專利名稱：茶尺蠖反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因rtp及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于昆蟲(chóng)基因工程領(lǐng)域。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一種茶尺蠖反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(retrotransposon， rtp)基因分離和分析；還涉及利用該基因進(jìn)行調(diào)節(jié)茶尺蠖對(duì)病毒抵御能 力。
背景技術(shù)：
茶尺蠖是主要茶園蟲(chóng)害之一，因此也是重要的防治對(duì)象。隨著茶園管理的無(wú)公害化和 有機(jī)化，化學(xué)合成農(nóng)藥的使用受到限制或禁止，而生物農(nóng)藥則成為大力推廣的制劑。核型 多角體病毒(NPV)是常用防治茶尺蠖的生物農(nóng)藥。研究顯示，NPV對(duì)幼齡茶尺蠖有較好 防效，但對(duì)3齡以上幼蟲(chóng)作用較小。高齡茶尺蠖對(duì)NPV產(chǎn)生抗性的原因的探索，將有助 于該生物農(nóng)藥的合理、高效使用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種茶尺蠖反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因rtp以及該基因編碼的 蛋白質(zhì)，該基因物的活性與不同齡期茶尺蠖害蟲(chóng)的抗病毒性能密切相關(guān)，可用于明確不同 齡期茶尺蠖對(duì)NPV的耐受性原因。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種茶尺蠖反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因rtp，其具有SEQID No: l所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時(shí)提供了上述基因rtp編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQIDNO: 2所示的氨基酸 序列。本發(fā)明還同時(shí)提供了上述基因rtp的用途，利用該基因物調(diào)節(jié)鱗翅目害蟲(chóng)的抗病毒性能。作為本發(fā)明基因rtp用途的改進(jìn)病毒為核型多角體病毒。 作為本發(fā)明基因rtp用途的進(jìn)一步改進(jìn)鱗翅目害蟲(chóng)為茶尺蠖。作為本發(fā)明基因rtp用途的進(jìn)一步改進(jìn)將根據(jù)SEQIDNo: l所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)的 rtpsiRNA注射入茶尺蠖體內(nèi)，使內(nèi)源rtp表達(dá)下調(diào)，達(dá)到茶尺蠖抗病毒能力下降。本發(fā)明通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)手段分離和分析與鱗翅目害蟲(chóng)抗病毒性能密切相關(guān)的基 因，為鱗翅目害蟲(chóng)NPV等生物農(nóng)藥的增強(qiáng)劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明是采用cDNA-AFLP 和RT-PCR技術(shù)分離茶尺蠖等鱗翅目害蟲(chóng)與抗病毒性能有密切關(guān)系的基因rtp;證明rtp基因 表達(dá)與鱗翅目害蟲(chóng)不同齡期的抗病毒能力密切相關(guān)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下一、茶樹(shù)鱗翅目害蟲(chóng)rtp基因分離和分析分別取高、低不同齡期茶尺蠖幼蟲(chóng)若干頭。以TRIZOL (Invitrogen公司)試劑提取總 RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)分離mRNA。 分別取l-5嗎mRNA進(jìn)行cDNA合成，雙鏈cDNA合成采用TakaRa MMLV RTase cDNA Synthesis Kit (寶生物工程[大連]有限公司)進(jìn)行。雙鏈cDNA經(jīng)異丙醇沉淀純化后，以TakaRa BspHI/BssHII (寶生物工程[大連]有限公司)組合酶切消化。消化后的片段與事先設(shè)計(jì)的2 個(gè)接頭SEQIDNo: 3和SEQIDNo: 4，以T4DNA連接酶(上海生工生物工程有限公司) 連接。以連接完成的cDNA片段為模板，以預(yù)擴(kuò)增引物SEQIDNo: 5和SEQIDNo: 6進(jìn)行 PCR預(yù)擴(kuò)增。