專利名稱：：中期因子基因?yàn)榘械男「蓴_rna、載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中期因子基因?yàn)榘械男「蓴_RNA(SiRNA)、含有該小干擾RNA的載體，及其在制備抗腫瘤藥物和防治新生血管異常增生的藥物中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：肝癌是種高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性的實(shí)體惡性腫瘤。盡管目前針對(duì)肝癌細(xì)胞本身進(jìn)行的手術(shù)切除、化療和放療等治療方案日趨完善，但仍難以取得滿意的療效，因此探索新的有效的治療途徑已成為提高肝癌生存率的關(guān)鍵。近年研究表明，與其他實(shí)體惡性腫瘤一樣，腫瘤血管生成(angiogenesis)是肝癌無(wú)限制侵襲生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，如果沒有新生血管生成，原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)不會(huì)超過12mm3。腫瘤組織必須依賴從新生血管中獲取營(yíng)養(yǎng)和排泄代謝產(chǎn)物。因此，以新生血管為靶點(diǎn)，抑制肝癌血管生成，切斷肝癌和轉(zhuǎn)移的"命脈"，對(duì)腫瘤進(jìn)行生物基因治療己成為近幾年新的研究熱點(diǎn)；它與傳統(tǒng)的以腫瘤細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療手段相比，具有廣譜、放大的抗腫瘤作用，且毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)。中期因子(Midkine，MK)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的促血管生成因子，其基因最初是在視黃酸(retinoicacid,RA)誘導(dǎo)分化早期的胚胎瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的，定位于染色體llq11.2，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，故又稱視黃酸反應(yīng)性肝素結(jié)合性生長(zhǎng)/分化因子。它是一種具有促細(xì)胞轉(zhuǎn)化、促有絲分裂作用、促血管生成、抗細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)纖維蛋白溶解等腫瘤形成相關(guān)活性的堿性肝素結(jié)合性蛋白質(zhì)，僅在胚胎中期和成年腎臟表達(dá)。已有的研究表明，MK能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化，對(duì)人腦與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、PC12細(xì)胞、神經(jīng)外胚層前體細(xì)胞和NIH3T3成纖維細(xì)胞具有有絲分裂原活性。在軟瓊脂培養(yǎng)中，MK能促進(jìn)SW13細(xì)胞克隆形成，而將經(jīng)MK轉(zhuǎn)染的SW13細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞接種無(wú)胸腺裸鼠，則能形成富含血管的腫瘤。在肝癌等許多人類惡性腫瘤組織中MKmRNA及蛋白均呈高度表達(dá)，而各種正常組織僅有低水平表達(dá)或無(wú)表達(dá)，并與肝癌的發(fā)生、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，血管生成及預(yù)后密切相關(guān)。因此，MK可能是抗血管生成治療肝癌的理想靶位。近年來(lái)的研究表明，一些小的雙鏈RNA(dsRNA)可以高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，促使mRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾(RNAinterference，RNAi)。其作用機(jī)制主要通過dsRNA被核酸酶切割成2125nt的干擾性小RNA片段即siRNA，由siRNA介導(dǎo)識(shí)別并耙向切割同源性靶mRNA分子而實(shí)現(xiàn)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用siRNA能高效阻斷某個(gè)特定基因的表達(dá)，利用siRNA表達(dá)載體，無(wú)需像反義核酸那樣進(jìn)行廣泛的化學(xué)修飾以提高半衰期，并能在低于反義核酸幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度下，使目標(biāo)基因表達(dá)降到極低水平甚至完全"剔除"，從而產(chǎn)生缺失突變體表型，而且比基因敲除技術(shù)更快更簡(jiǎn)單。該技術(shù)可介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞特異性基因沉默，可能成為關(guān)閉基因的有效手段。在基因功能、基因治療方面已顯示出巨大的應(yīng)用前景，并且有潛在的藥物研究和開發(fā)價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供對(duì)肝癌腫瘤血管生成促進(jìn)因子MK基因具有較好抑制活性的小干擾RNA序列及其化學(xué)修飾衍生物，為研發(fā)特異高效的新型抗肝癌血管生成基因治療的新藥提供基礎(chǔ)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是中期因子基因?yàn)榘械男「蓴_RNA,其特征在于所述小干擾RNA的核苷酸序列為正義鏈5，-GGAUUGCGGCGUGGGUUUC-3，，反義鏈5,-GAAACCCACGCCGCAAUCC-3'。