片段的細(xì)菌會(huì)有顏色反應(yīng)，表現(xiàn)為白色菌落。而沒有插入片段的菌落將表現(xiàn)為紅色菌落。通過顏色反應(yīng)初步鑒定后，用PCR反應(yīng)做進(jìn)一步的篩選，用滅菌的牙簽挑取單個(gè)克隆放入PCR管中，作為DNA模板，用基因特異性引物對(duì)克隆進(jìn)行PCR陽性篩選。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，EB染色，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，確定陽性克隆，PCR條件為94℃變性5min；28個(gè)循環(huán)94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸10min；4℃保溫。
4)測序?qū)z測到的陽性克隆送出測序。
5)在酵母菌種的轉(zhuǎn)化采用Invitrogen Corporation的Pichia methanolicaExpression System并參照其說明進(jìn)行。
黑鯛腫瘤壞死因子α(TNFα)cDNA序列(參見序列表中SEQ ID NO.1)1 AGCAGGCAGTAACGACAGAGAGCAGACTTGTGCACAGTATGGTGGCATACACAACAGCTC61 CATGTGACTTGGAGATGGGTCCTGAGGAGAGGACGGTAGTCTTGATAGAGAAGAAGTCAG121 CTACAGGGTGGATGTGGAAGGTGTCCGTGGCCCTGCTCGTCGCAGCACTTGCTTTCGCAG181 GCGTCCTGCTGTTTGCTTGGTATTGGAATGGCAAGCCAGAAATTCTGATACATTCAGGCC241 AAACAGAGGCGCTAACCAAGAATGACCACACTGAGAAAACAGATCCCCACTCCACGCTGA301 GGCGCATCAGCAGCAAAGCCAAGGCAGCCATCCATTTAGAAGGGAGCTATGATGAAGACG361 AAGGTTTGAAAGACCAGGTGGAGTGGAAGAATGGTCAAGGCCAGGCGTTCGCTCAGGGCG421 GCTTCCGACTGGTGGACAATAAGATCGTGATCCCGCAGACCGGCCTCTACTTCGTCTACA481 GCCAGGCGTCGTTCAGAGTCTCCTGCAGCGATGGCGACGAGGAGGGAGCAGGGAGACACC541 TCACACCTCTCAGCCACACCATCTCGCGCTACTCAGAGTCCATGGGCACTGATGTGTCTC601 TGATGAGCGCGGTGAGGTCGGCGTGCCAGAACACCGCTCACGAGGACAGCTACAGCGACG661 GACGGGGCTGGTACAACACCATCTATCTGGGCGCCGTGTTTCAGCTGAACAGAGGTGACA721 GACTGGAGACGGAAACCAACCAGTTGTCAGAGCTGGAGACAGACGAGGGCAAGACCTTCT781 TCGGTGTGTTTGCACTTTAAAATGACTGTGATACTGACAGAGAGGACGCAAAGCCTTGCA841 CAGTGCCAAAAGTTTGGCTTTTCTGAAAGATTTTATTTGAATTTTTATTATTCATCTTCA901 TGGTGATGTAGAAATGTTGAAATCTCAATGGAGATAACGCTTGCGGCTGAACAGGCGCTG961 CTGATTTTTTAAAATCCTATAAACTGTAACAGTTTGAAATGTTATTTCTATTTTAGGCAC1021 TTTTTGTACATTATTTATGCTGACCTGAGATTGTAGTAGGCCAGACTCTCTCTGCTGTAT1081 CTGATGACGACACAGCTCTTCACTGGAGAGTGCAGGTTTTTGAGGATTATCTACAGAATT1141 GTTATCATGTACCAATACAGCCTGTATGTATTTATTTGTATTTATTTATATTTAAATTGT1201 TGGGGTAAGGTGTTGAAAGATTTATATTTATATGTGCACATAAACTTAATTAAAATGCAA1261 AAAAACCCAAAAGAAAAAAAAAAAAAAA
序列特征長度1288堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來源黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)黑鯛腫瘤壞死因子α(TNFα)編碼蛋白的氨基酸序列(參見序列表中SEQ ID NO.2)1 MVAYTTAPCD LEMGPEERTV VLIEKKSATG WMWKVSVALL VAALAFAGVL LFAWYWNGKP61 EILIHSGQTE ALTKNDHTEK TDPHSTLRRI SSKAKAAIHL EGSYDEDEGL KDQVEWKNGQ121 GQAFAQGGFR LVDNKIVIPQ TGLYFVYSQA SFRVSCSDGD EEGAGRHLTP LSHTISRYSE181 SMGTDVSLMS AVRSACQNTA HEDSYSDGRG WYNTIYLGAV FQLNRGDRLE TETNQLSELE241 TDEGKTFFGV