將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物適當(dāng)稀釋后，以選擇性擴(kuò)增引物組合SEQ ID No: 7和SEQ ID No: 8，進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分析，以核酸銀染試 劑盒(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行顯帶。從凝膠上割取在低幼蟲(chóng)齡無(wú)表達(dá)或弱表達(dá)、而在高齡期幼蟲(chóng)有強(qiáng)表達(dá)的對(duì)應(yīng)條帶。割 取目標(biāo)帶，以純水浸提過(guò)夜后，取適量浸提液作為模板，以SEQIDNo: 7和SEQIDNo: 8 引物組合進(jìn)行PCR，產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。電泳結(jié)束后割取目標(biāo)條帶，以UNIQ-IO 柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行片段回收，并插入pUCm-T載 體(上海生工生物工程有限公司)，陽(yáng)性克隆委托Irwitrogen公司進(jìn)行序列分析，確定了其 中一個(gè)157bp的顯著差異序列與茶尺蠖齡期發(fā)育密切相關(guān)的片斷，經(jīng)與美國(guó)生物信息數(shù)據(jù) 庫(kù)http:〃www. ncbi.nlm.nih.gov比對(duì)，證實(shí)該序列與家蠶等反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子具有較高同源性， 具體序列如SEQIDNo:9。以此片斷以及檢索到的家蠶rtp為基礎(chǔ)，重新設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，即 SEQIDNo: 10和SEQIDNo: 11、SEQIDNo: 12和SEQIDNo: 13。以4齡茶尺蠖幼蟲(chóng)cDNA 為模板，以上述2對(duì)引物進(jìn)行PCR。兩個(gè)PCR產(chǎn)物分別插入pUCm-T載體中，委托Invitrogen 進(jìn)行序列分析，得到了長(zhǎng)度分別1214bp和1046bp的2段序列。經(jīng)S叫Man軟件(DNAStar公 司)對(duì)上述片斷進(jìn)行拼接，剔除中間長(zhǎng)157bp的重疊區(qū)序列，獲得了長(zhǎng)度為2104bp的可讀序 列，具體如SEQIDNo:l。經(jīng)與美國(guó)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)http:/Zwww. ncbi.nlm.nih.gov比對(duì)證實(shí)，該序列與家蠶等昆蟲(chóng)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子具有較高同源性。因此將該序列定名茶尺蠖rtp基因；經(jīng)過(guò)EditSeq軟件推演得到了包含700氨基酸的蛋白序列，具體如SEQ ID No:2。 二、 rtp基因表達(dá)與茶尺蠖抗病毒性能的關(guān)系將NPV病毒制劑用水稀釋成常規(guī)使用濃度，即2.0X10S-2.0Xl()SpiB/毫升，以稀釋后 的病毒液涂抹茶葉正面和反面，以帶病毒的茶葉飼喂不同齡期茶尺蠖，分析其對(duì)病毒的耐 受性，同時(shí)研究rtp的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，當(dāng)采用常規(guī)濃度處理l齡茶尺蠖幼蟲(chóng)時(shí)，幼蟲(chóng) 死亡率在95%以上，而相同的濃度處理2齡幼蟲(chóng)時(shí)，其病死比例約為60-80%，處理3齡幼蟲(chóng) 時(shí)病死比例只占處理總數(shù)20-40%，而4齡幼蟲(chóng)經(jīng)病毒處理后病死率在20%以下?；虮磉_(dá) 分析顯示，在l齡時(shí)茶尺蠖幼蟲(chóng)的rtp基因幾乎不表達(dá)，隨著發(fā)育齡期增加，該基因表達(dá)逐 漸加強(qiáng)。說(shuō)明該基因的表達(dá)活性與茶尺蠖的抗病毒有很強(qiáng)的相關(guān)性，即rtp表達(dá)強(qiáng)則茶尺蠖 抗病毒能力強(qiáng)，反之亦然。進(jìn)一步以siRNA技術(shù)研究了rtp基因表達(dá)對(duì)茶尺蠖抗病毒能力的影響。結(jié)果顯示，以人 工體外合成的rtp-siRNA注射高齡茶尺蠖后，再以常規(guī)濃度的NPV詞喂，高齡幼蟲(chóng)的抗病毒 能力大大降低，其死亡率達(dá)到65%以上，而未注射rtp-siRNA的對(duì)照，病毒飼喂后的死亡率 仍在40%以下?？