所述小干擾RNA序列，是根據(jù)GenBank中的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇NCBI公布的MidkinemRNA參考序列(GenBank序列號(hào)24475622)，通過對(duì)其進(jìn)行基于多預(yù)測(cè)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，根據(jù)Ambion公司的設(shè)計(jì)工具軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)得到。通過與GenBank聯(lián)機(jī)blast序列比對(duì)，所選擇的靶序列均具有很好的特異性，不會(huì)干擾人類其它正常基因的表達(dá)，其中前述序列篩選得到的為最佳序列，其作用于人MKmRNA的第282-302位，3號(hào)外顯子，該序列能特異性抑制人HepG2肝癌細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及肝癌腫瘤血管生成促進(jìn)因子基因MK的表達(dá)，具有成為用于抑制MK高表達(dá)的肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及與新生血管形成相關(guān)疾病的新型生物工程藥物的潛力。所述小干擾RNA的核苷酸序列3'端可有26個(gè)dT或T修飾。優(yōu)選的，所述小干擾RNA的核苷酸序列3'端有2個(gè)dT或T修飾。優(yōu)選的，所述小干擾RNA的核苷酸序列為正義鏈5，-GGAUUGCGGCGUGGGUUUCtt-3，，反義鏈5'-GAAACCCACGCCGCAAUCCtt-3'。本發(fā)明還涉及所述的中期因子基因?yàn)榘业男「蓴_RNA在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。包括有效成分的本發(fā)明的反義寡核苷酸或其修飾物以及藥物學(xué)可以接受的載體的藥物組合物，本發(fā)明的藥物組合物能用于抑制高表達(dá)MK的肝癌等惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及與新生血管形成相關(guān)的疾病。具體的，是所述中期因子基因?yàn)榘业男「蓴_RNA在制備抑制高表達(dá)MK的惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的應(yīng)用。更為具體的，是所述中期因子基因?yàn)榘业男「蓴_RNA在制備抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的應(yīng)用?；蛘撸撬鲋衅谝蜃踊?yàn)榘械男「蓴_RNA在制備抑制高表達(dá)MK的惡性腫瘤新生血管生成的藥物中的應(yīng)用。更為具體的，是所述中期因子基因?yàn)榘业男「蓴_RNA在制備抑制的肝癌新生血管生成的藥物中的應(yīng)用。所述的中期因子基因?yàn)榘械男「蓴_RNA還可應(yīng)用于制備預(yù)防和治療新生血管異常增生的藥物。本發(fā)明還涉及含有所述中期因子基因?yàn)榘械男「蓴_RNA的載體?；谒鲋衅谝蜃踊?yàn)榘械男「蓴_RNA的特性，所述載體也同樣具有上述用途。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了特異性抑制人HepG2肝癌細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及肝癌腫瘤血管生成促進(jìn)因子基因MK的表達(dá)的siRNA序列，為新藥研發(fā)提供了基礎(chǔ)。圖1為MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、匿6轉(zhuǎn)染HepG2后12，24，48，72h時(shí)間點(diǎn)的MKmRNA表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖2為MK2轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后MK蛋白的表達(dá)水平；1、2、3、4分別代表MK2濃度5nmol/L、50nmol/L、500nmol/L和對(duì)照組。圖3為MK2轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞增殖的影響。圖4為MK2插入pRNAT-U6.1/Neo的載體圖譜。圖5為MK2-shRNA重組表達(dá)質(zhì)粒插入序列的測(cè)序圖譜。圖6為MK2-shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞MKmRNA和蛋白表達(dá)的影響；圖中1、2、3、4依次代表對(duì)照組、MK2-shRNA濃度5nmol/L、50nmol/L、500nmol/L組。圖7為MK2-shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2/HUVEC細(xì)胞增殖的影響。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例l:耙向MK基因的小干擾序列的設(shè)計(jì)和篩選1、靶向MK基因小分子干擾序列的設(shè)計(jì)與合成檢索GenBank中的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇NCBI公布的MidkineraRNA參考序列(GenBank序列號(hào)24475622)，通過對(duì)其進(jìn)行基于多預(yù)測(cè)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，根據(jù)Ambion公司的工具軟件設(shè)計(jì)了6對(duì)SiRNA。