專利名稱：一種檢測老年性癡呆易感遺傳風險的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學和醫(yī)學領域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測老年性癡呆易感遺傳風險的試劑盒，通過同時檢測APOE基因上的兩個單核苷酸多態(tài)性位點基因型來評估個體老年性癡呆易感遺傳風險。
技術背景老年癡呆是指老年期出現(xiàn)的已獲得的智能在本質上出現(xiàn)持續(xù)的損害，也就是由器質性腦損害導致的基 本上不可逆的智能缺失和社會適應能力降低。主要表現(xiàn)為在智能方面出現(xiàn)抽象思維能力喪失、推理判斷與計劃不足、注意力缺失；在人格方面出 現(xiàn)興趣與始動性喪失、遲鈍或難以抑制、社會行為不端、不拘小節(jié)；在記憶方面出現(xiàn)遺忘，地形、視覺與 空間定向力差；在言語認知方面出現(xiàn)說話不流利，綜合能力缺失。歐美國家的統(tǒng)計表明，60歲以上老年人6% 12%發(fā)生癡呆，85歲以上的老人則有20% 40%發(fā)生 癡呆，其中半數(shù)以上為老年性癡呆。據(jù)統(tǒng)計，全球有超過2000萬的人患有老年性癡呆。調査結果表明， 我國北方地區(qū)65歲以上居民癡呆患病率為6.9%，其中老年性癡呆為4.2%。我國南方地區(qū)65歲以上居 民癡呆患病率為3.9%，其中老年性癡呆為2.8%。估計我國現(xiàn)有癡呆的老年患者超過400萬，其中老年 性癡呆約占1 / 3。 2000年我國60歲以上的人口達1. 3億，占人口總數(shù)的10%;到2020年將達到2. 3億， 占人口總數(shù)的20%以上。老年人口的不斷增加使老年性癡呆患者的人數(shù)大幅度上升。據(jù)預測到2030年， 全球患老年癡呆的人數(shù)將達到6000萬，僅我國就將有1200萬。己知APOE基因與老年性癡呆有密切關系。APOE是一種含299個氨基酸殘基的分泌性糖蛋白，它存在于多種脂蛋白的顆粒中，是參與膽固醇代 謝的重要血清脂蛋白。該基因定位于19號染色體上，分別由3種等位基岡e2、 e3、 e4編碼，并組合 產生6種基因型，即e2/2、 e3/3、 e 4/4、 e 2/3、 e 2/4、 e 3/4 ，相對應的6種遺傳表型為E2/2、 E3/3、 E4/ 4、 E2/3、 E2/4、 E3/ 4。正常人群中APOE基因型以E 3/3最多，APOE基因的多態(tài)性是由APOE基因 的112和158密碼子的單個堿基變異所致。APOE不能通過血腦屏障，但在腦內可以由星形細胞合成。目前認為E4是AD的危險因子，有人用實 驗對照組相關研究發(fā)現(xiàn)AP0Ee4等位基因在AD患者中過量表達，而大量其他的實驗研究也相繼證實了這 點。大約80 9&遲發(fā)型家族性AD和64先散在性AD患者至少攜帶一個e4等位基因，而對照組僅為31 %。 遺傳連鎖和相關研究也顯示APOE ￡ 4可使患AD的危險性增加，且呈劑量依賴關系。AP0Ee4純合子發(fā)病 比雜合子早。相反AD患者中APOE e 2減少，說明APOE e 2在SAD中起保護作用。在一個著名的美國晚發(fā)阿爾森海默氏癥的家族中(該家族的祖先是一對18世紀從法國移民到美國的 夫妻)，Brogaonkar13發(fā)現(xiàn)了在6個感染個體上E4亞型的劑量效應。4個E4/E4個體在60多歲即開始發(fā) 病，而2個E4/E3個體發(fā)病年齡分別是77歲和78歲。YadongHong的綜述中提到帶有兩個E4拷貝的個體 在85歲前AD發(fā)病的概率為50-90%,有一個E4拷貝的個體AD發(fā)病的概率為45%，相應的一般人群在85 歲前AD發(fā)病的概率為20X。Talbot等人15發(fā)現(xiàn)E2亞型對阿爾森海默氏癥具有保護作用，而且其作用不是單純的因為可以代替 E4亞型。Corder等人16在美國人群中研究也發(fā)現(xiàn)了 E4的劑量效應的同時發(fā)現(xiàn)了 E2的保護作用。并且發(fā) 現(xiàn)雖然65%的AD病人是由E4的存在導致的，且在E2/E3的個體中AD發(fā)生率非常少，但同時還發(fā)現(xiàn)了有 23%的病人是由于E2的缺失而造成。Bickeboller等人23在法國417例病人和1030例正常對照人群中的研究中確認了 AP0E4與AD發(fā)病的 相關性，發(fā)現(xiàn)AP0E4亞型對AP0E3的發(fā)病危險度為2. 7,而AP0E2則具有保護作用，0R為0. 5。此外E4的 劑量效應也得到了證明。與E3純合子相比，E4純合子的0R為11.2,而E4雜合子的0R為2.2。0h Yong Bang等人針對AD病人的apoE基因型，進行Meta分析。在東亞人群中抽取AD病人1470例， 對照組2247例，其結果為病例組，含有E4等位基因26.8n/。，對照組含有E4等位基因9. 2% 。結果顯示 老年癡呆和E4等位基因顯著相關。發(fā)明內容根據(jù)國家生物基因檢測技術應用評估認證中心頒布的《中國人口健康服務基因位點認證規(guī)程》，對與 老年型癡呆易感相關基因位點的支持文獻、分子生物學機理研究、中國人群適用性等進行綜合分析評估后， APOE基因上rs429358號SNP位點和rs7412號SNP位點通過國家生物基因檢測技術應用評估認證中心認定， 可用于檢測評估老年性癡呆易感遺傳風險?