專利名稱：：一種檢測(cè)女性骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)女性骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，通過(guò)同時(shí)檢測(cè)與女性骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)的白細(xì)胞介素6基因(IL-6)、骨保護(hù)素基因TNFRSF11B(OPG)、腫瘤壞死因子-a基因(TNF-a)、維生素D受體基因(VDR)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來(lái)評(píng)估女性骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)。
背景技術(shù)：
：骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,0P)是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨質(zhì)脆性增加和易于骨折的代謝性疾病。OP可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類。繼發(fā)性者的原發(fā)病因明確，常由內(nèi)分泌代謝疾病(如性腺功能減退癥、甲亢、甲旁亢、Cushing綜合癥、l型糖尿病等)或全身性疾病(如器官移植術(shù)后、腸吸收不良綜合癥、神經(jīng)性厭食、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、慢性腎衰竭、骨髓纖維化、白血病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、營(yíng)養(yǎng)不良癥等)引起。原發(fā)性者又可分為兩種亞型，即I型和II型。I型即絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausalosteoporosis,PM0P)發(fā)生于絕經(jīng)后婦女，其中多數(shù)患者的骨轉(zhuǎn)換(turnover)率增高，亦稱高轉(zhuǎn)換型0P;II型(老年性)OP多見于60歲以上的老人，女性的發(fā)病率為男性的2倍以上。己知，編碼白細(xì)胞介素6(IL-6)、骨保護(hù)素TNFRSF11B(0PG)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、維生素D受體(VDR)四種基因與女性骨骼健康有密切關(guān)系?；蚓幋a的白細(xì)胞介素6(IL-6)是一種多功能細(xì)胞因子，參與多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能調(diào)節(jié)，在免疫和炎癥反應(yīng)中具有重要作用，是機(jī)體重要的免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子。其功能的多樣性與許多細(xì)胞表面有IL-6受體的表達(dá)，IL-6受體和信號(hào)傳導(dǎo)部分GP130將多種生物信號(hào)傳給不同的組織和細(xì)胞有關(guān)。IL-6可由T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，其基因表達(dá)的變化與某些疾病的生理和病理變化密切相關(guān)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)IL-6參與骨代謝，IL-6的主要作用是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞產(chǎn)生和破骨細(xì)胞活化，IL-6和IL-1可以直接加強(qiáng)破骨細(xì)胞的活性、抑制其凋亡、并延長(zhǎng)破骨細(xì)胞的壽命；另外，IL-6還通過(guò)細(xì)胞核因子-kB(NF-kB)受體活化因子(RANK)的配基(RANKL)依賴機(jī)制加強(qiáng)破骨細(xì)胞的能力，這主要是經(jīng)由骨保護(hù)素(0PG)/RANKL/RANK系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。兩方面協(xié)同作用促使破骨活動(dòng)加強(qiáng)，骨丟失增加。有人認(rèn)為IL-6對(duì)成骨細(xì)胞有一定的增殖分化作用。IL-6的表達(dá)狀況受基因調(diào)控，特別是IL-6的基因調(diào)控區(qū)與IL-6的表達(dá)具有更直接的關(guān)系；其血清水平的變化與一些疾病的病理生理過(guò)程密切相關(guān)。隨著人們對(duì)分子病理學(xué)和疾病相關(guān)基因研究的不斷深入，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)IL-6可能參與了腦血管疾病的病理生理過(guò)程。目前國(guó)外研究表明IL-6的基因調(diào)控區(qū)一174G/C的多態(tài)性(rsl800795)可改變IL-6的轉(zhuǎn)錄，G等位基因?qū)е卵迮c組織中IL-6髙水平表達(dá)，與骨質(zhì)疏松、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等疾病密切相關(guān)。腫瘤壞死因子受體超家族，成員lib(TNFRSF11B),即骨保護(hù)素(osteoprotegerinOPG)是腫瘤壞死因子受體(tumornecroticfactorrec印torTNFR)超家族成員之一。0PG是一種分泌型糖蛋白，以單體形式在胞內(nèi)合成，以雙體形式分泌到胞外。