FAL序列特征長度253個(gè)氨基酸類型氨基酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來源黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)大腸桿菌表達(dá)的黑鯛腫瘤壞死因子α(TNFα)cDNA及氨基酸序列(參見序列表中SEQ ID NO.3和4)1 TCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCC1 I K E E K L T M R G SH H H H H HG S L61 TGAGGCGCATCAGCAGCAAAGCCAAGGCAGCCATCCATTTAGAAGGGAGCTATGATGAAG21R R I S S K A K A A I H L E G S Y D E D121 ACGAAGGTTTGAAAGACCAGGTGGAGTGGAAGAATGGTCAAGGCCAGGCGTTCGCTCAGG41E G L K D Q V E W K N G Q G Q A F A Q G181 GCGGCTTCCGACTGGTGGACAATAAGATCGTGATCCCGCAGACCGGCCTCTACTTCGTCT61G F R L V D N K I V I P Q T G L Y F V Y241 ACAGCCAGGCGTCGTTCAGAGTCTCCTGCAGCGATGGCGACGAGGAGGGAGCAGGGAGAC81S Q A S F R V S C S D G D E E G A G R H301 ACCTCACACCTCTCAGCCACACCATCTCGCGCTACTCAGAGTCCATGGGCACTGATGTGT101L T P L S H T I S R Y S E S M G T D V S361 CTCTGATGAGCGCGGTGAGGTCGGCGTGCCAGAACACCGCTCACGAGGACAGCTACAGCG121L M S A V R S A C Q N T A H E D S Y S D421 ACGGACGGGGCTGGTACAACACCATCTATCTGGGCGCCGTGTTTCAGCTGAACAGAGGTG141G R G W Y N T I Y L G A V F Q L N R G D481 ACAGACTGGAGACGGAAACCAACCAGTTGTCAGAGCTGGAGACAGACGAGGGCAAGACCT161R L E T E T N Q L S E L E T D E G K T F541 TCTTCGGTGTGTTTGCACTTTAA181F G V F A L *酵母表達(dá)的黑鯛腫瘤壞死因子α(TNFα)cDNA及氨基酸序列(參見序列表中SEQ ID NO.5和6)1 CGAGgCAAAATGCTGAGGCGCATCAGCAGCAAAGCCAAGGCAGCCATCCATTTAGAAGGG1 R G K M L R R I S S K A K A A I H L E G61 AGCTATGATGAAGACGAAGGTTTGAAAGACCAGGTGGAGTGGAAGAATGGTCAAGGCCAG21 S Y D E D E G L K D Q V E W K N G Q G Q121 GCGTTCGCTCAGGGCGGCTTCCGACTGGTGGACAATAAGATCGTGATCCCGCAGACCGGC41 A F A Q G G F R L V D N K I V I P Q T G181 CTCTACTTCGTCTACAGCCAGGCGTCGTTCAGAGTCTCCTGCAGCGATGGCGACGAGGAG61 L Y F V Y S Q A S F R V S C S D G D E E241 GGAGCAGGGAGACACCTCACACCTCTCAGCCACACCATCTCGCGCTACTCAGAGTCCATG81 G A G R H L T P L S H T I S R Y S E S M301 GGCACTGATGTGTCTCTGATGAGCGCGGTGAGGTCGGCGTGCCAGAACACCGCTCACGAG101 G T D V S L M S A V R S A C Q N T A H E361 GACAGCTACAGCGACGGACGGGGCTGGTACAACACCATCTATCTGGGCGCCGTGTTTCAG121 D S Y S D G R G W Y N T I Y L G A V F Q421 CTGAACAGAGGTGACAGACTGGAGACGGAAACCAACCAGTTGTCAGAGCTGGAGACAGAC141 L N R G D R L E T E T N Q L S E L E T D481 GAGGGCAAGACCTTCTTCGGTGTGTTTGCACTTAGGATCCACGCGTCGTCGACCCGCGGC161 E G K T F F G V F A L R I H A S S T R G541 GGCCGCCAGCTTCCTAGGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACG181 G R Q L P R G K P I P N P L L G L D S T601 CGTACCGGTCATCATCACCATCACCAT201 R T G H H H H H H實(shí)施例1.利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)黑鯛腫瘤壞死因子α，以pQE30為例。
(1)用PCR方法克隆黑鯛腫瘤壞死因子α基因。