；贏POE基因上rs429358號SNP位點和rs7412號SNP位點多態(tài)性可用來評估個體老年性癡呆易感 遺傳風險的基礎上，本發(fā)明提供一種檢測個體老年性癡呆易感遺傳風險的試劑盒。該試劑盒包括檢測APOE基因上rs429358號與rs7412號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對及DNA測序引物； PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應緩沖液、去離子水等)； PCR產物純化組件(包括SAP酶、Exo I酶、去離子水等)；DNA測序反應組件(包括BigDye mix, EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、去離子 水等)。本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對APOE基因上rs429358號SNP位點和rs7412號SNP位點， 能特異性擴增出包含這2個SNPs位點的DNA片段的引物對。設計這類引物對是本領域技術人員能夠輕易 完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 1和2所示序列的引物對。特異性引物對可用常規(guī)的合 成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這對引物。本試劑盒中所述的DNA測序引物是指針對APOE基因上rs429358號SNP位點和rs7412號SNP位點而 設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出這2個SNPs位點基因型的DNA測序引物。設計這類引物是本領 域技術人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQIDNO: 3所示序列的DNA測序引物。DNA測 序引物可用常規(guī)的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發(fā)明的DNA測序引物不限于這條引 物，所有可用于DNA測序技術檢測本發(fā)明中所述用來評估個體老年性癡呆易感遺傳風險的2個SNPs位點 的DNA測序引物均在本發(fā)明范圍內。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括1. PCR反應套裝10X PCR反應緩沖液2.5nl,25raM dNTP混合液0.2^1,25raM MgCl2溶液1. 5pl，5units/nl Taq DNA聚合酶0. 125jxl，2(^M特異性引物對每條引物各0.25nl，去離子水19. 175nl。2. PCR產物純化套裝 lunits/nl SAP酶O. 75nl， 10units/nl Exol酶0. 375pl， 去離子水3.875nl。3. 測序反應套裝25% BigDye mix 1^1, 3.2- DNA測序引物lnl， 125mM EDTA溶液 100%乙醇溶液15^1, 70%乙酵溶液3CHil， HIDI溶液8^1， 去離子水2fil。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。步驟2: PCR擴增反應使用檢測試劑盒中的PCR反應套裝，其中，含有下列引物對 有義引物l: 5， - TAAGCTTGCACGGCTGTCCMGGA -3' (SEQ ID NO: 1) 反義引物l: 5' - ACAGMTTCGCCCCGGCCTGGTACAC -3' (SEQ ID NO: 2) 反應的體系為總體積25jxl，包含濃度為12.5ng/nl的DNA模板lpl、10X PCR反應緩沖液2.5nl，25mM dNTP混合液0.2nl， 25mMMgC12溶液1.5nl， 5units/nl Taq DNA聚合酶0.125nl， 20nM特異性引物對每 條引物各0.25^1，去離子水19.175nl。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為94°C 、 12分鐘，進行30個循環(huán)的94。C 、 30秒，60 °C、 30秒，72'C、 30秒，然后進行72'C、 IO分鐘。步驟3: PCR產物純化使用檢測試劑盒中的PCR產物純化套裝，反應體系為總體積25nl，包含PCR產物20nl， lunits/nl SAP 酶0.75nl, 10units/nl Exol酶0.375^1,去離子水3.875^1。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37'C、 15分鐘，72°C、 20分鐘。步驟4: DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應套裝，其中，含有下列DNA測序引物DNA測序引物5' - TAAGCTTGCACGGCTGTCCAAGG -3' (SEQ ID NO: 3) 反應的體系為總體積5jil，包含PCR純化產物lnl， 25%BigDyemixlnl, 3.2nMDNA測序引物 去離子水2^1。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98°C 、2分鐘,進行25個循環(huán)的96'C 、30秒，55'C 、 30秒，60'C、 4分鐘。