OPG缺少跨膜和胞漿區(qū)域，但包含7個(gè)主要結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)OPG不僅涉及骨重塑、免疫調(diào)節(jié)、血管的發(fā)生等過(guò)程，而且是影響破骨細(xì)胞分化、生成及活性的最終途徑，在骨質(zhì)疏松的發(fā)生機(jī)制中扮演著重要的角色。OPG基因存在多個(gè)核苷酸多態(tài)性，國(guó)內(nèi)外研究已證明，rs2073618位點(diǎn)是位于OPG基因第一外顯子上的C/G變異。OPG基因外顯子1編碼的是OPG信號(hào)肽部分，是OPG從細(xì)胞中分泌所必需的。這一多態(tài)性使該外顯子的第三個(gè)氨基酸由賴氨酸Lys(AAG)變成了天冬酰氨Asn(MC)，賴氨酸是一種必需氣基酸而天冬氨酰是一種極性氨基酸。這種在基因信號(hào)肽區(qū)域的點(diǎn)多態(tài)性可能會(huì)影響OPG的分泌動(dòng)力學(xué)或OPGraRNA的表達(dá)其中GG基因型將增加?jì)D女骨質(zhì)疏松的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。TNF-a(T咖ornecrosisfactor-a)為編碼單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的腫瘤壞死因子的基因，由該基因編碼的蛋白是一種多功能的細(xì)胞因子，它能顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生間接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，增強(qiáng)特異性免疫保護(hù)功能。它不僅促進(jìn)破骨前體細(xì)胞增殖、分化，而且對(duì)成骨細(xì)胞也有多種效應(yīng)。rsl800629是位于第六號(hào)染色體上6p21.3區(qū)TNF-a基因啟動(dòng)區(qū)一個(gè)G/A多態(tài)，被認(rèn)為可能與該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)。該位點(diǎn)的多態(tài)性與骨疾病、胰島素耐受性、過(guò)氧化脂質(zhì)，血脂，血糖等因素相關(guān)。VDR(vitaminD(1,25-dihyd而yvitaminD3)rec印tor)編碼維生素D3的核激素受體，該奪白也是膽石酸的第一受體。VDR屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，為類固醇激素/甲狀腺類激素受體超家族的成員。該蛋白對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)主要通過(guò)一系列代謝反應(yīng)通路，包括免疫反應(yīng)和腫瘤激活通路。該基因的多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致維生素D缺乏引起的佝僂病。目前報(bào)導(dǎo)的VDR基因多態(tài)性主要與rsl544410和rs731236單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)有關(guān)，可用限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析，因此其多態(tài)性位點(diǎn)相應(yīng)的BsmI和TaqI限制酶命名，分別為第9內(nèi)含子的BsmI(G/A)多態(tài)性位點(diǎn)，及第10外顯子的TaqI位點(diǎn)，TaqI位點(diǎn)為T/C多態(tài)性，導(dǎo)致編碼氨基酸密碼子352ATT/ATC多態(tài)性。一般用b和t表示存在這2種內(nèi)切酶的多態(tài)性位點(diǎn)，用B和T表示缺乏這2種內(nèi)切酶的多態(tài)性位點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容基于編碼白細(xì)胞介素6基因(IL-6)、骨保護(hù)素TNFRSF11B基因(OPG)、腫瘤壞死因于-a基因(TNF-a)、維生素D受體基因(VDR)上的5個(gè)SNPs位點(diǎn)多態(tài)性可用來(lái)評(píng)估骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測(cè)女性骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)編碼白細(xì)胞介素6基因上rsl800795號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)；檢測(cè)骨保護(hù)素TNFRSFllB基因上rs2073618號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì):檢測(cè)腫瘤壞死因子-a基因上rsl800629號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)；檢測(cè)維生素D受體基因上rsl544410號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)；檢測(cè)維生素D受體基因上rs731236號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)；熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq嗨、dNTP混合液、MgCL溶液、反應(yīng)緩沖液、去離子水等)。