(2)以帶有特異性酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增目的片段，并將該片段亞克隆到表達(dá)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體。
(3)以化學(xué)轉(zhuǎn)化法，將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，制備工程菌。
(4)以IPTG誘導(dǎo)工程菌株表達(dá)。
(5)以鎳金屬親和層析或免疫親和層析分離純化重組蛋白。
實(shí)施例2.利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)黑鯛腫瘤壞死因子α，以pMETA載體為例。
(1)用PCR方法克隆黑鯛腫瘤壞死因子α基因。
(2)以帶有特異性酶切位點(diǎn)和酵母表達(dá)啟動(dòng)序列的引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增目的片段，并將該片段亞克隆到表達(dá)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體。
(3)以電轉(zhuǎn)移法和化學(xué)轉(zhuǎn)化法，將重組載體轉(zhuǎn)化到甲醇畢赤酵母，制備工程菌。
(4)以甲醇誘導(dǎo)工程菌株表達(dá)。
(5)以玻璃珠破碎細(xì)胞。
(6)以鎳金屬親和層析獲免疫親和層析分離純化重組蛋白。
實(shí)施例3實(shí)施例1、2的表達(dá)產(chǎn)物用作餌料添加劑或藥物添加劑將重組酵母直接破碎，將破碎的酵母直接作為餌料的添加成分，作為養(yǎng)殖生物的免疫增強(qiáng)劑，提高養(yǎng)殖生物對(duì)疾病和應(yīng)激的抵抗力；純化后的1、2重組產(chǎn)物，作為治療藥物在養(yǎng)殖生物上的應(yīng)用。海水養(yǎng)殖動(dòng)物包括魚、蝦和貝的餌料添加劑，禽類餌料添加劑和畜類餌料添加劑等。
實(shí)施例4.實(shí)施例1、2的表達(dá)產(chǎn)物用作免疫增強(qiáng)劑純化的重組產(chǎn)物與各種疫苗合用，增強(qiáng)疫苗的免疫效價(jià)和免疫保護(hù)力。如與魚的各種菌苗和疫苗合用，增加疫苗對(duì)魚的保護(hù)；與各種畜禽疫苗合用，增加疫苗對(duì)畜禽產(chǎn)品的保護(hù)。
實(shí)施例5.實(shí)施例1、2的表達(dá)產(chǎn)物用作病害防治藥物在病害發(fā)生時(shí)，直接使用1、2純化產(chǎn)物作為多種防治病害的預(yù)防或治療藥物，對(duì)魚類和其它動(dòng)物病害進(jìn)行治療。
實(shí)施例6.實(shí)施例1、2的表達(dá)產(chǎn)物用于魚類免疫機(jī)制的研究直接使用實(shí)例1、2的純化產(chǎn)物或?qū)嵗?、2的單克隆抗體或多克隆抗體，進(jìn)行魚類及其它動(dòng)物免疫機(jī)制的研究。
黑鯛SEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院海洋研究所<120>黑鯛腫瘤壞死因子α基因的重組表達(dá)方法<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1288<212>DNA<213>黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)<220>
<221>CDS<222>(39)..(797)<223>
<400>1agcaggcagt aacgacagag agcagacttg tgcacagt atg gtg gca tac aca aca 56Met Val Ala Tyr Thr Thr1 5gct cca tgt gac ttg gag atg ggt cct gag gag agg acg gta gtc ttg 104Ala Pro Cys Asp Leu Glu Met Gly Pro Glu Glu Arg Thr Val Val Leu10 15 20ata gag aag aag tca gct aca ggg tgg atg tgg aag gtg tcc gtg gcc 152Ile Glu Lys Lys Ser Ala Thr Gly Trp Met Trp Lys Val Ser Val Ala25 30 35ctg ctc gtc gca gca ctt gct ttc gca ggc gtc ctg ctg ttt gct tgg 200Leu Leu Val Ala Ala Leu Ala Phe Ala Gly Val Leu Leu Phe Ala Trp40 45 50tat tgg aat ggc aag cca gaa att ctg ata cat tca ggc caa aca gag 248Tyr Trp Asn Gly Lys Pro Glu Ile Leu Ile His Ser Gly Gln Thr Glu55 60 65 70
