專利名稱：腫瘤壞死因子α基因的報告質(zhì)粒與構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因，尤其是涉及一種基于熒光素酶(luciferase)報告基因的腫瘤壞死 因子a基因的報告質(zhì)粒的構(gòu)建及其應(yīng)用。
技術(shù)背景腫瘤壞死因子a (TNF-a)是一種具有重要生理功能的細胞因子。腫瘤壞死因子a主要由 巨噬細胞產(chǎn)生，產(chǎn)生細胞還包括淋巴細胞、自然殺傷細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、星形膠 質(zhì)細胞、表皮細胞和平滑肌細胞等。腫瘤壞死因子a具有廣泛的生物學活性，例如參與炎 癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答；抗腫瘤；參與內(nèi)毒素性休克、動脈硬化、靜脈血栓形成和脈管炎等病理 過程；引起惡液質(zhì)。在醫(yī)學臨床診斷、科學研究等領(lǐng)域，常常需要測定腫瘤壞死因子a基因的表達水平。腫 瘤壞死因子a的傳統(tǒng)檢測方法基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(Enzyme linked immunosorbent assays, ELISA)，其缺點在于過程繁瑣、檢測操作耗時長、試劑價格昂貴"Bioscience TNFa ELISA 檢測試齊U盒；Mouse TNFa (Tumor Necrosis Factor alpha, TNF-alpha, TNF-a) ELISA Ready-SET-Go! CAT#: 88-7324-88)。腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)?？捎行Х从衬[瘤壞死因 子a基因的表達水平(Beutler B， Brown T. A CAT Reporter Construct Allows Ultrasensitive Estimation of TNF Synthesis, and Suggests that the TNF Gene has been Silenced in Non-macrophage Cell Lines. J. Clin. Invest, 1991, 87: 1336-1344)，目前常用的腫瘤壞死因子a 基因的報告基因為氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)基因，氯霉 素乙?；D(zhuǎn)移酶的傳統(tǒng)檢測方法需要使用放射性標記的化合物(J.薩姆布魯克，DW拉塞爾 著.黃培堂等譯.分子克隆實驗指南(第三版).北京科學出版社，2002， 1354-1355)， 而使用ELISA的新方法的缺點上面己有敘述(葉平，方紅，周新，等.非諾貝特和吡格列酮 對心肌細胞腫瘤壞死因子-a表達的影響及機制.中國藥學雜志，2004， 39 (4) : 258-261)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種基于熒光素酶(lucifemse)報告基因的腫瘤壞死因子a基因的報告 質(zhì)粒。本發(fā)明的另一目的在于提供一種腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的構(gòu)建方法。本發(fā)明的另一目的是應(yīng)用帶有腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的細胞株(即腫瘤壞死因 子a基因報告細胞株)檢測化合物對腫瘤壞死因子a基因表達水平的影響。本發(fā)明所述的腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒構(gòu)建自商品化質(zhì)粒pGL3，即將腫瘤壞死 因子a基因的兩個調(diào)控元件腫瘤壞死因子a基因啟動子(promoter)和腫瘤壞死因子a基因 3，端非翻譯序列(3'-UTR)插入質(zhì)粒pGL3所含的熒光素酶(luciferase)報告基因兩側(cè)。構(gòu) 建完成的腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒所含的熒光素酶報告基因的表達由腫瘤壞死因子a 基因的兩個調(diào)控元件調(diào)控，將腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入細胞后，化合物對 熒光素酶報告基因表達的影響即代表該化合物對腫瘤壞死因子a基因表達水平的影響?？捎行Х从衬[瘤壞死因子a基因表達水平的腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的核心序列 為熒光素酶(luciferase)報告基因、腫瘤壞死因子a基因啟動子(promoter)及3，端非翻譯 序列(3'-UTR)組成的重組DNA序列，或者通過上述核苷酸序列中的一個或多個核苷酸的 缺失、取代或增加而得到的核苷酸序列；可有效反映腫瘤壞死因子a基因表達水平的腫瘤壞 死因子a基因的報告質(zhì)粒的核心序列的連接順序為腫瘤壞死因子a基因啟動子(promoter) -熒光素酶報告基因-腫瘤壞死因子a基因3'端非翻譯序列(3'-UTR)。本發(fā)明所述的腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括下列步驟1) 從小鼠基因組DNA中采用PCR方法擴增腫瘤壞死因子a基因啟動子和腫瘤壞死因 子a基因3'端非翻譯序列；2) 將腫瘤壞死因子a基因的兩個調(diào)控元件腫瘤壞死因子a基因啟動子和腫瘤壞死因子a 基因3'端非翻譯序列克隆至質(zhì)粒pGL3的熒光素酶報告基因兩側(cè)的克隆位點，即構(gòu)建了腫瘤 壞死因子a基因的報告質(zhì)粒。