通過與GenBank聯(lián)機(jī)blast序列比對(duì)，所選擇的靶序列均具有很好的特異性，不會(huì)干擾人類其它正?；虻谋磉_(dá)。6對(duì)SiRNA序列由上海吉瑪公司合成，用150ul的DEPC水稀釋，濃度為20pmol/ul，于-20。C保存。合成的6對(duì)SiRNA序列見表l。表l:依據(jù)Ambion公司設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)合成的siRNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、耙向MK基因小分子序列的篩選細(xì)胞所用試劑人HepG2肝癌細(xì)胞系由中科院上海細(xì)胞研究所提供，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVEC)購(gòu)自美國(guó)CascadeBiolgics公司。細(xì)胞用含10%小牛血清及100U/ml青霉素，100pg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37'C、5%C02孵箱培養(yǎng)。PCR相關(guān)試劑(Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、OligdT等)；限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII(TAKARA);T4DNA連接酶(invitrogen);瓊脂糖凝膠回收試劑盒；氨節(jié)青霉素(sigma);G418(GIBCO);Trizol〔invitrogen);MMLV(promage)、RPMI1640(GIBCO);胎牛血清(GIBCO);MK抗體(自制)；donkeyanti-rabbit(sc-2317，SANTACRUZ);CellLysis;SupersignalWestFemtokit;PMSF;定影液；顯影液儀器材料低溫高速離心機(jī)(Biofbge28RS)，恒溫水浴箱(ModelDK-8D);C02細(xì)胞培養(yǎng)箱(MCO-17AC);倒置顯微鏡(XDS-1A);光學(xué)顯微鏡；細(xì)胞超凈臺(tái)(ESCD);6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，熒光定量PCR儀FTC2000;酶標(biāo)儀；電泳槽；轉(zhuǎn)膜儀；電泳儀；轉(zhuǎn)膜槽；磁力攪拌器；脫色搖床；WS-III型卡片式暗盒；凝膠圖象分析系統(tǒng)BioSenSC300。實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染方法肝癌細(xì)胞株HepG2或HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640中，生長(zhǎng)呈對(duì)數(shù)期狀態(tài)備用。細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)過夜后，用01igofectamine2000轉(zhuǎn)染劑將SiRNA導(dǎo)入細(xì)胞。在1.5ml的eppendorf管中將7.5ul的oligofectamine加入10.5ul的RPMI1640中，混勻室溫放置5~10分鐘，分別將一定量的6種SiRNA加入到RPMI1640至體積102ul，再混合兩種溶液，室溫放置20分鐘；棄盡細(xì)胞孔的培養(yǎng)基，加入480ul含10X小牛血清的RPMI1640，然后加入制備好的上述轉(zhuǎn)染試劑，空白組僅用轉(zhuǎn)染試劑，一式三份，混勻，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中。RNA提取用Trizol試劑提取總RNA。棄盡培養(yǎng)液后，每孔加入0.5ml的Trizol試劑，反復(fù)吹打，轉(zhuǎn)移至1.5ml的eppendorf管中，加入0.2倍體積的氯仿，振蕩混勻15秒，室溫放置5分鐘后,4'C條件下15000g離心15分鐘，吸上清至另一eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置10分鐘，4。C條件下15000g離心10分鐘，棄上清，沉淀加75%乙醇，7500g離心5分鐘洗滌，次，室溫放置10分鐘左右，加入10ul的0.1。/。DEPC水溶解，260nm測(cè)光密度，用40ug/ml/OD計(jì)算RNA濃度，然后用0.1%DEPC水調(diào)節(jié)濃度至200ng/ul，-20°C保存?zhèn)溆谩T-PCR檢測(cè)MKmRNA方法cDNA合成用Invetrogen公司所提供的SuperscripTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，其過程簡(jiǎn)述如下取10ul上述RNA，加入lul的50uMligodT，7(TC變性10分鐘，立即置冰上2分鐘，離心。然后加入9ul混合試劑4ul5X1Strandbufer、2ul0.1MDTT、MdN(A,T，C,G)TP、lulRNaseinhibitor、0.5ulSSTR2、0.5ul1%DEPC水，在42°C水浴52分鐘，然后7(TC水浴15分鐘終止反應(yīng)，再加入水80ul，置冰箱保存。實(shí)時(shí)定量PCR方法50ul反應(yīng)體系中含有MK基因上游引物(5，-GCGCGCTACAATGCTCAGT-3，)、下游引物(5'-CCCTTCCCTTTCTTGGCTTT-3')各0.3uM、探針(5，-CCAGGAGACCATCCGCGTCCC-3，)0.2uM;2.5ul20XHmnanGAPDH;25ul2xPCRmastermix(PE公司)；10ul上述cDNA;加水補(bǔ)足體積。