梢?jiàn)rtp的正常表達(dá)與茶尺蠖等鱗翅目害蟲(chóng)的抗病毒能力有密切關(guān)系。上述研究證實(shí)，rtp表達(dá)與茶尺蠖的抗病毒能力呈正相關(guān)，rtp表達(dá)強(qiáng)，幼蟲(chóng)抗病毒能力 強(qiáng)。而且rtp作用機(jī)制為rtp通過(guò)自身表達(dá)，實(shí)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座行為，活化被插入下游的抗 病毒基因活性，從而使高齡幼蟲(chóng)具有強(qiáng)的抗病毒能力。 一旦rtp表達(dá)受到抑制，下游相關(guān)基 因無(wú)法活化，幼蟲(chóng)抗病毒能力下降。


下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1是由SEQ ID No: 7和SEQ ID No: 8引物組合所獲得的低齡和高齡茶尺蠖幼蟲(chóng) cDNA-AFLP差異條帶的顯示圖；注其中M為分子量標(biāo)記，A為l齡茶尺蠖幼蟲(chóng)，B為4齡茶尺蠖幼蟲(chóng)；黑色箭頭所 示為目標(biāo)條帶(分子量約為150bp)。圖2是以SEQ ID No: 14和SEQ ID No: 15引物組合PCR所得的不同齡期茶尺蠖中rtp 的表達(dá)情況顯示圖；注圖中RNA為18sRNA，作為基因表達(dá)的背景參照。M為分子量標(biāo)記，1為1齡幼 蟲(chóng)，2為2齡幼蟲(chóng)，3為3齡幼蟲(chóng)，4為4齡幼蟲(chóng)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l:取1齡后期幼蟲(chóng)10頭和4齡期茶尺蠖幼蟲(chóng)2頭，以TRIZOL (Invitrogen公司)試劑提取總 RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)分離mRNA。 分別取l ng mRNA進(jìn)行cDNA合成，雙鏈cDNA合成采用TakaRa MMLV RTase cDNA Synthesis Kit (寶生物工程[大連]有限公司)進(jìn)行。雙鏈cDNA經(jīng)異丙醇沉淀純化后，以TakaRa Bspffl和BssHII (寶生物工程[大連]有限公司)組合酶切消化，具體操作參照BspHI和BssHII 限制性內(nèi)切酶使用說(shuō)明。消化產(chǎn)物中加入等體積的異丙醇冰浴l小時(shí)后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心 25分鐘后取沉淀。將沉淀與事先設(shè)計(jì)的2個(gè)接頭SEQIDNo: 3和SEQIDNo: 4混合，以T4 DNA連接酶(上海生工生物工程有限公司)連接。以連接完成的cDNA片段為模板，以預(yù) 擴(kuò)增引物SEQIDNo: 5和SEQIDNo: 6進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增。具體PCR預(yù)擴(kuò)增條件為94。C變 性30秒，56。C退火60秒，72。C延伸60秒，共30個(gè)循環(huán)。將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍后，以選擇 性擴(kuò)增引物組合SEQIDNo: 7和SEQIDNo: 8，進(jìn)行PCR選擇性擴(kuò)增，具體選擇性擴(kuò)增條 件為94。C變性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸60秒，l個(gè)循環(huán)；94。C變性30秒，65。C退火 30秒，并以每循環(huán)下降0.7。C， 72。C延伸60秒，12個(gè)循環(huán)；94。C變性30秒，56。C退火30秒， 72。C延伸60秒，23個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物以6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分析，以核酸銀染 試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行顯帶，具體如圖l所示。從凝膠上割取在l齡幼蟲(chóng)無(wú)表達(dá)、而在4齡期有強(qiáng)表達(dá)的對(duì)應(yīng)條帶。目標(biāo)帶以純水浸提 過(guò)夜后，取適量浸提液作為模板，以引物組合SEQIDNo: 7和SEQIDNo: 8進(jìn)行PCR，擴(kuò) 增條件為94。C變性4分鐘，l個(gè)循環(huán);94。C變性30秒，55。C退火30秒，72。C延伸60秒，35 個(gè)循環(huán)；72。C延伸5分鐘。