上述構(gòu)建好的腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的熒光素酶報告基因由腫瘤壞死因子a基 因啟動子和腫瘤壞死因子a基因3'端非翻譯序列驅(qū)動，因此，熒光素酶基因的表達水平即反 映了腫瘤壞死因子a基因的表達水平。在步驟l)中，PCR方法擴增腫瘤壞死因子a基因啟動子和腫瘤壞死因子a基因3'端非 翻譯序列的引物對包括腫瘤壞死因子a基因啟動子的PCR擴增引物對和腫瘤壞死因子a基因 3'端非翻譯序列的PCR擴增引物對。腫瘤壞死因子a基因啟動子的PCR擴增引物對為正向引物5' AAAGGTACCATTCTGTCTGCTTGTGTCTGTCTTG 3，(下劃線標注的序列 為限制性內(nèi)切酶《/wI的酶切位點)；反向引物5' GGGAAGCTTGGTGTCTTTTCTGGAGGGAGATGTG 3，(下劃線標注的序列為限制性內(nèi)切酶///wd III的酶切位點)。腫瘤壞死因子ot基因3'端非翻譯序列(3'-UTR)的PCR擴增引物對為正向引物5，GGGTCTAGAAGGGAATGGGTGTTCATCCATTCTC 3，(下劃線標注的序列 為限制性內(nèi)切酶BawH I的酶切位點)；反向引物5,AAAGGATCCATGGATGCAGACTTCATCCCAAGAC 3，(下劃線標注的序 列為限制性內(nèi)切酶jaal的酶切位點)。以下給出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的腫瘤壞死因子a基因報告細胞株的 建立方法，其具體步驟為1 )將腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒和帶新霉素抗性的篩選標記質(zhì)粒用Fugene6轉(zhuǎn)染試 劑共轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞株RAW 264.7;2) 共轉(zhuǎn)染后，將小鼠巨噬細胞株RAW 264.7消化后轉(zhuǎn)接到細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液可為 Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(含8% 10%的胎牛血清，即FBS);3) 在培養(yǎng)液中加入G418 (新霉素類似物)(終濃度為300 400嗎/mL)進行篩選；篩 選期間換培養(yǎng)液的間隔時間為3 4 d;4) 待克隆大小為肉眼可見時，挑取克隆至多孔板中培養(yǎng)，每個克隆轉(zhuǎn)接l個孔，待細胞 長起后轉(zhuǎn)接至另一多孔板，每個克隆轉(zhuǎn)接2個孔，用于陽性克隆的篩選；5) 培養(yǎng)24h后，在轉(zhuǎn)接克隆的一個孔加入細菌脂多糖(LPS)至終濃度為100 200ng/mL， 5 6h后用裂解液裂解細胞，測定裂解液的熒光素酶活性細菌脂多糖刺激下的熒光素酶表 達量比細菌脂多糖未刺激的熒光素酶表達量至少有50倍增大，則表明該克隆為陽性克隆，此 克隆即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的腫瘤壞死因子a基因報告細胞株。上述所得的腫瘤壞死因子a基因報告細胞株需進行可行性驗證，即在細菌脂多糖(LPS) 刺激的不同時間點測定腫瘤壞死因子a基因報告細胞株的裂解液的熒光素酶活性，同時用酶 聯(lián)免疫反應(yīng)法(ELISA)測定上清液中的腫瘤壞死因子a的含量，根據(jù)比較兩種方法的結(jié)果 來判斷此報告細胞株的可行性，其步驟為1) 細菌脂多糖刺激時間設(shè)定為0、 2、 4、 6、 8、 12h，每個時間點設(shè)定3個平行樣；2) 將報告細胞株轉(zhuǎn)接至96孔板培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液可為Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(含 8 10%胎牛血清)；3) 加入細菌脂多糖至終濃度為100 200ng/mL，根據(jù)步驟l)的刺激時間進行處理；4) 在設(shè)定的時間點收集培養(yǎng)上清液及細胞裂解液，測定細胞裂解液的熒光素酶活性，同 時用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法測定培養(yǎng)上清液中的腫瘤壞死因子a的含量，比較兩種方法所得到的結(jié)果來驗證所構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的腫瘤壞死因子a基因報告細胞 株的可行性?？蓱?yīng)用腫瘤壞死因子a基因報告細胞株檢測化合物對腫瘤壞死因子a基因表達水平的影 響。例如，應(yīng)用腫瘤壞死因子a基因報告細胞株檢測地塞米松(DEX)和大黃素(emodin) 對腫瘤壞死因子a基因表達水平的影響。檢測地塞米松(DEX)對腫瘤壞死因子a基因表達水平的影響的具體步驟為1) 地塞米松濃度設(shè)定為O、 10、 25、 50、 100、 500nmol/L，每個濃度設(shè)定3個平行樣。2) 將腫瘤壞死因子a基因報告細胞株轉(zhuǎn)接至96孔板培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液可為Dulbecco改 良的Eagle培養(yǎng)基(含8 10%胎牛血清)。3) 吸掉培養(yǎng)液，加入含不同地塞米松(DEX)濃度的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(含 8 10%胎牛血清)，同時加入細菌脂多糖(LPS)至終濃度為100 200ng/mL。