然后在定量PCR反應(yīng)儀7700(PE公司)進(jìn)行，反應(yīng)條件為5(TC預(yù)變性2分鐘；95"C變性10分鐘；95'C變性30秒；6(TC退火1分鐘，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。然后以內(nèi)參照GAPDH基因相對(duì)定量MK基因表達(dá)。WesternBlot檢測(cè)MK蛋白表達(dá)提取孔中培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞或HUVEC細(xì)胞，用預(yù)溫PBS洗滌一次，加入200^1/孔CellLysis，冰上放置10min，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，4。C低溫離心U000轉(zhuǎn)/minxlOmin，吸取上清到新鮮Eppendorf管中。用蛋白定量試劑盒定量，取120昭蛋白作電泳并轉(zhuǎn)膜。兔抗MK抗體作為一抗，工作濃度為I:IO，Anti-rabbit為二抗，濃度為1:4000;按以下步驟操作①灌膠10%聚丙烯酰胺凝膠。②樣品處理加入6x加樣緩沖液，10(TC煮沸5min。③電泳80V電泳45min，150V電泳85min。轉(zhuǎn)膜:轉(zhuǎn)膜前10min將硝酸纖維膜和濾紙浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，恒定電壓100V轉(zhuǎn)膜60min。⑤春紅染色2min，去離子水漂洗，將Marker條帶標(biāo)記好。⑥用脫脂奶粉阻斷，室溫阻斷23h(或4。C過夜)。⑦加一抗，室溫結(jié)合2h(或4。C過夜)。⑧TBST洗滌3xl0min。⑨加二抗，室溫結(jié)合lh。⑩TBST洗滌3xl0min。(11)加底物顯色，結(jié)合lmin，將膜速封，放入X光片盒。(12)曝光，在暗室中放入X光膠片lmin，使膠片與膜接觸曝光。(13)把膠片放入顯影液1min，清水漂洗，放入定影液中，透明為止。(14)吹干，分析。MTT法分析細(xì)胞生長(zhǎng)抑制轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的細(xì)胞的OD值(A4卯).根據(jù)公式抑制率-[(A對(duì)照一A用藥)/A對(duì)照]xl00。/。計(jì)算出細(xì)胞抑制率。再根據(jù)抑制率計(jì)算半抑制濃度IC50。實(shí)驗(yàn)基本操作方法HepG2肝癌細(xì)胞或HUVEC細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種至培養(yǎng)板孔中，轉(zhuǎn)染siRNA或shRNA至細(xì)胞中，接下來(lái)分二方面來(lái)操作1、用MTT法來(lái)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染48h后的siRNA或shRNA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制情況；2、提取RNA，用RT-PCR來(lái)評(píng)價(jià)MKmRNA的量，用WesternBlot來(lái)評(píng)價(jià)MK蛋白表達(dá)水平，根據(jù)圖片和結(jié)果數(shù)據(jù)，Bio-rad圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)，再與對(duì)照組比較分析的出結(jié)論。細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、RNA提取、RT-PCR、WesternBlot、MTT在上述已列出，試驗(yàn)中培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染劑及試劑的用量及操作的要求按實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮托Ч麃?lái)定。6條siRNA抑制HepG2肝癌細(xì)胞MK表達(dá)的最佳siRNA及時(shí)間效應(yīng)評(píng)價(jià)HepG2肝癌細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于6孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染6種相同濃度siRNA后，進(jìn)行培養(yǎng)，分別在轉(zhuǎn)染后12h、24h、48h、72h四個(gè)時(shí)間段收集細(xì)胞，抽提mRNA。然后經(jīng)RT-PCR檢測(cè)MKmRNA的量及對(duì)MK的抑制率，與空白載體組對(duì)照，Bio-rad圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)，從而可以評(píng)價(jià)哪種siRNA對(duì)MK的抑制作用最強(qiáng)，將其篩選出。MK-2siRNA作抑制HepG2肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)情況及劑量效應(yīng)評(píng)價(jià)HepG2肝癌細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于96孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染不同濃度MK-2siRNA后，進(jìn)行培養(yǎng)，48h后，每孔加入10ul5mg/mL的MTT液，37°C、5。