專利名稱：：食線蟲真菌侵染性胞外絲氨酸蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及到用X光晶體衍射方法確定的食線蟲真菌侵染性胞外絲氨酸蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)，屬于分子生物學和應(yīng)用微生物學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：線蟲是一類線形多細胞原生動物，廣泛分布于海水、淡水及土壤中，其中一部分能夠寄生于植物或動物體內(nèi)。植物寄生線蟲可以引起多種經(jīng)濟作物的嚴重病害，造成巨大的經(jīng)濟損失。其中危害最嚴重的線蟲包括根結(jié)線蟲(Jkfe/o/tfogv"espp.)、胞囊線蟲(//"eratferaspp.)和松材線蟲(5w^印力e/e"c/z^xy/dpMws)等。應(yīng)用化學農(nóng)藥雖然對病原線蟲有良好的防治效果，但是化學農(nóng)藥容易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和線蟲容易產(chǎn)生藥物抗性等缺點，所以，研究殺線蟲生物資源和開發(fā)生物殺線蟲制劑日益受到關(guān)注。食線蟲真菌是指寄生、捕捉、定殖和毒害線蟲的一類微生物，它們在植物的病原昆蟲和線蟲的生物防治中起著非常重要的作用。其中寡孢節(jié)叢孢(^^^^//:^。/iga^or")、厚垣孢普可尼亞菌(尸oc/ww'flc/ztow;^ay;wra)和淡紫擬青霉(尸fle"7omycey///a"'"M)等食線蟲真菌在侵染線蟲的過程中能夠分泌胞外酶并參與對線蟲體壁的降解和侵染過程(2,6,7)。對食線蟲真菌的研究表明蛋白酶等侵染性胞外酶在侵染線蟲的過程中起著非常重要的作用(3-5)。然而，這些食線蟲真菌在自然條件下所產(chǎn)生和分泌的胞外酶的濃度是非常低的^g/L)(7),所以提高食線蟲真菌胞外蛋白酶的表達水平是提高線蟲生防制劑防效的一種途徑。Ahman等(l)的研究工作表明應(yīng)用分子生物學手段構(gòu)建的含有多拷貝胞外蛋白酶(PII)編碼基因的寡孢節(jié)叢孢突變株不僅能夠使生防菌株分泌更多的胞外酶，而且生防菌株的捕食能力也得到了極大的增強，這也為食線蟲真菌的遺傳改造提供了較好的思路和方法。目前提高食線蟲真菌侵染活性的方法僅限于利用基因工程提高侵染性絲氮酸蛋白酶基因的拷貝數(shù)，增加表達量來實現(xiàn)，但沒有對絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)進行細致的研究。經(jīng)文獻檢索，未發(fā)現(xiàn)與本
發(fā)明內(nèi)容相同文獻的公開報道。參考文獻1.Ahman，J.，T.Johansson,M.Olsson，P.J.Punt,C.A.vandenHondel，andA.Tunlid.2002.Improvingthepathogenicityofanematode-trappingfungusbygeneticengineeringofasubtilisinwith'nematotoxicactivity.ApplEnvironMicrobiol368:3408-15.2.Bo腿ts，P.J.，P.F.Fitters,H.Thijs，E.denBelder，C.Waahvijk，andJ.W.Henfling.1995.AbasicserineproteasefromPaecilomyceslilacinuswithbiologicalactivityagainstMeloidogynehaplaeggs.Microbiology141(Pt4):775-84.3.^GillespieJP，B.R.，Charn!eyAK.1998.RoleofcuticledegradingproteasesinthevirulenceofMetarhiziumspp.forthedesertlocust,schistocercagregaria.JInvertebrPathol71:128-137.4.H,M.1996.Roleofmicrobialproteasesinpathogenesis.MicrobiolImmunol40:685-693.5.Huang,X.，N.Zhao,andK.Zhang.2004.Extracellularenzymesservingasvirulencefactorsinnematophagousfungiinvolvedininfectionofthehost.ResMicrobiol155:811-6.6.Segers，R.，T.M.Butt,B.R.Kerry,andJ.F.Peberdy.'1994.ThenematophagousfungusVerticilliumchlamydosporiumproducesachymoelastase-likeproteasewhichhydrolyseshostnematodeproteinsinsitu.Microbiology140(Pt10):2715-23.7.