黑鯛gcg cta acc aag aat gac cac act gag aaa aca gat ccc cac tcc acg296Ala Leu Thr Lys Asn Asp His Thr Glu Lys Thr Asp Pro His Ser Thr75 80 85ctg agg cgc atc agc agc aaa gcc aag gca gcc atc cat tta gaa ggg344Leu Arg Arg Ile Ser Ser Lys Ala Lys Ala Ala Ile His Leu Glu Gly90 95 100agc tat gat gaa gac gaa ggt ttg aaa gac cag gtg gag tgg aag aat 392Ser Tyr Asp Glu Asp Glu Gly Leu Lys Asp Gln Val Glu Trp Lys Asn105 110 115ggt caa ggc cag gcg ttc gct cag ggc ggc ttc cga ctg gtg gac aat 440Gly Gln Gly Gln Ala Phe Ala Gln Gly Gly Phe Arg Leu Val Asp Asn120 125 130aag atc gtg atc ccg cag acc ggc ctc tac ttc gtc tac agc cag gcg 488Lys Ile Val Ile Pro Gln Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Gln Ala135 140 145 150tcg ttc aga gtc tcc tgc agc gat ggc gac gag gag gga gca ggg aga 536Ser Phe Arg Val Ser Cys Ser Asp Gly Asp Glu Glu Gly Ala Gly Arg155 160 165cac ctc aca cct ctc agc cac acc atc tcg cgc tac tca gag tcc atg 584His Leu Thr Pro Leu Ser His Thr Ile Ser Arg Tyr Ser Glu Ser Met170 175 180ggc act gat gtg tct ctg atg agc gcg gtg agg tcg gcg tgc cag aac 632Gly Thr Asp Val Ser Leu Met Ser Ala Val Arg Ser Ala Cys Gln Asn185 190 195acc gct cac gag gac agc tac agc gac gga cgg ggc tgg tac aac acc 680Thr Ala His Glu Asp Ser Tyr Ser Asp Gly Arg Gly Trp Tyr Asn Thr200 205 210atc tat ctg ggc gcc gtg ttt cag ctg aac aga ggt gac aga ctg gag 728Ile Tyr Leu Gly Ala Val Phe Gln Leu Asn Arg Gly Asp Arg Leu Glu215 220 225 230acg gaa acc aac cag ttg tca gag ctg gag aca gac gag ggc aag acc 776Thr Glu Thr Asn Gln Leu Ser Glu Leu Glu Thr Asp Glu Gly Lys Thr235 240 245ttc ttc ggt gtg ttt gca ctt taaaatgact gtgatactga cagagaggac827Phe Phe Gly Val Phe Ala Leu250gcaaagcctt gcacagtgcc aaaagtttgg cttttctgaa agattttatt tgaattttta 887ttattcatct tcatggtgat gtagaaatgt tgaaatctca atggagataa cgcttgcggc 947tgaacaggcg ctgctgattt tttaaaatcc tataaactgt aacagtttga aatgttattt 1007ctattttagg cactttttgt acattattta tgctgacctg agattgtagt aggccagact 1067ctctctgctg tatctgatga cgacacagct cttcactgga gagtgcaggt ttttgaggat 1127tatctacaga attgttatca tgtaccaata cagcctgtat gtatttattt gtatttattt 1187atatttaaat tgttggggta aggtgttgaa agatttatat ttatatgtgc acataaactt 1247aattaaaatg caaaaaaacc caaaagaaaa aaaaaaaaaa a 1288
黑鯛<210>2<211>253<212>PRT<213>黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)<400>2Met Val Ala Tyr Thr Thr Ala Pro Cys Asp Leu Glu Met Gly Pro Glu1 5 10 15Glu Arg Thr Val Val Leu Ile Glu Lys Lys Ser Ala Thr Gly Trp Met20 25 30Trp Lys Val Ser Val Ala Leu Leu Val Ala Ala Leu Ala Phe Ala Gly35 40 45Val Leu Leu Phe Ala Trp Tyr Trp Asn Gly Lys Pro Glu Ile Leu Ile50 55 60His Ser Gly Gln Thr Glu Ala Leu Thr Lys Asn Asp His Thr Glu Lys65 70 75 80Thr Asp Pro His Ser Thr Leu