產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后割取目標(biāo)條帶， 以UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行片段回收，并插入 pUCm-T載體(上海生工生物工程有限公司)，陽(yáng)性克隆委托Invitrogen公司進(jìn)行序列分析， 確定了其中一個(gè)157bp的顯著差異序列與茶尺蠖齡期發(fā)育密切相關(guān)的片斷，具體序列見(jiàn)SEQ ID No: 9，經(jīng)與美國(guó)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)1^9://^^.11(^.111111.1^.2(^比對(duì)，證實(shí)該序列與家蠶等 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子具有70%左右同源性。以此片斷以及檢索到的家蠶rtp (GenBank Accessing No. AB126055.1)為基礎(chǔ)，重新設(shè)計(jì)2對(duì)引物，艮卩SEQIDNo: 10和SEQIDNo: 11、 SEQIDNo: 12和SEQIDNo: 13。以4齡茶尺蠖幼蟲(chóng)cDNA為模板，以上述2對(duì)引物進(jìn)行PCR。兩個(gè)PCR 產(chǎn)物分別插入pUCm-T載體中，委托Invitrogen進(jìn)行序列分析，得到了長(zhǎng)度分別1214 bp和1046bp的2段序列。經(jīng)SeqMan軟件(DNAStar公司)對(duì)上述片斷進(jìn)行拼接，剔除中間長(zhǎng)157bp 的重疊區(qū)序列，獲得了長(zhǎng)度為2104bp的可讀序列，具體如SEQIDNo:l。經(jīng)與美國(guó)生物信息 數(shù)據(jù)庫(kù)http:〃www. ncbi.nlm.nih.gov比對(duì)證實(shí)，該序列與家蠶等昆蟲(chóng)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子具有 60%左右的同源性。因此將該序列定名茶尺蠖rtp基因；經(jīng)過(guò)EditSeq軟件(DNAStar公司) 推演得到了包含700氨基酸的蛋白序列,具體如SEQIDNo:2，該序列與家蠶等反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 具有60%以上的同源性。 實(shí)施例2:將NPV病毒制劑用水稀釋成10.0X 105 PIB/毫升，以稀釋后的病毒液涂抹茶葉正面和反 面，室內(nèi)晾干后飼喂l齡、2齡、3齡和4齡期茶尺蠖，于飼喂2小時(shí)后，在各處理中取樣2-10 頭幼蟲(chóng)。上述幼蟲(chóng)樣品以TRIZOL (Invitrogen公司)提取總RNA，并以重新設(shè)計(jì)的引物組 合SEQIDNo: 14和SEQIDNo: 15 (預(yù)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度為341bp)進(jìn)行PCR，研究不同齡期rtp表 達(dá)以及幼蟲(chóng)對(duì)NPV病毒抗性的相關(guān)性。結(jié)果顯示，NPV病毒制劑處理1齡茶尺蠖幼蟲(chóng)后， 幼蟲(chóng)死亡率約為93%，而2齡幼蟲(chóng)的病死比例約為75%， 3齡幼蟲(chóng)的病死比例只占處理總數(shù) 37%，而4齡幼蟲(chóng)經(jīng)病毒處理后病死率18%?；虮磉_(dá)分析顯示，在l齡時(shí)茶尺蠖幼蟲(chóng)的rtp 基因幾乎不表達(dá)，條帶強(qiáng)度為0.10以下，2齡幼蟲(chóng)rtp強(qiáng)度為0.35， 3齡幼蟲(chóng)rtp強(qiáng)度為0.85， 4 齡幼蟲(chóng)rtp強(qiáng)度為0.98，見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)隨著發(fā)育齡期增加，該基因表達(dá)逐漸加強(qiáng)。說(shuō)明該基因 的表達(dá)活性是組成型的，且與不同齡期茶尺蠖的抗病毒性能有很強(qiáng)的相關(guān)性，即rtp表達(dá)強(qiáng) 則茶尺蠖抗病毒能力強(qiáng)，反之亦然。以茶尺蠖rtp SEQ ID No: 1為材料，采用TaKaRa siRNA Cocktail Kit (si-RNAase III TM)(寶生物工程[大連]有限公司)制備可與鱗翅目害蟲(chóng)內(nèi)源rtp發(fā)生雙鏈干涉作用的 rtp-siRNAs。將60頭3齡茶尺蠖分成2組， 一組用于rtp-siRNAs注射處理，另一組為對(duì)照。