反應結束后加入125mM EDTA溶液lpl和100%乙醇溶液15^1,于室溫下沉淀15分鐘；在4'C以3650 轉/分的轉速離心30分鐘，輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液3(^1,以3650轉/分的轉速離心15分鐘， 輕輕倒去上清液；室溫放置20分鐘后加入HIDI溶液8nl，放入測序儀中。步驟5:基因型分析熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點的基因型。實施例2.對人們進行個體老年性癡呆易感遺傳風險檢測的服務 步驟l: DNA提取由醫(yī)院檢驗科醫(yī)師指導被檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮 細胞的DNA抽提。步驟2:基因分型檢測使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢測者基因組DNA的APOE基因上rs429358號SNP位點和rs7412號 SNP位點進行DNA測序檢測，確定這2個SNPs位點的基因型。步驟3:個體老年性癡呆易感遺傳風險的分析通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具個體老年性癡呆易感遺傳風險的分析報告單。報告中詳細 說明了被檢測者老年性癡呆易感遺傳風險的高低，并由醫(yī)師向被檢者詳細說明和解讀個體老年性癡呆易感 遺傳風險分析報告單。序列表〈110〉上海主健生物工程有限公司<120> —種檢測老年性癡呆易感遺傳風險的試劑盒<160〉 3<210> 1 <211> 24 <212>腿 <213>人工序列<220><223>引物 〈婦1TAAGCTTGCA CGGCTGTCCA AGGA 2 4<210> 2 <211〉 26 <212> DNA 〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物 <400> 2ACAGAATTCG CCCCGGCCTG GTACAC 2 6<210> 3 <211〉 23 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220><223〉引物 <400> 3TAAGCTTGCA CGGCTGTCCA AGG 2權利要求
1. 一種檢測個體老年性癡呆易感遺傳風險的試劑盒，其特征在于包括檢測APOE基因上rs429358號SNP位點和rs7412號SNP位點的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應緩沖液、SAP酶、Exo I酶、BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去離子水等。
2. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對APOE基因上rs429358 號SNP位點和rs7412號SNP位點，能特異性擴增出包含這2個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在T:所述的DNA測序引物是指針對APOE基因上rs429358 號SNP位點和rs7412號SNP位點而設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出這2個SNPs位點基因型的DNA 測序引物。
4. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對選自具有SEQ ID NO: l和2所 示序列的引物對。
5. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的DNA測序引物選自具有SEQ ID NO: 3所示序 列的引物。
6. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括1) PCR反應套裝:10X PCR反應緩沖液25mM dNTP混合液0. 2ri， 25mM MgC12溶液 5units/W Taq DNA聚合酶0. 20爛特異性引物對每條引物各0.25ri，去離子水19. 175W。2) PCR產物純化套裝:lunits/W SAP酶0.75(4, lOunitsM Exol酶0.375t4,去離子水3.87514。3) 測序反應套裝25% BigDye mix 1W， 3. 2湖DNA測序引物1W, 125mM EDTA溶液100%乙 醇溶液15W， 70%乙醉溶液HIDI溶液8W,去離子水2Hl。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測個體老年性癡呆易感遺傳風險的試劑盒。該試劑盒包括檢測APOE基因上rs429358號SNP位點和rs7412號SNP位點的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測與老年性癡呆易感遺傳密切相關的APOE基因上的單核苷酸多態(tài)性位點基因型來評估個體老年性癡呆易感遺傳風險。
文檔編號C12Q1/68GK101240318SQ200710037168
公開日2008年8月13日 申請日期2007年2月6日 優(yōu)先權日2007年2月6日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司