Arg Arg Ile Ser Ser Lys Ala Lys Ala85 90 95Ala Ile His Leu Glu Gly Ser Tyr Asp Glu Asp Glu Gly Leu Lys Asp100 105 110Gln Val Glu Trp Lys Asn Gly Gln Gly Gln Ala Phe Ala Gln Gly Gly115 120 125Phe Arg Leu Val Asp Asn Lys Ile Val Ile Pro Gln Thr Gly Leu Tyr130 135 140Phe Val Tyr Ser Gln Ala Ser Phe Arg Val Ser Cys Ser Asp Gly Asp145 150 155 160Glu Glu Gly Ala Gly Arg His Leu Thr Pro Leu Ser His Thr Ile Ser165 170 175Arg Tyr Ser Glu Ser Met Gly Thr Asp Val Ser Leu Met Ser Ala Val180 185 190Arg Ser Ala Cys Gln Asn Thr Ala His Glu Asp Ser Tyr Ser Asp Gly195 200 205
黑鯛Arg Gly Trp Tyr Asn Thr Ile Tyr Leu Gly Ala Val Phe Gln Leu Asn210 215 220Arg Gly Asp Arg Leu Glu Thr Glu Thr Asn Gln Leu Ser Glu Leu Glu225 230 235 240Thr Asp Glu Gly Lys Thr Phe Phe Gly Val Phe Ala Leu245 250<210>3<211>563<212>DNA<213>黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)<220>
<221>CDS<222>(3)..(560)<223>
<400>3tc att aaa gag gag aaa tta act atg aga gga tcg cat cac cat cac 47Ile Lys Glu Glu Lys Leu Thr Met Arg Gly Ser His His His His1 5 10 15cat cac gga tcc ctg agg cgc atc agc agc aaa gcc aag gca gcc atc95His His Gly Ser Leu Arg Arg Ile Ser Ser Lys Ala Lys Ala Ala Ile20 25 30cat tta gaa ggg agc tat gat gaa gac gaa ggt ttg aaa gac cag gtg 143His Leu Glu Gly Ser Tyr Asp Glu Asp Glu Gly Leu Lys Asp Gln Val35 40 45gag tgg aag aat ggt caa ggc cag gcg ttc gct cag ggc ggc ttc cga 191Glu Trp Lys Asn Gly Gln Gly Gln Ala Phe Ala Gln Gly Gly Phe Arg50 55 60ctg gtg gac aat aag atc gtg atc ccg cag acc ggc ctc tac ttc gtc 239Leu Val Asp Asn Lys Ile Val Ile Pro Gln Thr Gly Leu Tyr Phe Val65 70 75tac agc cag gcg tcg ttc aga gtc tcc tgc agc gat ggc gac gag gag 287Tyr Ser Gln Ala Ser Phe Arg Val Ser Cys Ser Asp Gly Asp Glu Glu80 85 90 95gga gca ggg aga cac ctc aca cct ctc agc cac acc atc tcg cgc tac 335Gly Ala Gly Arg His Leu Thr Pro Leu Ser His Thr Ile Ser Arg Tyr100 105 110tca gag tcc atg ggc act gat gtg tct ctg atg agc gcg gtg agg tcg 383
黑鯛Ser Glu Ser Met Gly Thr Asp Val Ser Leu Met Ser Ala Val Arg Ser115 120 125gcg tgc cag aac acc gct cac gag gac agc tac agc gac gga cgg ggc431Ala Cys Gln Asn Thr Ala His Glu Asp Ser Tyr Ser Asp Gly Arg Gly130 135 140tgg tac aac acc atc tat ctg ggc gcc gtg ttt cag ctg aac aga ggt479Trp Tyr Asn Thr Ile Tyr Leu Gly Ala Val Phe Gln Leu Asn Arg Gly145 150 155gac aga ctg gag acg gaa acc aac cag ttg tca gag ctg gag aca gac527Asp Arg Leu Glu Thr Glu Thr Asn Gln Leu Ser Glu Leu Glu Thr Asp160 165 170 175gag ggc aag acc