將 制備的rtp-siRNAs用水溶解后，從3齡幼蟲(chóng)氣門處注射rtp-siRNAs，注射劑量為每頭300ng的 rtp-siRNAs(注射體積為2PL);同時(shí)以注射等體積純水為對(duì)照。注射處理24小時(shí)后，再以IO.O X105PIB/毫升NPV涂抹處理后的茶葉飼喂，飼喂3天開(kāi)始計(jì)算死亡數(shù)量，直至化蛹為止。 結(jié)果顯示，以rtp-siRNA抑制茶尺蠖內(nèi)源rtp基因活性后，3齡幼蟲(chóng)在詞喂NPV后，對(duì)NPV的 敏感性顯著增加，第7天時(shí)幼蟲(chóng)死亡率已達(dá)87%,而沒(méi)有注射rtp-siRNA的對(duì)照飼喂NPV后 死亡率僅為40%?？梢?jiàn)注射rtp-siRNA干涉高齡幼蟲(chóng)內(nèi)源rtp表達(dá)活性后，高齡幼蟲(chóng)對(duì)NPV的 抗性顯著降低。反過(guò)來(lái)證明rtp的正常表達(dá)對(duì)茶尺蠖抗病毒能力提高有顯著作用。 —本發(fā)明試驗(yàn)證明茶尺蠖內(nèi)源rtp基因的正常表達(dá)與茶尺蠖對(duì)NPV的抗性密切相關(guān)。因此，rtp的表達(dá)受發(fā)育進(jìn)程控制，該基因的表達(dá)引起的轉(zhuǎn)座對(duì)茶尺蠖抗病毒有利。rtp基因及 其產(chǎn)物是茶尺蠖等害蟲(chóng)病毒農(nóng)藥的新型增效劑的研發(fā)中的潛在作用位點(diǎn)。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明 不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直 接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表SEQ ID No: 1acttctcgcgtgccccacaatcagatgacgtcactattgaggccacatcgcaggaggtta60cggctgcgattacatcttttttgagtggctcagceggaggcctagatggcctgacacctc120aac at c t aaaagatcttctatcttttagctctggtg郷tcgcagagtccctcttgagag180atctaacctctttagtt犯tctcatgttatctggtcgagtcagtagtgatattgtcgaag240ttttgtacggcgctaatctgtgcgcacttttggtgggatc3ggCC33tCg300ctgtcggcactacatatcgtcgccttgctgcc卿gtgggttgtaggaaaaaggttgctc360ttttgagctcccttttccaaCC^t3C33Ctcggctttggttcgcggggtggatgtg鄉(xiāng)420ctgccgttxattctgtccggaccttccttccgg卿ggtgctgtt犯agg480tggacgtcaaa犯cgctttt幼ttcggttgatcgaggagccctgttggccca^gtgsiEigg540ataaaattectgatctgtacaattttctttggcaatgttatggcgagcccacaaaattga600ct tatcaaaacaatcatatgctatcctccgttggctgtcaa^鄉(xiāng)gtg3tcccttcggcc660ctgcgaccttcgccctggccattcaccctatcattcaacgtctccagtcca^a<cta<aacg720tttggtacttggacgeicggsacgttggggcacgcg卿agt犯aatactgc鄉(xiāng)ggttgc780ccgttgtgggtttgagtcttcacgggg咖gttgtgaatttttcggggtcgctgttcatt840gggtctttgggtatgttctcgctgaatctgggcttcattattctccagagtttattgggg900gaattgttgatgggtcggtttegactgetgttgctgagtttcgatcatttttagggttta960ttatttattceggacttttttttcgtaatgcgtgtggagttttaaagectttatctgagc1020ttttgaaa犯agg犯at犯ctggtactggggagcttgtcatgagaacgettttaeggege1080ttaagaactttttggcgttggatctggtattggctcattttaattataacgcgtccctca1140ttttaactgttgstgtgtcgcggtcaggtctttcagegattttttttcagat3gaatc犯1200ctgggUtgcgcgcccggtgttttttgcgtcgcgaatcctaagtgttgctgat犯tggtt1260attctcegtttcaggtggtagccaacgctattattttttgtgttcggggttactaccatt1320tcgactstattgtaggattgttccatttatettaegtacagatcttgaactgcttttctt1380ggtttttggtttttatcgaggtattttctcCC￡lCC3tCC3atgc犯caactgecttagat1440ttggacatcattgccgctctcaacctcgacgctttcgttgt3C3C犯CCtC1500actgtgg卿caattgegtggtgCEl卿gtcagaggcttcatgectataetgetctgage1560RFLP檢測(cè)將PCR產(chǎn)物3nL, 