本試劑盒中所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)編碼白細(xì)胞介素6基因上rsl800795號(hào)SNP位點(diǎn)、骨保護(hù)素TNFRSF11B基因上rs2073618號(hào)SNP位點(diǎn)、腫瘤壞死因子-a基因上rs1800629號(hào)SNP位點(diǎn)、維生素D受體基因上rsl544410號(hào)和rs731236號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包含這5個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。設(shè)計(jì)這類引物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQIDN0:1和2、3和4、5和6、7和8、9和10所示序列的引物對(duì)。特異性引物對(duì)可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這五對(duì)引物。本試劑盒中所述的特異性熒光探針對(duì)是指針對(duì)編碼白細(xì)胞介素6基因上rsl800795號(hào)SNP位點(diǎn)、骨保護(hù)素TNFRSFllB基因上rs2073618號(hào)SNP位點(diǎn)、腫瘤壞死因子-a基因上rsl800629號(hào)SNP位點(diǎn)、維生素D受體基因上rsl544410號(hào)和rs731236號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這五個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的Taqman探針對(duì)。設(shè)計(jì)這類探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQIDNO:11和12、13和14、15和16、17和18、19和20所示序列的T叫man探針對(duì)。特異性熒光探針對(duì)可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光Taqman探針對(duì)不限于這五對(duì)探針，所有可用于熒光定量PCR法檢測(cè)本發(fā)明中所述用來(lái)評(píng)估骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的五個(gè)SNPs位點(diǎn)的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括5jd10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液，0.5nl25mMdNTP混合液，3jd25mMMgCh溶液，0.125^1(5units/jxl)T叫DNA聚合酶，20nM特異性引物對(duì)每條引物各0.225nl，10jiM特異性熒光探針對(duì)每條探針各0.25fil，去離子水26.625nl。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。卜列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例l.檢測(cè)試劑盒的使用步驟l:DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測(cè)女性骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其中，含有下列引物對(duì)和熒光探針對(duì)有義引物l:5'-ACTTTTCCCCCTAGTTG-3'(SEQIDNO:1)反義引物1:5，-TGTGCMTGTGACGTC-3'(SEQIDNO:2)有義引物2:5，-TTACCACGAGCGCG-3'(SEQIDNO:3)反義引物2:5'-GGTTTCCGGGGACC-3'(SEQIDNO:4)有義引物3:5'-GAGGCAATAGGTTTTGAGGG-3'(SEQIDNO:5)反義引物3:5，-GGACCCTGGAGGCTGM-3'(SEQIDNO:6)有義引物4:5'-GAGCAGAGCCTGAGTATT-3'(SEQIDNO:7)反義引物4:5'-TTCCTGGGGCCACAGA-3'(SEQIDNO:8)有義引物5:5'-TGGACAGGCGGTCC_3'(SEQIDNO:9)反義引物5:5'-CTGGGGTGCAGGAC-3'(SEQIDNO:10)帶VIC熒光基團(tuán)探針l:5'-CTTGCcATGCTAAA-3'(SEQIDNO:11)帶FAM熒光基團(tuán)探針l:5'-CTTGCgATGCTAAA-3'(SEQIDNO:12)帶VIC熒光基團(tuán)探針2:5,-AGCAAcTTGTTCATT-3'(SEQIDNO:13)帶FAM熒光基團(tuán)探針2:5'-AGCAAgTTGTTCATT_3'(SEQIDNO:14)帶VIC熒光基團(tuán)探針3:5'-CATGaGGACGG-3'(SEQIDNO:15)帶FAM熒光基團(tuán)探針3:5'-CATGgGGACG-3'(SEQIDNO:16)帶VIC熒光基團(tuán)探針4:5，-GGMTGcGCAGGC-3'(SEQIDNO:17)帶FAM熒光基團(tuán)探針4:5'-GGGAATGtGCAGGC-3'(SEQIDNO:18)帶VIC熒光基團(tuán)探針5:5'-TGGCCTCaATCAG-3'(SEQIDNO:19)帶FAM熒光基團(tuán)探針5:5'-TGGCCTCgATCAG-3'(SEQIDNO:20)有義引物l,反義引物l、帶VIC熒光基團(tuán)探針1、帶FAM熒光基團(tuán)探針l特異地針對(duì)檢測(cè)編碼白細(xì)胞介素6基因上rsl800795號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；有義引物2，反義引物2、帶VIC熒光基團(tuán)探針2、帶FAM熒光基團(tuán)探針2特異地