ttc ttc ggt gtg ttt gca ctt taa563Glu Gly Lys Thr Phe Phe Gly Val Phe Ala Leu180 185<210>4<211>186<212>PRT<213>黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)<400>4Ile Lys Glu Glu Lys Leu Thr Met Arg Gly Ser His His His His His1 5 10 15His Gly Ser Leu Arg Arg Ile Ser Ser Lys Ala Lys Ala Ala Ile His20 25 30Leu Glu Gly Ser Tyr Asp Glu Asp Glu Gly Leu Lys Asp Gln Val Glu35 40 45Trp Lys Asn Gly Gln Gly Gln Ala Phe Ala Gln Gly Gly Phe Arg Leu50 55 60Val Asp Asn Lys Ile Val Ile Pro Gln Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr65 70 75 80Ser Gln Ala Ser Phe Arg Val Ser Cys Ser Asp Gly Asp Glu Glu Gly85 90 95Ala Gly Arg His Leu Thr Pro Leu Ser His Thr Ile Ser Arg Tyr Ser100 105 110Glu Ser Met Gly Thr Asp Val Ser Leu Met Ser Ala Val Arg Ser Ala115 120 125
黑鯛Cys Gln Asn Thr Ala His Glu Asp Ser Tyr Ser Asp Gly Arg Gly Trp130 135 140Tyr Asn Thr Ile Tyr Leu Gly Ala Val Phe Gln Leu Asn Arg Gly Asp145 150 155 160Arg Leu Glu Thr Glu Thr Asn Gln Leu Ser Glu Leu Glu Thr Asp Glu165 170 175Gly Lys Thr Phe Phe Gly Val Phe Ala Leu180 185<210>5<211>627<212>DNA<213>黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)<220>
<221>CDS<222>(1)..(627)<223>
<400>5cga ggc aaa atg ctg agg cgc atc agc agc aaa gcc aag gca gcc atc48Arg Gly Lys Met Leu Arg Arg Ile Ser Ser Lys Ala Lys Ala Ala Ile1 5 10 15cat tta gaa ggg agc tat gat gaa gac gaa ggt ttg aaa gac cag gtg96His Leu Glu Gly Ser Tyr Asp Glu Asp Glu Gly Leu Lys Asp Gln Val20 25 30gag tgg aag aat ggt caa ggc cag gcg ttc gct cag ggc ggc ttc cga 144Glu Trp Lys Asn Gly Gln Gly Gln Ala Phe Ala Gln Gly Gly Phe Arg35 40 45ctg gtg gac aat aag atc gtg atc ccg cag acc ggc ctc tac ttc gtc 192Leu Val Asp Asn Lys Ile Val Ile Pro Gln Thr Gly Leu Tyr Phe Val50 55 60tac agc cag gcg tcg ttc aga gtc tcc tgc agc gat ggc gac gag gag 240Tyr Ser Gln Ala Ser Phe Arg Val Ser Cys Ser Asp Gly Asp Glu Glu65 70 75 80gga gca ggg aga cac ctc aca cct ctc agc cac acc atc tcg cgc tac 288Gly Ala Gly Arg His Leu Thr Pro Leu Ser His Thr Ile Ser Arg Tyr85 90 95tca gag tcc atg ggc act gat gtg tct ctg atg agc gcg gtg agg tcg 336Ser Glu Ser Met Gly Thr Asp Val Ser Leu Met Ser Ala Val Arg Ser100 105 110