4) 5 6h后，測定細胞裂解液的熒光素酶活性，該活性即代表腫瘤壞死因子a基因的表 達水平，同時用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法測定培養(yǎng)上清液中的腫瘤壞死因子a的含量，比較兩種方法 的測定結(jié)果。檢測大黃素(emodin)對腫瘤壞死因子a基因表達水平的影響的具體步驟為1) 大黃素濃度設(shè)定為O、 25、 50、 100pmol/L，每個濃度設(shè)定3個平行樣。2) 將腫瘤壞死因子a基因報告細胞株轉(zhuǎn)接至96孔板培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液可為Dulbecco 改良的Eagle培養(yǎng)基(含8 10%胎牛血清)。3) 吸掉培養(yǎng)液，加入含不同大黃素濃度的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(含8 10%胎 牛血清)，同時加入細菌脂多糖至終濃度為100 200ng/mL。4) 5 6h后，測定細胞裂解液的熒光素酶活性，該活性即代表腫瘤壞死因子a基因的 表達水平，同時用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法測定培養(yǎng)上清液中的腫瘤壞死因子a的含量，比較兩種方 法的測定結(jié)果。腫瘤壞死因子a的傳統(tǒng)測量方法采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(ELISA)，另外，至于采用報告 基因的方法已見報道的為氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶報告基因，這兩種方法都存在如說明書背景技 術(shù)中闡明的多種缺點，本發(fā)明采用熒光素酶報告基因的突出優(yōu)點為檢測方便、靈敏度高、 不使用放射性標記的化合物；經(jīng)過本發(fā)明列舉的可行性驗證及關(guān)于檢測化合物對腫瘤壞死因 子a基因表達水平的影響的具體應(yīng)用表明本發(fā)明公開的腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒及腫 瘤壞死因子a基因報告細胞株都具有優(yōu)良的應(yīng)用效果。


圖1為腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖2為用腫瘤壞死因子a基因報告細胞株檢測細菌脂多糖(LPS)刺激時間對腫瘤壞死 因子a基因表達水平的影響的結(jié)果。在圖2中，橫坐標為時間(h)，縱坐標為熒光素酶活性。圖3為利用腫瘤壞死因子a ELISA檢測試劑盒檢測細菌脂多糖(LPS)刺激時間對腫瘤 壞死因子a基因表達水平的影響的結(jié)果。在圖3中，橫坐標為時間(h)，縱坐標為腫瘤壞死 因子a (pg/mL)。圖4為用腫瘤壞死因子a基因報告細胞株檢測地塞米松對腫瘤壞死因子a基因表達水平 的影響的結(jié)果。在圖4中，橫坐標為地塞米松(nmol/L)，縱坐標為熒光素酶活性(％)。圖5為用腫瘤壞死因子a ELISA檢測試劑盒檢測地塞米松對腫瘤壞死因子a基因表達水 平的影響的結(jié)果。在圖5中，橫坐標為地塞米松(nmol/L)，縱坐標為腫瘤壞死因子a (%)。圖6為利用腫瘤壞死因子a基因報告細胞株檢測大黃素(emodin)對腫瘤壞死因子a基 因表達水平的影響的結(jié)果。在圖6中，橫坐標為大黃素(pmol/L)，縱坐標為熒光素酶活性(。/。)。圖7為用腫瘤壞死因子a ELISA檢測試劑盒檢測大黃素對腫瘤壞死因子a基因表達水平 的影響的結(jié)果。在圖7中，橫坐標為大黃素(pmol/L)，縱坐標為腫瘤壞死因子a (%)。
具體實施方式
實施例1構(gòu)建腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒，具體步驟為-1) 從小鼠基因組DNA中采用PCR方法擴增腫瘤壞死因子a基因啟動子(promoter)及 3'端非翻譯序列G，-UTR);2) 將腫瘤壞死因子a基因啟動子(promoter)及3'端非翻譯序列(3'-UTR)克隆至質(zhì)粒 pGL3的熒光素酶基因兩側(cè)的克隆位點。上述構(gòu)建好的腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的熒光素酶基因由腫瘤壞死因子a基因啟 動子(promoter)及3'端非翻譯序列(3'-UTR)驅(qū)動，因此，熒光素酶基因的表達水平即反 映了腫瘤壞死因子a基因的表達水平。在步驟l)中，利用PCR方法擴增腫瘤壞死因子a基因啟動子(promoter)及3'端非翻 譯序列(3'-UTR)，它們的堿基序列全長分別為1323 bp及807 bp，其中所用引物對的堿基 序列如下所示。腫瘤壞死因子a基因啟動子(promoter)的PCR擴增引物對正向引物5， AAAGGTACCATTCTGTCTGCTTGTGTCTGTCTTG 3，(下劃線標注的序列 為限制性內(nèi)切酶《jw I的酶切位點)；反向引物5' GGGAAGCTTGGTGTCTTTTCTGGAGGGAGATGTG 3，(下劃線標注的序 列為限制性內(nèi)切酶if/ d III的酶切位點)。腫瘤壞死因子a基因3'端非翻譯序列(3'-UTR)的PCR擴增引物對正向引物5'GGGTCTAGAAGGGAATGGGTGTTCATCCATTCTC3，(下劃線標注的序列 為限制性內(nèi)切酶BamH I的酶切位點)；反向引物5'AAAGGATCCATGGATGCAGACTTCATCCCAAGAC 3，(下劃線標注的序 列為限制性內(nèi)切酶J^"的酶切位點)。PCR反應(yīng)體系(20jtL)如下10x反應(yīng)緩沖液2pL， TH向引物100ng，反向引物100ng， 10mmol/LdNTP 1.5nL，模板DNA 1 ng， T叫DNA聚合酶1 ^L，滅菌超純水補至20 nL。上 述各組份混勻后，將PCR管置于PCR儀中，啟動反應(yīng)程序。擴增腫瘤壞死因子a基因啟動子(promoter)的PCR反應(yīng)程序如下① 預(yù)變性，95°C、 5min。② 變性，94°C、 lmin;復(fù)性，61°C、 1 min;延伸，72°C、 2 min;步驟②共進行35個循環(huán)。③ 反應(yīng)延續(xù)，72°C、 7min。