10xBuffer lpL，限制性內(nèi)切酶///"P1I為0.2(iL (2U)，加雙蒸水補(bǔ)至 10nL，將樣品混勻后離心，37'C培養(yǎng)箱放置12h，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在 紫外燈下拍照。用引物擴(kuò)增豬基因組DNA得到了 635bp特異性擴(kuò)增片段(詳見(jiàn)圖4)，序列分析結(jié)果表明在144bp處 存在C144-T144突變，并導(dǎo)致州力PII多態(tài)性。該基囚突變位點(diǎn)由兩個(gè)等位基囚控制，其中T是沒(méi)有形成 酶切位點(diǎn)的等位基因，C是形成酶切位點(diǎn)的等位基因。這兩個(gè)等位基因可組成三種基因型其中AA型為未 發(fā)生酶切的純合型(電泳檢測(cè)時(shí)只有635bp —條DNA帶)，BB型為發(fā)生酶切的純合型(電泳檢測(cè)時(shí)出現(xiàn) 492bp和143bp兩條DNA帶)，AB為雜合型(電泳檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)635bp、 492bp和143bp三條DNA帶)。 (三)PCR—^ff^PlI—RFLP多態(tài)性在各豬品種中的分布情況的檢測(cè)的應(yīng)用利用PCR—iZ/"PlI—RFLP檢測(cè)了六個(gè)豬種其中屬丁中國(guó)地方血緣的豬種分別是二花臉豬，通城豬， 大花白豬，屬于外來(lái)的例如歐美血緣的豬種分別是長(zhǎng)白豬，大白豬和杜洛克豬。該突變位點(diǎn)在不同豬種中 的基因型和基因頻率如表l所示，結(jié)果顯示在地方豬種中等位基因A占優(yōu)勢(shì).在國(guó)外豬種中等位基因G 占優(yōu)勢(shì)。_表1:幾個(gè)豬品種中g(shù)CL/tf基因144位點(diǎn)多態(tài)性的基因型和基因頻率_基因型 等位基因頻率品種 個(gè)體數(shù),T 1 "奴 TT(AA) TC(AB) CC(BB) T (A) C(B)二花臉豬 22 0 1 21 0.023 0.977通城豬 35 0 3 32 0.043 0.957大花白豬 41 4 16 21 0.293 0.707長(zhǎng)白豬 17 2 11 4 0.441 0.559大白豬 31 5 19 7 0.468 0.532杜洛克豬 32 0 11 21 0.172 0.828x 2檢驗(yàn)六個(gè)豬種間基因型頻率差異性發(fā)現(xiàn)，幾個(gè)豬種間基因頻率差異不顯著 實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)豬群來(lái)自廣東華農(nóng)溫氏畜牧股份有限公司水臺(tái)原種豬場(chǎng)的K:白豬(為國(guó)外豬種血緣)，父母代為 17頭長(zhǎng)白豬公豬和36頭長(zhǎng)白豬母豬，子一代長(zhǎng)白豬共302頭仔豬，父母代及子代全部進(jìn)行了基因型檢測(cè)， 子代在0、 17、 32日齡采集抗凝血和非抗凝血，采用常規(guī)方法對(duì)血常規(guī)和抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。所分析的性狀主要是免疫性狀，包括豬繁殖與呼吸綜合征(藍(lán)耳病)病毒抗體水平、豬瘟病毒抗體水 平、偽狂犬抗體水平及血常規(guī)18項(xiàng)。根據(jù)采集樣品的群體結(jié)構(gòu)，申請(qǐng)人運(yùn)用混合模型來(lái)統(tǒng)計(jì)分析5C丄" 基W SNPs位點(diǎn)的基因型效應(yīng)及其與免疫指標(biāo)的關(guān)系Y=X|3+ZY+e其中Y為免疫性狀測(cè)定值向量；X為固定效應(yīng)關(guān)聯(lián)矩陣；p為固定效應(yīng)參數(shù)向量，包括性別效應(yīng)、胎 次效應(yīng)、線別效應(yīng)、候選基因的基因型效應(yīng)；Z為混合模型中的隨機(jī)效應(yīng)的關(guān)聯(lián)矩陣；Y為所有隨機(jī)效應(yīng) 參數(shù)向量，包括公畜效應(yīng)、公畜內(nèi)母畜效應(yīng)；e為隨機(jī)殘差效應(yīng)；采用SAS(Version 