針對(duì)檢測(cè)骨保護(hù)素TNFRSF11B基因上rs2073618號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；有義引物3，反義引物3、帶VIC熒光基團(tuán)探針3、帶FAM熒光基團(tuán)探針3特異地針對(duì)檢測(cè)腫瘤壞死因子-a基因上rsl800629號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性有義引物4，反義引物4、帶VIC熒光基團(tuán)探針4、帶FAM熒光基團(tuán)探針4特異地針對(duì)檢測(cè)維生素D受體基因上rsl544410號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；有義引物5,反義引物5、帶VIC熒光基團(tuán)探針5、帶FAM熒光基團(tuán)探針5特異地針對(duì)檢測(cè)維生素D受體基因上rs731236號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；5個(gè)SNPs位點(diǎn)分別進(jìn)行5次獨(dú)立的熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)的體系為總體積10^1，包含濃度為20ng/nl的DNA模板2fd、lpl10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0.lnl25mMdNTP混合液、0.6nl25mMMga溶液、0.025nl(5units/jU)TaqDNA聚合酶、20-的有義引物和反義引物各0.225^1、10一的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針各0.25jil,去離子水5.325jil。在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為5(TC、2分鐘，95'C、10分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95'C、30秒，6(TC、l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟3:SNP基因型分析熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針VIC和FAM熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因型。實(shí)施例2.對(duì)人們進(jìn)行女性骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)的服務(wù)步驟l:DNA提取由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)被檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提。步驟2:基因分型檢測(cè)使用本發(fā)明提供的試劑盒,對(duì)被檢測(cè)者基因組DNA的編碼白細(xì)胞介素6基因上rsl800795號(hào)SNP位點(diǎn)、骨保護(hù)素TNFRSFllB基因上rs2073618號(hào)SNP位點(diǎn)、腫瘤壞死因子-a基因上rsl800629號(hào)SNP位點(diǎn)、維生素D受體基因上rsl544410號(hào)和rs731236號(hào)位點(diǎn)分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，確定這五個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型。步驟3:女性骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的分析通過(guò)對(duì)被檢測(cè)者SNPs基因型的分析，出具女性骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說(shuō)明了被檢測(cè)者骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的高低，并由醫(yī)師向被檢者詳細(xì)說(shuō)明和解讀女性骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)分析報(bào)告單。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><223>引物<400>4GGTTTCCGGGGACC14〈210〉<211>〈212〉〈213>520DNA人工序列<220><223>引物■>5GAGGCAATAGGTTTTGAGGG20〈210><211〉〈212〉<213>617薩人工序列<220><223>引物<400〉6GGACCCTGGAGGCTGAA17<210><211〉<212><213>18醒人工序列<220〉<223>引物〈400〉7GAGCAGAGCCTGAGTATT18<210>8〈211〉16〈212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<柳〉8TTCCTGGGGCCACAGA16<210〉<211〉<212〉<213〉914DNA人工序列<220><223〉引物<400>9TGGACAGGCGGTCC14<210〉<211〉<212〉<213>1014卵A人工序列<220〉<223〉引物<柳〉10CTGGGGTGCAGGAC14<210><211><212〉<213>1114DNA人工序列<220〉<223>探針<400〉11CTTGCCATGCTAAA14<210><211〉<212〉〈213〉1214DNA人工序列<220><223〉探針<400