樣品保存，4'C。擴增腫瘤壞死因子a基因3'端非翻譯序列(3'-UTR)的PCR反應(yīng)程序如下① 預(yù)變性，95°C、 5min。② 變性，94°C、 lmin;復(fù)性，61°C、 1 min;延伸，72°C、 1.5 min;步驟②共進行35個 循環(huán)。③ 反應(yīng)延續(xù)，72°C、 7min。④ 樣品保存，4°C。待反應(yīng)結(jié)束，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測后使用DNA片段純化試劑盒(TaKaRa: DNA Fragment Purification Kit(Ver2.0)， Code No. DV807A)純化上述PCR擴增產(chǎn)物，具體步驟參照 試劑盒說明書。PCR擴增出來的腫瘤壞死因子a基因啟動子(promoter)的堿基序列全長為1323 bp,具 體如下所示sttctgtctg cttgtgtctg tcttgcgttg ggggsgsssc ttcctggtct ctttaaggsg 60 tggagcaggg gscsgsggcc tcsgttggtc cstgggstcc gggcagsgcs sagagacstg 120 sggagcsggc agctcccsga gacstggtgg attcscggga gtgaggc3gc ttasctgccg 180 g3ggsg3ccc assggstgsg ctsgggsgst ccstccssgg gtggsgsgsg stgeigggttc 240 tggggsgssg tgsctccsct ggsgggtggg 3g3gtgttt3 gg3gtggg3g ggtgggggsg 300gggsatccttgg33g3ccggggsgtc3tacgg3ttgggsgswtcctgg33gc3gggctg360tgggscct333tgtctg3gttgatgtsccgc3gtc33g3t3tggc3g3ggctccgtggs3420sactcscttgggsgcsgggscccs33gcsgcsgcctgsgctcstgstcsgsgtgsssggs480gsaiggcttgtg3ggtccgtg33ttcccsgggctgsgttC3ttccctctggggctgcccc3540t3ctcaitccc3tt3CCCCCCcc3cc3gccctcccaaagcccatgcscscttcccsactct600cssgctgctctgccttcsgccscttcctccscaigggggctttccctcctc660ctccccccttatgcaccc3gctttcsgssgC3CCCCCCC3tgctaagttc720tcccccstgg3tgtccc3tt3C3C3ggcstggtctttcts780g3c33tg3ttsgctctggsg333tgggtttcsgttctcag840ggtcct3t3ccaccctcctg9003ttggcccc3gsttgccacagastcctggtggggscgscgggg3gg3g3ttccttgstgc960ctgggtgtccccsactttccssaccctctgcccccgcgstccg3g3c3g31020ggtgtsgggccactaccgcttCCtCC3C3tg3g3tcstggttttctccsc1080ttccgagggtcttttccccgccctcttcccca3gggctat3ssggcggcc1140gtctgcscsgcc3gcc3gc3gssgctccctcagcgaggacsgcssggg3ctsgccsgg3g1200catcttggaa3tsgctcccaC3gCC33CC31260ggcsggttctgtccctttcactcsctggccC33ggcgccscstctccctc13203CC1323PCR擴增出來的腫瘤壞死因子a基因3'端非翻譯序列(3'-UTR)的堿基序列全長為807 bp，具體如下所示sgggs3tgggtgttc3tcceittctctsccc3gccccc3Ctctgacccctttsctctgscc60cctttattgtCt3CtCCtC3gsgcccccsgtctgtstccttctsscttsg33sgggg3tt1203tggctcagggtccssctctgtgctcsgsgCtttC33C33ct3ctcag33180ctgggscsgtgscctggsctgtgggcctctC3tgcacc3cC3tc3sggsctcsaatgggc240tttccg33ttcsctggsgtctcgsstgtcc3ttcctg3gttctgc333gggsgsgtggtc3003ggttgcctctgtctcagsstgsggctggsts3gstctc3ggccttcct3ccttcsgscc360tttccagattcttccctgsggtgcsstgcc3sgccttcctc3c3g3gcc3gcccccctcs4203ttt3t3tttgcacttattatttsttsttt3ttt3tt3tttattt3tttgcttatgaatg480tstttscttggssggccggggtgtcctggsggscccsgtgtgggssgctgtcttcsg3C3540g3C3tgttttctgtgsasscggsgctgsgctgtccccscctggcctctct3ccttgttgc600ctcctcttttgctt33tgtttSttt3tCt3acccasttgtCtt33t33Cg660ctgstttggtgsccsggctgtcgct3C3tc3ctgsccctcttgccccscgggsgccgtga720ctgt33tcgcctscggtcsats33gstcgc3stgtg3ttt780ctgtcttgggatgasgtctgC3tCC3t807在步驟2)中，質(zhì)粒pGL3、腫瘤壞死因子a基因啟動子(promoter)及腫瘤壞死因子a基 因3'端非翻譯序列(3'-UTR)的雙酶切及連接，報告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、小量提取及鑒定等步驟均 參照《分子克隆實驗指南》(第三版)(J.