8.1)軟件中MIXED125130135GlyGlyCysGlu Ala Ala ValHisSer Val ArgThrPhe Leu His140145150GinAsnCysGly Glu Val LeuLeu Lys Val AspValLys Asn Ala155160165PheAsnSerVal Asp Arg GlyAla Leu Leu AlaGinVal Lys Asp170175180LyslieProAsp Leu Tyr AsnPheLeu Trp GinCysTyr Gly Glu185190195ProThrLysLeu Thr Tyr GinAsnAsn His MetLeuSer Ser Val200205210GlyCysGinGin Gly Asp ProPheGly Pro AlaThrPhe Ala Leu215220225AlalieHisPro lie lie GinArgLeu Gin SerLysLeu Asn Val230235240TrpTyrLeuAsp Asp Gly ThrLeuGly His AlaSer Lys lie245250255LeuGinGlyLeu Pro Val ValGlyLeu Ser LeuHisGly Glu Ser260265270CysGluPhePhe Gly Val AlaValHis Trp ValPheGly Tyr Val275280285LeuAlaGluSer Gly Leu HisTyrSer Pro GluPhelie Gly Gly290295300lieValAspGly Ser Val SerThrAla Val AlaGluPhe Arg Ser305310315PheLeuGlyPhe lie lie TyrSerGly Leu PhePheArg Asn Ala320325330CysGlyValLeu Lys Pro LeuSerGlu Leu LeuLysLys Gly Asn335340345Asn Trp Tyr Trp Gly Ala Cys His Glu Asn Ala Phe Thr Ala Leu 350 355 360Lys Asn Phe Leu Ala Leu Asp Leu Val Leu Ala His Phe Asn Tyr 365 370 375Asn Ala Ser Leu lie Uu Thr Val Asp Val Ser Arg Ser Gly Leu 380 385 390Ser Ala lie Phe Phe Gin lie Glu Ser Thr Gly Phe Ala Arg Pro 395 400 405Val Phe Phe Ala Ser Arg lie Leu Ser Val Ala Asp Asn Gly Tyr 410 415 420Ser Pro Phe Gin Val Val Ala Asn Ala lie lie Phe Cys Val Arg 425 430 435Gly Tyr Tyr His Phe Asp Tyr lie Val Gly Leu Phe His Leu Ser 440 445 450Tyr Val Gin lie Leu Asn Cys Phe Ser Trp Phe Leu Val Phe lie 455 460 465Glu Val Phe Ser Pro Thr lie Gin Cys Asn Asn Cys Leu Arg Phe 470 475 480Gly His lie Lys Asn Gin Cys Arg Ser Gin Pro Arg Arg Phe Arg 485 490 495Cys Thr Gin Pro His Cys Gly Asp Asn Cys Val Val Gin Glu Ser 500 505 510Glu Ala Ser Cys Leu Tyr Cys Ser Glu His His Phe Ser Thr Ser 515 520 525Arg Ser Cys Pro Glu Gin Glu Arg Gin Arg Ala lie Lys Met Lys 530 535 540Met Ser Arg Asp Gly lie Ser Tyr Gin Glu Ala Cys Ser Gin Thr 545 550 555Ala Lys Val Asn Arg Arg Leu Asn Gin Val Ala Gly Ser Val Pro560565570ValThrGinThrGinAla SerLeuLeuProProSerAsnAla Thr575580585GinProProProSerSer SerSerGinProPheGinSerTyr Arg590595600LysThrValSerHisSer ProArgProLysAlaLeuLeuGly Lys605610615SerTyrAspArglieAla HisGinAsnlielieAlaGinGly Pro620625630SerThrlieProAsnGly TyrProLeuGluArgAlaGinSer