—Tunlid,A.，S.Rosen,B.Ek，andL.Rask.1994.Purificationand'characterizationofanextracellularserineproteasefromthenematode-trapj)ingfungUsArthrobotrysoligospora.Microbiology140(Pt7):1687-95.8.汪家政，范明.2000.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊.科學出版社.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于通過X-晶體衍射的方法，確定食線蟲真菌侵染性胞外絲氨酸蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)。本發(fā)明通過對刀孢輪枝菌aecaw'd/tom戸flWotoe，YMF1:00U2)，保藏號CGMCCNo.l312，和淡紫擬青霉(Pae"7o附少cMWad/ms，M-14)，保藏CGMCCNo0241在誘導產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基PL-4中發(fā)酵培養(yǎng)，使真菌在發(fā)酵液中分泌大量的絲氨酸蛋白酶。然后對發(fā)酵;液進行硫酸銨分級沉淀(鹽析)，'對有蛋白酶活性的沉淀在AKTA(TM)(GE)純化儀上進行陽離子交換層析和分子篩(凝膠柱)純化。通過^t)S-PAGE檢驗蛋白酶的純度。在獲得電泳純(>95%)的蛋白酶后用超濾濃縮管(Millipore,USA)將其濃縮到較高濃度。然后使用懸滴氣相擴散法進行晶體培養(yǎng)。結(jié)晶條件的篩選使用Hampton(USA)公司的結(jié)晶條件篩選試劑盒。在獲得好的篩選條件后，即在該條件下培養(yǎng)蛋白晶體。獲得的晶體在X光機上衍射。使用HKL2000，O，ccp4等軟件進行處理，最終獲得該蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的真菌液體培養(yǎng)，將發(fā)酵液進行硫酸銨分級沉淀。將具蛋白酶活性部分用緩沖液溶解，即獲得粗酶液。將粗酶液在蛋白純化儀AKTA(TM,GE)上進行陽離子交換層析和分子篩純化。通過SDS-PAGE檢驗純度。獲得純酶以后進行濃縮處理以獲得較高濃度的酶溶液。將高濃度的酶溶液進行懸滴氣相擴散結(jié)晶。結(jié)晶條件通過試劑盒篩選。得到的晶體在X光機上衍射并收集足夠多張衍射圖片。用HKL2000處理衍射圖片，并用O，ccp4等軟件解析和優(yōu)化蛋白結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的具體步驟如下1、真菌的培養(yǎng)真菌通過PDA斜面保藏，.用PDA平板傳代。將少量菌絲接入液體產(chǎn)酶PL-4培養(yǎng)基(土豆100g/L煮沸25分鐘加入明膠lg/L,葡萄糖lg/L,硫酸銨lg/L,磷酸二氫鉀2g/L,硫酸鎂0.5g/L,硫酸亞鐵0.001g/L;每500mL三角瓶中分裝200mL)中，在搖床上28°C，150rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)6天以后收集培養(yǎng)液。酶活的測定采用FoIin-酚法(8)。2、胞外蛋白酶的純化一將發(fā)酵物用4層紗布過濾除掉菌絲，收集上清液。加入不同質(zhì)量的固體硫酸銨(終濃度5-85%)進行鹽析，8500rpni離心12分鐘，棄上清，.用發(fā)酵液1/20體積的磷酸鹽緩沖液(10mMPBS，Ph6.0)溶解沉淀。測各溶液樣品的蛋白'酶活。具有蛋白酶活的樣品用45um微孔濾膜過濾。加到AKTA蛋白純化儀上用10mMPBS，pH6.0平衡過的Resourcel5S陽離子柱上。用含有1MNaCl的10mMPBS，pH6.0緩沖液梯度洗脫。收集不同的洗脫峰，分別測蛋白酶酶活。SDS-PAGE電泳檢測。將具有蛋白酶活的洗脫液濃縮后上分子篩(Superdex7526/60)，緩沖液為50mMPBSpH7.0，力n0.15MNaCl。收集不同的洗脫峰，分別測蛋白酶活。SDS-PAGE電泳檢測。3、蛋白酶的結(jié)晶'通過以上純化步驟獲得電泳純的蛋白酶樣品。將此蛋白溶液加入Amicon(TM，Millipore)超濾濃縮管。4000rpm離心，直到達到預期的體積。使用Brandford染色法確定蛋白濃度。使用Hampton結(jié)晶試劑盒進行結(jié)晶條件的篩選。蛋白酶濃度為5mg/ml,將lul蛋白和lul池液混合均勻點在硅化的蓋玻片上，倒扣密H"在含有200ul池液的槽上，在16'C進行懸滴氣相擴散結(jié)晶。具體見試劑盒說明書。每隔8小時觀察結(jié)晶。