〉12CTTGCgATGCTAAA14〈210〉13〈211>15<212>DNA<213>人工序列〈220〉<223>探針<400>13AGCAAcTTGTTCATT115〈210><211>〈212〉<213〉1415DNA人工序列<220><223>探針<400〉14AGCAAgTTGTTCATT15<210><211><212><213>1511DNA人工序列<220><223>探針<柳〉15CATGaGGACGG11<210><211><212〉<213>1610DNA人工序列〈220〉〈223>探針<柳〉16CATGgGGACG10<210>17<211〉13<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223>探針<400〉17GGAATGcGCAGGC13〈210〉<211>〈212〉<213>1814DNA人工序列<220><223>探針<400>18GGGAATGtGCAGGC14<210>〈211><212><213〉1913DNA人工序列<220><223>探針〈400>19TGGCCTCaATCAG13<210><211><212><213>2013DNA人工序列<220>〈223〉探針<400>20TGGCCTCgATCAG1權(quán)利要求1.一種檢測(cè)女性骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其特征在于包括同時(shí)檢測(cè)編碼白細(xì)胞介素6基因上rs1800795號(hào)SNP位點(diǎn)、骨保護(hù)素TNFRSF11B基因上rs2073618號(hào)SNP位點(diǎn)、腫瘤壞死因子-α基因上rs1800629號(hào)SNP位點(diǎn)、維生素D受體基因上rs1544410號(hào)和rs731236號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)編碼白細(xì)胞介素6基因上rsl800795號(hào)SNP位點(diǎn)、骨保護(hù)素TNFRSF11B基因上rs2073618號(hào)SNP位點(diǎn)、腫瘤壞死因子-a基因上rsl800629號(hào)SNP位點(diǎn)、維生素D受體基因上rsl544410號(hào)和rs731236號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包含這5個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針對(duì)是指針對(duì)編碼白細(xì)胞介素6基因上rsl800795號(hào)SNP位點(diǎn)、骨保護(hù)素TNFRSF11B基因上rs2073618號(hào)SNP位點(diǎn)、腫瘤壞死因子-a基因上rsl800629號(hào)SNP位點(diǎn)、維生素D受體基因上rsl544410號(hào)和rs731236號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這五個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的Taqman探針對(duì)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對(duì)選自具有SEQIDNO:l和2、3和4、5和6、7和8、9和IO所示序列的引物對(duì)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQIDNO:11和12、13和14、15和16、17和18、19和20所示序列的Taqman探針對(duì)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括5^1IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0.5jxl25mMdNTP混合液、3pl25mMMgCh溶液、0.125^1(5units/nl)TaqDNA聚合酶、20pM特異性引物對(duì)每條引物各0.225jxl、10jiM特異性熒光探針對(duì)每條探針各0.25nl、去離子水26.625^1。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測(cè)女性骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。該試劑盒包括同時(shí)檢測(cè)編碼白細(xì)胞介素6基因上rs1800795號(hào)SNP位點(diǎn)、骨保護(hù)素TNFRSF11B基因上rs2073618號(hào)SNP位點(diǎn)、腫瘤壞死因子-α基因上rs1800629號(hào)SNP位點(diǎn)、維生素D受體基因上rs1544410號(hào)和rs731236號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、用于熒光定量PCR檢測(cè)的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)同時(shí)檢測(cè)與骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來(lái)評(píng)估女性骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)。文檔編號(hào)C12N15/11GK101240322SQ20071003717公開日2008年8月13日申請(qǐng)日期2007年2月6日優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日發(fā)明者馮哲民,鄒祖燁申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司