黑鯛gcg tgc cag aac acc gct cac gag gac agc tac agc gac gga cgg ggc384Ala Cys Gln Asn Thr Ala His Glu Asp Ser Tyr Ser Asp Gly Arg Gly115 120 125tgg tac aac acc atc tat ctg ggc gcc gtg ttt cag ctg aac aga ggt432Trp Tyr Asn Thr Ile Tyr Leu Gly Ala Val Phe Gln Leu Asn Arg Gly130 135 140gac aga ctg gag acg gaa acc aac cag ttg tca gag ctg gag aca gac480Asp Arg Leu Glu Thr Glu Thr Asn Gln Leu Ser Glu Leu Glu Thr Asp145 150 155 160gag ggc aag acc ttc ttc ggt gtg ttt gca ctt agg atc cac gcg tcg528Glu Gly Lys Thr Phe Phe Gly Val Phe Ala Leu Arg Ile His Ala Ser165 170 175tcg acc cgc ggc ggc cgc cag ctt cct agg ggt aag cct atc cct aac576Ser Thr Arg Gly Gly Arg Gln Leu Pro Arg Gly Lys Pro Ile Pro Asn180 185 190cct ctc ctc ggt ctc gat tct acg cgt acc ggt cat cat cac cat cac624Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His195 200 205cat627His<210>6<211>209<212>PRT<213>黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)<400>6Arg Gly Lys Met Leu Arg Arg Ile Ser Ser Lys Ala Lys Ala Ala Ile1 5 10 15His Leu Glu Gly Ser Tyr Asp Glu Asp Glu Gly Leu Lys Asp Gln Val20 25 30Glu Trp Lys Asn Gly Gln Gly Gln Ala Phe Ala Gln Gly Gly Phe Arg35 40 45Leu Val Asp Asn Lys Ile Val Ile Pro Gln Thr Gly Leu Tyr Phe Val50 55 60Tyr Ser Gln Ala Ser Phe Arg Val Ser Cys Ser Asp Gly Asp Glu Glu65 70 75 80Gly Ala Gly Arg His Leu Thr Pro Leu Ser His Thr Ile Ser Arg Tyr85 90 95
黑鯛Ser Glu Ser Met Gly Thr Asp Val Ser Leu Met Ser Ala Val Arg Ser100 105 110Ala Cys Gln Asn Thr Ala His Glu Asp Ser Tyr Ser Asp Gly Arg Gly115 120 125Trp Tyr Asn Thr Ile Tyr Leu Gly Ala Val Phe Gln Leu Asn Arg Gly130 135 140Asp Arg Leu Glu Thr Glu Thr Asn Gln Leu Ser Glu Leu Glu Thr Asp145 150 155 160Glu Gly Lys Thr Phe Phe Gly Val Phe Ala Leu Arg Ile His Ala Ser165 170 175Ser Thr Arg Gly Gly Arg Gln Leu Pro Arg Gly Lys Pro Ile Pro Asn180 185 190Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His195 200 205His
權(quán)利要求
1.黑鯛腫瘤壞死因子α基因的重組表達(dá)方法，包括重組載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與篩選、表達(dá)產(chǎn)物的分離純化和鑒定，其特征在于1)重組載體構(gòu)建根據(jù)黑鯛腫瘤壞死因子α成熟肽的cDNA序列，利用一對(duì)特異性引物rTF和rTR在其兩端引入BamHI和HindIII兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，克隆到表達(dá)載體，載體包括pQE系列、pET系列、pGEX-4T系列，pPIC系列以及pGAPZ系列；2)轉(zhuǎn)化與篩選將構(gòu)建的得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α、Jm109、XL1-blue或畢赤酵母、巴斯德酵母中，進(jìn)行PCR雙向篩選；獲得的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒純化，限制性內(nèi)切酶消化驗(yàn)證；并經(jīng)序列測定鑒定后，所篩選的陽性克隆作為預(yù)備工程菌株，分別對(duì)細(xì)菌或酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；3)表達(dá)產(chǎn)物的分離純化采用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)工程菌的表達(dá)，直接取上清液或經(jīng)裂解液或玻璃珠裂解細(xì)胞，用親和層法進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳鑒定。