薩姆布魯克，DW拉塞爾著.黃培堂等譯.分子克 隆實驗指南(第三版).北京科學出版社，2002)進行。最后，雙酶切鑒定及后續(xù)的提交 英駿生物技術(shù)有限公司進行的測序鑒定表明本發(fā)明成功獲得了腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì) 粒(參見圖1， "pGL3-TNFPro-UTR"為根據(jù)質(zhì)粒命名規(guī)則命名的腫瘤壞死因子a基因的報告 質(zhì)粒的名稱，"6630bp"表示腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的堿基序列全長為6630bp;"TOF-a promoter"表示腫瘤壞死因子a基因啟動子；"luciferase"表示熒光素酶報告基因； "TNF-a 3'-UTR"表示腫瘤壞死因子a基因3'端非翻譯序列；"^w I、 /f/wd III、 Wa I、 5awH I、 萬g/ n"表示限制性內(nèi)切酶識別位點，其中，顯示為黑體字的限制性內(nèi)切酶識別位點為本發(fā)明 在構(gòu)建腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒時使用的位點。)。構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的腫瘤壞死因子a基因報告細胞株。具體 方法為1) 將腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒和篩選標記質(zhì)粒pCR3.1(新霉素抗性)用Fugene6 轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞株RAW264.7。2) 共轉(zhuǎn)染后，將細胞消化后轉(zhuǎn)接到細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液可為Dulbecco改良的Eagle 培養(yǎng)基(DMEM)(含8 10%胎牛血清)。3) 在培養(yǎng)液中加入G418 (新霉素類似物)(終濃度為300 400 pg/mL)進行篩選；篩 選期間換培養(yǎng)液的間隔時間為3 4d;4) 待克隆大小為肉眼可見時，挑取克隆至多孔板中培養(yǎng)，每個克隆轉(zhuǎn)接l個孔，待細胞 長起后轉(zhuǎn)接至另一多孔板，每個克隆轉(zhuǎn)接2個孔，用于陽性克隆的篩選；5) 培養(yǎng)24h后，在轉(zhuǎn)接克隆的一個孔加入細菌脂多糖(LPS)至終濃度為100 200ng/mL， 5 6 h后用裂解液裂解細胞，測定裂解液的熒光素酶活性細菌脂多糖(LPS)刺激下的熒 光素酶表達量比細菌脂多糖(LPS)未刺激的熒光素酶表達量至少有50倍增大，則表明該克 隆為陽性克隆，此克隆即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的腫瘤壞死因子a基因 報告細胞株。上述所得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的腫瘤壞死因子a基因報告細胞株 需進行可行性驗證，即在細菌脂多糖(LPS)刺激的不同時間點測定腫瘤壞死因子a基因報 告細胞株的裂解液的熒光素酶活性，同時用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(ELISA)測定上清液中的腫瘤 壞死因子a的含量，根據(jù)比較兩種方法的結(jié)果來判斷此報告細胞株的可行性，其步驟為1) 細菌脂多糖(LPS)刺激時間設(shè)定為O、 2、 4、 6、 8、 12 h，每個時間點設(shè)定3個平 行樣；2) 將腫瘤壞死因子a基因報告細胞株轉(zhuǎn)接至96孔板培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液可為Dulbecco改 良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(含8 10%胎牛血清)；3) 加入細菌脂多糖(LPS)至終濃度為100 200ng/mL，根據(jù)步驟l)的刺激時間進行 處理；4) 在設(shè)定的時間點收集培養(yǎng)上清液及細胞裂解液，測定細胞裂解液的熒光素酶活性，同時用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(ELISA)測定培養(yǎng)上清液中的腫瘤壞死因子a的含量，比較兩種方法 所得到的結(jié)果來驗證所構(gòu)建的腫瘤壞死因子a基因報告細胞株的可行性。腫瘤壞死因子a基 因報告細胞株的可行性驗證的結(jié)果見圖2和圖3?？蓱?yīng)用腫瘤壞死因子a基因報告細胞株檢測化合物對腫瘤壞死因子a基因表達水平的影 響，例如檢測地塞米松(DEX)對腫瘤壞死因子a基因表達水平的影響，其具體步驟為1) 地塞米松(DEX)濃度設(shè)定為O、 10、 25、 50、 100、 500nmol/L，每個濃度設(shè)定3個 平行樣。