/。C02細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150ulDMSO，37。C振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀在測(cè)量波長(zhǎng)570nm、參考波長(zhǎng)為630nm條件下測(cè)量各孔的吸光度OD值。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的細(xì)胞的OD值(A490).根據(jù)公式抑制率呵(A對(duì)照一A用藥)/A對(duì)照]xlO()n/。計(jì)算出細(xì)胞抑制率。MK-2siRNA抑制MKmRNA和蛋白表達(dá)水平情況及劑量效應(yīng)評(píng)價(jià)HepG2肝癌細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于6孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染不同濃度MK-2siRNA后，進(jìn)行培養(yǎng)，24h后，收集細(xì)胞，分別抽提mRNA和蛋白，RT-PCR檢測(cè)MKmRNA，WesternBlot檢測(cè)MK蛋白表達(dá)。RT-PCR、WesternBlot在前面論述己經(jīng)列出，同上。結(jié)果1.耙向MKmRNA的shRNA的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)MKmRNA的計(jì)算機(jī)模擬二級(jí)結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了6條siRNA。根據(jù)Ambion公司的設(shè)計(jì)工具軟件設(shè)計(jì)，上海吉瑪公司合成，序列見表l。各用150ul的DEPC水稀釋，濃度為20pmol/ul，于-2(TC保存。2.6條SiRNA轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞MK表達(dá)的影響RT-PCR法檢測(cè)MK1、MK2、MK3、Mk4、MK5、MK6轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞中MK的表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)如下，與對(duì)照組相比，MK1、MK2、MK3、Mk4、MK5、MK6分別不同程度的抑制了HepG2細(xì)胞MK基因的表達(dá)，其中MK2在同一時(shí)間點(diǎn)抑制效率均高于MK1、MK3、Mk4、MK5、MK6的抑制水平，且在轉(zhuǎn)染后24h檢測(cè)點(diǎn)的抑制水平達(dá)到9615/。(圖1)。進(jìn)一步轉(zhuǎn)染不同濃度的MK2siRNA入HepG2細(xì)胞，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24hHepG2細(xì)胞MKmRNA和MK蛋白的表達(dá)水平。故篩出MK2-siRNA進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果顯示，MK2-siRNA轉(zhuǎn)染24h對(duì)MKmRNA的抑制率為5nmol/L的抑制率為42.5%,50nmol/L的抑制率為96%,500nmol/L的抑制率為99%;故釆用50nmol/L的轉(zhuǎn)染工作濃度進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。3.MTT法檢測(cè)MK2-SiRNA轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，不同濃度的MK2-SiRNA均有效抑制HepG2細(xì)胞的增殖，且具有劑量依賴效應(yīng)。這與不同濃度的MK2-SiRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)MK蛋白的抑制水平基本保持平衡，兩者具有很好的相關(guān)性。結(jié)果統(tǒng)計(jì)見圖3。實(shí)施例2:MK2-siRNA重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其活性驗(yàn)證1.構(gòu)建重組質(zhì)粒載體MK2-shRNA:取上述抑制效率最高的MK2-SiRNA構(gòu)建shRNA，選擇的載體為美國(guó)genscript公司的pRNAT-U6.1/Neo，U6啟動(dòng)子下游作表達(dá)的兩個(gè)酶切位點(diǎn)分別為BamHI禾BHindIII，構(gòu)建MK2-shRNA重組表達(dá)質(zhì)粒。先化學(xué)合成R7-l:5'-gatcccGGATTGCGGCGTGGGTTTCttgatatccgGAAACCCACGCCGCAATCCttttttccaaa-3，禾tlR7-2:5，-agcttttggaaaaaaGGATTGCGGCGTGGGTTTCcggatatcaaGAAACCCACGCCGCAATCCgg-3，，兩條單鏈復(fù)性成雙鏈，將目的片段與載體PRNAT-U6.1/neo分別用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，并用凝膠回收試劑盒回收。酶切后，載體和片段用T4DNA連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5(x巾，涂于氨芐陽(yáng)性板中，挑取陽(yáng)性克隆并增菌，抽提質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。