2.按照權(quán)利要求1所述的黑鯛腫瘤壞死因子α基因的重組表達(dá)方法，其特征在于所述重組載體構(gòu)建，分為原核系統(tǒng)表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)黑鯛腫瘤壞死因子α成熟肽的cDNA序列，利用一對(duì)基因特異性引物rTF 5′-TAG GAT CCC TGA GGC GCA TCA GCAG-3′和rTR 5′-GCG AAG CTT AAG TGC AAA CAC ACC GAA G-3′，分別在引物兩端引入BamHI、HindIII兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，在經(jīng)感染的黑鯛cDNA上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物亞克隆到表達(dá)載體pQE30，完成原核系統(tǒng)表達(dá)載體的構(gòu)建；真核系統(tǒng)表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)黑鯛腫瘤壞死因子α成熟肽的cDNA序列，采用另一對(duì)含酶切位點(diǎn)的特異性引物ryTF 5’-CAG AGC TCG CAA AAT GCTGAG GCG CAT CA-3’和yrTR5’-ATG GAT CCT AAG TGC AAA CAC ACC GAA-3’，該特異性引物分別含SacI和BamHI兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，在黑鯛經(jīng)鰻弧菌感染的頭腎cDNA文庫中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SacI和BamHI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶消化后，亞克隆到pMETA穿梭型表達(dá)載體上，完成用于不同宿主轉(zhuǎn)化所需的表達(dá)載體構(gòu)建。
3.按照權(quán)利要求1所述的黑鯛腫瘤壞死因子α基因的重組表達(dá)方法，其特征在于所述誘導(dǎo)原核工程菌在大腸桿菌表達(dá)的誘導(dǎo)劑為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷；誘導(dǎo)重組酵母工程菌在酵母表達(dá)的誘導(dǎo)劑為甲醇。
4.按照權(quán)利要求1所述的黑鯛腫瘤壞死因子α基因的重組表達(dá)方法，其特征在于經(jīng)誘導(dǎo)后，融合表達(dá)的菌液經(jīng)裂解液或玻璃珠裂解，分泌型表達(dá)細(xì)胞直接收集上清液，用6His單克隆抗體進(jìn)行免疫親和層析，或用鎳金屬親和層析純化，以SDS-PAGE電泳鑒定。
5.按照權(quán)利要求1所述的黑鯛腫瘤壞死因子α基因的重組表達(dá)方法，其特征在于所述鎳金屬親和層析純化使用的鎳金屬親和純化膠體是Ni-NTA。
6.按照權(quán)利要求1所述的黑鯛腫瘤壞死因子α基因的重組表達(dá)方法，其特征在于在表達(dá)產(chǎn)物的分離純化后應(yīng)進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的活性鑒定，其鑒定方法為，以純化后的重組黑鯛腫瘤壞死因子α重組蛋白，體外刺激黑鯛和真鯛的巨噬細(xì)胞，檢測白介素1β、TNFα、TGFβ和IL8細(xì)胞因子被重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是黑鯛腫瘤壞死因子α(BS TNFα)基因的體外表達(dá)與純化技術(shù)。本發(fā)明包括重組表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化子篩選和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化和鑒定等技術(shù)環(huán)節(jié)。其中重組體的構(gòu)建是根據(jù)黑鯛腫瘤壞死因子α預(yù)測成熟肽的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，引入兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶突變位點(diǎn)，然后克隆到表達(dá)載體，再將構(gòu)建成的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌和酵母，篩選陽性克隆并以IPTG或甲醇誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。利用親和層析對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行多級(jí)純化，獲得高純度體外表達(dá)的重組腫瘤壞死因子α。該產(chǎn)品可用于魚類免疫機(jī)制的理論研究，也可作為餌料添加劑、免疫增強(qiáng)劑、病害防治藥物等在生產(chǎn)方面進(jìn)行應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1740321SQ20041005033
公開日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月27日
發(fā)明者宋林生, 蔡中華, 高春萍, 相建海 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院海洋研究所