2) 將腫瘤壞死因子a基因報告細胞株轉(zhuǎn)接至96孔板培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液可為Dulbecco改 良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(含8 10%胎牛血清)。3) 吸掉培養(yǎng)液，加入含不同地塞米松(DEX)濃度的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基 (DMEM)(含8 10。/。胎牛血清)，同時加入細菌脂多糖(LPS)至終濃度為100 200ng/mL。4) 5 6h后，測定細胞裂解液的熒光素酶活性，該活性即代表腫瘤壞死因子a基因的表 達水平，同時用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(ELISA)測定培養(yǎng)上清液中的腫瘤壞死因子a的含量，比 較兩種方法的測定結(jié)果。地塞米松(DEX)對腫瘤壞死因子a基因的表達水平的影響見圖4 和圖5。實施例2實施例2與實施例1的不同之處在于實施例2應(yīng)用腫瘤壞死因子a基因報告細胞株檢測 大黃素(emodin)對腫瘤壞死因子a基因的表達水平的影響，其具體步驟為1) 大黃素(emodin)濃度設(shè)定為0、 25、 50、 100 pmol/L，每個濃度設(shè)定3個平行樣。2) 將腫瘤壞死因子a基因報告細胞株轉(zhuǎn)接至96孔板培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液可為Dulbecco 改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(含8 10%胎牛血清)。3) 吸掉培養(yǎng)液，加入含不同大黃素(emodin)濃度的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基 (DMEM)(含8 10。/()胎牛血清)，同時加入細菌脂多糖(LPS)至終濃度為100 200 ng/mL。4)5 6h后，測定細胞裂解液的熒光素酶活性，該活性即代表腫瘤壞死因子a基因的表 達水平，同時用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(ELISA)測定培養(yǎng)上清液中的腫瘤壞死因子a的含量，比 較兩種方法的測定結(jié)果。大黃素(emodin)對腫瘤壞死因子a基因的表達水平的影響見圖6 和圖7。序列表PCR方法擴增腫瘤壞死因子a基因啟動子和腫瘤壞死因子a基因3'端非翻譯序列的引物 對包括腫瘤壞死因子a基因啟動子的PCR擴增引物對和腫瘤壞死因子a基因3'端非翻譯序列 的PCR擴增引物對。腫瘤壞死因子a基因啟動子的PCR擴增引物對為正向引物5' AAAGGTACCATTCTGTCTGCTTGTGTCTGTCTTG 3,(下劃線標注的序列 為限制性內(nèi)切酶^wl的酶切位點)；反向引物5' GGGAAGCTTGGTGTCTTTTCTGGAGGGAGATGTG 3，(下劃線標注的序列為限制性內(nèi)切酶/z/wdin的酶切位點)。腫瘤壞死因子a基因3'端非翻譯序列(3'-UTR)的PCR擴增引物對為正向引物5，GGGTCTAGAAGGGAATGGGTGTTCATCCATTCTC 3，(下劃線標注的序列為限制性內(nèi)切酶^wjH I的酶切位點)；反向引物5，AAAGGATCCATGGATGCAGACTTCATCCCAAGAC 3，(下劃線標注的序列為限制性內(nèi)切酶WaI的酶切位點)。PCR擴增出來的腫瘤壞死因子a基因啟動子(promoter)的堿基序列全長為1323 bp，具 體如下所示sttctgtctgcttgtgtctgtcttgcgttgttcctggtctctttasggag60tggsgcsggggscsgsggcctcsgttggtcC3tgggstccgggcsgsgcs120sggsgcsggc3gctccc3gsgacatggtgg3ttcscggg3gtgsggcsgctt3sctgccg180gaggsgsccc333gg3tg3gctagggsgatcc3tccssgggtggsgsgsgstgsgggttc240tggggsgssgtgsctcc3ctggsgggtggg3gsgtgttt3ggsgtgggsgggtgggggsg300gggsatccttggssgsccggggsgtcstscgg3ttggg3g3S3tcctggssgcsgggctg360tgggsccts3stgtctgsgttgstgtsccgcsgtC33g3t3tggcsgsggctccgtgg33420sactcacttggg3gcsgggscsgcctgsgctcstgatc3g480gsaggcttgtgsggtccgtgS3ttcccsgggctgsgttcsttccctctggggctgccccs540t3CtC3tCCC3tt3CCCCCCccsccsgccctcccs33gccC3tgC3C3Cttcccasctct600cssgctgctctgccttcagcC3CttCCtCC3csgggggctttccctcctc66033t3tC3tgtctcccccctt3tgc3cccsgctttcagssgC3CCCCCCC3tgctssgttc720tcccccatggstgtcccatt3C3csggcstggtctttcts780g3C33tgsttsgctctggsgg3c3g3g33g3S3tgggtttC3gttctcsg840ggtcctatscC3C3C3C3C3C3C3C3C3C3csccctcctg9003ttggccccsgsttgccsc3gastcctggtggggscgscggggsgg3gsttccttgstgc960ctgggtgtccCC33CtttCC333CCC七Ctgcccccgcgst1020ggtgtsgggccsctsccgcttCC七CC3C3tg3gstcstggttttCtCC3Cc33gg33gtt1080ttccgagggttg33tg3g3gcttttccccgccctcttccccsagggctat333ggcggcc1140gtctgcacsg