用測(cè)序法測(cè)序基因序列準(zhǔn)確性，測(cè)序序列Forward:5'-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3'。2.MK2-shRNA轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞，檢測(cè)MK抑制情況HepG2肝癌細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于6孔培養(yǎng)板中，將shRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)立空質(zhì)粒組和脂質(zhì)體組，進(jìn)行培養(yǎng)，用RT-PCR檢測(cè)MKmRNA表達(dá)。轉(zhuǎn)染MK2-shRNA(分三組，濃度分別為5nmol/L、50nmol/L、500nmol/L)后，繼續(xù)培養(yǎng)24h收集細(xì)胞，抽提mRNA和蛋白，RT-PCR和WesternBlot具體操作同上。3.MTT法檢測(cè)MK2-shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2/HUVEC細(xì)胞增殖的影響HepG2/HUVEC細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種96孔板，培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)染MK2-shRNA(5nmol/L、50nmol/L、500nmol/L)，轉(zhuǎn)染后48h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平，方法同上。結(jié)果1.構(gòu)建MK2的重組表達(dá)質(zhì)粒取上述抑制效率最高的MK-2構(gòu)建shRNA，選擇的載體為genscript的pRNAT-U6.1/Neo，U6啟動(dòng)子下游作表達(dá)的兩個(gè)酶切位點(diǎn)分別為Bamffl和HindIII。先化學(xué)合成R7-l:5'-gatcccGGATTGCGGCGTGGGTTTCttgatatccgGAAACCCACGCCGCAATCCttttttccaaa-3，禾tlR7-2:5，-agcttttggaaaaaaGGATTGCGGCGTGGGTTTCcggatatcaaGAAACCCACGCCG-CAATCCgg-3'，兩條單鏈復(fù)性成雙鏈，將目的片段與載體PRNAT-U6.1/neo分別用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，并用凝膠回收試劑盒回收。酶切后，載體和片段用T4DNA連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a中，涂于氨芐陽(yáng)性板中，挑取陽(yáng)性克隆并增菌，抽提質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。載體質(zhì)粒圖譜見圖4。用測(cè)序法測(cè)序基因序列準(zhǔn)確性，測(cè)序序列Forward:5，-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3，。序列分析軟件分析結(jié)果顯示，所插入序列與目的序列MK2-SiRNA同源性100n/n，測(cè)序結(jié)果見圖5。2.RT-PCR和western-blot法檢測(cè)MK2-shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞MKmRNA和蛋白表達(dá)的影響MK2-shRNA轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收集細(xì)胞提RNA和總蛋白，供RT-PCR和western-blot實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)結(jié)果表明，MK2-shRNA轉(zhuǎn)染有效抑制HepG2細(xì)胞MKmRNA和蛋白的表達(dá)，并具有劑量依賴效應(yīng)，結(jié)果見圖6。3.MTT法檢測(cè)MK2-shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2/HUVEC細(xì)胞增殖的影響MK2-shRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，不同濃度的MK2-shRNA均有效抑制HepG2/HUVEC細(xì)胞的增殖，且具有劑量依賴效應(yīng)。這與不同濃度的MK2-shRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)MKmRNA和蛋白表達(dá)的抑制水平基本一致，兩者具有很好的相關(guān)性。結(jié)果統(tǒng)計(jì)見圖7。序列表.ST25.UtSEQUENCELISTING<110〉湖州中心醫(yī)院<120>中期因子基因?yàn)榘械男∏_RNA、載體及其應(yīng)用<130><160〉18<170〉Patentlnversion3.2<210〉1<211>19<212〉RNA<213〉Unknown〈220〉<223>人工序列<400〉1cugg卿卿gaguuuggei<210>2<211>19〈212>腿<213>Unknown〈220〉〈223〉人工序列〈400〉2uccaaacuccuucuuccag19〈210〉3<211〉19<212>廳<213〉Unknown<220>〈223〉人工序列<400〉3ggauugcggcguggguuuc<210〉4<211>19〈212〉RNA<213〉Unknown<220><223〉人工序列<400>4gaaacccacgccgcaaucc19<210>5〈211>19<212〉RNA<213>Unknown〈220〉<223>人工序列<400〉5guacaaguuugagaacugg19<210>6<211〉19<212>RNA序列表.ST25.txt<213>Unknown<220〉<223>人工序列<400>6ccaguucuc3aacuuguac19<210>7<211>19<212〉RNA〈213〉Unknown<220><223>人工序列<400>7g83ggcgcgcuacaaugcu19<210>8<211>19<212>腿<213>Unknown<220><223>人工序列〈400>8agc肌uguagcgcgccuuc19<210>9<211〉19<212>艦<213>Unknown<220><223〉人工序列<400>9gacca肌gcaaaggccaaa19〈210>10<211>19<212〉RNA<213〉Unknown〈220〉<223>人工序列<400>10uuuggccuuugcuuugguc19<210〉11<211〉19〈212>RNA<213>Unknown<220><223〉人工序列<400〉11sggcca33gcC33gaaagg19<210〉12<211>19<212>RNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400〉12ccuuucuuggcuuuggccu序列表.ST25.txt19<210><211〉〈212〉〈213〉1319DNAUnknown<220〉<223〉人工序列<400>13gcgcgctacaatgctcagt19<210><211〉<212〉<213>1420■Unknown<220〉<223〉人工序列<400〉14cccttccctttcttggcttt20<210>15<211〉21<212>醒〈213>Unknown<220>〈223〉人工序列<400>15ccaggagaccatccgcgtccc21〈210〉16<211>65<212〉DNA<213〉Unknown<220><223>人工序列<400>16gatcccggattgcggcgtgggtttcttgatatccggaaacccacgccgcaatcctttttt60cca犯65<210〉17〈211>65<212>DNA<213>Unknown<220><223〉人工序列<400>17agcttttggaaaaaaggattgcggcgtgggtttccggatatcaag站acccacgccgcaa60tccgg65<210>18〈211〉23〈212〉隱<213>Unknown序列表.ST25.txt<220><223>人工序列<400>18tacg8tacaaggctgtt3gagsg2權(quán)利要求1、中期因子基因?yàn)榘械男「蓴_RNA，其特征在于所述小干擾RNA的核苷酸序列為正義鏈5’-GGAUUGCGGCGUGGGUUUC-3’，反義鏈5’-GAAACCCACGCCGCAAUCC-3’。2、如權(quán)利要求1所述的中期因子基因?yàn)榘械男「蓴_RNA，其特征在于所述小干擾RNA的核苷酸序列3'端有26個(gè)dT修飾。3、如權(quán)利要求2所述中期因子基因?yàn)榘械男「蓴_RNA，其特征在于所述小干擾RNA的核苷酸序列3'端有2個(gè)dT修飾。4、權(quán)利要求13之一所述的中期因子基因?yàn)榘械男「蓴_RNA在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。5、如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述中期因子基因?yàn)榘业男「蓴_RNA在制備抑制高表達(dá)MK的惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的應(yīng)用。6、如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述中期因子基因?yàn)榘械男∈當(dāng)_RNA在制備抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的應(yīng)用。7、如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述中期因子基因?yàn)榘业男「蓴_RNA在制備抑制高表達(dá)MK的惡性腫瘤新生血管生成的藥物中的應(yīng)用。8、如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述中期因子基因?yàn)榘业男「蓴_RNA在制備抑制的肝癌新生血管生成的藥物中的應(yīng)用。9、權(quán)利要求13之一所述的中期因子基因?yàn)榘业男「蓴_RNA在制備預(yù)防和治療新生血管異常增生的藥物中的應(yīng)用。10、含有如權(quán)利要求1或2所述中期因子基因?yàn)榘械男「蓴_RNA的載體。全文摘要本發(fā)明提供了中期因子基因?yàn)榘械男「蓴_RNA，所述小干擾RNA的核苷酸序列為正義鏈5’-GGAUUGCGGCGUGGGUUUC-3’，反義鏈5’-GAAACCCACGCCGCAAUCC-3’。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了特異性抑制人HepG2肝癌細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及肝癌腫瘤血管生成促進(jìn)因子基因MK的表達(dá)的siRNA序列，為新藥研發(fā)提供了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12N15/11GK101407810SQ20081005936公開日2009年4月15日申請(qǐng)日期2008年1月25日優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日發(fā)明者行姚,戴利成,楊水新,翔王申請(qǐng)人:湖州市中心醫(yī)院