Gin635640645SerProHisProThrPro AspSerHisGinLeuLeuThrGin Leu650655660LeuThrlielielieAsn MetlieThrHisAspProAsnSer Leu665670675ProSerAsnValAlaHis MetliePheGinLeuProSerLeu lie680685690AsnHisHis Gly Ser Met Pro Asn Asn Pro695 700SEQIDNo: 3 (BspHI接頭)5，-CTCGTAGACTGCGTACC -3，3，- CATCTGACGCATGGGTAC-5SEQIDNo: 4 (BssHII接頭)5，-GACGATGAGTCCTGAG -3，3，- TACTCAGGACTCGCGC-5"SEQIDNo: 5 (預(yù)擴(kuò)增上游引物)5，-GTAGACTGCGTACCCATGA-3， SEQIDNo: 6 (預(yù)擴(kuò)增下游引物)5，-GATGAGTCCTGACGCGCA-3，SEQIDNo: 7 (選擇性擴(kuò)增上游引物)5，-GACTGCGTACCCATGAG-3， SEQIDNo: 8 (選擇性擴(kuò)增下游引物)5，-GATGAGTCCTGACGCGCAA-3， SEQIDNo: 9tcatgagaac gcttttacgg cgcttaagaa ctttttggcg ttggatctgg tattggctca 60 ttttaattat aacgcgtccc tcattttaac tgttgatgtg tcgcggtcag gtctttcagc 120 gatttttttt cagatagaat caactgggtt tgcgcgc 157SEQIDNo: SEQIDNo: SEQ ID No: SEQIDNo: SEQ ID No: SEQIDNo:10 5，-AYTTYTCGCRTRYCCCRSAATC11 5，-GCGCGCAAACCCAGTTGATTC12 5，-CATGAGAACGCTTTTACGGCGC13 5，-ATTSSATTAYTRGRCATARA14 (rtp表達(dá)上游引物)15 (rtp表達(dá)下游引物)5 ，-ACTATTGAGGCCACATCGCAGGAG ;，-CCGC AATTTTGGTGAAGGAAGGT
權(quán)利要求
1、一種茶尺蠖反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因rtp，其特征是具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
2、 如權(quán)利要求l所述的基因rtp編碼的蛋白質(zhì)，其特征是具有SEQIDNO: 2所示的氨 基酸序列。
3、 如權(quán)利要求l所述的基因rtp的用途，其特征是利用該基因物調(diào)節(jié)鱗翅目害蟲(chóng)的抗病 毒性能。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因rtp的用途，其特征是所述病毒為核型多角體病毒。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因rtp的用途，其特征是所述鱗翅目害蟲(chóng)為茶尺蠖。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因rtp的用途，其特征是將根據(jù)SEQIDNo: l所示的核苷酸 序列設(shè)計(jì)的rtp siRNA注射入茶尺蠖體內(nèi)，使內(nèi)源rtp表達(dá)下調(diào)，達(dá)到茶尺蠖抗病毒能力下降。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種茶尺蠖反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因rtp，其具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還公開(kāi)了上述基因rtp編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還公開(kāi)了上述基因rtp的用途利用該基因物調(diào)節(jié)鱗翅目害蟲(chóng)的抗病毒性能。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101215566SQ200810059158
公開(kāi)日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2008年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月14日
發(fā)明者晨 林, 梁月榮, 董占波, 鄭新強(qiáng), 陸建良 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)