ccsgccagca gaagctccct cagcgsggac agcsagggsc tagccaggag 1200ggsgsscsgs asctccagsa catcttgg33 3tsgctcccs g3333gc33g csgccasccs 12 60ggcsggttct gtccctttcs ctcsctggcc caaggcgcca cstctccctc caga333g3c 1320acc 1323PCR擴增出來的腫瘤壞死因子a基因3'端非翻譯序列(3'-UTR)的堿基序列全長為807 bp，具體如下所示sgggs3tgggtgttcstcc3ttCtC七3CCCsgcccccsctctgacccctttsctctgscc60cctttattgtctaictcctc3gsgcccccsgtctgtstccttct33cttsg33sggggstt120stggctc3gggtcc3sctctgtgctcsgsgCtttC33C33ct3Ctcsg333C3cssg3tg180ctgggscsgtgscctggsctgtgggcctctcstgc3cc3cC3tc33ggsctca33tgggc240tttccgssttcactggagtctcgsstgtcc3ttcctgsgttctgc333gggsgsgtggtc300sggttgcctctgtctc3g33tg3ggctgg3tssg3tctC3ggccttcctsccttcsg3cc360tttccagattcttccctgsggtgc33tgccaisgccttcctcacagagccagcccccctc34203ttt3t3tttgcsctt3tt3ttt3tt3ttt3ttt3ttsttt3ttt3tttgcttatgsstg480tsttt3cttgg33ggccggggtgtcctggaggsccc3gtgtgggssgctgtcttcagsca540gacatgttttctgtgss33Cggsgctgsgctgtccccscctggcctctctsccttgttgc600ctcctcttttgcttaLSitgtt七3ttt3tCt33ccc3attgtCtt33t33Cg660ctg3tttggtgaccaggctgtcgct3C3tcactgaccctcttgccccscgggsgccgtgs720ctgt33tcgcct3cggtc33t333gatcgcttgg3333g3satgtg3ttt780ctgtcttgggstgsagtctgC3tCC3t80權(quán)利要求
1.腫瘤壞死因子α基因的報告質(zhì)粒，其特征在于其核心序列為熒光素酶報告基因、腫瘤壞死因子α基因啟動子及3’端非翻譯序列組成的重組DNA序列，或者通過上述核苷酸序列中的一個或多個核苷酸的缺失、取代或增加而得到的核苷酸序列，上述核心序列的連接順序為腫瘤壞死因子α基因啟動子-熒光素酶報告基因-腫瘤壞死因子α基因3’端非翻譯序列。
2. 如權(quán)利要求l所述的腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括下列步驟1) 從小鼠基因組DNA中采用PCR方法擴增腫瘤壞死因子a基因啟動子和腫瘤壞死因 子a基因3'端非翻譯序列；2) 將腫瘤壞死因子a基因的兩個調(diào)控元件腫瘤壞死因子a基因啟動子和腫瘤壞死因子a 基因3'端非翻譯序列克隆至質(zhì)粒pGL3的熒光素酶報告基因兩側(cè)的克隆位點，即構(gòu)建了腫瘤 壞死因子a基因的報告質(zhì)粒。
3. 如權(quán)利要求2所述的腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于在步驟 1)中，PCR方法擴增腫瘤壞死因子a基因啟動子和腫瘤壞死因子a基因3'端非翻譯序列的 引物對包括腫瘤壞死因子a基因啟動子的PCR擴增引物對和腫瘤壞死因子a基因3'端非翻譯 序列的PCR擴增引物對；腫瘤壞死因子a基因啟動子的PCR擴增引物對為正向引物5' AAAGGTACCATTCTGTCTGCTTGTGTCTGTCTTG 3，(下劃線標注的序列 為限制性內(nèi)切酶^wl的酶切位點)；反向引物5' GGGAAGCTTGGTGTCTTTTCTGGAGGGAGATGTG 3，(下劃線標注的序 列為限制性內(nèi)切酶ffi"d III的酶切位點)；腫瘤壞死因子a基因3'端非翻譯序列(3'-UTR)的PCR擴增引物對為正向引物5，GGGTCTAGAAGGGAATGGGTGTTCATCCATTCTC 3，(下劃線標注的序列 為限制性內(nèi)切酶^wjH I的酶切位點)；反向引物5，AAAGGATCCATGGATGCAGACTTCATCCCAAGAC 3，(下劃線標注的序 列為限制性內(nèi)切酶Z&"I的酶切位點)。