在產(chǎn)生結(jié)晶的條件下對蛋白濃度和池液中各物質(zhì)的濃度進行梯度優(yōu)化以獲得較好的蛋白結(jié)曰曰曰o4、X光衍射和結(jié)構(gòu)解析在收集到蛋白酶的X射線衍射數(shù)據(jù)后，首先使用HKL2000等(包括Mosflm、D*trek等)軟件對上一步驟中收集得到的衍射數(shù)據(jù)進行處理，獲得完整的數(shù)據(jù)文件；其次，使用CNS或者CCP4程序包中的Phaser、Molrep等，利用分子置換(MolecularReplacement)的方法，得到蛋白酶PL646和抑制劑的精細三維結(jié)構(gòu)。本發(fā)明首次報道了食線蟲真菌侵染性胞外絲氨酸蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)，為提高蛋白酶的水解活性和食線蟲真菌的侵染能力奠定了基礎(chǔ)。圖1為蛋白酶PL646晶體結(jié)構(gòu)的飄帶模型。由圖可知蛋白酶PL646包含6個a螺旋，一個7股平行p折疊片，兩個2股反平行p折疊片。圖中同時展示了抑制劑的結(jié)合位置。屈:2為抑制劑與蛋白酶PL646.結(jié)合的精細結(jié)構(gòu)四肽(Ala-Ala-Pro-Val)與蛋白酶形成氫鍵。抑制劑的末端碳原子和Val的C端碳原子分別與催化中心的組氨酸和絲氨酸殘基形成共價鍵。具體實施例方式以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實施例一刀孢輪枝菌￡^""/"7//訓/^///^<^胞外絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)解析將PDA平板上培養(yǎng)的刀孢輪枝菌aec朋/dWm/7戸fl〃/otoe，YMF1.00112)，保藏號CGMCCNo.1312的菌株接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28°C，150rpm搖床培養(yǎng)6天。過濾發(fā)酵液，上清液用硫酸銨沉淀。將有蛋白酶活性的部分用10mMPBS(pH6.0)緩沖液溶解，通過陽離子交換層析進行純化。將有酶活的洗脫液通過分子篩進一步純化。得到電泳純的蛋白l每Ver112，濃縮后進行結(jié)晶獲得蛋白酶晶體。晶體通過X光衍射，用HKL2000，ccp4等軟件處理得到該蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)。"實施例二淡紫擬青霉尸ae"7o^yc^Waa>z^胞外絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)解析將PDA平板上培養(yǎng)的淡紫擬青霉(尸ae"7oOT7CM///a"'"^，M-14)，保藏CGMCCNo0241.的菌株接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28°C，150rpm搖床培養(yǎng)6天。過濾發(fā)酵液，上清液用硫酸銨沉淀。將蛋白酶活性的部分用10mMPBS(pH6.0)緩沖液溶解，通過陽離子交換層析進行純化。將有酶活的洗脫液通過分子篩進一步純化。得到電泳純的蛋白酶PL646，濃縮后進行結(jié)晶獲得蛋白酶晶體。晶體通過X光衍射，用HKL2000，ccp4等軟件處理得到該蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)。'上述實施實例得到的食線蟲真菌胞外堿性絲氨酸酶的晶體結(jié)構(gòu)，其特征為兩種食線蟲真菌胞外堿性絲氨酸蛋白酶Verll2和PL646晶體衍射后分辨率分別達到1.6A和2.1A。、兩個蛋白酶都是球形蛋白，'具有6個a螺旋，一個7股平行p折疊片，兩個2股反平行卩折疊片組成，另外Verll2有一個3/10螺旋。兩個蛋白酶都含'有5個半胱氨酸，其中四個組成兩個二硫鍵。兩個蛋白酶都含有一個鈣結(jié)合位點，結(jié)合l丐離子能提高蛋白酶的熱穩(wěn)定性。上述實施實例得到的食線蟲真菌胞外堿性絲氨酸蛋白酶的活性中心，其特征為通6過對PL646及其蛋白酶抑制劑(mbthoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethylketone)的復合物結(jié)晶的衍射后確定了蛋白酶的底物結(jié)合口袋。抑制劑的^g肽片段與底物結(jié)合區(qū)的兩條肽鏈通過氫鍵連接形成一個3股反平行折疊片。其C端與催化中心的絲氨酸和組氨酸殘基形成共價鍵。通過此結(jié)構(gòu)確定了4個底物結(jié)合口袋，Sl-S4，分別結(jié)合底物的四個氨基酸殘基P1-P4。P1殘基C端的肽鍵被催化中心的絲氨酸側(cè)鏈的氧原子通過親核攻擊打斷，從而催化了蛋白底物的水解反應(yīng)。表一蛋白酶晶體參數(shù)衍射數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>aVaiueSinparenthesescorrespondtothehighestresolutionshell.bRmerge=2/^!