4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的腫瘤壞死因子a基因報告細胞株的建立 方法，其具體步驟為1 )將腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒和帶新霉素抗性的篩選標記質(zhì)粒用Fugene6轉(zhuǎn)染試 劑共轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞株RAW 264.7;2) 共轉(zhuǎn)染后，將小鼠巨噬細胞株RAW 264.7消化后轉(zhuǎn)接到細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液可為 Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，含8% 10%的胎牛血清，gp FBS; 3) 在培養(yǎng)液中加入G418 (新霉素類似物)，終濃度為300 400 pg/mL進行篩選，篩選 期間換培養(yǎng)液的間隔時間為3 4d; 4) 待克隆大小為肉眼可見時，挑取克隆至多孔板中培養(yǎng)，每個克隆轉(zhuǎn)接l個孔，待細胞 長起后轉(zhuǎn)接至另一多孔板，每個克隆轉(zhuǎn)接2個孔，用于陽性克隆的篩選； 5) 培養(yǎng)24h后，在轉(zhuǎn)接克隆的一個孔加入細菌脂多糖至終濃度為100 200ng/mL， 5 6h后用裂解液裂解細胞，測定裂解液的熒光素酶活性細菌脂多糖剌激下的熒光素酶表達量 比細菌脂多糖未刺激的熒光素酶表達量至少有50倍增大，則表明該克隆為陽性克隆，此克隆 即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的腫瘤壞死因子a基因報告細胞株。
5. 如權(quán)利要求4所述的腫瘤壞死因子a基因報告細胞株的可行性驗證方法，其步驟為 1) 細菌脂多糖刺激時間設(shè)定為0、 2、 4、 6、 8、 12h，每個時間點設(shè)定3個平行樣； 2) 將報告細胞株轉(zhuǎn)接至96孔板培養(yǎng)24h，培養(yǎng)液可為Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基， 含8 10%胎牛血清； 3) 加入細菌脂多糖至終濃度為100 200ng/mL，根據(jù)步驟l)的刺激時間進行處理； 4) 在設(shè)定的時間點收集培養(yǎng)上清液及細胞裂解液，測定細胞裂解液的熒光素酶活性，同 時用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法測定培養(yǎng)上清液中的腫瘤壞死因子a的含量，比較兩種方法所得到的結(jié) 果來驗證所構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的腫瘤壞死因子a基因報告細胞 株的可行性。
6. 帶有腫瘤壞死因子a基因的報告質(zhì)粒的細胞株，即腫瘤壞死因子a基因報告細胞株在 檢測化合物對腫瘤壞死因子a基因表達水平的影響中的應(yīng)用。
7. 如權(quán)利要求6所述的在檢測化合物對腫瘤壞死因子a基因表達水平的影響中的應(yīng)用， 其特征在于檢測地塞米松對腫瘤壞死因子a基因表達水平的影響的具體步驟為 1) 地塞米松濃度設(shè)定為O、 10、 25、 50、 100、 500nmol/L，每個濃度設(shè)定3個平行樣； 2) 將腫瘤壞死因子a基因報告細胞株轉(zhuǎn)接至96孔板培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液可為Dulbecco改 良的Eagle培養(yǎng)基，含8 10%胎牛血清； 3) 吸掉培養(yǎng)液，加入含不同地塞米松濃度的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，含8 10% 胎牛血清，同時加入細菌脂多糖至終濃度為100 200ng/mL; 4) 5 6h后，測定細胞裂解液的熒光素酶活性，該活性即代表腫瘤壞死因子a基因的表 達水平，同時用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法測定培養(yǎng)上清液中的腫瘤壞死因子a的含量，比較兩種方法的測定結(jié)果。
8.如權(quán)利要求6所述的在檢測化合物對腫瘤壞死因子a基因表達水平的影響中的應(yīng)用， 其特征在于檢測大黃素對腫瘤壞死因子a基因表達水平的影響的具體步驟為 1) 大黃素濃度設(shè)定為0、 25、 50、 100pmol/L，每個濃度設(shè)定3個平行樣； 2) 將腫瘤壞死因子a基因報告細胞株轉(zhuǎn)接至96孔板培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液可為Dulbecco 改良的Eagle培養(yǎng)基，含8 10%胎牛血清； 3) 吸掉培養(yǎng)液，加入含不同大黃素濃度的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，含8 10%胎 牛血清，同時加入細菌脂多糖至終濃度為100 200ng/mL; 4) 5 6h后，測定細胞裂解液的熒光素酶活性，該活性即代表腫瘤壞死因子a基因的 表達水平，同時用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法測定培養(yǎng)上清液中的腫瘤壞死因子a的含量，比較兩種方 法的測定結(jié)果。
全文摘要
腫瘤壞死因子α基因的報告質(zhì)粒與構(gòu)建方法及其應(yīng)用，涉及一種基因。提供一種基于熒光素酶報告基因的腫瘤壞死因子α基因的報告質(zhì)粒與構(gòu)建方法及其應(yīng)用。從小鼠基因組DNA中采用PCR方法擴增腫瘤壞死因子α基因啟動子及3’端非翻譯序列，再克隆至質(zhì)粒pGL3的熒光素酶報告基因兩側(cè)的克隆位點。腫瘤壞死因子α基因的報告質(zhì)粒的熒光素酶基因由腫瘤壞死因子α基因啟動子及3’端非翻譯序列驅(qū)動，熒光素酶基因的表達水平即反映了腫瘤壞死因子α基因的表達水平。腫瘤壞死因子α基因的報告質(zhì)粒用于檢測化合物對腫瘤壞死因子α基因表達水平的影響。
文檔編號C12N15/28GK101250552SQ200810070798
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月21日
發(fā)明者俞春東, 卓 成, 揚 趙, 強 陳 申請人:廈門大學