^|/(7^/」廣</(7^/)〉|/2/^/^1(7^/人，where</(7A:/」>isthemeanintensityoftheobservationsofreflectionhkl.權(quán)利要求1、一種食線蟲真菌侵染性胞外絲氨酸蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)，其特征在于絲氨酸蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)經(jīng)如下步驟得到a.真菌通過PDA斜面保藏，用PDA平板傳代，將少量菌絲接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在搖床上28℃，150rpm培養(yǎng)；培養(yǎng)6天以后收集培養(yǎng)液；b.過濾收集上清液，硫酸銨沉淀；通過AKTA蛋白純化儀(sourece15S陽離子柱和凝膠柱superdex7526/60)進行純化，得到電泳純的蛋白酶；c.檢測多肽抑制劑methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethylketone對蛋白酶PL646的抑制活性；.d.通過以上純化步驟獲得的電泳純蛋白酶樣品進行懸滴氣象擴散法進行結(jié)晶；e.用旋進法收集X射線衍射數(shù)據(jù)在收集到蛋白酶的X射線衍射數(shù)據(jù)后，首先使用HKL2000、包括Mosflm、D*trek軟件對上一步驟中收集得到的衍射數(shù)據(jù)進行處理，獲得完整的數(shù)據(jù)文件；再使用CNS或者CCP4程序包中的Phaser、Molrep軟件，利用MolecularReplacement的分子置換方法，得到蛋白酶PL646和抑制劑的精細三維結(jié)構(gòu)；其中食線蟲真菌胞外絲氨酸酶的總體結(jié)構(gòu)，其特征為兩種食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶Ver112和PL646晶體衍射后分辨率分別達到1.6和2.1。兩個蛋白酶都是球形蛋白，具有6個α螺旋，一個7股平行β折疊片，兩個2股反平行β折疊片組成，另外Ver112有一個3/10螺旋；兩個蛋白酶都含有5個半胱氨酸，其中四個組成兩個二硫鍵，都含有一個鈣結(jié)合位點，結(jié)合鈣離子能提高蛋白酶的熱穩(wěn)定性；食線蟲真菌胞外堿性絲氨酸蛋白酶的活性中心，其特征為通過對PL646及其蛋白酶抑制劑(methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethylketone)的復合物結(jié)晶的衍射后確定了蛋白酶的底物結(jié)合口袋；抑制劑的四肽片段與底物結(jié)合區(qū)的兩條肽鏈通過氫鍵連接形成一個3股反平行折疊片；其C端與催化中心的絲氨酸和組氨酸殘基形成共價鍵；通過此結(jié)構(gòu)確定了4個底物結(jié)合口袋，S1-S4，分別結(jié)合底物的四個氨基酸殘基P1-P4；P1殘基C端的肽鍵被催化中心的絲氨酸側(cè)鏈的氧原子通過親核攻擊打斷，從而催化了蛋白底物的水解反應(yīng)。全文摘要本發(fā)明涉及食線蟲真菌侵染性胞外絲氨酸蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)，屬于分子生物學和應(yīng)用微生物學領(lǐng)域。本發(fā)明用食線蟲真菌刀孢輪枝菌(Lecanicilliumpsalliotae，YMF1.00112)及淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus，M-14)進行液體培養(yǎng)，將發(fā)酵液進行硫酸銨分級沉淀。將具蛋白酶活性部分用緩沖液溶解，即獲得粗酶液。將粗酶液進行陽離子交換層析和分子篩純化。獲得純酶以后進行濃縮處理以獲得較高濃度的酶溶液。將高濃度的酶溶液進行懸滴氣相擴散結(jié)晶。結(jié)晶條件通過試劑盒篩選。得到的晶體在X光機上衍射并收集足夠多張衍射圖片。用HKL2000處理衍射圖片，并用O，ccp4等軟件解析和優(yōu)化蛋白結(jié)構(gòu)。本發(fā)明首次報道了食線蟲真菌侵染性胞外絲氨酸蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)，為提高蛋白酶的水解活性和食線蟲真菌的侵染能力奠定了基礎(chǔ)。文檔編號C12N9/58GK101434945SQ20081005898公開日2009年5月20日申請日期2008年9月27日優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日發(fā)明者婁智勇,孟照輝,張克勤,楊金奎,梁連銘,饒子和申請人:云南大學